RU2197262C2 - Ligands for notch - Google Patents

Ligands for notch Download PDF

Info

Publication number
RU2197262C2
RU2197262C2 RU99112175/14A RU99112175A RU2197262C2 RU 2197262 C2 RU2197262 C2 RU 2197262C2 RU 99112175/14 A RU99112175/14 A RU 99112175/14A RU 99112175 A RU99112175 A RU 99112175A RU 2197262 C2 RU2197262 C2 RU 2197262C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
notch
delta
antigen
serrate
Prior art date
Application number
RU99112175/14A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU99112175A (en
Inventor
Джонатан Роберт ЛЭМБ
Маргарет Джейн ДАЛЛМАН
Джеральд Фрэнсис ХОЙН
Original Assignee
Лорантис Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лорантис Лимитед filed Critical Лорантис Лимитед
Publication of RU99112175A publication Critical patent/RU99112175A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2197262C2 publication Critical patent/RU2197262C2/en

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

FIELD: biology, medicine, immunology. SUBSTANCE: invention relates to the use of therapeutic compounds in modification of interactions of T-cells, antigen-presenting cells with T-cells and interactions between pathogenic organisms and immunocompetent host-cells. In part, invention relates to the use of these compounds in modification of interactions between proteins Notch and their ligands and to the use of such compounds in production of medicinal agents used for treatment of states, for example, transplant rejection, autoimmune processes, allergy and asthma and infectious diseases. The advantage of invention involves the development of agent inhibiting T-cellular interactions resulting to infectious tolerance and that can be used in production of medicinal preparations for immunotherapy carrying out. EFFECT: valuable biological and medicinal properties of ligands. 12 cl, 9 dwg, 2 tbl, 12 ex

Description

Изобретение относится к использованию терапевтических соединений в модификации активации Т-клеток. В частности, оно имеет отношение к их использованию для модуляции взаимодействия между белками семейства Notch и их лигандами и использовании подобных соединений в терапии таких состояний как: реакция отторжения трансплантата, аутоиммунные реакции, аллергии, инфекционные болезни и опухоли. The invention relates to the use of therapeutic compounds in modifying T-cell activation. In particular, it relates to their use for modulating the interaction between Notch family proteins and their ligands and the use of similar compounds in the treatment of conditions such as the transplant rejection reaction, autoimmune reactions, allergies, infectious diseases and tumors.

Контролируемое взаимодействие между Т-клетками и между антиген-представляющими клетками (АП-клетками) и Т-клетками является жизненно важным для функционирования иммунной системы человека. Тем не менее при определенных патологиях может быть полезно модифицировать, положительно или отрицательно, подобные взаимодействия. Например, при таких состояниях как аутоиммунная реакция, аллергия или реакция отторжения трансплантата желательно индуцировать регуляцию по типу отрицательной обратной связи иммунного ответа путем стимуляции негативных Т-клеток или взаимодействия Т-клеток с АП-клетками. Модели "инфекционной толерантности" и "связанной супрессии" предполагают, что толерантность может быть индуцирована в небольшом количестве Т-клеток, и данные Т-клетки затем передают эту толерантность другим Т-клеткам, таким образом предупреждая эффективную иммунологическую атаку. При иных патологических состояниях, таких как индуцированная опухолью иммуносупрессия, паразитарные вирусные или бактериальные инфекции, иммуносупрессия является обычным явлением. В данных обстоятельствах было бы, следовательно, желательно ингибировать Т-клеточные взаимодействия, ведущие к инфекционной толерантности. The controlled interaction between T cells and between antigen presenting cells (AP cells) and T cells is vital for the functioning of the human immune system. However, for certain pathologies, it may be useful to modify, positively or negatively, such interactions. For example, in conditions such as an autoimmune reaction, an allergy, or a transplant rejection reaction, it is desirable to induce regulation by the type of negative feedback of the immune response by stimulating negative T cells or interacting T cells with AP cells. Models of "infectious tolerance" and "associated suppression" suggest that tolerance can be induced in a small number of T cells, and these T cells then transfer this tolerance to other T cells, thereby preventing an effective immunological attack. In other pathological conditions, such as tumor-induced immunosuppression, parasitic viral or bacterial infections, immunosuppression is common. In these circumstances, it would therefore be desirable to inhibit T cell interactions leading to infectious tolerance.

Однако до настоящего момента механизмы, поддерживающие подобные взаимодействия Т-клеток и Т-клеток с АП-клетками, не были изучены. However, to date, the mechanisms supporting such interactions of T cells and T cells with AP cells have not been studied.

В заявке WO 92/19734 обнаружены нуклеотидные последовательности генов Notch и Delta и определены аминокислотные последовательности кодируемых ими белков. Показано, что семейство генов Notch играет существенную роль для правильного развития дифференцировки эмбриональных клеток насекомых, таких как Drosophila. In WO 92/19734, the nucleotide sequences of Notch and Delta genes were detected and the amino acid sequences of the proteins encoded by them were determined. It was shown that the Notch gene family plays an essential role for the proper development of differentiation of insect embryonic cells, such as Drosophila.

Белки, относящиеся к семейству Notch, являются трансмембранными рецепторами, которые содержат несколько консервативных пептидных мотивов. Каждый белок из этого семейства имеет характерные повторы подобно внеклеточному эпидермальному фактору роста (EGF) и околомембранный мотив Lin-12/Notch. Кроме того, каждый белок имеет 6-8 анкириновых повторяющихся мотивов в цитоплазматическом хвосте вместе с последовательностью PEST. Лиганды Notch имеют диагностический домен DSL (D, Delta, S, Serrate, L,Lag2), включающий 20-22 аминокислот на аминоконце белка и от 3 до 8 EGF-подобных повторов во внеклеточной области. Белки имеют короткий цитоплазматический хвост с несохраненными функциональными доменами. Proteins belonging to the Notch family are transmembrane receptors that contain several conserved peptide motifs. Each protein in this family has characteristic repeats like the extracellular epidermal growth factor (EGF) and the Lin-12 / Notch transmembrane motif. In addition, each protein has 6-8 ankyrin repeating motifs in the cytoplasmic tail along with the PEST sequence. Notch ligands have a DSL diagnostic domain (D, Delta, S, Serrate, L, Lag2), including 20-22 amino acids at the amino terminus of the protein and from 3 to 8 EGF-like repeats in the extracellular region. Proteins have a short cytoplasmic tail with unsaved functional domains.

Полученные данные свидетельствуют о том, что Notch способствует дифференцировочному коммитированию незрелых Т-клеток в тимусе, направляя тимоциты по пути дифференцировки в клетки CD8+, не зависящие от МНС (Robey E. с сотр. Cell, 1996, 87:483-492). В процессе созревания в тимусе Т-клетки приобретают способность распознавать свои собственные антигены и отличать их от чужих, данный процесс назван аутотолерантностью (von Boehmer Н. с.сотр. Ann Rev Immunol. 1990; 8:531). Механизмы индукции и поддержки толерантности существуют также и на периферии, и во многих отношениях их значение находится в стадии изучения. Существует много экспериментальных моделей реакции отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний и специфических ответов на аллергены, которые четко иллюстрируют способность индуцировать состояние специфической ареактивности (толерантность или анергия) у реципиента при иммунизации определенным антигеном. В результате можно сделать два важных вывода. Во-первых, иммунизация пептидным фрагментом антигена в особых условиях может подавлять специфические ответы не только на себя самого, но и на другие области этой же молекулы в том случае, если интактный белок используется для провокационной иммунизации (связанная супрессия; Hoyne GF. с сотр. J. Exp Med. 1993; 178:183 и Metzler В., Wraith DC. Int. Immunol. 1993; 5: 1159). Во-вторых, наилучшим образом показано в экспериментальных моделях трансплантации в феномене "инфекционной толерантности", где постулировано, что иммунокомпетентные клетки, будучи невосприимчивыми к определенному антигену, способны подавлять клеточный ответ у других клеток и, более того, эта вторая популяция клеток становится регуляторной и толерантной (Qin SX. с сотр. Science, 1993; 258:974). Иммунологические механизмы, лежащие в основе этого явления пока не выяснены. The data obtained indicate that Notch promotes differential differentiation of immature T cells in the thymus by directing thymocytes along the differentiation path to CD8 + cells independent of MHC (Robey E. et al. Cell, 1996, 87: 483-492). In the process of maturation in the thymus, T cells acquire the ability to recognize their own antigens and distinguish them from strangers, this process is called autotolerance (von Boehmer N. s.cp. Ann Rev Immunol. 1990; 8: 531). Mechanisms of induction and support of tolerance also exist on the periphery, and in many respects their significance is under study. There are many experimental models of transplant rejection reactions, autoimmune diseases, and specific responses to allergens that clearly illustrate the ability to induce a state of specific areactivity (tolerance or anergy) in a recipient when immunized with a specific antigen. As a result, two important conclusions can be drawn. First, immunization with a peptide fragment of an antigen under special conditions can suppress specific responses not only to itself, but to other regions of the same molecule if an intact protein is used for provocative immunization (associated suppression; Hoyne GF. Et al. J. Exp Med. 1993; 178: 183 and Metzler B., Wraith DC. Int. Immunol. 1993; 5: 1159). Secondly, it is best shown in experimental models of transplantation in the phenomenon of "infectious tolerance", where it is postulated that immunocompetent cells, being immune to a specific antigen, are able to suppress the cellular response in other cells and, moreover, this second population of cells becomes regulatory and tolerant (Qin SX. et al. Science, 1993; 258: 974). The immunological mechanisms underlying this phenomenon have not yet been elucidated.

Стимулом для появления данного изобретения послужило открытие того, что рецепторы семейства Notch и их лиганды Delta и Serrate экспрессированы на поверхности нормальных зрелых клеток периферической иммунной системы. The stimulus for the appearance of this invention was the discovery that Notch family receptors and their ligands Delta and Serrate are expressed on the surface of normal mature cells of the peripheral immune system.

Следовательно, в условиях согласно изобретению, Notch-лиганды могут быть использованы в производстве медицинских препаратов для иммунотерапии. Therefore, under the conditions of the invention, Notch ligands can be used in the manufacture of medicaments for immunotherapy.

Характер экспрессии рецепторов семейства Notch и их лигандов в периферической иммунной системе здорового взрослого человека до сих пор не был описан, но в настоящем изобретении показано, что Т-клетки конститутивно экспрессируют Notch 1 мРНК, в то время как экспрессия Delta ограничена только субпопуляцией Т-клеток в периферических лимфоидных тканях. Экспрессия Serrate ограничена субпопуляцией антиген-представляющих клеток (АП-клеток) на периферии (фигура 1). Следовательно, семейство рецепторных лигандов может продолжать регулировать судьбу клеток в иммунной системе, как было показано на других тканях, после эмбрионального развития (Ellisen LW. с сотр. Cell, 1991; 66: 649). Сигнализация Notch может играть центральную роль в индукции периферической реакционной ареактивности (толерантности или анергии) и может обеспечивать физическое объяснение связанной супрессии и инфекционной толерантности. The expression patterns of Notch family receptors and their ligands in the peripheral immune system of a healthy adult have not yet been described, but the present invention has shown that T cells constitutively express Notch 1 mRNA, while Delta expression is limited only by a subpopulation of T cells in peripheral lymphoid tissues. Serrate expression is limited to a subpopulation of antigen presenting cells (AP cells) at the periphery (Figure 1). Therefore, the family of receptor ligands can continue to regulate the fate of cells in the immune system, as has been shown on other tissues, after embryonic development (Ellisen LW. Et al. Cell, 1991; 66: 649). Notch signaling can play a central role in the induction of peripheral reactive activity (tolerance or anergy) and can provide a physical explanation for the associated suppression and infectious tolerance.

Настоящее изобретение, кроме того, связано с применением лигандов Notch для воздействия на реакции, опосредованные Т-клетками. Так, было замечено, что при совместной экспозиции популяции нативных Т-клеток с лигандами Notch, экспрессированными на АП-клетках, в присутствии антигена или аллергена лиганды Notch способны вызвать толерантность Т-клеточной популяции к указанному антигену или аллергену. Более того, данная популяция Т-клеток при дальнейшей экспозиции со второй популяцией нативных Т-клеток, также способна передать второй популяции толерантность к указанным антигену или аллергену. The present invention also relates to the use of Notch ligands for influencing T-cell mediated reactions. Thus, it was observed that when a joint exposure of a population of native T cells with Notch ligands expressed on AP cells in the presence of an antigen or allergen, Notch ligands can cause tolerance of the T cell population to the indicated antigen or allergen. Moreover, this population of T cells upon further exposure with a second population of native T cells is also able to transmit tolerance to the indicated antigen or allergen to the second population.

Таким образом, изобретение также связано с применением лигандов Notch для воздействия на связанную толерантность и/или перенесенную толерантность (также называемой инфекционной толерантностью). Thus, the invention also relates to the use of Notch ligands to influence related tolerance and / or tolerance (also called infectious tolerance).

Другой аспект изобретения связан с применением лигандов Notch для модуляции экспрессии функционального белка Notch или путей сигналирования Notch. Another aspect of the invention relates to the use of Notch ligands to modulate the expression of functional Notch protein or Notch signaling pathways.

В приведенных выше аспектах согласно изобретению лиганд Notch может быть экспонирован Т-клеткам путем инкубации смешивания Т-клеток с АП-клетками или им подобными, которые экспрессируют или избыточно экспрессируют лиганды Notch в присутствии аллергена или антигена. Избыточная экспрессия гена лиганда Notch может быть вызвана АП-клетками при трансфекции их геном, способным вызывать экспрессию лиганда Notch, или АП-клетками, экспонированными с агентом, способным повышать экспрессию эндогенного гена (генов) лиганда Notch. In the above aspects of the invention, a Notch ligand can be exposed to T cells by incubating the mixing of T cells with AP cells or the like that express or overexpress Notch ligands in the presence of an allergen or antigen. Excessive expression of the Notch ligand gene can be caused by AP cells by transfection with their gene capable of causing expression of the Notch ligand, or by AP cells exposed with an agent capable of increasing the expression of the endogenous Notch ligand gene (s).

Соответствующие агенты, влияющие на экспрессию лигандов Notch, включают в себя агенты, воздействующие на экспрессию генов Delta и/или Serrate. Например, для экспрессии Delta связывание внеклеточных BMPs (морфогенетических белков кости, Wilson, P.А. и Hemmati-Brivanlou A., 1997, Neuron 18: 699-710, Hemmati-Brivanlou A. и Melton D. Cell 88:13-17) с их рецепторами приводит к обратной регуляции транскрипции Delta посредством ингибирования экспрессии фактора транскрипции комплекса Achaete/Scute. Есть основания полагать, что этот комплекс непосредственно вовлечен в регуляцию экспрессии Delta. Таким образом, любой агент, ингибирующий связывание BMPs с их рецепторами, способен вызвать увеличение экспрессии Delta и/или Serrate. К подобным агентам относятся: Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs, Fringe, а также их производные и иные разновидности (см. ссылки на noggin-Smith W.C. и Наrland, R. M Cell 70:829-840, chordin-Sasai, Y. et al., 1994 Cell 79: 779-790). Таким образом, связь Noggin и Chordin BMPs препятствует активации их сигнального каскада, который приводит к подавлению транскрипции Delta. Suitable agents that affect the expression of Notch ligands include agents that affect the expression of Delta and / or Serrate genes. For example, for Delta expression, the binding of extracellular BMPs (morphogenetic proteins of bone, Wilson, P.A. and Hemmati-Brivanlou A., 1997, Neuron 18: 699-710, Hemmati-Brivanlou A. and Melton D. Cell 88: 13-17 ) with their receptors leads to reverse regulation of Delta transcription by inhibiting the expression of the transcription factor of the Achaete / Scute complex. There is reason to believe that this complex is directly involved in the regulation of Delta expression. Thus, any agent that inhibits the binding of BMPs to their receptors can cause an increase in the expression of Delta and / or Serrate. Such agents include: Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs, Fringe, as well as their derivatives and other varieties (see links to noggin-Smith WC and Narland, R. M Cell 70: 829-840, chordin-Sasai, Y. et al., 1994 Cell 79: 779-790). Thus, the binding of Noggin and Chordin BMPs prevents the activation of their signaling cascade, which leads to the suppression of transcription of Delta.

При некоторых болезненных состояниях иммунитет оказывается ослабленным и может возникнуть необходимость подавить экспрессию Delta и/или Serrate с целью преодоления иммуносупрессии. При подобных обстоятельствах могут быть использованы агенты, способные ингибировать экспрессию Delta и/или Serrate. Примерами агентов, способных подавлять экспрессию Delta и/или Serrate, может служить белок Toll (Medzhitov R. с сотр., 1997 Nature 388: 394-397) BMPs и иные агенты, способные снижать или препятствовать образованию Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs и Fringe. Таким образом, изобретение связано также с применением агента, способного по типу отрицательной обратной связи снижать экспрессию белков Delta или Serrate, в производстве медицинских препаратов для применения при лечении повторной бактериальной инфекции или иммуносупрессии, вызванной опухолью. In some painful conditions, immunity is impaired and it may be necessary to suppress the expression of Delta and / or Serrate in order to overcome immunosuppression. Under such circumstances, agents capable of inhibiting the expression of Delta and / or Serrate may be used. Examples of agents capable of suppressing the expression of Delta and / or Serrate are the Toll protein (Medzhitov R. et al., 1997 Nature 388: 394-397) BMPs and other agents capable of reducing or inhibiting the formation of Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGFs and Fringe. Thus, the invention also relates to the use of an agent capable of negatively reducing the expression of Delta or Serrate proteins in the manufacture of medicaments for use in the treatment of repeated bacterial infection or tumor immunosuppression.

Как обсуждалось выше, изобретение также связано с модификацией экспрессии белка Notch, или презентации на клеточной мембране, либо путей сигнализации. Было показано, что все это вовлекается в опосредованные Т-клетками ответы, которые принимают участие в возникновении толерантности (связанной и/или инфекционной). Агенты, увеличивающие презентацию полностью функционального белка Notch на поверхности клетки, включают в себя металлопротеиназы матрикса, такие как продукт гена дрозофилы Kuzbanian (Dkuz, Pan, D и Rubin, G.M. 1997 Cell 90: 2.71-280) и других генов семейства ADAMALYSIN. Агентами, снижающими или препятствующими его презентации как полноценно функционирующего белка клеточной мембраны могут служить ингибиторы металлопротеиназ матрикса (ММР), такие как ингибиторы, основанные на гидроксиматах. As discussed above, the invention also relates to modifying expression of Notch protein, or presentation on a cell membrane, or signaling pathways. It has been shown that all this is involved in T-cell-mediated responses that are involved in the occurrence of tolerance (related and / or infectious). Agents that enhance the presentation of the fully functional Notch protein on the cell surface include matrix metalloproteinases, such as the product of the Kuzbanian Drosophila gene (Dkuz, Pan, D and Rubin, G.M. 1997 Cell 90: 2.71-280) and other genes of the ADAMALYSIN family. Matrix metalloproteinase inhibitors (MMPs), such as hydroximate-based inhibitors, can serve as agents that reduce or prevent its presentation as a fully functioning cell membrane protein.

Понятие "антиген-представляющая клетка или ей подобная", здесь подразумевает не только АП-клетки. Специалисту понятно, что подразумевается любой наполнитель, способный представлять требуемый лиганд Notch популяции T-клеток; для обозначения всех подобных структур с целью упорядочивания терминологии используется понятие АП-клетки. Таким образом, понятие АП-клетки включает в себя также дендритные клетки, L-клетки, гибридомы, лимфомы, макрофаги, В-клетки или синтетические АП-клетки, такие как липидные мембраны. The term "antigen-presenting cell or the like," here refers not only to AP cells. One of skill in the art will understand that any excipient is capable of representing the desired Notch ligand of a T cell population; To denote all such structures in order to streamline terminology, the concept of AP cells is used. Thus, the concept of AP cells also includes dendritic cells, L cells, hybridomas, lymphomas, macrophages, B cells or synthetic AP cells, such as lipid membranes.

Когда АП-клетки трансфицированы геном, способным к экспрессии лиганда Notch, трансфекция может быть осуществлена вирусом, таким как ретровирус или аденовирус, или другим носителем или методом, способным доставить ген клетке. Эффективность любых подобных носителей или методов показана в генной терапии, и к ним относятся ретровирусы, липосомы, метод электропорации, а также другие вирусы, такие как аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, ДНК, преципитированная фосфатом кальция, трансфекция с помощью ДЕАЕ-декстрана, микроинъекции, полиэтиленгликоль, комплексы белок-ДНК. When AP cells are transfected with a gene capable of expressing a Notch ligand, transfection can be performed with a virus, such as a retrovirus or adenovirus, or with another carrier or method capable of delivering the gene to the cell. The effectiveness of any such carriers or methods has been shown in gene therapy, and these include retroviruses, liposomes, electroporation, as well as other viruses such as adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes virus, vaccinia virus, calcium phosphate precipitated DNA, transfection using DEAE-dextran, microinjection, polyethylene glycol, protein-DNA complexes.

Использование подобных носителей или методов по отдельности или в комбинации друг с другом делает возможным осуществлять сайтнаправленную передачу гена в определенную клеточную популяцию, делая возможным осуществление способа настоящего изобретения in vivo. Например, вирус может быть использован в комбинации с липосомами с целью повышения эффективности поглощения ДНК. Сайтспецифичность доставки может быть достигнута включением специфических белков (Например, одноцепочечного антитела, реагирующего с CD11c дендритных клеток/макрофагов) в вирусную оболочку или липосомы. The use of such carriers or methods individually or in combination with each other makes it possible to carry out site-directed gene transfer into a specific cell population, making it possible to implement the method of the present invention in vivo. For example, the virus can be used in combination with liposomes to increase the efficiency of DNA uptake. Site specific delivery can be achieved by incorporation of specific proteins (eg, single chain antibodies that react with dendritic cells / macrophages CD11c) into the viral envelope or liposomes.

Предпочтительно использование конструкций, с помощью которых экспрессия гена (например, Serrate) была бы связана с экспрессией антигена. АП-клетки, избыточно экспрессирующие Serrate, имели бы, кроме того, высокий уровень экспрессии связанного антигена и предпочтительно реагировали бы с Т-клетками соответствующей специфичности. Preferred are constructs by which gene expression (e.g., Serrate) is associated with antigen expression. AP cells overexpressing Serrate would also have a high level of expression of the bound antigen and would preferably react with T cells of appropriate specificity.

Дальнейшее воплощение данного изобретения связано с молекулой, содержащей фрагмент лиганда Notch, оперативно связанный с Т-клеточным фрагментом аллергена или антигена, так что при экспозиции с Т-клетками оба фрагмента способны взаимодействовать своими соответствующими сайтами. Такая молекула способна превращать антиген/аллерген-специфичную Т-клетку, толерантную к аллергену или антигену, содержащему этот фрагмент, поскольку специфичность, требуемая от фрагмента лиганда Notch, обусловлена тесным контактом фрагмента аллергена или антигена. A further embodiment of the invention relates to a molecule containing a Notch ligand fragment operably linked to a T-cell fragment of an allergen or antigen, so that when exposed to T cells, both fragments are able to interact at their respective sites. Such a molecule is capable of converting an antigen / allergen-specific T cell tolerant to an allergen or antigen containing this fragment, since the specificity required from the Notch ligand fragment is due to the close contact of the allergen or antigen fragment.

Фрагментом антигена или аллергена может являться, например, синтетический МНС-пептидный комплекс. Это фрагмент молекулы МНС, несущий антигенный пептидсвязывающий участок, несущий элемент антигена. Подобные комплексы были описаны в Altman JD с сотр. Science 1996 274:94-6. A fragment of an antigen or allergen may be, for example, a synthetic MHC peptide complex. This is a fragment of the MHC molecule that carries the antigenic peptide binding site that carries the antigen element. Similar complexes have been described in Altman JD et al. Science 1996 274: 94-6.

В приведенных далее пояснениях описываемое вещество является слитым белком, содержащим сегмент Notch или внеклеточный домен лиганда Notch и иммуноглобулин Fc, предпочтительно IgGFc или IgMFc.In the following explanations, the described substance is a fusion protein containing the Notch segment or the extracellular domain of the Notch ligand and immunoglobulin F c , preferably IgGF c or IgMF c .

Во всех описанных выше аспектах настоящего изобретения предпочтительно, чтобы лигандом Notch были белки семейства Serrate или белки семейства Delta, их производные, фрагменты или аналоги. In all of the above aspects of the present invention, it is preferred that the Notch ligand is Serrate family proteins or Delta family proteins, derivatives, fragments or analogs thereof.

В список заболеваний или инфекций, которые могут быть охарактеризованы как опосредованные Т-клетками, можно включить одно или более из нижеперечисленного: астма, аллергия, отторжение трансплантата, аутоиммунные проявления, вызванные опухолью аберрации в системе Т-клеток, а также инфекционные заболевания, такие как вызванные видами плазмодия, микрофилярией, гельминтами, микобактериями, ВИЧ, цитомегаловирусом, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza типа В, возбудителями кори, гепатита С или Toxicara. Таким образом, при использовании подходящего аллергена или антигена, лиганд Notch может быть использован согласно изобретению для лечения указанных заболеваний или инфекций. The list of diseases or infections that can be characterized as mediated by T cells can include one or more of the following: asthma, allergies, transplant rejection, autoimmune manifestations caused by an aberration tumor in the T cell system, and infectious diseases such as caused by plasmodium species, microfilariae, helminths, mycobacteria, HIV, cytomegalovirus, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza type B, causative agents of measles, hepatitis C or Toxicara. Thus, when using a suitable allergen or antigen, the Notch ligand can be used according to the invention for the treatment of these diseases or infections.

В изобретении также предусматривается способ, позволяющий обнаруживать иммуносупрессию, индуцированную поражающим организмом. Подобные организмы способны создавать растворимые формы из членов семейств Serrate, Notch и/или Delta или из их производных, или из белков, действующих на их экспрессию in vivo, индуцируя таким образом, инфекционную толерантность иммуносупрессии. Способ включает в себя анализ на присутствие in vivo немембраносвязанных Serrate, Delta, Notch или их производных и предпочтительно связан с антителами против Serrate, Delta или Notch или их производных. The invention also provides a method for detecting immunosuppression induced by an invading organism. Such organisms are capable of creating soluble forms from members of the Serrate, Notch and / or Delta families or from their derivatives, or from proteins acting on their expression in vivo, thus inducing infectious tolerance of immunosuppression. The method includes an in vivo assay for the presence of non-membrane bound Serrate, Delta, Notch or derivatives thereof, and is preferably coupled to antibodies against Serrate, Delta or Notch or their derivatives.

Применяемые методы скрининговых анализов для регистрации сниженной или повышенной экспрессии и/или процессинга Notch, Delta/Serrate, включают в себя:
1. Экспрессию Delta/Serrate, Notch и Fringe, устанавливаемую после экспозиции изолированных клеток с исследуемыми соединениями в культуре, например,
a) на белковом уровне посредством специфического окрашивания антител с использованием методов иммуногистохимии или проточной цитометрии,
b) на уровне РНК посредством количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой RT-PCR. RT-PCR может быть реализована при помощи контрольной плазмиды с заданными стандартами для измерения эндогенной экспрессии гена при помощи специфических для Notch 1 и Notch 2, Serrate 1 и Serrate 2, Delta 1 и Delta 2, Delta 3 и Fringe праймеров. Эта конструкция может быть модифицирована как только будут идентифицированы новые члены лигандной группы.The screening methods used to record reduced or increased expression and / or processing of Notch, Delta / Serrate include:
1. Expression of Delta / Serrate, Notch and Fringe, established after exposure of isolated cells with the studied compounds in culture, for example,
a) at the protein level through specific staining of antibodies using immunohistochemistry or flow cytometry,
b) at the RNA level by means of a quantitative polymerase chain reaction with reverse transcriptase RT-PCR. RT-PCR can be implemented using a control plasmid with specified standards for measuring endogenous gene expression using specific Notch 1 and Notch 2, Serrate 1 and Serrate 2, Delta 1 and Delta 2, Delta 3 and Fringe primers. This design can be modified as soon as new members of the ligand group are identified.

c) на функциональном уровне посредством анализа клеточной адгезии. c) at the functional level through cell adhesion analysis.

Повышенный уровень экспрессии Delta/Serrate или Notch должен приводить к усилению адгезии между клетками, экспрессирующими Notch, и его лигандами Delta/Serrate. Тестируемые клетки подвергаются частичной обработке в культуре, и выявляются меченные радиоактивными или флуоресцентными метками клетки-мишени (трансфицированные белком Notch/Delta/Serrate). Смеси клеток инкубируются при 37oС в течение 2 ч. Неприлипающие клетки смываются, и степень адгезии определяют по уровню, радиоактивности/иммунофлуоресценции на поверхности плашки.An increased level of expression of Delta / Serrate or Notch should lead to increased adhesion between cells expressing Notch and its Delta / Serrate ligands. The test cells undergo partial processing in culture, and the target cells (transfected with Notch / Delta / Serrate protein) labeled with radioactive or fluorescent tags are detected. Mixtures of cells are incubated at 37 ° C. for 2 hours. Non-adherent cells are washed off and the degree of adhesion is determined by the level of radioactivity / immunofluorescence on the plate surface.

Использование подобных методов позволяет выявлять соединения или лиганды Notch, нарушающие экспрессию или процессинг белка Notch или лиганда Notch. Изобретение также относится к соединениям или лигандам Notch, которые могут быть выявлены подобными аналитическими методами. Using such methods, it is possible to detect Notch compounds or ligands that disrupt the expression or processing of a Notch protein or Notch ligand. The invention also relates to Notch compounds or ligands that can be detected by similar analytical methods.

В сферу данного изобретения также входит способ анализа, включающий в себя контактирование (а) белка Notch и лиганда, способного связываться с белком Notch (b); и определение того, влияет ли соединение с на связывание лиганда с белком Notch, в особенности если белок Notch ассоциирован с Т-клеткой. The scope of the present invention also includes an assay method comprising contacting (a) a Notch protein and a ligand capable of binding to a Notch protein (b); and determining whether compound c affects ligand binding to the Notch protein, especially if the Notch protein is associated with a T cell.

Лигандами Notch согласно изобретению предпочтительно являются белки - члены семейств Delta или Serrate или их полипептиды, или их производные. Предпочтительно, чтобы они были получены стандартными рекомбинантными методами, хорошо известными специалистам в данной области. Соответствующие последовательности генов для образования подобных соединений согласно изобретению могут быть получены из публикаций, таких как WO 97/01571, WO 96/27610 и WO 92/19734. Однако изобретение не ограничивается последовательностями Notch, Delta и Serrate, обнаруженными в данных публикациях. Еще более предпочтительно, чтобы члены семейств Notch, Delta или Serrate, белки или полипептиды, или их производные являлись фрагментами внеклеточных доменов Notch, Delta или Serrate или членами их семейств, или производными подобных фрагментов. Здесь понятие "лиганд Notch" дополнительно включает в себя любой лиганд или член семейства лигандов, взаимодействующий с членом семейства белков Notch и включает в себя группу белков, относящуюся как к "топоритмическим белкам", т.е. белкам - продуктам генов Delta, Serrate, Deltex и Enhancer of split (энхансер сублокуса), так и к другим членам этого семейства генов, идентифицируемых благодаря способности их генных последовательностей гибридизоваться с или их гомологии белками Notch, Delta и Serrate, или способности их генов проявлять фенотипические взаимодействия. The Notch ligands of the invention are preferably proteins of the Delta or Serrate families or their polypeptides or their derivatives. Preferably, they are prepared by standard recombinant methods well known to those skilled in the art. Appropriate gene sequences for the formation of such compounds according to the invention can be obtained from publications such as WO 97/01571, WO 96/27610 and WO 92/19734. However, the invention is not limited to the Notch, Delta, and Serrate sequences found in these publications. Even more preferably, members of the Notch, Delta or Serrate families, proteins or polypeptides, or their derivatives, are fragments of the extracellular domains of Notch, Delta or Serrate or members of their families, or derivatives of similar fragments. As used herein, the term “Notch ligand” further includes any ligand or member of the ligand family that interacts with a member of the Notch protein family and includes a group of proteins referred to as “toporhythmic proteins”, i.e. proteins - products of the Delta, Serrate, Deltex and Enhancer of split genes (sublocus enhancer), as well as to other members of this family of genes identified by the ability of their gene sequences to hybridize with or their homology Notch, Delta and Serrate proteins, or the ability of their genes to display phenotypic interactions.

Notch, Delta или Serrate впервые были описаны у дрозофилы, и, следовательно, представляют собой белки-прототипы рецептора Notch и, соответственно, членов семейства лиганда Notch. Множественные белки и лиганды Notch в настоящий момент описаны у многих видов позвоночных и беспозвоночных, но их номенклатура может отличаться от таковой у мухи. Например, Notch является гомологом Lin 12 и Glp 1, Serrate/Delta являются гомологами Jagged, Apx1 и Lag-2. Notch, Delta or Serrate were first described in Drosophila and, therefore, are prototype Notch receptor proteins and, accordingly, members of the Notch ligand family. Multiple Notch proteins and ligands are currently described in many species of vertebrates and invertebrates, but their nomenclature may differ from that of a fly. For example, Notch is the homologue of Lin 12 and Glp 1; Serrate / Delta are the homologues of Jagged, Apx1, and Lag-2.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть составлены в соответствии с общеизвестными специалистам в данной области принципами. Таким образом, природа наполнителя и уровень активности будут зависеть от соединения согласно изобретению, которое должно быть введено в состав композиции. The pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in accordance with principles generally known to those skilled in the art. Thus, the nature of the excipient and the level of activity will depend on the compound according to the invention, which should be incorporated into the composition.

Предпочтительно, чтобы фармацевтические композиции были представлены в виде одноразовой дозировки. Preferably, the pharmaceutical compositions are presented in unit dosage form.

Дозировки соединений настоящего изобретения, назначаемые пациенту в виде фармацевтической композиции, могут быть определены лечащим врачом. Dosages of the compounds of the present invention administered to a patient in the form of a pharmaceutical composition may be determined by the attending physician.

Предпочтительным способом назначения композиции согласно изобретению является один из обычных способов, включающих внутримышечный и внутрибрюшинный, внутривенную инъекцию, интраназальную ингаляцию, легочную ингаляцию, введение подкожно, внутрикожно, внутрисуставно, внутриоболочковый, местный способы введения, а также способ введения через пищеварительный тракт (например, через пейеровы бляшки). A preferred method for administering the composition according to the invention is one of the usual methods, including intramuscular and intraperitoneal, intravenous injection, intranasal inhalation, pulmonary inhalation, subcutaneous, intradermal, articular, intrathecal, local routes of administration, as well as a route of administration through the digestive tract (e.g. Peyer's plaques).

Понятие "производное", используемое здесь в отношении белков или полипептидов настоящего изобретения, может включать в себя любое замещение, вариацию, модификацию, делецию, замену или добавку одного (или более) аминокислотного остатка в последовательности, при условии, что полученный белок или полипептид обладает способностью модулировать взаимодействия лигандов Notch-Notch. The term "derivative", as used herein with respect to the proteins or polypeptides of the present invention, may include any substitution, variation, modification, deletion, substitution or addition of one (or more) amino acid residue in the sequence, provided that the resulting protein or polypeptide has ability to modulate Notch-Notch ligand interactions.

Понятие "вариант", используемое здесь в отношении белков или полипептидов настоящего изобретения, может включать в себя любое замещение, вариацию, модификацию, замену, делецию или добавку одного (или более) аминокислотного остатка в последовательности, при условии, что полученный белок или полипептид обладает способностью модулировать взаимодействия лигандов Notch-Notch. The term "variant", as used here with respect to the proteins or polypeptides of the present invention, may include any substitution, variation, modification, substitution, deletion or addition of one (or more) amino acid residue in the sequence, provided that the resulting protein or polypeptide has ability to modulate Notch-Notch ligand interactions.

Понятие "аналог", используемое здесь в отношении белков или полипептидов настоящего изобретения, включает в себя любой пептидомиметик, который является химическим соединением, обладающим способностью модулировать взаимодействия лигандов Notch-Notch аналогично родительским белку или полипептиду. К ним относятся соединения, которые могут положительно или отрицательно влиять на экспрессию или активность белка Notch или лиганда Notch. The term “analogue” as used herein with respect to the proteins or polypeptides of the present invention includes any peptidomimetic that is a chemical compound that is capable of modulating Notch-Notch ligand interactions similarly to the parent protein or polypeptide. These include compounds that can positively or negatively affect the expression or activity of a Notch protein or Notch ligand.

Соединение может быть рассмотрено как модулирующее взаимодействие лигандов Notch-Notch, если оно способно либо подавлять, либо усиливать взаимодействие Notch с его лигандами, предпочтительно в достаточной для обеспечения терапевтической эффективности степени. A compound can be considered as a modulating interaction of Notch-Notch ligands if it is capable of either inhibiting or enhancing the interaction of Notch with its ligands, preferably to a degree sufficient to provide therapeutic efficacy.

Под экспрессией "лиганда Notch-Notch" здесь подразумевается взаимодействие между членом семейства Notch и лигандом, способным связывать один или более подобных членов. By the expression “Notch-Notch ligand” is meant an interaction between a member of the Notch family and a ligand capable of binding one or more such members.

Понятие терапии, используемое здесь, охватывает диагностические и профилактические мероприятия. The concept of therapy used here encompasses diagnostic and preventative measures.

Понятие "медицинский" включает в себя применение в ветеринарии и к человеку. The term "medical" includes application in veterinary medicine and to humans.

Здесь понятия белок и полипептид могут быть приняты как синонимы, при этом понятие белок обычно чаще используется для обозначения относительно более длинной аминокислотной последовательности, чем у полипептида. Here, the concepts of protein and polypeptide can be taken as synonyms, and the term protein is usually used more often to refer to a relatively longer amino acid sequence than the polypeptide.

Далее настоящее изобретение будет описано неограничивающими примерами со ссылкой на соответствующие чертежи, в которых:
на фигуре 1 показаны результаты гибридизации in situ, выполненной, как описано в примере 1;
на фигуре 2 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 4;
на фигуре 3 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 5;
на фигуре 4 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 6;
на фигуре 5 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 7;
на фигуре 6 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 8;
на фигуре 7 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 9;
на фигурах 8а и 8b показаны результаты эксперимента, описанного в примере 10;
на фигуре 9 показаны результаты эксперимента, описанного в примере 11.The present invention will now be described by non-limiting examples with reference to the relevant drawings, in which:
figure 1 shows the results of in situ hybridization performed as described in example 1;
figure 2 shows the results of the experiment described in example 4;
figure 3 shows the results of the experiment described in example 5;
figure 4 shows the results of the experiment described in example 6;
figure 5 shows the results of the experiment described in example 7;
figure 6 shows the results of the experiment described in example 8;
figure 7 shows the results of the experiment described in example 9;
Figures 8a and 8b show the results of the experiment described in Example 10;
figure 9 shows the results of the experiment described in example 11.

Пример 1
Notch, Delta и Serrate экспрессируются в периферической иммунной системе.Example 1
Notch, Delta and Serrate are expressed in the peripheral immune system.

Антисмысловые пробы РНК, специфичные для Notch 1, Delta 1 и Serrate 1, были синтезированы и включены с меченным дигоксигенином UTP. Каждая проба была растворена в гибридизационном буфере, нагретом до 70oС в течение 5-10 мин, и добавлена к покрытым TESPA микроскопическим препаратам, содержащим 10 мм среды селезенки и тимуса, которые предварительно были фиксированы в 4% р-ре параформальдегида + PBS. Микроскопические препараты были гибридизованы в течение ночи при 65oС. На следующий день эти препараты дважды промывали при 65oС и дважды - при комнатной температуре (КТ) 1хSSС/50%формамид/0,1%твин-20. Микроскопические препараты промывали дважды (МАВТ)-буфером 0,1М малеиновой кислотой /0,15М NaCl/0,1% твин-20, рН 7,5, при КТ, и затем блокированы на 2 ч МАВТ + 20% козьей сыворотки + 296-блокирующий реагент Берингера (BBR). Микропрепараты инкубировали в течение ночи при КТ с антидигоксигениновыми Fаb-фрагментами. После 4 промываний МАВТ микропрепараты промывали еще 2 раза в щелочном субстратном буфере. Наличие связанных проб антисмысловой РНК определяли посредством инкубации микропрепаратов в темноте в субстратном буфере, содержащем NBT + BCIP. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и закрепляли в среднем закрепителе Depx.Antisense RNA samples specific for Notch 1, Delta 1, and Serrate 1 were synthesized and included with labeled digoxigenin UTP. Each sample was dissolved in a hybridization buffer heated to 70 ° C. for 5-10 minutes and added to TESPA-coated microscopic specimens containing 10 mm of spleen and thymus, which were previously fixed in 4% paraformaldehyde + PBS. Microscopic preparations were hybridized overnight at 65 ° C. The next day, these preparations were washed twice at 65 ° C. and twice at room temperature (CT) 1xSSC / 50% formamide / 0.1% tween-20. Microscopic preparations were washed twice (MAHT) with 0.1 M maleic acid / 0.15 M NaCl / 0.1% Tween-20 buffer, pH 7.5, at CT, and then blocked for 2 hours with MAHT + 20% goat serum + 296 Beringer blocking reagent (BBR). The micropreparations were incubated overnight at CT with antidigoxygenin F AB fragments. After 4 washes with MABT, micropreparations were washed 2 more times in alkaline substrate buffer. The presence of bound antisense RNA samples was determined by incubation of micropreparations in the dark in a substrate buffer containing NBT + BCIP. The micropreparations were stained with hematoxylin and fixed in the middle fixative Depx.

Результаты
Результаты данных по гибридизации приведены на фигуре 1, где показано, что в селезенке трехмесячной мыши Delta и Serrate экспрессировались изолированными клетками в периартериолярном влагалище, но не в зародышевом центре (ЗЦ). Notch экспрессировался во множестве клеток, опять же в периартериолярном влагалище.results
The results of hybridization data are shown in Figure 1, which shows that in the spleen of a three-month-old mouse, Delta and Serrate were expressed by isolated cells in the periarterial vagina, but not in the germinal center (GC). Notch was expressed in a variety of cells, again in the periarteriolar vagina.

Пример 2
Получение слитого белка Delta-Fc
Вектор экспрессии pIG-1 [D.Simmons, "Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells", pp. 93-128, Cellular Interactions in Development Ed. D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] позволяет получать слитый белок, содержащий внеклеточную часть Delta 1, связанную с IgGl-Fc-доменом человека. Фрагмент фермента рестрикции, содержащий только внеклеточный домен белка Delta 1, клонирован в вектор pIG-1, Полученная плазмида была трансформирована в МС 1061 E. coli и выращена в SOB, содержащем 10 мкг/мл тетрациклина/ампициллина. Очищенный вектор использовали для трансфекции клеток COS in vitro. Клетки COS выращивали до 50-75% конфлюэнтности и были трансфицированы 10 мкг плазмидной ДНК на чашку методом DEAE-декстран. Через 24 ч после трансфекции культуральную среду заменяли на среду, содержащую 1% FCS, клетки культивировали еще 3-6 дней in vitro. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об/мин до осаждения клеточных обломков и образования клеточного осадка, супернатант удаляли и сохраняли для последующих опытов. Слияние Delta-Fc очищали от культуральных супернатантов добавлением 2 мл 50% смеси протеин-сефарозы (Pharmacia) и перемешивали в течение ночи при 4oС. Гранулы сефарозы удаляли, пропуская культуральные супернатанты через 0,45 мм фильтр, отмывали и переносили в 10 мл пластиковую колонку. Слитую конструкцию Delta-Fc элюировали 2 мл элюционного буфера, рН 4,0. Элюат дополнительно нейтрализовали добавлением 1М трис.Example 2
Obtaining fused protein Delta-F c
The expression vector pIG-1 [D. Simmons, "Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells", pp. 93-128, Cellular Interactions in Development Ed. D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] allows to obtain a fusion protein containing the extracellular part of Delta 1, associated with human IgGl-F c- domain. A restriction enzyme fragment containing only the extracellular domain of Delta 1 protein was cloned into pIG-1 vector. The resulting plasmid was transformed into E. coli MS 1061 and grown in SOB containing 10 μg / ml tetracycline / ampicillin. The purified vector was used for transfection of COS cells in vitro. COS cells were grown to 50-75% confluency and were transfected with 10 μg of plasmid DNA per dish using DEAE-dextran. 24 hours after transfection, the culture medium was replaced with a medium containing 1% FCS, the cells were cultured for another 3-6 days in vitro. Cells were centrifuged for 5 min at 5000 rpm until the cell debris precipitated and a cell pellet formed, the supernatant was removed and stored for subsequent experiments. Fusion Delta-F c was purified from culture supernatants by adding 2 ml of a 50% protein sepharose mixture (Pharmacia) and stirred overnight at 4 ° C. Sepharose granules were removed by passing the culture supernatants through a 0.45 mm filter, washed and transferred to 10 ml plastic column. The Delta-F c fusion was eluted with 2 ml of elution buffer, pH 4.0. The eluate was further neutralized by the addition of 1M Tris.

Пример 3
Примеры моделей, в которых можно исследовать сигналирование лиганда Notch
Периферическая толерантность к собственным антигенам может быть исследована в Т-клеточном рецепторе (TCR) трансгенных мышей, у которых лиганд TCR экспрессирован как собственный антиген только на периферии. Периферическая толерантность к трансплантационным антигенам может быть вызвана несколькими путями, включая преобработку реципиента антителами против Т-клеток или блокаду костимуляции. Посредством этого становится возможным продемонстрировать как связанную супрессию, так и инфекционную толерантность. Периферическая толерантность к аллергенам может быть индуцирована интраназальным введением выделенных из аллергена белков. Экспрессию лигандов Notch-Notch измеряли на клетках, взятых из воздухоносных путей и/или из лимфоидных тканей, прилежащих к областям ингаляции аллергена, и выявили изменения в толерантности. Более того, в экспериментальных моделях заражения инфекционными агентами экспрессия лигандов Notch-Notch может быть измерена в организме (патогенном) и в иммунокомпетентных клетках хозяина.Example 3
Examples of models in which Notch ligand signaling can be investigated
Peripheral tolerance to native antigens can be investigated in the T cell receptor (TCR) of transgenic mice in which the TCR ligand is expressed as a native antigen only at the periphery. Peripheral tolerance to transplant antigens can be caused in several ways, including the conversion of the recipient with anti-T cell antibodies or blockade of costimulation. Through this, it becomes possible to demonstrate both associated suppression and infectious tolerance. Peripheral tolerance to allergens can be induced by intranasal administration of proteins derived from the allergen. The expression of Notch-Notch ligands was measured on cells taken from the airways and / or from lymphoid tissues adjacent to the allergen inhalation areas, and changes in tolerance were detected. Moreover, in experimental models of infection with infectious agents, expression of Notch-Notch ligands can be measured in the body (pathogenic) and in immunocompetent host cells.

Пример 4
Экспрессирующие Delta гибридомы могут подавлять ответы примированных антигеном лимфоцитов
Мышей иммунизировали синтетическим пептидом, содержащим иммунодоминантный эпитоп аллергена домашнего пылевого клеща (НДМ), Der p1 (p110-131), или овальбумином (OVA, белок куриного яйца). Через неделю клетки лимфатических узлов (клетки ЛУ) выделяли и из них получали клеточные суспензии. Лимфатические узлы животных, иммунизированных другими антигенами, хранили отдельно. Эти клетки были названы примированными клетками ЛУ.Example 4
Delta Expressing Hybridomas May Suppress Antigen-Primed Lymphocyte Responses
Mice were immunized with a synthetic peptide containing an immunodominant epitope of a house dust mite allergen (NDM), Der p1 (p110-131), or ovalbumin (OVA, chicken egg protein). After a week, lymph node cells (LN cells) were isolated and cell suspensions were obtained from them. The lymph nodes of animals immunized with other antigens were stored separately. These cells were called the primed LU cells.

Т-клеточные гибридомы также транфицировали полноразмерной Delta или контрольной плазмидой, такой, чтобы Delta экспрессировалась как мембранный белок. Через два дня культивирования гибридомы облучали, чтобы предотвратить их пролиферацию или продукцию цитокинов. Таким образом, единственный ответ, который был измеряем в анализе, исходил только из клеток лимфатических узлов. T cell hybridomas were also transfected with a full-length Delta or control plasmid, such that Delta is expressed as a membrane protein. After two days of cultivation, the hybridomas were irradiated to prevent their proliferation or cytokine production. Thus, the only response that was measurable in the analysis came only from lymph node cells.

Облученные гибридомы добавляли в увеличенном количестве в культуры, содержащие примированные клетки ЛУ. Надлежащий антиген (напр., р110-131 или OVA) добавляли в клеточную культуру на 24 часа. Супернатанты затем собирали и определяли содержание IL-2 (главный фактор роста Т-клеток). Пролиферативный ответ клеток лимфатических узлов также измеряли через 72 часа. Irradiated hybridomas were added in an increased amount to cultures containing primed LU cells. The appropriate antigen (e.g., p110-131 or OVA) was added to the cell culture for 24 hours. Supernatants were then collected and the content of IL-2 (the main T-cell growth factor) was determined. The proliferative response of lymph node cells was also measured after 72 hours.

Результаты: клетки лимфатических узлов, культивируемые в присутствии облученных гибридом, экспрессирующих контрольную плазмиду, продолжали пролиферировать, как показано на фигуре 2, и секретировали IL-2, когда стимулировались в культуре надлежащим антигеном. Их способность к ответу поддерживалась в соотношении 1:1 клетки ЛУ:гибридома. Напротив, пролиферативный ответ и продукция IL-2 клетками лимфоузлов снизилась на 88% при культивировании в присутствии гибридом, экспрессирующих полноразмерную Delta (в соотношении 1: 1), с соответствующим антигеном. Гибридомы трансфицировали контрольным вирусом (пустые кружки), Delta вирусом (пустые квадраты). На фигуре 2 приведены данные счета радиоактивности в минуту (cрm) метки 3H-Tdr, включенной за 72 часа с начала роста культуры. Счет/мин для клеток лимфатических узлов, выращиваемых в присутствии гибридом, экспрессирующих Delta или контрольные конструкции. Общее число клеток на лунку = 4•105 (т.е. количество клеток лимфоузла варьирует, в зависимости от отношения гибридом к клеткам ЛУ, т.о., cрm будет варьировать). Клетки ЛУ p110-131 являются клетками, примированными Der p1 (p110-131), OVA-клетки ЛУ являются клетками, примированными OVA. 2BB11 и 2ВСЗ являются двумя различными Der p1-гибридомами.Results: lymph node cells cultured in the presence of irradiated hybridomas expressing the control plasmid continued to proliferate as shown in Figure 2 and secreted IL-2 when stimulated in culture with the appropriate antigen. Their responsiveness was maintained at a 1: 1 ratio of LU: hybridoma cells. In contrast, the proliferative response and IL-2 production by lymph node cells decreased by 88% when cultured in the presence of hybridomas expressing full-length Delta (1: 1 ratio) with the corresponding antigen. Hybridomas were transfected with the control virus (empty circles), Delta virus (empty squares). The figure 2 shows the data of the account of radioactivity per minute (CPM) label 3 H-Tdr, included 72 hours from the beginning of the growth of the culture. Count / min for lymph node cells grown in the presence of hybridomas expressing Delta or control constructs. The total number of cells per well = 4 • 10 5 (that is, the number of lymph node cells varies, depending on the ratio of hybridomas to LN cells, that is, the cpm will vary). LU p110-131 cells are Der p1-primed cells (p110-131), LU OVA cells are OVA-primed cells. 2BB11 and 2BCC are two different Der p1 hybridomas.

Эти данные показывают, что ингибирование ответов экспрессирующими Delta Т-клетками может быть отсрочено. Несмотря на то, что в этой культуральной системе Т-гибридомы, экспрессирующие Delta и специфичные в отношении Der р1, проявляли способность ингибировать ответ примированных OVA Т-клеток, эта кажущаяся потеря специфичности, по всей видимости, обусловлена непосредственной близостью с клетками, усиленными в культуральной системе. Действительно, данные представленные на фигурах 8а и 8b, показывают, что у животных гибридомы, экспрессирующие Delta, должны проявлять антигенную специфичность с иммуногеном, для которого имеет место модуляционный эффект на иммунный ответ на этот иммуноген. В этом случае вероятно, что Т-клетки, экспрессирующие Delta, могут оказаться в непосредственной близости только с отвечающими Т-клетками, если они распознают один и тот же антиген на одной и той же АП-клетке. These data indicate that inhibition of responses by Delta-expressing T cells may be delayed. Despite the fact that in this culture system, T-hybridomas expressing Delta and specific for Der p1 showed the ability to inhibit the response of the primed OVA T cells, this apparent loss of specificity is most likely due to the close proximity to cells amplified in the culture system. Indeed, the data presented in figures 8a and 8b show that in animals hybridomas expressing Delta must exhibit antigenic specificity with the immunogen, for which there is a modulation effect on the immune response to this immunogen. In this case, it is likely that T cells expressing Delta can be in close proximity only with responding T cells if they recognize the same antigen on the same AP cell.

Пример 5
Дендритные клетки, экспрессирующие Serrate, предотвращают примирование антигеном Т-лимфоцитов
Дендритные клетки (ДК) являются основными антиген-представляющими клетками в иммунной системе и незаменимы при стимуляции Т-клеточного ответа. ДК получали из селезенки и трансфицировали либо ретровирусом, в результате чего происходит экспрессия полноразмерного белка Serrate, либо контрольным ретровирусом. Также ДК в течение 3 часов непрерывно взбалтывали с белком HDM p110-131 при температуре 37oС in vitro. Затем ДК промывали и использовали для иммунизации интактных мышей, вводя подкожно 105 клеток/мышь. Через 7 дней выходящие клетки ЛУ собирали и повторно стимулировали в культуре пептидом, 4•105 клеток/лунку. Поскольку мыши были иммунизированы только дендритными клетками, обработанными белком при взбалтывании, это дало нам возможность оценить способность этих клеток к примированию иммунного ответа.Example 5
Serrate Expressing Dendritic Cells Prevent T Cell Antigen Primation
Dendritic cells (DCs) are the main antigen-presenting cells in the immune system and are indispensable in stimulating the T-cell response. DC was obtained from the spleen and transfected either with a retrovirus, resulting in the expression of the full-length Serrate protein, or with a control retrovirus. Also, DC for 3 hours was continuously shaken with protein HDM p110-131 at a temperature of 37 o C in vitro. The DCs were then washed and used to immunize intact mice by subcutaneous injection of 10 5 cells / mouse. After 7 days, emerging LU cells were harvested and re-stimulated in culture with a peptide, 4 × 10 5 cells / well. Since mice were only immunized with dendritic cells treated with protein with shaking, this enabled us to evaluate the ability of these cells to primate the immune response.

Результаты: на фигуре 3 приведены данные счета радиоактивности в минуту в клетках ЛУ, выделенных через 72 часа из культуры; эти клетки были получены у животных, иммунизированных контрольными трансфицированными (пустые кружки) или трансфицированными Serrate (пустые квадраты) дендритными клетками (ДК). Results: figure 3 shows the data of the account of radioactivity per minute in LU cells isolated after 72 hours from the culture; these cells were obtained from animals immunized with control transfected (empty circles) or transfected Serrate (empty squares) dendritic cells (DCs).

Иммунизация мышей экспрессирующими Serrate дендритными клетками привела к 10-кратному уменьшению числа клеток, полученных из лимфатических узлов, по сравнению с иммунизацией контрольными ДК. Кроме того, мы обнаружили, что клетки ЛУ мышей, иммунизированных ДК+Serrate, не проявляли пролиферативной активности (93% снижение относительно контрольных значений, фигура 3) и не секретировали IL-2 по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными ДК. Immunization of mice with Serrate-expressing dendritic cells resulted in a 10-fold decrease in the number of cells obtained from the lymph nodes compared to immunization with control DCs. In addition, we found that LU cells of mice immunized with DC + Serrate did not show proliferative activity (93% decrease relative to control values, Figure 3) and did not secrete IL-2 compared to mice immunized with control DCs.

Пример 6
Экспрессирующие Delta Т-клеточные гибридомы способны ингибировать развитие иммунитета к Per p1-антигену у животных
Т-клеточные гибридомы (реактивные с Der p1) трансфицировали ретровирусом, содержащим Delta мыши, такой, что Delta был экспрессирован на поверхности клетки или с контрольным ретровирусом. С57 BL-мышам вводили внутрибрюшинно 10 млн. облученных гибридом и подкожно иммунизировали 50 мкг Der р1, эмульгированном в полном адъюванте Фрейнда (CFA). Через 7 дней собирали выходящие из лимфатических узлов клетки и выращивали их в количестве 4•105 клеток/лунку в присутствии Der р1 (10 мкг/мл), пептида 110-131 Der р1 (10 мкг/мл) или пептида 81-102 Der p1 (10 мкг/мл). Культуры инкубировали в течение 72 часов при 37oС и за 8 часов до конца инкубации добавляли меченный тритием тимидин. Результаты анализов пролиферации клеток животных, инъецированных контрольно трансфицированными (puro) или трансфицированными Delta (Delta-FL), показаны на фигуре 4.Example 6
Delta-expressing T-cell hybridomas are able to inhibit the development of immunity to Per p1 antigen in animals
T cell hybridomas (reactive with Der p1) were transfected with a retrovirus containing mouse Delta, such that Delta was expressed on the cell surface or with a control retrovirus. C57 BL mice were injected intraperitoneally with 10 million irradiated hybridomas and immunized subcutaneously with 50 μg Der p1 emulsified in Freund's complete adjuvant (CFA). After 7 days, cells emerging from the lymph nodes were harvested and grown in an amount of 4 × 10 5 cells / well in the presence of Der p1 (10 μg / ml), peptide 110-131 Der p1 (10 μg / ml) or 81-102 Der p1 (10 μg / ml). The cultures were incubated for 72 hours at 37 ° C. and tritiated thymidine was added 8 hours before the end of the incubation. The results of cell proliferation assays of animals injected with control transfected (puro) or transfected Delta (Delta-FL) are shown in Figure 4.

Результаты: клетки ЛУ животных, инъецированных контрольными вирус-трансфицированными гибридомами, продуцировали высокие уровни IL-2 и пролиферировали в культуре в присутствии Der p1, пептида 110-131 или пептида 81-102. И наоборот, клетки животных, инъецированных гибридомами, экспрессирующими Delta, не отвечали ни на один из Der р1 антигенов (фиг.4). Results: LU cells of animals injected with control virus-transfected hybridomas produced high levels of IL-2 and proliferated in culture in the presence of Der p1, peptide 110-131 or peptide 81-102. Conversely, animal cells injected with Delta expressing hybridomas did not respond to any of the Der p1 antigens (Figure 4).

Пример 7
Экспрессирующие Delta Т-клетки человека могут блокировать ответ нормальных Т-клеток
Реактивный к гриппу клон Т-клеток (НА1.7) человека трансфицировали мышиным Delta, используя ретровирусную конструкцию, чтобы белок Delta экспрессировался на клеточной поверхности. Смешивание этой клеточной популяции с нормальными НА1.7 предотвращало дальнейшую реактивность этих нормальных НА1.7 с пептидом НА306-318 и с антиген-представляющими клетками. НА1.7 в количестве 5•105 смешали с 1•106 облученных DRB1*0101 мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) + 1 мкг НА306-318 и культивировали при 37oС. Через 6 часов добавляли 5% лимфокультуру (среду, содержащую IL-2) до общего объема 1 мл. Через 24 часа после инициации культуры добавляли Delta или контрольный ретровирус, или не добавляли ничего. Через 7 дней после начала культивирования клетки собирали, отмывали, и трансфицированные клетки облучали. Трансфицированные клетки смешивали в соотношении 2:1 с необработанными НА1.7 и культивировали в течение 2 дней. Затем смешанные культуры собирали, отмывали и переносили на плашки в количестве 2•104 жизнеспособных клеток на лунку вместе с:
a) 2,5•104 DRB1*0101 PBMCs (среда)
b) 2,5•104 DRB1*0101 PBMCs + пептид (Аg+АП-клетки)
c) 5% лимфокультурой (IL-2)
Клетки собирали через 68 часов, последние 8 часов клетки культивировали в присутствии меченного тритием тимидина.Example 7
Human Delta T cells can block the response of normal T cells
The human flu-reactive T cell clone (HA1.7) was transfected with murine Delta using a retroviral construct so that the Delta protein is expressed on the cell surface. Mixing this cell population with normal HA1.7 prevented further reactivity of these normal HA1.7 with the HA306-318 peptide and with antigen-presenting cells. HA1.7 in an amount of 5 • 10 5 was mixed with 1 • 10 6 irradiated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) + 1 μg of HA306-318 DRB1 * 0101 and cultured at 37 ° C. After 6 hours, 5% lymph culture was added (medium containing IL-2) to a total volume of 1 ml. 24 hours after culture initiation, Delta or control retrovirus was added, or nothing was added. 7 days after the start of cultivation, cells were harvested, washed, and transfected cells were irradiated. Transfected cells were mixed in a 2: 1 ratio with untreated HA1.7 and cultured for 2 days. Then mixed cultures were collected, washed and transferred onto plates in an amount of 2 • 10 4 viable cells per well along with:
a) 2.5 • 10 4 DRB1 * 0101 PBMCs (medium)
b) 2.5 • 10 4 DRB1 * 0101 PBMCs + peptide (Ag + AP cells)
c) 5% lymphatic culture (IL-2)
Cells were harvested after 68 hours, the last 8 hours, cells were cultured in the presence of tritiated thymidine.

Результаты показаны на фигуре 5. The results are shown in figure 5.

Результаты
Описываемая культура как таковая или после трансфекции контрольным вирусом НА1.7; необработанные НА1.7 дают хорошую ответную реакцию на белок + антиген-представляющие клетки. Инкубация в присутствии Delta-трансфицированных облученных НА1.7 полностью препятствует ответу необработанных НА1.7 на антиген + АП-клетки. Однако такие клетки дают такой же хороший ответ на IL-2, как и необработанные или инкубированные с контрольным вирусом клетки НА1.7, что показывает, что они просто не способны к пролиферации (фиг.5).results
The described culture as such or after transfection with the control HA1.7 virus; untreated HA1.7 give a good response to protein + antigen-presenting cells. Incubation in the presence of Delta-transfected irradiated HA1.7 completely inhibits the response of untreated HA1.7 to antigen + AP cells. However, such cells give the same good response to IL-2 as untreated or incubated with the control virus HA1.7 cells, which indicates that they are simply not capable of proliferation (Fig. 5).

Пример 8
Экспрессия Serrate антиген-представляющими клетками препятствует Т-клеточным ответам
Клон НА1.7 смешивали с пептидом НА306-318 (1,0 мкг/мл) в присутствии L-клеток, экспрессирующих HLA-DRB1*0101 (как антиген-представляющие клетки), используя 2•104 клеток каждого типа. L-клетки трансфицировали либо контрольным (puro), либо Serrate (Serrate L-клетки)- экспрессирующим ретровирусом. Пролиферативный ответ измеряли через 72 часа, последние 8 часов культивирование проводили в присутствии меченного тритием тимидина. Результаты даны на фигуре 6 для культур НА1.7:
a) без добавок
b) HL-2
c) + пептид + DRВ1*0101-L-клетки
d) + пептид + DRВ1*0101-L-клетки, трансфицированные контрольным вирусом
е) + пептид + DRВ1*0101-L-клетки, трансфицированные вирусом Serrate
Результаты: НА1.7, стимулированные L-клетками, экспрессирующими Serrate, демонстрировал слабый ответ на антиген по сравнению с таковыми, стимулированными контрольно трансфицированными L-клетками (фиг.6).Example 8
Serrate expression by antigen-presenting cells interferes with T-cell responses
Clone HA1.7 was mixed with the HA306-318 peptide (1.0 μg / ml) in the presence of L cells expressing HLA-DRB1 * 0101 (as antigen presenting cells) using 2 × 10 4 cells of each type. L-cells were transfected with either control (puro) or Serrate (Serrate L-cells) expressing retrovirus. The proliferative response was measured after 72 hours, the last 8 hours, cultivation was carried out in the presence of tritiated thymidine. The results are given in figure 6 for crops HA1.7:
a) no additives
b) HL-2
c) + peptide + DRB1 * 0101-L-cells
d) + peptide + DRB1 * 0101-L cells transfected with a control virus
f) + peptide + DRB1 * 0101-L cells transfected with Serrate virus
Results: HA1.7 stimulated with L-cells expressing Serrate showed a weak antigen response compared to those stimulated with control transfected L-cells (Fig. 6).

Пример 9
Экспрессирующие Serrate антиген-представляющие клетки индуцируют регуляторные Т-клетки
Клон НА1.7 смешивали с пептидом НА306-318 и L-клетками (экспрессирующими DRB1*0101 как антиген-представляющие клетки) в присутствии 2% IL-2. L-клетки трансфицировали либо контрольным, либо Serrate - экспрессирующим ретро-вирусом. Через 7 дней культивирования клетки НА1.7 собирали, промывали и облучали перед тем как смешать со свежими НА1.7 (используя по 2•104 клеток каждой популяции). Затем клетки культивировали еще 2 дня перед стимуляцией пептидом (10 мкг/мл) + нормальные антиген-представляющие клетки (DRB1*0101 PBMCs). Пролиферативный ответ оценивали через 72 часа после начала культивирования, причем за 8 часов до конца культивирования вводили 3H-тимидин. Результаты приведены на фиг. 7 для свежекультивированных клеток НА1.7:
a) без добавок
b) + IL-2
c) + контрольные вирус-индуцированные НА1.7, затем пептид + DRB1*1010 PBMC
d) + Serrate - вирус-индуцированные НА1.7, затем пептид + DRB1*0101 PBMC
Результаты: НА1.7, индуцированные Serrate-экспрессирующими L-клетками (Serrate-индуцированные НА1.7), утрачивали способность нормальных клеток НА1.7 отвечать на нормальный антигенный стимул (фиг.7). Это указывает на способность клеток, ставших толерантными под действием Serrate, преодолевать их толерантность, превращаясь в популяцию нативных клеток (инфекционная/перенесенная толерантность).Example 9
Serrate-expressing antigen-presenting cells induce regulatory T cells
Clone HA1.7 was mixed with HA306-318 peptide and L-cells (expressing DRB1 * 0101 as antigen-presenting cells) in the presence of 2% IL-2. L cells were transfected with either a control or Serrate expressing retro virus. After 7 days of cultivation, HA1.7 cells were harvested, washed and irradiated before being mixed with fresh HA1.7 (using 2 • 10 4 cells of each population). Then, the cells were cultured another 2 days before stimulation with the peptide (10 μg / ml) + normal antigen-presenting cells (DRB1 * 0101 PBMCs). The proliferative response was evaluated 72 hours after the start of cultivation, and 8 H before the end of cultivation, 3 H-thymidine was administered. The results are shown in FIG. 7 for freshly cultured HA1.7 cells:
a) no additives
b) + IL-2
c) + control virus-induced HA1.7, then peptide + DRB1 * 1010 PBMC
d) + Serrate - virus-induced HA1.7, then peptide + DRB1 * 0101 PBMC
Results: HA1.7 induced by Serrate-expressing L-cells (Serrate-induced HA1.7) lost the ability of normal HA1.7 cells to respond to a normal antigenic stimulus (Fig. 7). This indicates the ability of cells that have become tolerant under the action of Serrate to overcome their tolerance, turning into a population of native cells (infectious / transferred tolerance).

Пример 10
Регуляция, индуцируемая Delta-экспрессирующими Т-клетками, является антигеноспецифической
Мышам вводили 107 клеток Т-клеточной гибридомы, трансдуцированной Delta или контрольным ретровирусом. Эта гибридома 2ВС3 обладает специфичностью к белку 110-131 Der р1. В то же время животные получали либо Der р1, либо овальбумин, эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда. Через 7 дней клетки лимфатических узлов удаляли, и 4•105 клеток культивировали в присутствии Der р1 или овальбумина (т.е. использовался тот же антиген, каким они уже были иммунизированы). Продукцию IL-2 измеряли через 24 часа после начала культивирования. Индексы стимуляции продукции IL-2 показаны на фигуре 8а (ответы животных, иммунизированных Der р1) и на фигуре 8b (ответы животных, иммунизированных ОBА) у животных, которым инъецировали гибридомы, трансфицированные контрольным (puro) или Delta (delta)-ретровирусами.Example 10
Regulation Induced by Delta Expressing T Cells is Antigen-Specific
Mice were injected with 10 7 cells of a T-cell hybridoma transduced with Delta or control retrovirus. This hybridoma 2BC3 has specificity for the protein 110-131 Der p1. At the same time, the animals received either Der p1 or ovalbumin emulsified in Freund's complete adjuvant. After 7 days, lymph node cells were removed, and 4 x 10 5 cells were cultured in the presence of Der p1 or ovalbumin (ie, the same antigen was used as they were already immunized). IL-2 production was measured 24 hours after the start of cultivation. The stimulation indices of IL-2 production are shown in Figure 8a (responses of animals immunized with Der p1) and Figure 8b (responses of animals immunized with OBA) in animals injected with hybridomas transfected with control (puro) or Delta (delta) retroviruses.

Результаты: ответ на Der р1 у животных, которым были введены гибридомы delta, экспрессирующие 2ВС3, был практически полностью подавлен, тогда как ответ на овальбумин был незатронут. Это показано на фиг.8а и 8b, где каждая точка представляет собой продукцию IL-2 у каждой отдельной мыши на антиген как индекс стимуляции (ИС) контрольных ответов (без добавления антигена). Results: The response to Der p1 in animals that were introduced with delta hybridomas expressing 2BC3 was almost completely suppressed, while the response to ovalbumin was unaffected. This is shown in figa and 8b, where each point represents the production of IL-2 in each individual mouse on the antigen as an index of stimulation (IP) of control responses (without adding antigen).

Пример 11
Т-клетки экспрессируют Delta в процессе индукции толерантности
НА1.7 культивировали в присутствии пептида НА306-318 (50 мкг/мл) в отсутствие АП-клеток. Подобные условия использовались с целью развития в НА1.7 толерантности. По прошествии 0, 30, 120, 240 или 360 минут клетки (1,5•106) собирали в капсулы и замораживали. РНК получали из клеточных осадков путем гомогенизации в растворе гуанидина тио-цианата и затем центрифугированием в плотности CsCl. 1 мкг РНК превращали в кДНК при помощи олигопраймера dT. Из полученной кДНК 1/20 подвергли PCR (40 циклов), используя специфические для delta-гомолога человека праймеры. Образцы PCR анализировали посредством гель-электрофореза (фигура 9), где: дорожка 1 - маркер, дорожка 2 - t=0 мин, дорожка 3 - t=30 мин, дорожка 4 - t=120 мин, дорожка 5 - t=240 мин, дорожка 6 - t=360 мин, дорожка 7 - негативный контроль.Example 11
T cells Express Delta during tolerance induction
HA1.7 was cultured in the presence of the peptide HA306-318 (50 μg / ml) in the absence of AP cells. Similar conditions were used to develop tolerance in HA1.7. After 0, 30, 120, 240, or 360 minutes, the cells (1.5 x 10 6 ) were collected in capsules and frozen. RNA was obtained from cell pellets by homogenization in a solution of thiocyanate guanidine and then centrifugation in CsCl density. 1 μg of RNA was converted to cDNA using the oligoprimer dT. Of the obtained cDNA, 1/20 was subjected to PCR (40 cycles) using primers specific for the human delta homolog. PCR samples were analyzed by gel electrophoresis (figure 9), where: lane 1 - marker, lane 2 - t = 0 min, lane 3 - t = 30 min, lane 4 - t = 120 min, lane 5 - t = 240 min , lane 6 - t = 360 min, lane 7 - negative control.

Результаты
Покоящиеся НА1.7 не экспрессировали Delta-мРНК, но транскрипты появлялись по прошествии 2 часов после начала развития схемы по инициации толерантности.results
The resting HA1.7 did not express Delta mRNA, but transcripts appeared 2 hours after the start of the development of a tolerance initiation scheme.

Пример 12
Анализы экспрессии Notch 1, Serrate 1 и Delta 1 в процессе индукции толерантности иммуногистологическим методом и методом гибридизации in situ
Мышам С57 BL/6J интраназально вводили либо 100 мкг 110-131 белка Der p1, либо контрольный раствор (солевой фосфатный буфер, PBS) в течение 3 дней последовательно. Показано, что интраназальное введение антигена подобным способом приводит к развитию невосприимчивости к данному антигену. Некоторую часть животных оставляли на две недели до повторного введения 50 мкг антигена Der p1 CFA подкожно в основание хвоста. Поверхностные лимфатические узлы и селезенки животных с этого времени выделяли через различные промежутки времени (d0 есть первый день введения антигена или повторной иммунизации) и использовали в иммуногистологических исследованиях или для гибридизации in situ. Для иммуногистологических исследований ткани замораживали и делали тонкие 3 мкм срезы, которые фиксировали в ледяном ацетоне и метили поликлональными антителами, специфичными к Notch 1 или Serrate 1. Связанные антитела определяли при помощи пероксидазы хрена, конъюгированной с козьими антикроличьими антителами, полученными в присутствии диаминобензидина в качестве субстрата. Антитела, специфичные к Delta 1, в исследованиях не применяли. Для гибридизации in situ делали срезы замороженных тканей и фиксировали их в 4% параформальдегиде. Срезы подвергали гибридизации с дигоксигенин-связанными пробами антисмысловой РНК, специфичными к Notch I, Serrate 1 и Delta 1, при 65oС. Связанную пробу определяли с помощью щелочной фосфатазы, конъюгированной с козьими антидигоксигениновыми антителами, полученными при использовании NBT и BCIP в качестве субстрата. Данные, показанные в таблицах 1 и 2, относятся к иммуногистологическим исследованиям и гибридизации in situ соответственно. Данные представляют собой анализ тканей 5 различных мышей после интраназального введения одного только пептида (первично PBS/p110-131) или интраназального и подкожного введения антигена (PBS/p110-131 повторно).Example 12
Analysis of expression of Notch 1, Serrate 1, and Delta 1 during tolerance induction by the immunohistological method and in situ hybridization method
C57 BL / 6J mice were intranasally injected with either 100 μg 110-131 Der p1 protein or a control solution (saline phosphate buffer, PBS) for 3 days in a row. It was shown that intranasal administration of antigen in a similar way leads to the development of immunity to this antigen. Some animals were left for two weeks until 50 μg of Der p1 CFA antigen was reintroduced subcutaneously into the base of the tail. The surface lymph nodes and spleens of animals from this time were isolated at various time intervals (d0 is the first day of antigen administration or re-immunization) and used in immunohistological studies or for in situ hybridization. For immunohistological studies, tissues were frozen and thin sections were made, which were fixed in ice-cold acetone and labeled with polyclonal antibodies specific for Notch 1 or Serrate 1. Bound antibodies were determined using horseradish peroxidase conjugated to goat anti-rabbit antibodies obtained in the presence of diaminobenzidine as substrate. Antibodies specific for Delta 1 were not used in the studies. For in situ hybridization, sections of frozen tissues were made and fixed in 4% paraformaldehyde. Sections were hybridized with digoxigenin-linked antisense RNA samples specific for Notch I, Serrate 1 and Delta 1 at 65 ° C. The bound sample was determined using alkaline phosphatase conjugated to goat anti-digoxigenin antibodies obtained using NBT and BCIP as a substrate . The data shown in tables 1 and 2 relate to immunohistological studies and in situ hybridization, respectively. The data are tissue analyzes of 5 different mice after intranasal administration of the peptide alone (primarily PBS / p110-131) or intranasal and subcutaneous administration of antigen (PBS / p110-131 again).

+ слабая окраска
++ умеренная окраска
+++ сильная окраска
Результаты
Начальные уровни Notch, Delta и Serrate экспрессировались у контрольных мышей, получавших только PBS. Мыши, получавшие PBS интраназально и антиген подкожно, демонстрировали умеренное повышение экспрессии всех трех молекул в течение 8 дней после повторной иммунизации. Животные, получавшие либо интраназально один пептид либо интраназально пептид и вслед за ним повторно антиген, демонстрировали одинаковую картину повышенной экспрессии Notch, Delta и Serrate, которая развивалась более быстро и до более высоких значений, чем у контрольных мышей.+ weak color
++ moderate color
+++ strong coloring
results
Initial levels of Notch, Delta, and Serrate were expressed in control mice treated with PBS alone. Mice treated with PBS intranasally and subcutaneously antigen showed a moderate increase in the expression of all three molecules within 8 days after re-immunization. Animals that received either the intranasally single peptide or the intranasal peptide and followed by the re-antigen showed the same pattern of increased expression of Notch, Delta and Serrate, which developed more rapidly and to higher values than in control mice.

Claims (12)

1. Применение лиганда Notch в производстве лекарственного средства для лечения опосредованного Т-клетками заболевания или инфекции. 1. The use of the Notch ligand in the manufacture of a medicament for the treatment of T-cell mediated disease or infection. 2. Применение по п. 1, в котором опосредованное Т-клетками заболевание или инфекция является следствием одного или нескольких состояний, выбранных из аллергии, аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, индуцированного опухолью нарушения в системе Т-клеток, и инфекционных заболеваний, таких, как вызванные видами плазмодия, микрофилярией, гельминтами, микобактериями, ВИЧ, цитомегаловирусом, Pseudomonas, Toxoplasma, эхинококком, Haemophilus influenza типа В, возбудителями кори, гепатитом С или Toxicara. 2. The use according to claim 1, wherein the T-cell mediated disease or infection is the result of one or more conditions selected from allergies, autoimmune diseases, transplant rejection, tumor-induced disorders in the T-cell system, and infectious diseases such as caused by plasmodium species, microfilariae, helminths, mycobacteria, HIV, cytomegalovirus, Pseudomonas, Toxoplasma, echinococcus, Haemophilus influenza type B, measles, hepatitis C or Toxicara. 3. Применение по п. 1 или 2, где лиганд Notch выбран из Serrate, Delta или из их фрагментов, производных или аналогов. 3. The use according to claim 1 or 2, where the Notch ligand is selected from Serrate, Delta or from fragments, derivatives or analogues thereof. 4. Способ развития толерантности Т-клеток к аллергену или антигену, включающий в себя инкубацию/экспозицию указанных Т-клеток с антиген-представляющими клетками, экспрессирующими или избыточно экспрессирующими лиганд Notch в присутствии указанного аллергена или антигена. 4. A method of developing T-cell tolerance to an allergen or antigen, comprising incubating / exposing said T cells with antigen-presenting cells expressing or overexpressing a Notch ligand in the presence of said allergen or antigen. 5. Способ по п. 4, где (избыточная) экспрессия лиганда Notch является следствием трансфекции антиген-представляющих клеток вирусом, способным экспрессировать указанный лиганд. 5. The method of claim 4, wherein (over) expression of the Notch ligand is a consequence of transfection of antigen presenting cells with a virus capable of expressing said ligand. 6. Способ по п. 4, где (избыточная) экспрессия лиганда Notch является следствием стимуляции антиген-представляющих клеток агентом, повышающим экспрессию гена, экспрессирующего лиганд Notch. 6. The method of claim 4, wherein (over) expression of the Notch ligand is a consequence of stimulation of antigen presenting cells with an agent that enhances the expression of a gene expressing the Notch ligand. 7. Способ по п. 6, где агент выбирают из Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, факторов роста фибропластов, или их производных, или фрагментов. 7. The method according to p. 6, where the agent is selected from Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, fibroblast growth factors, or their derivatives, or fragments. 8. Способ по п. 4, 5, 6 или 7, в котором антиген-представляющие клетки выбирают из дендритных клеток, L-клеток, гибридом, лимфом, макрофагов, В-клеток или искусственных антиген-представляющих клеток, таких, как липидные мембраны. 8. The method of claim 4, 5, 6, or 7, wherein the antigen presenting cells are selected from dendritic cells, L cells, hybridomas, lymphomas, macrophages, B cells, or artificial antigen presenting cells, such as lipid membranes . 9. Способ по любому из пп. 4-9, в котором лиганд Notch выбирают из Serrate, Delta или из их фрагментов, производных или аналогов. 9. The method according to any one of paragraphs. 4-9, in which the Notch ligand is selected from Serrate, Delta, or from fragments, derivatives or analogs thereof. 10. Слитый белок, включающий в себя сегмент внеклеточного домена лиганда Notch и Fс - сегмент иммуноглобулина.10. A fusion protein comprising a segment of the extracellular domain of the Notch ligand and F c is an immunoglobulin segment. 11. Слитый белок по п. 10, где внеклеточный домен лиганда Notch получен Notch, Delta или Serrate. 11. The fusion protein of claim 10, wherein the extracellular domain of the Notch ligand is derived from Notch, Delta or Serrate. 12. Слитый белок по п. 10 или 11, где Fс - сегмент является IgGFс или IgMFс.12. The fusion protein of claim 10 or 11, wherein the F c segment is IgGF c or IgMF c .
RU99112175/14A 1996-11-07 1997-11-06 Ligands for notch RU2197262C2 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9623236.8A GB9623236D0 (en) 1996-11-07 1996-11-07 Notch
GB9623236.8 1996-11-07
GB9715674.9 1997-07-24
GB9719350.2 1997-09-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU99112175A RU99112175A (en) 2001-04-20
RU2197262C2 true RU2197262C2 (en) 2003-01-27

Family

ID=10802617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU99112175/14A RU2197262C2 (en) 1996-11-07 1997-11-06 Ligands for notch

Country Status (2)

Country Link
GB (1) GB9623236D0 (en)
RU (1) RU2197262C2 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2532830C2 (en) * 2007-08-23 2014-11-10 Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк Compositions of humanised notch fused proteins and methods of treating
RU2567662C2 (en) * 2008-08-22 2015-11-10 Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк HYBRID PROTEINS BASED ON HUMAN Notch3 AS TRAPS-INHIBITORS OF Notch3 SIGNAL TRANSMISSION
RU2570639C2 (en) * 2009-08-29 2015-12-10 Эббви Инк Therapeutic dll4-binding proteins
US9469689B2 (en) 2010-03-02 2016-10-18 Abbvie Inc. Therapeutic DLL4 binding proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTAVANIS-TSAKOHAS et al., Notch Signallings, Science, 1995, v. 268, р.225-232. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2532830C2 (en) * 2007-08-23 2014-11-10 Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк Compositions of humanised notch fused proteins and methods of treating
RU2567662C2 (en) * 2008-08-22 2015-11-10 Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк HYBRID PROTEINS BASED ON HUMAN Notch3 AS TRAPS-INHIBITORS OF Notch3 SIGNAL TRANSMISSION
RU2570639C2 (en) * 2009-08-29 2015-12-10 Эббви Инк Therapeutic dll4-binding proteins
US9469688B2 (en) 2009-08-29 2016-10-18 Abbvie Inc. Therapeutic DLL4 binding proteins
US9469689B2 (en) 2010-03-02 2016-10-18 Abbvie Inc. Therapeutic DLL4 binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
GB9623236D0 (en) 1997-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100393234B1 (en) Notch
US7064185B2 (en) Antibody for human Cyr61
JPH11513883A (en) Human vascular endothelial growth factor 2
JP2002505873A (en) Vascular endothelial growth factor 2
KR20030093316A (en) Vascular endothelial growth factor 2
JP2000517174A (en) Keratinocyte growth factor-2 (KGF-2 or fibroblast growth factor-12, FGF-12)
KR20020059609A (en) Vascular endothelial growth factor 2
JP2000508894A (en) Extracellular / epidermal growth factor HCABA58X
US20060034857A1 (en) Notch
RU2197262C2 (en) Ligands for notch
CA2215350C (en) Transforming growth factor alpha hii
Frazier-Jessen et al. Transforming growth factor-β: a cytokine paradigm
KR19990022316A (en) Transformation Growth Factor Alpha HI
JP2000508531A (en) Extracellular / epidermal growth factor-like protein
AU773479B2 (en) Notch
MXPA99004282A (en) Notch
JP2002511743A (en) Extracellular / epidermal growth factor-like protein
JPH11507506A (en) Endothelial monocyte active polypeptide III
JP2001509001A (en) Human vascular endothelial growth factor 3
MXPA97009237A (en) Growth factor alpha hi transform
MXPA97009243A (en) Human vascular endothelial growth factor
JP2003000247A (en) TRANSFORMING GROWTH FACTOR alphaHII
JP2006087443A (en) TRANSFORMING GROWTH FACTOR alphaHII
JP2009100747A (en) TRANSFORMING GROWTH FACTOR alphaHII
JPH11510368A (en) Human chemokine β-13

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20061107