RU2190666C2

RU2190666C2 - Method of preparing d-apiose from duck's-meat lemna minor polysaccharide

Info

Publication number: RU2190666C2
Application number: RU2000118498A
Authority: RU
Inventors: Ю.С. Оводов; В.В. Головченко; Р.Г. Оводова
Original assignee: Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2002-10-10

Abstract

FIELD: chemistry, biochemistry, immunochemistry. SUBSTANCE: method involves treatment of polysaccharide from duck's-meat Lemna minor with a trifluoroacetic acid solution in concentration 0.01-0.02 mole/l at temperature 70-100 C for 1-4 h, precipitation of polysaccharide from solution with 96% ethyl alcohol and removal of precipitated deposit by centrifugation. The end product is isolated by concentration, supernatant drying by evaporation with methanol under vacuum at temperature 40 C. Treatment of polysaccharide with a trifluoroacetic acid solution is carried out in the ratio of mass of the parent polysaccharide and a solvent volume = (1-3) : (100-400). The precipitation of polysaccharide from a solution with ethyl alcohol is carried out in the ratio solution : alcohol = 1: (3-4), respectively. Method ensures to isolate D-apiose in an individual state with a specific rotation value [α]

\binom{20}{D}

+5,4^° (c. = 1.0; H₂O) as a syrup-like form. The isolated apiose is a valuable biochemical preparation used in the investigation of chemical structure, biochemical behavior of different physiologically active compounds, for assay of determinant groups of immunomodulating agents. EFFECT: improved method of preparing, valuable properties of apiose. 3 cl, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к химии, биохимии и иммунохимии, а именно к способу получения D-апиозы - моносахарида с разветвленной углеводной цепью из полисахарида, выделенного из ряски малой Lemna minor. The invention relates to chemistry, biochemistry and immunochemistry, and in particular to a method for producing D-apiosa - a branched carbohydrate monosaccharide from a polysaccharide isolated from duckweed minor Lemna minor.

Известна D-апиоза, выделенная из петрушки Apium petroselinum кипячением предварительно выделенного гликозида апиина с 0,3%-ной серной кислотой, который распадается на D-апиозу и апигенин-D-глюкозид; последний, в свою очередь, при обработке соляной кислотой дает D-глюкозу и апигенин [E. Vongerichten, Fr. Muller, Ann. 318, 127 (1901); 321,74 (1902). E. Vongerichten, Fr. Muller, B. 39, 235 (1906)]. Способ описан не достаточно подробно, что затрудняет его повторение. Кроме того, в его описании ничего не говорится о количествах выделенной апиозы. Можно предположить, что она этим способом была выделена в аналитических количествах для установления ее структуры. Known D-apiosis, isolated from parsley Apium petroselinum by boiling previously isolated apiin glycoside with 0.3% sulfuric acid, which breaks down into D-apiosis and apigenin-D-glucoside; the latter, in turn, when treated with hydrochloric acid gives D-glucose and apigenin [E. Vongerichten, Fr. Muller, Ann. 318,127 (1901); 321.74 (1902). E. Vongerichten, Fr. Muller, B. 39, 235 (1906)]. The method is not described in sufficient detail, which complicates its repetition. In addition, his description does not say anything about the amount of excreted apiosis. It can be assumed that in this way it was isolated in analytical amounts to establish its structure.

Других способов выделения апиозы из растительного сырья нами не выявлено, хотя на данный момент известно, что D-апиоза в минорных количествах входит в состав многих пектиновых веществ, выделенных из возобновленного растительного сырья [Ю.С. Оводов // Биоорганическая химия, 1998, т. 24, 7, с. 483-501]. We have not found other ways of isolating apiosis from plant materials, although at the moment it is known that D-apiosis in minor quantities is a part of many pectin substances isolated from renewed plant materials [Yu.S. Ovodov // Bioorganic chemistry, 1998, v. 24, 7, p. 483-501].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения D-апиозы из широко распространенного пресноводного растения ряски малой Lemna minor в препаративных количествах с высокой степенью очистки при небольших затратах. An object of the present invention is to provide a method for isolating D-apiosa from a widespread freshwater duckweed plant of Lemna minor minor in preparative quantities with a high degree of purification at low cost.

Это изобретение позволяет выделить D-апиозу в индивидуальном состоянии с удельным вращением [α] $\binom{20}{D}$ +5.4^° (с. 1.0; Н₂О) в виде сиропа, что соответствует характеристикам апиозы, описанным ранее [Толленс-Эльснер. Справочник по углеводам. - Л.: Красный печатник, 1937].This invention allows to isolate D-apiosis in an individual state with specific rotation [α] $\binom{20}{D}$ +5.4 ^° (p. 1.0; H ₂ O) in the form of a syrup, which corresponds to the apiosis characteristics described earlier [Tollens-Elsner. Handbook of carbohydrates. - L .: Red printer, 1937].

Поскольку в полисахариде ряски малой Lemna minor содержание D-апиозы составляет около 25% общего моносахаридного состава полисахарида [Оводова Р.Г. , Головченко В.В., Шашков А.С., Попов С.В., Оводов Ю.С. // Биоорган. химия, 2000, т. 26, 10], то этот способ позволяет получать D-апиозу в препаративных количествах (выход 10-25% от массы полисахарида). Since in the polysaccharide of duckweed Lemna minor, the content of D-apiosis is about 25% of the total monosaccharide composition of the polysaccharide [Ovodova R.G. , Golovchenko V.V., Shashkov A.S., Popov S.V., Ovodov Yu.S. // Bioorgan. chemistry, 2000, v. 26, 10], then this method allows to obtain D-apiosis in preparative quantities (yield 10-25% by weight of the polysaccharide).

Выделенная таким способом апиоза является ценным биохимическим препаратом при изучении химического строения, биохимического поведения различных физиологически активных соединений, определении детерминантных групп иммуномодуляторов и при идентификации D-апиозы в составе олиго- и полисахаридов, а также гликозидов и других углеводсодержащих соединений. Apiosis isolated in this way is a valuable biochemical preparation for studying the chemical structure, biochemical behavior of various physiologically active compounds, determining the determinant groups of immunomodulators, and for identifying D-apioses in oligo- and polysaccharides, as well as glycosides and other carbohydrate-containing compounds.

Существенные признаки изобретения. The essential features of the invention.

Способ получения D-апиозы, включающий обработку полисахарида ряски малой Lemna minor, способ получения которого описан в патенте RU 2149642, раствором трифторуксусной кислоты концентрацией 0,01-0,02 моль/л при 70-100^oС в течение 1-4 ч, соотношении массы исходного полисахарида и объема растворителя 1-3:100-400 соответственно, осаждение полисахарида из раствора 96%-ным этиловым спиртом при соотношении раствор: спирт 1:3-4, удаление выпавшего осадка центрифугированием и выделение целевого продукта путем концентрирования, сушки супернатанта упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС.A method of producing D-apiosis, comprising treating the small duckweed polysaccharide Lemna minor, the method of preparation of which is described in patent RU 2149642, with a solution of trifluoroacetic acid at a concentration of 0.01-0.02 mol / l at 70-100 ^o C for 1-4 hours, the ratio of the mass of the starting polysaccharide and the volume of the solvent is 1-3: 100-400, respectively, the precipitation of the polysaccharide from the solution with 96% ethyl alcohol at a ratio of solution: alcohol 1: 3-4, the precipitate is removed by centrifugation and the target product is isolated by concentration, drying the supernatant evaporation with methanol in vacuum at 40 ^o C.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Пример 1. 1-3 г полисахарида ряски малой Lemna minor заливают 100-400 мл 0,01-0,02М трифторуксусной кислотой, нагревают в термостате при 70-100^oС в течение 1-4 ч. Полисахарид осаждают из раствора 96%-ным этиловым спиртом в соотношении раствор: спирт 1:3-4, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Полученный супернатант, содержащий D-апиозу, концентрируют и сушат упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. В результате этой процедуры получают D-апиозу в виде сиропа с выходом 18-25% от массы взятого полисахарида ряски малой Lemna minor в виде сиропа.Example 1. 1-3 g of duckweed polysaccharide small Lemna minor pour 100-400 ml of 0.01-0.02 M trifluoroacetic acid, heated in a thermostat at 70-100 ^o C for 1-4 hours. The polysaccharide precipitated from a solution of 96% - ethyl alcohol in the ratio of solution: alcohol 1: 3-4, the precipitate is separated by centrifugation. The resulting supernatant containing D-apiose is concentrated and dried by evaporation with methanol in vacuo at 40 ^° C. As a result of this procedure, D-apiose is obtained in the form of a syrup with a yield of 18-25% of the weight of the duckweed polysaccharide small Lemna minor in the form of a syrup.

Определение соответствия выделенного продукта апиозе осуществляли следующими методами. Determination of the correspondence of the isolated product to apiosis was carried out by the following methods.

1. Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). ГЖХ проводили на хроматографе Hewlett-Packard 4890А с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой RTX-1 (0,25 мм ⌀ • 30 м), газ-носитель - Аr, сброс 1:60. Идентификация образцов D-апиозы проводилась в виде соответствующих ацетатов полиолов [York W.S., Darvill A. G., McNeil M.A., Stevenson T.T, Albersheim P. //Meth. Enzymol. l985. V. 118. P. 3-40], температурный режим - 175^oС --> 250^oС, Δ 3^o/мин.1. The method of gas-liquid chromatography (GLC). GLC was performed on a Hewlett-Packard 4890A chromatograph with a flame ionization detector, RTX-1 capillary column (0.25 mm ⌀ • 30 m), carrier gas — Ar, discharge 1:60. Identification of samples of D-apiosis was carried out in the form of the corresponding polyol acetates [York WS, Darvill AG, McNeil MA, Stevenson TT, Albersheim P. // Meth. Enzymol. l985. V. 118. P. 3-40], temperature - 175 ^o C -> 250 ^o C, Δ 3 ^o / min.

2. Методом бумажной хроматографии (БЖХ). Бумажную хроматографию проводили нисходящим методом на бумаге Filtrak FN-12 и FN-13 в системе н-бутанол-пиридин-вода (6: 4: 3) с индикацией пятна моносахарида апиозы с помощью кислого анилинфталата при 105^oС.2. The method of paper chromatography (BLC). Paper chromatography was performed in a top-down manner on Filtrak FN-12 and FN-13 paper in the n-butanol-pyridine-water system (6: 4: 3) with an apiose monosaccharide spot using acid aniline phthalate at 105 ^o C.

3. Определением удельного вращения. Величину удельного вращения образца измеряли на приборе Polartronic MHZ (Германия) в кювете на 1 мл при температуре 20^oС в водном растворе концентрацией 1,0 мг/ 100 мл.3. The definition of specific rotation. The specific rotation of the sample was measured on a Polartronic MHZ device (Germany) in a 1 ml cuvette at a temperature of 20 ^° C in an aqueous solution with a concentration of 1.0 mg / 100 ml.

По данным этих методов выявлено соответствие полученного продукта D-апиозе с удельным вращением [α] $\binom{20}{D}$ +5.4^° (с. 1.0; Н₂О).According to these methods, the correspondence of the obtained product to D-apiosis with specific rotation [α] $\binom{20}{D}$ +5.4 ^° (p. 1.0; H ₂ O).

Экспериментальные данные, полученные по описанному способу, приведены в таблице. The experimental data obtained by the described method are shown in the table.

Пример 2. 2 г полисахарида ряски малой Lemna minor заливают 160 мл 0,05M трифторуксусной кислотой. Нагревают в термостате при 100^oС в течение 3 ч. Полисахарид осаждают 96%-ным этиловым спиртом в соотношении раствор:спирт 1: 3, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Полученный супернатант, содержащий апиозу, концентрируют и сушат упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. По данным описанных выше методов (ГЖХ, БХ) выделенный образец представляет собой смесь апиозы и арабинозы в соотношении 8-10:1.Example 2. 2 g of the duckweed polysaccharide small Lemna minor pour 160 ml of 0.05 M trifluoroacetic acid. Heated in a thermostat at 100 ^o C for 3 hours. The polysaccharide precipitated with 96% ethanol in the ratio of solution: alcohol 1: 3, the precipitate was separated by centrifugation. The resulting apiose-containing supernatant was concentrated and dried by evaporation with methanol in vacuo at 40 ^° C. According to the methods described above (GLC, BH), the isolated sample was a mixture of apiose and arabinose in a ratio of 8-10: 1.

Из этого примера видно, что повышение концентрации растворителя ведет к получению смеси моносахаридов апиозы и арабинозы. From this example, it can be seen that increasing the concentration of solvent leads to a mixture of apios and arabinose monosaccharides.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет выделить апиозу из полисахарида ряски малой Lemna minor в индивидуальном состоянии с удельным вращением [α] $\binom{20}{D}$ +5.4^° (с. 1.0; H₂О) в виде сиропа в препаративных количествах с высокой степенью очистки при небольших затратах.Thus, the present invention allows to isolate apiosa from the polysaccharide of duckweed minor Lemna minor in an individual state with specific rotation [α] $\binom{20}{D}$ +5.4 ^° (p. 1.0; H ₂ O) in the form of syrup in preparative quantities with a high degree of purification at low cost.

Claims

1. The method of producing D-apiosis by treating natural compounds obtained from plant materials with acid by heating, characterized in that the raw duck polysaccharide Lemna minor is used as a raw material, the treatment is carried out with a solution of trifluoroacetic acid with a concentration of 0.01-0.02 mol / l at 70-100 ^o C for 1-4 hours, after which the polysaccharide is precipitated from the solution with 96% ethanol, the precipitate is removed by centrifugation, and the target product is isolated by concentration and drying of the supernatant by evaporation with methanol in vacuum at 40 ^o C.

2. The method according to p. 1, characterized in that the raw material is treated with a solution of trifluoroacetic acid with a ratio of raw material: solution 1-3: 100-400.

3. The method according to p. 1, characterized in that the deposition of the polysaccharide from the solution is carried out with ethyl alcohol at a ratio of solution: alcohol 1: 3-4.