RU2186056C1

RU2186056C1 - Method of separation of tryptophan and phenylalanine mixture

Info

Publication number: RU2186056C1
Application number: RU2000128191A
Authority: RU
Inventors: А.В. Казначеев; В.Ю. Хохлов; В.Ф. Селеменев
Original assignee: Воронежский государственный университет
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2002-07-27

Abstract

FIELD: amino acids, chemical technology. SUBSTANCE: invention relates to methods of isolation of individual amino acids from their mixtures. Process is carried out at increased rate of amino acids passing through anionite AV-17-2P in OH-form and the use of sodium hydroxide solution as an eluent converting sorbent to the parent form. Method provides the improved separation of mixture components by 2.4-fold, decreased time of separation cycle by 3 times as compared with equilibrium regime of process carrying out. Method excludes the use of additional stage of ionite regeneration. Invention can be used in chemical, food, microbiological industries and agriculture. EFFECT: enhanced effectiveness of separation of mixture of tryptophan and phenylalanine, essential decrease of process duration, simplified procedure. 1 ex

Description

Изобретение относится к способам выделения индивидуальных ароматических и гетероциклических аминокислот из их смесей и может быть использовано в химической, микробиологической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. The invention relates to methods for the isolation of individual aromatic and heterocyclic amino acids from mixtures thereof and can be used in the chemical, microbiological, food industry, and agriculture.

Известны способы выделения аминокислот, в основе которых лежит классическая ионообменная хроматография [А.с. СССР 644782, С 07 С 99/12, 1979, А. с. СССР 639862, С 07 С 99/12, 1978, А.с. СССР 979991, G 01 N 31/08, 1981, А. с. СССР 960163, С 07 С 99/12, 1982 ]. Недостатками этих способов являются использование для регенерации значительного количества вспомогательных реактивов, наличие стадии предварительной подготовки растворов аминокислот перед пропусканием через ионит, большое время проведения процесса разделения. Наиболее близок к данному изобретению способ разделения пролина с валином (лейцином, оксипролином) [ Патент РФ 2144530 от 16.07.97. ]. Недостатками этого способа является длительность проведения процесса, связанное с низкой скоростью протекания подвижной фазы через слой хроматографического носителя для установления сорбционного равновесия и необходимость регенерации сорбента после проведения каждого цикла разделения. Known methods for the separation of amino acids, which are based on classical ion-exchange chromatography [A.S. USSR 644782, C 07 C 99/12, 1979, A. p. USSR 639862, C 07 C 99/12, 1978, A.S. USSR 979991, G 01 N 31/08, 1981, A. p. USSR 960163, C 07 C 99/12, 1982]. The disadvantages of these methods are the use for the regeneration of a significant amount of auxiliary reagents, the presence of the stage of preliminary preparation of amino acid solutions before passing through the ion exchanger, a long time for the separation process. Closest to this invention is a method for the separation of proline with valine (leucine, hydroxyproline) [RF Patent 2144530 from 16.07.97. ]. The disadvantages of this method is the length of the process associated with the low rate of flow of the mobile phase through the layer of a chromatographic carrier to establish sorption equilibrium and the need for regeneration of the sorbent after each separation cycle.

Задачей предлагаемого способа является повышение эффективности разделения смеси фенилаланина и триптофана при существенном сокращении продолжительности процесса и исключении дополнительной стадии регенерации ионита. The objective of the proposed method is to increase the efficiency of separation of a mixture of phenylalanine and tryptophan with a significant reduction in the duration of the process and the exclusion of an additional stage of regeneration of the ion exchanger.

Поставленная задача достигается пропусканием смеси фенилаланина и триптофана через колонну с анионитом АВ-17-2П [Иониты (каталог). Черкассы: Изд-во НИИТЭХИМ, 1975. 38 с.] в ОН-форме со скоростью 6 мл/мин, элюированием 0,1М раствором NaOH и фракционным выделением растворов фенилаланина и триптофана на выходе из колонны. The problem is achieved by passing a mixture of phenylalanine and tryptophan through a column with anion exchange resin AB-17-2P [Ionites (catalog). Cherkasy: Publishing House of NIITEKHIM, 1975. 38 pp.] In the OH form at a rate of 6 ml / min, eluting with 0.1 M NaOH solution and fractional separation of phenylalanine and tryptophan solutions at the column outlet.

Использование в качестве элюента 0,1М раствора NaOH исключает необходимость регенерации сорбента, так как выделение аминокислот протекает с одновременным переводом ионита в ОН-форму. Предподчтительность выбора указанной скорости протекания подвижной фазы через слой хроматографического носителя обусловлена существованием области динамических сорбционных режимов, в которой повышение скорости пропускания элюента приводит к улучшению разделения компонентов смеси. Максимальное разделение аминокислот наблюдается при скорости пропускания элюента 6 мл/мин. При этом разрешение компонентов увеличивается в 2,4 раза по сравнению с равновесным режимом проведения процесса (скорость пропускания 2 мл/мин) и в 3 раза сокращается время цикла разделения. Дальнейшее увеличение скорости подачи подвижной фазы приводит к ухудшению разделения, так как объемы выхода компонентов приближаются к величине свободного объема колонки. The use of 0.1 M NaOH solution as an eluent eliminates the need for sorbent regeneration, since the release of amino acids proceeds with the simultaneous conversion of the ion exchanger into the OH form. The preference for choosing the indicated flow rate of the mobile phase through the chromatographic support layer is due to the existence of a region of dynamic sorption modes in which an increase in the transmission rate of the eluent leads to an improvement in the separation of the components of the mixture. The maximum separation of amino acids is observed at an eluent transmission rate of 6 ml / min. In this case, the resolution of the components is increased by 2.4 times compared with the equilibrium mode of the process (transmission rate of 2 ml / min) and the separation cycle time is reduced by 3 times. A further increase in the feed rate of the mobile phase leads to a deterioration of separation, since the output volumes of the components approach the value of the free volume of the column.

Пример. Разделение проводят при температуре 20^oС на колонне с высокоосновным анионитом АВ-17-2П в ОН-форме массой 3,0000 г; высота слоя сорбента 12 см. В колонну вводят искусственно приготовленную смесь, содержащую 0,3020 г фенилаланина и 0,1825 г триптофана марки ч.д.а., растворенных в 50 мл 0,01М раствора NaOH. В качестве элюента используют 0,1М раствор NaOH. На выходе из колонны собирают фракции по 25 мл, которые анализируют на содержание разделяемых аминокислот спектрофотометрически на приборе Specord M 40 кварцевых кюветах 1=1 см при 257 нм для фенилаланина и 279 нм для триптофана с учетом влияния аминокислот на аналитический сигнал друг друга. Максимальное разделение аминокислот наблюдается при скорости пропускания элюента 6 мл/мин. При этом разрешение компонентов увеличивается в 2,4 раза по сравнению с равновесным режимом проведения эксперимента (скорость пропускания 2 мл/мин) и в 3 раза сокращается время цикла разделения. Первые 75 мл вытекающего из колонки раствора, не содержащие аминокислот, отбрасывают. Последующие 300 мл, не содержащие триптофан и содержащие фенилаланин в концентрации 0,402 г/л, (что составляет 40% от исходного содержания данной аминокислоты в смеси) собирают. Далее 500 мл вытекающего из колонки раствора содержат как фенилаланин 0,360 г/л (60% от содежания в смеси), так и триптофан 0,166 г/л (45% от содержания в смеси) и направляются на следующий цикл разделения. Последующие 950 мл, не содержащие фенилаланин и содержащие триптофан в концентрации 0,106 г/л (55%), собирают. Таким образом в результате проведения цикла разделения получают три фракции: первая содержит только фенилаланин (0,1206 г) без примеси триптофана; вторая представляет собой смесь аминокислот; третья содержит только триптофан (0,101 г) без примеси фенилаланина. Степень чистоты полученных индивидуальных аминокислот достигает 95% (контроль осуществлялся методом ТСХ согласно [Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. М.: Мир, 1980. Ч.1.295 с. 4.2. 621 с.]).Example. The separation is carried out at a temperature of 20 ^o C on a column with highly basic anion exchange resin AB-17-2P in OH-form weighing 3.0000 g; the height of the sorbent layer is 12 cm. An artificially prepared mixture is introduced into the column, containing 0.3020 g of phenylalanine and 0.1825 g of analytical grade tryptophan dissolved in 50 ml of a 0.01 M NaOH solution. A 0.1 M NaOH solution was used as eluent. 25 ml fractions are collected at the column exit, which are analyzed for the content of shared amino acids spectrophotometrically on a Specord M 40 quartz cuvette 1 = 1 cm at 257 nm for phenylalanine and 279 nm for tryptophan, taking into account the effect of amino acids on each other's analytical signal. The maximum separation of amino acids is observed at an eluent transmission rate of 6 ml / min. Moreover, the resolution of the components increases by 2.4 times compared with the equilibrium mode of the experiment (transmission rate of 2 ml / min) and the separation cycle time is reduced by a factor of 3. The first 75 ml of the resulting amino acid-free solution from the column is discarded. The next 300 ml, not containing tryptophan and containing phenylalanine at a concentration of 0.402 g / l, (which is 40% of the initial content of this amino acid in the mixture) is collected. Then, 500 ml of the solution resulting from the column contain both phenylalanine 0.360 g / l (60% of the content in the mixture) and tryptophan 0.166 g / l (45% of the content in the mixture) and are sent to the next separation cycle. A further 950 ml, not containing phenylalanine and containing tryptophan at a concentration of 0.106 g / L (55%), was collected. Thus, as a result of the separation cycle, three fractions are obtained: the first contains only phenylalanine (0.1206 g) without tryptophan impurity; the second is a mixture of amino acids; the third contains only tryptophan (0.101 g) without phenylalanine impurities. The degree of purity of the obtained individual amino acids reaches 95% (control was carried out by TLC according to [Sharshunova M., Schwartz V., Mikhalets Ch. Thin-layer chromatography in pharmacy and clinical biochemistry. M: Mir, 1980. Part 1.295 p. 4.2. 621 s .]).

Claims

A method for separating a mixture of phenylalanine and tryptophan, including passing the mixture through a column with anion exchange resin AB-17-2P in OH form at a rate of 6 ml / min and eluting with 0.1 M NaOH solution, while phenylalanine solution and tryptophan solution are fractionally isolated from the column. .