RU2189223C2

RU2189223C2 - Agent for deep cutaneous defects healing

Info

Publication number: RU2189223C2
Application number: RU2000128911/14A
Authority: RU
Inventors: Н.Д. Юрченко; Т.Д. Колокольцова; О.В. Шумакова; Г.П. Трошкова; Е.А. Нечаева
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2002-09-20

Abstract

FIELD: biology, medicine, transplantology. SUBSTANCE: cellular suspension of the certified diploid strain or collagen microcarriers with the grown cellular monolayer are immobilized into gel of polyethylene oxide for the following application on burned surfaces, sluggish cutaneous wounds or other cutaneous defects. Invention provides decrease of wound healing time, simplifies transport conditions, decreases labor intensity of preparing and transfer of cellular material, expands field of the use of the certified diploid strain of fibroblasts. EFFECT: improved properties, enhanced effectiveness of agent. 2 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к трансплантологии. The invention relates to biology and medicine, namely to transplantology.

В последние годы в клинической практике широкое распространение получил метод восстановления поврежденного кожного покрова с помощью культивированных in vitro ауто- и аллофибробластов клеток человека [1, 2]. Известно, что фибробласты посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса не только стимулируют адгезию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов при культивировании, но и оказывают непосредственное влияние на заживление ран, стимулируют рост сохранившихся очагов эпителия, а также способствуют лучшему приживлению аутодермального расщепленного лоскута [3]. In recent years, in clinical practice, the method of repairing damaged skin with the help of in vitro cultured auto- and allofibroblasts of human cells has become widespread [1, 2]. It is known that fibroblasts through the synthesis of extracellular matrix components not only stimulate the adhesion, proliferation and differentiation of keratinocytes during cultivation, but also have a direct effect on wound healing, stimulate the growth of preserved epithelial foci, and also contribute to better engraftment of an autodermal split flap [3].

Фибробласты предварительно культивируют на различных подложках в виде пленок и на микроносителях, а затем, после образования монослоя, переносят на раневую поверхность [2, 5]. Fibroblasts are pre-cultured on various substrates in the form of films and on microcarriers, and then, after the formation of a monolayer, they are transferred to the wound surface [2, 5].

Однако используемые алло- и аутофибробласты взрослой кожи намного уступают фетальным фибробластам, как по ростовым свойствам, так и в отношении стимуляции роста кератиноцитов в ране. Кроме того, они быстро стареют в культуре и не могут длительно размножаться. В связи с этим диплоидные штаммы от взрослых доноров непригодны для приготовления и полной аттестации банков и, следовательно, являются потенциально опасными для использования в клинической медицине. However, the used allo- and autofibroblasts of adult skin are much inferior to fetal fibroblasts, both in growth properties and in relation to stimulation of keratinocyte growth in the wound. In addition, they quickly age in the culture and cannot reproduce for a long time. In this regard, diploid strains from adult donors are unsuitable for the preparation and full certification of banks and, therefore, are potentially dangerous for use in clinical medicine.

Для иммобилизации клеток в биотехнологии используют различные гели; некоторые из них способны поддерживать пролиферацию клеток, другие сохранять жизнеспособность длительное время при определенных условиях. В ряде работ по реконструкции дермы чаще всего применяются гели, основой которых служит коллаген [6, 7], в других случаях используют для временной иммобилизации клеток агар, агарозу, метилцеллюлозу и другие [8]. Various gels are used to immobilize cells in biotechnology; some of them are able to maintain cell proliferation, others remain viable for a long time under certain conditions. In a number of dermal reconstruction works, gels are most often used based on collagen [6, 7]; in other cases, agar, agarose, methylcellulose, and others are used for temporary immobilization of cells [8].

Вышеперечисленные гели могут создавать на ране дополнительную питательную среду для развития микрофлоры и нежелательны для использования в медицине. The above gels can create an additional nutrient medium on the wound for the development of microflora and are undesirable for use in medicine.

В связи с этим гель полиэтиленоксида, благодаря своим качествам, является наиболее приемлемым для временной иммобилизации клеток с последующей трансплантацией на раневую поверхность [9]. In this regard, the polyethylene oxide gel, due to its qualities, is most suitable for temporary immobilization of cells with subsequent transplantation onto the wound surface [9].

Наиболее близким к заявленному изобретению является аллотрансплантат для восстановления кожного покрова и способ лечения кожных дефектов с помощью культивированных клеток диплоидного штамма [10, прототип]. Согласно данному способу аттестованные клетки диплоидного штамма Л-68 размораживают из рабочего банка, после чего подвергают 5-7 кратному пассированию. Последнее субкультивирование проводят в чашках Петри на целлофановой пленке в течение 3-5 суток до получения полного монослоя. Чашки Петри, стерильно упакованные, доставляют в операционную и клетки вместе с мембраной переносят на раневую поверхность. Closest to the claimed invention is an allograft for restoration of the skin and a method of treating skin defects using cultured cells of the diploid strain [10, prototype]. According to this method, the certified cells of the diploid strain L-68 are thawed from the working bank, and then subjected to 5-7 times passaging. The last subculture is carried out in Petri dishes on a cellophane film for 3-5 days until a complete monolayer is obtained. Sterile-packed Petri dishes are delivered to the operating room and the cells, along with the membrane, are transferred to the wound surface.

Несмотря на то, что этот метод зарекомендовал себя как достаточно эффективный для восстановления кожного покрова, он имеет некоторые недостатки. Данный способ предполагает использование пленки, которая деформируется на неровных и глубоких раневых поверхностях, что препятствует миграции клеток на рану. Кроме того, пленки с выращенными фибробластами должны транспортироваться в чашках Петри в стерильном контейнере при соблюдении температурного режима, в строго горизонтальном положении с исключением грубого механического встряхивания. Despite the fact that this method has established itself as sufficiently effective to restore the skin, it has some disadvantages. This method involves the use of a film that is deformed on uneven and deep wound surfaces, which prevents the migration of cells to the wound. In addition, films with grown fibroblasts should be transported in Petri dishes in a sterile container subject to temperature conditions, in a strictly horizontal position with the exception of rough mechanical shaking.

Задачей изобретения является возможность сокращения сроков заживления ран, упрощение условий транспортировки, снижение трудоемкости получения и переноса клеточного материала, расширение сферы применения клеток аттестованного диплоидного штамма в виде гелевой формы, способных проникать в неровные и глубокие раны. The objective of the invention is the possibility of reducing the healing time of wounds, simplifying the conditions of transportation, reducing the complexity of obtaining and transferring cellular material, expanding the scope of cells of a certified diploid strain in the form of a gel form that can penetrate uneven and deep wounds.

Поставленная задача решается применением средства, содержащего суспензию клеток в питательной среде ИГЛА MEM в концентрации 2,5-5,0•10⁶ кл/мл или суспензию микроносителей в питательной среде с выращенным клеточным монослоем, 10-кратную питательную среду для культур клеток и носитель в соотношении 3,0-25%, 1-12% и до 100% соответственно, которое наносится тонким слоем на рану. В качестве питательной среды для культур клеток используют среду ИГЛА MEM, а в качестве носителя - гель полиэтиленоксида. После чего рана покрывается неадгезивной повязкой.The problem is solved by the use of a tool containing a suspension of cells in a nutrient medium NEEDLE MEM at a concentration of 2.5-5.0 • 10 ⁶ cells / ml or a suspension of microcarriers in a nutrient medium with a grown cell monolayer, a 10-fold nutrient medium for cell cultures and a carrier in the ratio of 3.0-25%, 1-12% and up to 100%, respectively, which is applied in a thin layer to the wound. As a nutrient medium for cell cultures, MEMA IgLA medium is used, and a polyethylene oxide gel is used as a carrier. After which the wound is covered with a non-adhesive dressing.

Применение концентрации клеточной суспензии в средстве менее 3% приводит к снижению лечебного эффекта, а использование концентрации более 25% приводит к разжижению средства. The use of a concentration of cell suspension in an agent of less than 3% leads to a decrease in the therapeutic effect, and the use of a concentration of more than 25% leads to a dilution of the agent.

Гель полиэтиленоксида (ТУ 9154-004-11821987-93) является фармакопейным препаратом, нетоксичен, сохраняет влажность, предохраняет клетки от повреждения, имеет желеобразное состояние, иммобилизует клеточную суспензию и микроносители, обеспечивая свободный выход клеток на поверхность раны. Polyethylene oxide gel (TU 9154-004-11821987-93) is a pharmacopoeial drug, non-toxic, retains moisture, protects cells from damage, has a jelly-like state, immobilizes cell suspension and microcarriers, providing free access of cells to the wound surface.

Для получения гелевой формы можно использовать как суспензию клеток, так и микроносители с выращенным клеточным монослоем, включенные в изотонический и нетоксический гель. Используют диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека, посевной и рабочие банки которых были аттестованы в соответствии с требованиями ВОЗ для производства иммунобиологических препаратов [4, 11]. Для культивирования ампулу из рабочего банка с клетками размораживают на водяной бане при температуре 37^oС, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37^oС и пассируют до получения необходимого объема клеток, затем клеточный монослой подвергают ферментативной обработке (смесь 0,02% раствора версена и 0,025% трипсина), собирают суспензию клеток, соединяют с гелем. Для выращивания фибробластов используют биодеградируемые коллагеновые микроносители [12]. В концентрированную суспензию микроносителей вносят суспензию фибробластов, инкубируют при 37^oС, периодически перемешивая для полного распределения и распластывания клеток на микроносителях, затем добавляют питательную среду до нужного объема. На 4-7 сутки культивирования микроносители с клеточным монослоем осаждают и соединяют с гелем. Полученный гель с клетками на микроносителях помещают в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.To obtain a gel form, one can use both a suspension of cells and microcarriers with a grown cell monolayer included in an isotonic and non-toxic gel. Diploid strains of fibroblasts of the human embryo are used, the inoculum and working banks of which were certified in accordance with the WHO requirements for the production of immunobiological preparations [4, 11]. For cultivation, the ampoule from the working bank with cells is thawed in a water bath at a temperature of 37 ^° C, the suspension is transferred to a culture vessel, incubated in a MEM needle culture medium with the addition of 10% cattle fetal serum at 37 ^° C and passaged until the required cell volume is obtained then the cell monolayer is subjected to enzymatic treatment (a mixture of a 0.02% versene solution and 0.025% trypsin), a cell suspension is collected, combined with a gel. For the growth of fibroblasts, biodegradable collagen microcarriers are used [12]. A suspension of fibroblasts is added to the concentrated suspension of microcarriers, incubated at 37 ^{° C.} , periodically mixing to completely distribute and spread the cells on the microcarriers, then the nutrient medium is added to the desired volume. On the 4-7th day of cultivation, microcarriers with a cell monolayer are precipitated and combined with a gel. The resulting gel with cells on microcarriers is placed in a sterile vial and transported to a medical facility.

Далее на предварительно приготовленную раневую поверхность стерильным шпателем наносится тонким слоем заявляемое средство и закрывается неадгезивной повязкой. На 2-5 сутки после пересадки производится перевязка. Next, on a pre-prepared wound surface with a sterile spatula, the claimed agent is applied with a thin layer and closed with a non-adhesive dressing. 2-5 days after transplantation, dressing is performed.

Существенным признаком данного изобретения является:
- использование гелевой формы для иммобилизации клеточног. материала в виде суспензии или выращенного на микроносителях.An essential feature of this invention is:
- the use of a gel form for immobilization of the cellular. material in the form of a suspension or grown on microcarriers.

По совокупности вышеуказанных признаков использование гелевой формы для иммобилизации клеточного материала в виде суспензии или выращенного на микроносителях с последующей трансплантацией на рану свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень". By the totality of the above characteristics, the use of a gel form for immobilization of cellular material in the form of a suspension or grown on microcarriers with subsequent transplantation onto a wound indicates the compliance of the claimed invention with the criterion of "novelty" and "inventive step".

Примеры осуществления предлагаемого изобретения. Examples of the invention.

Пример 1. Приготовление геля с суспензией клеток. Example 1. The preparation of a gel with a suspension of cells.

Для культивирования ампулу с клетками аттестованного диплоидного штамма размораживают на водяной бане при 37^oС, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37^oС и пассируют до получения необходимого количества клеток. Полученный монослой подвергают ферментативной (смесь 0,02% раствора версена и 0,025% раствора трипсина) или механической обработке, собирают суспензию клеток в небольшом объеме питательной среды, доводя концентрацию до 2,5-5,0•10⁶ кл./мл, соединяют с гелем и 10-кратной питательной средой, тщательно перемешивают, переносят в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.For cultivation, the ampoule with the cells of the certified diploid strain is thawed in a water bath at 37 ^° C, the suspension is transferred to a culture vessel, incubated in MEM needles with 10% embryonic cattle serum at 37 ^° C and passaged until the required number of cells is obtained . The obtained monolayer is subjected to enzymatic (a mixture of a 0.02% versene solution and 0.025% trypsin solution) or mechanical treatment, a cell suspension is collected in a small volume of culture medium, bringing the concentration to 2.5-5.0 • 10 ⁶ cells / ml, combined with gel and 10-fold nutrient medium, mix thoroughly, transfer to a sterile vial and transport to a medical facility.

Предлагаемый состав содержит, %:
Суспензия клеток в питательной среде - 20
Среда ИГЛА MEM 10-кратная - 10
Гель полиэтиленоксида - 70
Пример 2. Приготовление геля с клетками, выращенными в виде монослоя на коллагеновых микроносителях.The proposed composition contains,%:
Cell suspension in a nutrient medium - 20
MEM NEEDLE 10x - 10
Polyethylene Oxide Gel - 70
Example 2. The preparation of a gel with cells grown as a monolayer on collagen microcarriers.

Размораживание и культивирование клеток проводят аналогично примеру 1. При последнем субкультивировании используют коллагеновые микроносители. Thawing and culturing of cells is carried out analogously to example 1. With the last subculture using collagen microcarriers.

К микроносителям добавляют выращенную клеточную суспензию, доводят концентрацию клеток до 3,0•10⁵ кл./мл, добавляя питательную среду ИГЛА MEM до нужного объема, инкубируют при 37^oС при постоянном перемешивании. На 3-4 сутки после образования монослоя микроносители осаждают, соединяют с гелем и 10-кратной питательной средой, осторожно перемешивают, переносят в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.The grown cell suspension is added to the microcarriers, the cell concentration is adjusted to 3.0 • 10 ⁵ cells / ml, adding MEMA MEM nutrient medium to the required volume, incubated at 37 ^° C with constant stirring. 3-4 days after the formation of the monolayer, the microcarriers are precipitated, combined with a gel and a 10-fold nutrient medium, carefully mixed, transferred to a sterile vial and transported to a medical facility.

Предлагаемый состав содержит, %:
Суспензия микроносителей с выращенным клеточным монослоем - 20
Среда ИГЛА MEM 10-кратная - 10
Гель полиэтиленоксида - 70
Пример 3. Способ лечения трофических язв.The proposed composition contains,%:
Microcarrier suspension with grown cell monolayer - 20
MEM NEEDLE 10x - 10
Polyethylene Oxide Gel - 70
Example 3. A method for the treatment of trophic ulcers.

Больному А. с диабетом, 44 года, с некротической язвой на пяточной области, не заживающей около года, была произведена трансплантация культивированных аллофибробластов, включенных в виде суспензии в гель полиэтиленоксида. На участках с поражением на 8-е сутки наблюдалась краевая эпителизация. Полная эпителизация произошла на 32-е сутки. A patient A. with diabetes, 44 years old, with a necrotic ulcer in the calcaneal region that does not heal for about a year, underwent transplantation of cultured allofibroblasts, which are included in the suspension in a polyethylene oxide gel. In areas with lesions on the 8th day, marginal epithelization was observed. Complete epithelization occurred on the 32nd day.

Пример 4. Способ лечения глубоких ожогов. Example 4. A method for the treatment of deep burns.

Больному В. с послеожоговой раной, не заживающей в течение 3 месяцев, трансплантировали суспензию микроносителей с клетками диплоидного штамма, включенными в гель. На 2-е сутки наблюдалась краевая эпителизация, на 7-е сутки появились островки эпителия, на 15-е сутки произошла полная эпителизация раны. Patient B. with a post-burn wound that did not heal for 3 months was transplanted with a suspension of microcarriers with diploid strain cells included in the gel. On the 2nd day, marginal epithelization was observed, on the 7th day, epithelial islands appeared, on the 15th day, the wound was completely epithelized.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что данные средство и способ оказываются эффективными при лечении глубоких кожных ранах. Thus, the above examples show that these tool and method are effective in the treatment of deep skin wounds.

Список литературы
1. Саркисов Д. С., Глушенко Е.В., Гуруков Ш.Р. и др. Бюллетень экспер. биол. и мед. 1991. Т. 5, 542, с. 542-544.List of references
1. Sarkisov D. S., Glushenko E. V., Gurukov Sh. R. et al. Bulletin expert. biol. and honey. 1991.Vol. 5, 542, p. 542-544.

2. Глушенко Е.В., Алексеев А.А., Морозов С.С. и др. Хирургия, 1993, 11, 26-29. 2. Glushenko E.V., Alekseev A.A., Morozov S.S. et al. Surgery, 1993, 11, 26-29.

3. Саркисов Д.С., Алексеев А.А., Глушенко Е.В., и др. Вестн. РАМН, 1994, т. 6, с. 6-11. 3. Sarkisov D.S., Alekseev A.A., Glushenko E.V., et al. Vestn. RAMS, 1994, v. 6, p. 6-11.

4. Колокольцова Т. Д. , Юрченко Н.Д., Колосов Н.Г. и др. Вестник РАМН, 1998, 3, с. 32-35. 4. Kolokoltsova T. D., Yurchenko N. D., Kolosov N. G. et al. Vestnik RAMS, 1998, 3, p. 32-35.

5. Заявка РФ 93037867/14 "Способ лечения длительно незаживающих ран и трофических язв кожных покровов". А 61 К 35/14. 5. Application of the Russian Federation 93037867/14 "A method for the treatment of long non-healing wounds and trophic ulcers of the skin." A 61 K 35/14.

6. Lubertret L. Skin Pharmacol 1990, 3, Р. 144-148. 6. Lubertret L. Skin Pharmacol 1990, 3, P. 144-148.

7. Jeffry R, Yarmush M. Science 1997, 4, P. 6-15. 7. Jeffry R, Yarmush M. Science 1997, 4, P. 6-15.

8. Freshney R.I. Culture of Animal Cells. Second Editor - 1987, Alan R. Liss, Inc., New York. 8. Freshney R.I. Culture of Animal Cells. Second Editor - 1987, Alan R. Liss, Inc., New York.

9. Патент РФ 2139044 "Средство для лечения гнойно-некротических ран и ожогов "коллагель". 6 А 61 К 9/06, 38/48, бюл. 28. 9. RF patent 2139044 "Means for the treatment of purulent-necrotic wounds and burns" collagen ". 6 A 61 K 9/06, 38/48, bull. 28.

10. Патент РФ 2142820 "Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии". 6 А 61 L 27/00, бюл. 35. 10. RF patent 2142820 "Allograft for restoration of the skin, method for its preparation and method for restoration of the skin in case of injuries of various etiologies." 6 A 61 L 27/00, bull. 35.

11. Патент РФ 2112545 "Способ получения живой коревой вакцины". А 61 К 35/19, бюл. 16. 11. RF patent 2112545 "Method for producing live measles vaccine." A 61 K 35/19, bull. 16.

12. Патент РФ 2010028 "Способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных". С 12 N 5/00, бюл. 6. 12. RF patent 2010028 "Method for restoring the skin of seriously burned". C 12 N 5/00, bull. 6.

Claims

1. An agent for treating deep skin defects based on cultured fibroblast cells of a diploid human strain, characterized in that it contains a suspension of cells or microcarriers with cells and culture medium and carrier in a volume ratio
Suspension of cells in the culture medium of Igla MEM with a cell concentration of 2.5-5.0 • 10 ⁶ cells / ml or suspension of microcarriers in the culture medium of Igla MEM with a grown cell monolayer,% - 3.0 - 25
Nutrient medium for cell cultures,% - 10
Carrier,% - The rest is up to 100
2. The tool according to p. 1, characterized in that as a nutrient medium for cell cultures using the medium MEMA 10-fold, and as a carrier - gel of polyethylene oxide.