RU2194753C2

RU2194753C2 - Medium for conservation of splenic cells

Info

Publication number: RU2194753C2
Application number: RU2001101802A
Authority: RU
Inventors: С.А. Лепехова; М.В. Прокопьев; К.А. Апарцин; О.А. Гольдберг
Original assignee: Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН
Priority date: 2001-01-18
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2002-12-20

Abstract

FIELD: medicine, biology. SUBSTANCE: the innovation deals with development of cell banks. Medium for cryoconservation of splenic cells as a cryoprotector contains low-molecular polyvinylpyrrolidone, as survival components - nutritive medium RPMI-1629, veal embryonic serum and potassium orotate. The suggested medium provides high viability and the absence of splenic cells' adhesion at prolonged storage in a frozen state. It, also, provides the possibility for cellular transplantation without any removal of cryoconservative medium. EFFECT: higher efficiency.

Description

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к сохранению клеток и тканей человека, и может быть использовано при создании клеточных банков для нужд тканевой терапии. The invention relates to the field of medicine and biology, namely to the preservation of human cells and tissues, and can be used to create cell banks for the needs of tissue therapy.

Известно, что для долговременного хранения клеток используют специальные среды и вещества - криопротекторы, которые обеспечивают сохранность и жизнеспособность биологических объектов после размораживания [1]. It is known that for long-term storage of cells they use special media and substances - cryoprotectants, which ensure the safety and viability of biological objects after thawing [1].

Так известна среда для консервации лимфоцитов, содержащая в качестве основы стандартную среду 199, инактивированную человеческую сыворотку и в качестве криопротектора 10%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) [2]. Данная среда имеет следующий состав: 10% диметилсульфоксида, 20% инактивированной человеческой сыворотки, 70% среды 199 [3]. So known medium for the preservation of lymphocytes, containing as a base standard medium 199, inactivated human serum and as a cryoprotectant 10% solution of dimethyl sulfoxide (DMSO) [2]. This medium has the following composition: 10% dimethyl sulfoxide, 20% inactivated human serum, 70% medium 199 [3].

Концентрация лимфоцитов в криоконсервирующем растворе составляет 2,5•10⁴-2,5•10⁶ клеток/мл. В зависимости от концентрации клеток в растворе меняется их сохранность.The concentration of lymphocytes in the cryopreservation solution is 2.5 • 10 ⁴ -2.5 • 10 ⁶ cells / ml. Depending on the concentration of cells in the solution, their preservation changes.

Также известна среда, содержащая в качестве криопротектора 12,5% раствор ДМСО, разведенный в аутологической сыворотке крови [4]. Концентрация лимфоцитов в данном криоконсервирующем растворе составляет 1-3•10⁶ клеток/мл.Also known is a medium containing as a cryoprotectant 12.5% DMSO solution diluted in autologous blood serum [4]. The concentration of lymphocytes in this cryopreservation solution is 1-3 • 10 ⁶ cells / ml.

К недостаткам известных сред относится невысокий процент жизнеспособных клеток через 3 месяца хранения, который составляет от 57,5% до 85,5-93,1% [2, 4] . Наибольшая сохранность лимфоцитов достигается при их минимальной концентрации 2,5•10⁴ в 1 мл питательной среды [2].The disadvantages of the known media include a low percentage of viable cells after 3 months of storage, which ranges from 57.5% to 85.5-93.1% [2, 4]. The greatest preservation of lymphocytes is achieved with their minimum concentration of 2.5 • 10 ⁴ in 1 ml of culture medium [2].

К недостаткам данных сред следует также отнести необходимость удаления ДМСО после размораживания, в связи с его токсическим действием по отношению к лимфоцитам, а также невозможность полного удаления ДМСО из клеток, т.к. он относится к внутриклеточным консервантам. Следствием чего является повышение трудозатрат при использовании этого криоконсерванта и дополнительное повреждающее действие на лимфоциты при отмывании ДМСО. The disadvantages of these media should also include the need to remove DMSO after thawing, due to its toxic effect on lymphocytes, as well as the inability to completely remove DMSO from cells, because It belongs to intracellular preservatives. The consequence of this is an increase in labor costs when using this cryopreservative and an additional damaging effect on lymphocytes when washing DMSO.

Также необходимо отметить низкую концентрацию лимфоцитов, подвергающихся криоконсервации в этих средах, и необходимость хранения замороженных клеток в жидком азоте. It is also necessary to note the low concentration of lymphocytes undergoing cryopreservation in these environments, and the need to store frozen cells in liquid nitrogen.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда для консервации клеток печени [5]. Сущность известной среды заключается в том, что в качестве криоконсерванта она содержит низкомолекулярный поливинилпирролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов содержит питательную среду RPMI - 1629, 1% раствор альбумина, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
Среда RPMI-1629 - 10-10,5
Поливинилпирролидон - 1-1,5
1% Раствор альбумина человеческого - 3-3,6
Калий оротат - 1-1,2
рН 7,6
После криоконсервирования в известной среде и хранения в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток составляет 89,3±0,9%, после хранения в течение 12 месяцев - 87,5±0,5%.Closest to the technical nature of the claimed invention is a medium for the conservation of liver cells [5]. The essence of the known medium lies in the fact that it contains low molecular weight polyvinylpyrrolidone as a cryopreservative, and contains RPMI nutrient medium 1629, 1% albumin solution, potassium orotate in the following ratio, wt.h .:
RPMI-1629 environment - 10-10.5
Polyvinylpyrrolidone - 1-1.5
1% Solution of human albumin - 3-3.6
Potassium Orotate - 1-1.2
pH 7.6
After cryopreservation in a known medium and storage for 6 months, the number of viable cells is 89.3 ± 0.9%, after storage for 12 months - 87.5 ± 0.5%.

К недостатку данной среды следует отнести то, что она не обеспечивает высокой жизнеспособности криоконсервированных клеток селезенки, так как предназначена для клеток печени. Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого технического решения был установлен процент жизнеспособных клеток селезенки на среде клеток печени, который составил 82,6±2,0% в режиме заморозка-оттаивание и 69% после 3-х месяцев хранения в замороженном состоянии. The disadvantage of this medium is that it does not provide high viability of cryopreserved spleen cells, as it is intended for liver cells. Experimental studies of the authors of the proposed technical solution established the percentage of viable spleen cells on the environment of the liver cells, which amounted to 82.6 ± 2.0% in the freeze-thaw mode and 69% after 3 months of storage in a frozen state.

Задачей заявляемого изобретения является разработка среды, обеспечивающей высокую жизнеспособность всех клеток селезенки, как лимфоцитов, так и макрофагов, моноцитов и ретикулярных клеток, при их длительном хранении в замороженном состоянии. The task of the invention is to develop a medium that provides high viability of all spleen cells, both lymphocytes and macrophages, monocytes and reticular cells, during their long-term storage in a frozen state.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение жизнеспособности всех клеток селезенки при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие их слипания и обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации. The technical result of the claimed invention is to increase the viability of all spleen cells during prolonged storage in a frozen state, the absence of their adhesion and the possibility of cell transplantation without removing the cryopreservation medium.

Эта задача решается применением среды, содержащей в качестве криоконсерванта низкомолекулярный поливинилпирролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду RPMI-1629. Кроме указанных компонентов среда также содержит калия оротат, рН среды 7,6. This problem is solved by using a medium containing low molecular weight polyvinylpyrrolidone as a cryopreservative, and RPMI-1629 nutrient medium as life-supporting components. In addition to these components, the medium also contains potassium orotate, pH of 7.6.

Отличие предлагаемой среды заключается в том, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов она дополнительно содержит сыворотку эмбриональную телячью категории К055, дексаметазон Е-6 - 5,0 Е в 1 мл и липиды бобов сои без холестерина. The difference of the proposed environment lies in the fact that, as life-supporting components, it additionally contains serum fetal calf category K055, dexamethasone E-6 - 5.0 E in 1 ml and soy bean lipids without cholesterol.

Предлагаемая среда для консервации клеток селезенки имеет следующее соотношение компонентов, мас.ч.:
Среда RPMI-1629 - 10-10,5
Поливинилпирролидон 10% - 1-1,5
Сыворотка эмбриональная телячья кат. К055 - 3-3,6
Калий оротат - 1-1,2
Дексаметазон Е-6 - 5,0 Е в 1 мл - 0,1
Липиды бобов сои без холестерина 17 мкг/мл - 1
рН 7,6
Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого изобретения установлено, что предлагаемая среда обеспечивает высокую жизнеспособность и отсутствие слипания клеток селезенки при хранении в замороженном состоянии длительное время - в течение 6 месяцев.The proposed environment for the conservation of spleen cells has the following ratio of components, parts by weight:
RPMI-1629 environment - 10-10.5
Polyvinylpyrrolidone 10% - 1-1.5
Fetal calf serum cat. K055 - 3-3.6
Potassium Orotate - 1-1.2
Dexamethasone E-6 - 5.0 E in 1 ml - 0.1
Soya bean lipids without cholesterol 17 mcg / ml - 1
pH 7.6
Experimental studies of the authors of the claimed invention established that the proposed environment provides high viability and the absence of adhesion of spleen cells when stored in a frozen state for a long time - for 6 months.

Основой предлагаемой среды служит стандартная среда RPMI-1629 [6], которая является питательным субстратом при культивации клеток селезенки. The basis of the proposed environment is the standard medium RPMI-1629 [6], which is a nutrient substrate for the cultivation of spleen cells.

Поливинилпирролидон является внеклеточным криоконсервантом, защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда, и не оказывает на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон является иммуностимулятором и обладает антитоксичным действием [7]. Polyvinylpyrrolidone is an extracellular cryopreservative that protects cells during freezing and thawing, preventing them from being damaged by ice crystals, and does not have a toxic effect on them. In addition, polyvinylpyrrolidone is an immunostimulant and has an antitoxic effect [7].

Авторами заявляемой среды экспериментальным путем установлено, что 10%-ная концентрация поливинилпирролидона обеспечивает высокую сохранность клеток. The authors of the claimed medium experimentally found that a 10% concentration of polyvinylpyrrolidone provides high cell safety.

Стандартная сыворотка эмбриональная телячья категории К055 и липиды бобов сои являются питательной добавкой к среде криоконсервации, обеспечивающей высокую сохранность клеток селезенки. Standard serum embryonic calf category K055 and soy bean lipids are a nutritional supplement to the cryopreservation medium, which ensures high preservation of spleen cells.

Известно, что при замораживании клетки интенсивно теряют калий, что приводит к "свинчиванию" цитоплазмы и потере их жизнеспособности. It is known that upon freezing, cells intensively lose potassium, which leads to "screwing up" of the cytoplasm and the loss of their viability.

Авторами заявляемого изобретения установлено, что перенасыщение среды калием, достигаемое за счет введения калия оротата, повышает жизнеспособность клеток при криоконсервации. Кроме этого также установлено, что калий оротат не позволяет клеткам слипаться при длительном хранении в замороженном состоянии. The authors of the claimed invention found that the saturation of the medium with potassium, achieved through the introduction of potassium orotate, increases the viability of cells during cryopreservation. In addition, it was also established that potassium orotate does not allow cells to stick together during prolonged storage in a frozen state.

Величина рН 7,6 является оптимальной для жизнедеятельности клеток селезенки, что и было установлено авторами экспериментальным путем. The pH value of 7.6 is optimal for the vital activity of spleen cells, which was established by the authors experimentally.

Концентрация клеток селезенки при криоконсервации на заявляемой среде составила 2,15•10⁷ в 1 мл. Температура криоконсервации составила - 70^oС.The concentration of spleen cells during cryopreservation on the inventive medium was 2.15 • 10 ⁷ in 1 ml. The temperature of cryopreservation was 70 ^o C.

Указанный состав предлагаемой среды и условия хранения обеспечили высокую степень сохранности клеток после длительной, в течение 6 месяцев криоконсервации. The specified composition of the proposed environment and storage conditions ensured a high degree of preservation of the cells after a long, for 6 months cryopreservation.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для криоконсервации клеток селезенки отличается от известной введением новых компонентов, а именно: сыворотки эмбриональной телячьей кат. К055, дексаметазона Е-6, липидов бобов сои без холестерина, и следовательно, обладает критерием патентоспособности "новизна". Comparative analysis with the prototype allows us to conclude that the claimed environment for cryopreservation of spleen cells differs from the known introduction of new components, namely: fetal calf cat serum. K055, dexamethasone E-6, lipids of soybeans without cholesterol, and therefore, has the patentability criterion of "novelty."

Заявленная среда обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - обеспечение высокой жизнеспособности клеток селезенки при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток, обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации. The claimed medium ensures the achievement of the technical result perceived by the applicant - ensuring high viability of spleen cells during prolonged storage in a frozen state, the absence of cell adhesion, ensuring the possibility of cell transplantation without removing the cryopreservation medium.

Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". From the above it follows that the claimed invention meets the condition of patentability "industrial applicability".

При анализе известных сред для криоконсервации тканевых лимфоцитов было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемой среды на достижение технического результата. When analyzing known media for the cryopreservation of tissue lymphocytes, they revealed a lack of information about the influence of the distinguishing features of the claimed medium on the achievement of a technical result.

Известных сред для криоконсервации всех выделенных клеток селезенки - лимфоцитов, макрофагов, моноцитов, ретикулярных клеток и в большей концентрации, нами не найдено, следовательно, изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень". We did not find any known media for the cryopreservation of all isolated spleen cells — lymphocytes, macrophages, monocytes, reticular cells and in higher concentrations, therefore, the invention meets the criterion of “inventive step”.

Заявляемую среду готовят следующим образом. The inventive medium is prepared as follows.

К 5 мл сыворотки эмбриональной телячьей кат. К055, проверенной на цитотоксичность, добавляют 0,75 г стерильного калия оротата, 1 мл дексаметазона Е-6 - 5,0 Е в 1 мл, липиды бобов сои без холестерина - 17 мкг/мл в количестве 1 мл. Затем в суспензию вводят раствор консерванта. Для этого концентрированный поливинилпирролидон молекулярной массой 18 000 разводят на среде культивации RPMI - 1629 до получения 10% концентрации (9 мл питательной среды RPMI-1629±1 мл поливинилпирролидона). рН среды консервирования 7,6. To 5 ml of serum fetal calf cat. K055, tested for cytotoxicity, add 0.75 g of sterile potassium orotate, 1 ml of dexamethasone E-6 - 5.0 E in 1 ml, soy bean lipids without cholesterol - 17 μg / ml in an amount of 1 ml. Then, a preservative solution is added to the suspension. For this, concentrated polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of 18,000 is diluted on RPMI-1629 cultivation medium to obtain a 10% concentration (9 ml of RPMI-1629 medium ± 1 ml of polyvinylpyrrolidone). The pH of the preservation medium is 7.6.

Среда RPMI-1629 /4/ имеет следующий состав:
Аминокислоты: мг/л
L-аланин - 13,90
L-аргинин-HCl - 42,10
L-аспарагин - 45,00
L-аспарагиновая кислота - 19,97
L-цистеин - 31,50
L-глутаминовая кислота - 22,10
L-глутамин - 219,20
Глицин - 7,50
L-гистидин-НСl•Н₂О - 20,96
L-гидроксипролин - 19,70
L-изолейцин - 39,36
L-лейцин - 39,36
L-лизин-НСl - 36,50
L-метионин - 14,90
L-фенилаланин - 16,50
L-пролин - 17,30
L-серин - 26,30
L-треонин - 17,90
L-триптофан - 3,10
L-тирозин - 18,10
L-валин - 17,60
Витамины:
Аскорбиновая кислота - 0,50
Биотин - 0,20
Холинхлорид - 5,00
Р-Са-пантотенат - 0,20
Фолиевая кислота - 10,00
I-инозит - 36,00
Никотинамид - 0,50
Никотиновая кислота - 0,50
n-Аминобензойная кислота - 1,00
Пиридоксаль-HCl - 0,50
Пиридоксин-HCl - 0,50
Рибофлавин - 0,20
Тиамин-HCl - 0,20
Витамин B₁₂ - 2,00
Соли:
CaCl₂ - 100,0
HCl - 400,0
MgSO₄•7H₂O - 200
NaCl - 6460,0
NaHCO₃ - 2200,0
NaH₂PO₄•7H₂O - 580,0
Другие компоненты
Феноловый красный - 10,0
Глюкоза - 3000,0
Глутатион - 0,50
Бакто-пептон - 600,0
Сыворотка эмбриона крупного рогатого скота - 0-30%
Выделенные клетки селезенки концентрируют путем центрифугирования и удаления супернатанта. Далее взвесь клеток аккуратно смешивают со средой криоконсервации, разливают по ампулам, замораживают и хранят при температуре - 70^oС.The RPMI-1629/4 / medium has the following composition:
Amino acids: mg / L
L-Alanine - 13.90
L-Arginine-HCl - 42.10
L-asparagine - 45.00
L-aspartic acid - 19.97
L-cysteine - 31.50
L-glutamic acid - 22.10
L-Glutamine - 219.20
Glycine - 7.50
L-histidine-Hcl • H ₂ O - 20.96
L-hydroxyproline - 19.70
L-isoleucine - 39.36
L-Leucine - 39.36
L-lysine-Hcl - 36.50
L-methionine - 14.90
L-phenylalanine - 16.50
L-Proline - 17.30
L-serine - 26.30
L-threonine - 17.90
L-tryptophan - 3.10
L-tyrosine - 18.10
L-valine - 17.60
Vitamins:
Ascorbic acid - 0.50
Biotin - 0.20
Choline chloride - 5.00
R-S-pantothenate - 0.20
Folic Acid - 10.00
I-Inositol - 36.00
Nicotinamide - 0.50
Niacin - 0.50
n-Aminobenzoic acid - 1.00
Pyridoxal-HCl - 0.50
Pyridoxine HCl - 0.50
Riboflavin - 0.20
Thiamine-HCl - 0.20
Vitamin B ₁₂ - 2.00
Salts:
CaCl ₂ - 100.0
HCl - 400.0
MgSO ₄ • 7H ₂ O - 200
NaCl - 6460.0
NaHCO ₃ - 2200.0
NaH ₂ PO ₄ • 7H ₂ O - 580.0
Other components
Phenol Red - 10.0
Glucose - 3000.0
Glutathione - 0.50
Bacto Peptone - 600.0
Cattle embryo serum - 0-30%
The isolated spleen cells are concentrated by centrifugation and removal of the supernatant. Next, a suspension of cells is carefully mixed with cryopreservation medium, poured into ampoules, frozen and stored at a temperature of - 70 ^o C.

Пример конкретного выполнения. An example of a specific implementation.

0,75 г стерильного калия оротата в 5 мл стерильной эмбриональной телячьей сыворотки кат. К055, проверенной на цитотоксичность, смешивают с 0,1 мл дексаметазона Е-6 (5,0 Е в 1 мл), 1 мл липидов бобов сои без холестерина (17 мкг/мл), а затем с концентрированной клеточной взвесью, приготовленной из селезенок поросят 1-2-дневного возраста. Затем в суспензию добавляют 10%-ный раствор поливинилпирролидона в среде RPMI-1629, при рН 7,6. Соотношение объемов поливинилпирролидона к клеточной взвеси с суспензией, как 1:2. 0.75 g of sterile potassium orotate in 5 ml of sterile fetal calf serum cat. K055, tested for cytotoxicity, is mixed with 0.1 ml of dexamethasone E-6 (5.0 E in 1 ml), 1 ml of soy bean lipids without cholesterol (17 μg / ml), and then with concentrated cell suspension prepared from spleens piglets of 1-2 days of age. Then, a 10% solution of polyvinylpyrrolidone in RPMI-1629 medium was added to the suspension at a pH of 7.6. The ratio of the volumes of polyvinylpyrrolidone to cell suspension with a suspension of 1: 2.

Оценку жизнеспособности консервированных клеток проводили с помощью теста "на исключение красителя", подсчет абсолютного количества клеток в 1 мкл, суправитальная окраска трипановым синим [8]. Assessment of the viability of canned cells was carried out using the test "on the exclusion of dye", the calculation of the absolute number of cells in 1 μl, supravital staining with trypan blue [8].

Для экспериментальной проверки были проведены исследования на 40 образцах клеточной взвеси, приготовленной из селезенок поросят 1-2-дневного возраста. For experimental verification, studies were conducted on 40 samples of cell suspension prepared from spleens of piglets of 1-2 days of age.

В суспензию клеток добавляли водный раствор красителя (трипановый синий) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывали число неокрашенных клеток. An aqueous dye solution (trypan blue) was added to the cell suspension, and the number of unpainted cells was counted in a Fuchs-Rosenthal chamber.

Подсчет клеток лучше проводить при их концентрации 0,5-2•10⁶ кл/мл и в течение 1-5 мин после смешивания суспензии с красителем.Cell counting is best done at a concentration of 0.5-2 • 10 ⁶ cells / ml and within 1-5 minutes after mixing the suspension with dye.

Число неповрежденных клеток после замораживания-оттаивания составило:
на заявляемой среде - 98,9±0,3%
на среде с ДМСО (аналог) - 70,7±0,7%
на среде с ПЭО-400 (прототип) - 95% (указано в источнике)
После криоконсервирования в заявляемой среде и хранения в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток составило 98,2±0,5%. Данные обработаны по методу Стьюдента.The number of intact cells after freezing-thawing was:
on the claimed medium - 98.9 ± 0.3%
on a medium with DMSO (analogue) - 70.7 ± 0.7%
on an environment with PEO-400 (prototype) - 95% (indicated in the source)
After cryopreservation in the inventive medium and storage for 6 months, the number of viable cells was 98.2 ± 0.5%. The data were processed by the student method.

При использовании среды - аналога через 6 месяцев хранения жизнеспособность клеток составила 70,8±0,6%. When using an analog medium after 6 months of storage, cell viability was 70.8 ± 0.6%.

Таким образом, предложенная среда обеспечивает высокую жизнеспособность клеток селезенки при длительном /6 месяцев/ хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к трансплантации, так как не требуется удаления среды криоконсервации и тем самым снижается травмирование клеток. Thus, the proposed environment provides high viability of spleen cells during long-term / 6 months / storage in a frozen state, while there is no cell adhesion, the procedure for preparing cells for transplantation is simplified, since the cryopreservation medium is not required to be removed, and cell injury is reduced.

Источники информации
1. Биохимия мембран: Учеб. пособие для биол. и мед. спец. вузов/Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 3. А.М. Белоус, Е.М. Гордиенко, Л.Ф. Розанов. Замораживание и криопротекция. - М.: Высш. Шк., - С. 68-77.Sources of information
1. Biochemistry of membranes: Textbook. allowance for biol. and honey. specialist. Universities / Ed. A.A. Boldyreva. Prince 3. A.M. Belous, E.M. Gordienko, L.F. Rozanov. Freezing and cryoprotection. - M .: Higher. Shk., - S. 68-77.

2. Зарецкая Ю.М., Шахназарян А.М., Полянская И.С., Долбин А.Г. Выявление антигенов HLA-A и HLA-B на криоконсервированных лимфоцитах. - Пробл. Гематологии и переливания крови, 1978, 23, 3, с.50-53. 2. Zaretskaya Yu.M., Shakhnazaryan A.M., Polyanskaya I.S., Dolbin A.G. Detection of HLA-A and HLA-B antigens on cryopreserved lymphocytes. - Probl. Hematology and blood transfusion, 1978, 23, 3, pp. 50-53.

3. Morgan J.M., Campbell M.E., Morton H.J. Cell culture // J. Nat. Cancer Inst., Vol.16, 1955, p. 557. 3. Morgan J.M., Campbell M.E., Morton H.J. Cell culture // J. Nat. Cancer Inst., Vol.16, 1955, p. 557.

4. Попов А.С., Мхеидзе Д.Г. Некоторые методические особенности длительного хранения лимфоцитов человека.// Бюлл. экспер. Биологии и медицины, 1976, 81(6), с.763-765. 4. Popov A.S., Mkheidze D.G. Some methodological features of long-term storage of human lymphocytes. // Bull. an expert. Biology and Medicine, 1976, 81 (6), pp. 763-765.

5. Патент РФ RU 2161198, МКИ⁷ С 12 N 5/00, 5/08, 1/04. Среда для консервации клеток печени / С.А. Лепехова, О.А. Гольдберг (РФ).- 4 с.5. RF patent RU 2161198, MKI ⁷ C 12 N 5/00, 5/08, 1/04. Environment for the preservation of liver cells / S.A. Lepekhova, O.A. Goldberg (RF) .- 4 p.

6. Методы культуры клеток для биохимиков/ Пер. с англ. Р. Адамс. М.: Мир, 1983, с.230-231. 6. Methods of cell culture for biochemists / Per. from English R. Adams. M.: Mir, 1983, pp. 230-231.

7. Климанский В.А., Рудаев Я.А. Трансфузионная терапия при хирургических заболеваниях. - М.: Медицина, 1984, С.39. 7. Klimansky V.A., Rudaev Y.A. Transfusion therapy for surgical diseases. - M .: Medicine, 1984, S. 39.

8. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ./ Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989. С.116. 8. Culture of animal cells. Methods: Per. from English / Ed. R. Freshney. M .: Mir, 1989.S. 116.

Claims

Spleen cell preservation medium containing RPMI-1629 medium, potassium orotate and cryoprotector - low molecular weight polyvinylpyrrolidone - pH 7.6, characterized in that it additionally contains serum fetal calf category K055, dexamethasone E-6-5.0 E in 1 ml, lipids of soybeans without cholesterol 17 μg / ml, in the following ratio, wt. hours:
RPMI-1629 environment - 10-10.5
Low molecular weight polyvinylpyrrolidone - 1-15
Serum embryonic calf category K 055 - 3-3.6
Potassium Orotate - 1-1.2
Dexamethasone E-6-5.0 E in 1 ml - 0.1
Soya bean lipids without cholesterol 17 mcg / ml - 1