RU2183643C1 - Peptide showing biocide activity - Google Patents
Peptide showing biocide activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2183643C1 RU2183643C1 RU2000131492A RU2000131492A RU2183643C1 RU 2183643 C1 RU2183643 C1 RU 2183643C1 RU 2000131492 A RU2000131492 A RU 2000131492A RU 2000131492 A RU2000131492 A RU 2000131492A RU 2183643 C1 RU2183643 C1 RU 2183643C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lys
- butyloxycarbonyl
- trp
- tert
- pro
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым пептидным структурам, обладающим биоцидными, в частности антибактериальными свойствами. The invention relates to the field of biotechnology, namely to new peptide structures having biocidal, in particular antibacterial properties.
К настоящему времени в фармакологии и медицине сложилась ситуация, которую можно охарактеризовать как накопление толерантности к довольно широкому перечню фармакологических препаратов. Это в первую очередь касается антибиотиков. Многие из традиционных антибиотиков, которые во второй половине нашего века были основным инструментом борьбы с различными инфекциями, постепенно теряют свои активные качества вследствие постоянного увеличения числа бактериальных штаммов, устойчивых к используемому препарату (Cassell G.H. Emergent antibiotic resistance: health risks and economic impact // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1997. - v.18.- 4.-p.271-274). To date, a situation has developed in pharmacology and medicine, which can be described as the accumulation of tolerance for a fairly wide range of pharmacological drugs. This is especially true for antibiotics. Many of the traditional antibiotics, which were the main tool in the fight against various infections in the second half of our century, are gradually losing their active qualities due to the constant increase in the number of bacterial strains resistant to the drug used (Cassell GH Emergent antibiotic resistance: health risks and economic impact // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1997.- v.18.- 4.-p.271-274).
Разработка новых активных антибактериальных соединений чрезвычайно актуальна. Одним из возможных путей решения проблемы является создание препаратов на основе антибиотических пептидов, которые в настоящее время применяются в практической медицине или проходят клинические испытания как антибиотические, антикандидозные и противоопухолевые средства (Hancock R.E.V. Peptide antibiotics // Lancet - 1997.-v.349.-N 4.-р.418-422; Andreu D., Rivas L. Animal antimicrobial peptides: an overview // Biopolymers (Peptide Science) - 1998.- v.47.- 6.-p.415-433). The development of new active antibacterial compounds is extremely relevant. One of the possible ways to solve the problem is to create drugs based on antibiotic peptides that are currently used in practical medicine or are undergoing clinical trials as antibiotic, anti-candidiasis and antitumor drugs (Hancock REV Peptide antibiotics // Lancet - 1997.-v.349.- N 4.-p. 418-422; Andreu D., Rivas L. Animal antimicrobial peptides: an overview // Biopolymers (Peptide Science) - 1998.- v.47.- 6.-p.415-433).
Механизм уничтожения клеток микроорганизмов такими пептидами связан со способностью этих соединений образовывать при взаимодействии с двойным слоем липидной мембраны клеток амфипатичные спирали, для которых характерны катион обогащенные и гидрофобные участки, что приводит к лизису клетки. The mechanism of destruction of microorganism cells by such peptides is associated with the ability of these compounds to form amphipathic helices when interacting with a double layer of the lipid membrane of cells, which are characterized by cation-rich and hydrophobic regions, which leads to cell lysis.
Побочным действием антибиотических пептидов на фоне их высокого антибиотического эффекта является цитолитическая активность в отношении ряда нормальных клеток / Bikshapathy E., Sitaram N., Nagaraj R. Addition and omission analogs of the 13-residue antibacterial and hemolytic peptide PKLLKTFLSKWIG: structural preferences, model membrane binding and biological activities // J.Pept.Res. - 1999.-v.53.- 1.-р.47-55/. A side effect of antibiotic peptides against the background of their high antibiotic effect is cytolytic activity against a number of normal cells / Bikshapathy E., Sitaram N., Nagaraj R. Addition and omission analogs of the 13-residue antibacterial and hemolytic peptide PKLLKTFLSKWIG: structural preferences, model membrane binding and biological activities // J. Pept. Res. - 1999.-v.53.- 1.-p. 47-55 /.
Наиболее близким к заявляемому решению по структуре и свойствам являлся пептид индолицидин общей формулы (1):
(1) H-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2, (Selsted M. E. , Novotny M.J., Morris W.L, Tang Y.Q., Smith W., Cullor J.S., Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J.Biol. Chemistry. - vol.267. - 7. - 1992. - p.4292-4295), который обладает антимикробным действием по отношению к широкому кругу микроорганизмов, в частности к бактериям, грибам, вирусам и т.д.Closest to the claimed solution in terms of structure and properties was the indolecidine peptide of general formula (1):
(1) H-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 , (Selsted ME, Novotny MJ, Morris WL, Tang YQ, Smith W. , Cullor JS, Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J. Biol. Chemistry. - vol. 267. - 7. - 1992. - p.4292-4295), which has an antimicrobial effect in relation to a wide range microorganisms, in particular bacteria, fungi, viruses, etc.
Недостатком индолицидина является наличие высокой гемолитической активности. The disadvantage of indolicidin is the presence of high hemolytic activity.
Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлась разработка более эффективных и безопасных пептидов, лишенных побочного цитотоксического эффекта в отношении эритроцитов крови, то есть не обладающих гемолитической активностью. The challenge facing the authors in the creation of the present invention was the development of more effective and safe peptides, devoid of side cytotoxic effect against red blood cells, that is, not having hemolytic activity.
Было найдено, что стоящая перед авторами задача решается путем создания пептида общей формулы (2):
(2) H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys -;
c, d = -Lys- или -Тrр-;
e = -Arg- или -Ala-.It was found that the task facing the authors is solved by creating a peptide of the general formula (2):
(2) Ha-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH 2 ,
where a = -Ile- or -Lys-;
b = -Pro- or -Lys -;
c, d = -Lys- or -Trp-;
e = -Arg- or -Ala-.
Лучшие результаты были получены при использовании пептидов (3-7)
(3) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(4) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(5) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH2,
(6) H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(7) H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2.The best results were obtained using peptides (3-7)
(3) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 ,
(4) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 ,
(5) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH 2 ,
(6) H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 ,
(7) H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 .
Пептиды получают твердофазным методом Меррифилда (Memfield R.B. and Barany G. Solid Phase peptide synthesis. // The Pepthides. Analysis Synthesis, Biology. - Eds. Gross K., Meinhofer J., N.Y. - Academic Press. - 1980. - vol. 2. - р.3.) на метилбензгидриламинополимере с использованием Вос-технологии. Peptides are prepared by the Merrifield solid phase method (Memfield RB and Barany G. Solid Phase peptide synthesis. // The Pepthides. Analysis Synthesis, Biology. - Eds. Gross K., Meinhofer J., NY - Academic Press. - 1980. - vol. 2 . - p.3.) on methylbenzhydrylaminopolymer using Boc technology.
Для временной защиты α-аминогрупп используют трет.-бутилоксикарбонильную защитную группировку. Индольные кольца триптофана блокируют формильной группой, гуаногруппы аргинина - нитрогруппами, ε-аминогруппы лизина- 2-хлорбензилоксикарбонильной защитой. Наращивание пептидной цепи осуществляют с помощью оксибензотриазоловых эфиров с нейтрализацией in situ (Schnolzer M., Alewood P. , Jones A., Alewood D., Kent S.B.H. In situ neutralization solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assemdly of difficult sequences. // Int.J.Pept.Prot.Res. - 1992.-v.40.- 2 -p.180-193). For temporary protection of the α-amino groups, a tert-butyloxycarbonyl protecting group is used. The indole tryptophan rings are blocked with the formyl group, the arginine guano groups with nitro groups, the lysine ε-amino group with 2-chlorobenzyloxycarbonyl protection. The growth of the peptide chain is carried out using oxybenzotriazole esters with in situ neutralization (Schnolzer M., Alewood P., Jones A., Alewood D., Kent SBH In situ neutralization solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assemdly of difficult sequences. // Int.J. Pept.Prot.Res. - 1992.-v.40.- 2 -p.180-193).
Полноту протекания реакции контролируют нингидриновым тестом. Отщепление от смолы и удаление защитных групп проводят в два этапа. На первом этапе, непосредственно на полимере с помощью пиперидина удаляют формильные группы, на втором этапе - фтористым водородом в присутствии анизола производят окончательное деблокирование и отщепление пептида от смолы. The completeness of the reaction is controlled by the ninhydrin test. Cleavage from the resin and removal of the protective groups is carried out in two stages. At the first stage, formyl groups are removed directly with piperidine directly on the polymer, and at the second stage, with the use of hydrogen fluoride in the presence of anisole, the peptide is finally released and the peptide is cleaved from the resin.
Очистку синтезированных пептидов проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) на обращенной фазе. Purification of the synthesized peptides is carried out using high-performance liquid chromatography high pressure (HPLC) on reverse phase.
Чистота полученных при этом препаратов была более 95%. Все они имели удовлетворительный аминокислотный анализ и были индивидуальны по данным аналитической ВЭЖХ. The purity of the resulting preparations was more than 95%. All had a satisfactory amino acid analysis and were individual according to analytical HPLC.
Промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами. The industrial applicability of the invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (3)
Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г. Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-аргинин-метил-бензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание аргинина 1,0 ммол/г полимера. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в табл. 1.Example 1. Synthesis of the peptide H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 (3)
To synthesize the peptide, 0.2 g of N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω- nitro-arginine-methyl-benzhydrylaminopolymer in 10 ml of dimethylformamide were loaded into the reaction vessel. The arginine content of 1.0 mmol / g of polymer. The peptide chain was further expanded from the C-terminus according to the program given in table. 1.
Если нингидриновый тест положителен, повторяли конденсацию, начиная с п. 7. If the ninhydrin test is positive, the condensation is repeated starting from
Для синтеза пептида (3) к исходному Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутил-оксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутил-оксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.For the synthesis of peptide (3) to the initial N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L-arginine-methylbenzhydrylaminopolymer according to the program given in Table 1, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L-arginine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl were sequentially attached -N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -t-butyl-hydroxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tret-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl- L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine and N-tert-butyloxycarbonyl-L-isoleucine.
По завершении синтеза пептидил-полимер высушивали в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и 0,2 г пептидил-полимера деблокировали по программе, приведенной в табл. 2. Upon completion of the synthesis, the peptidyl polymer was dried in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide and 0.2 g of the peptidyl polymer were released according to the program given in Table. 2.
Лиофилизат подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому. The lyophilisate was purified by reverse phase chromatography on a
Пример 2. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (4)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (4) осуществляли теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в таблице 1, последовательно присоединяли Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.Example 2. Synthesis of the peptide H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 (4)
The synthesis, deblocking, purification and characterization of the peptide (4) was carried out in the same manner as the peptide (3) of Example 1, except that for its preparation to the starting N α -t-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-arginine- According to the program in Table 1, methylbenzhydrylamino polymer was sequentially coupled with N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω- nitro-L-arginine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, tert-butyloxycarbonyl-L -proline, N α -t-butyloxycarbonyl-N ε -hlorbenziloksikarbonil-L-lysine, N α -t-butyloxycarbonyl-N in -for yl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -t-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N α -t-butyloxycarbonyl-N ε -hlorbenziloksikarbonil-L-lysine, N α tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine and N-tert-butyloxycarbonyl-L-isoleucine.
Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Obtained as a result of release according to the program given in table. 2, the lyophilized peptide was purified by reverse phase chromatography on a
Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому. The content of the main substance, according to optical density, is not less than 95%. The amino acid composition of the peptide is consistent with the theoretical.
Пример 3. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH2 (5)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (5) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-L-аланин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил
The synthesis, deblocking, purification and characterization of the peptide (5) are carried out in the same manner as the peptide (3) of Example 1, except that for its preparation to the original N α -t-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L- arginine-methylbenzhydrylaminopolymer according to the program given in table. 1, N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl were sequentially attached
Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Obtained as a result of release according to the program given in table. 2, the lyophilized peptide was purified by reverse phase chromatography on a
Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому. The content of the main substance, according to optical density, is not less than 95%. The amino acid composition of the peptide is consistent with the theoretical.
Пример 4. Синтез пептида H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2= (6)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (6) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитрo-L-аргинин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин.Example 4. The synthesis of the peptide H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH 2 = (6)
The synthesis, deblocking, purification and characterization of the peptide (6) are carried out in the same manner as the peptide (3) of Example 1, except that for its preparation to the original N α -t-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L- arginine-methylbenzhydrylamino-polymer according to the program given in table. 1, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L-arginine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl were sequentially attached -N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L- tryptophan, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tret-butyloxycarbonyl -N ε α-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine; and N α -t-butyloxycarbonyl-N ε -chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine.
Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Obtained as a result of release according to the program given in table. 2, the lyophilized peptide was purified by reverse phase chromatography on a
Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому. The content of the main substance, according to optical density, is not less than 95%. The amino acid composition of the peptide is consistent with the theoretical.
Пример 5. Синтез пептида H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (7)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (7) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nω-нитро-L-аргинин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, 
The synthesis, deblocking, purification and characterization of the peptide (7) are carried out in the same ways as the peptide (3) of Example 1, except that for its preparation to the original N α -t-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L- arginine-methylbenzhydrylaminopolymer according to the program given in table. 1, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ω -nitro-L-arginine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tert-butyloxycarbonyl were sequentially attached -N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan, N-tert-butyloxycarbonyl-L-proline, N α -tret-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L- lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N ε- chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine, N α -tert-butyloxycarbonyl-N in -formyl-L-tryptophan,
Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Obtained as a result of release according to the program given in table. 2, the lyophilized peptide was purified by reverse phase chromatography on a
Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому. The content of the main substance, according to optical density, is not less than 95%. The amino acid composition of the peptide is consistent with the theoretical.
Пример 6. Влияние синтезированных пептидов на рост микроорганизмов. Example 6. The effect of synthesized peptides on the growth of microorganisms.
Культуры клеток, выращенные на твердой питательной среде, выдерживали сутки в холодильнике при +6oС. Перед измерением клетки снимали петлей в жидкую среду LB и доводили концентрацию до 5•106 -107 клеток/мл. В стерильные планшеты "Costar" для клеточных культур (96 ячеек) вносили по 50 мкл раствора пептида в воде (концентрация 200 мкг/мл) и по 100 мкл суспензии клеток в среде LB, и проводили далее разбавление с шагом 2. Инкубировали планшеты в течение 16 часов при 37oС, встряхивали планшеты при комнатной температуре в течение 20-30 минут для взвешивания клеток и снимали показатели оптической плотности на ридере для планшет при длине волны 490 нм.Cell cultures grown on solid nutrient medium were kept in the refrigerator at + 6 ° C for 24 hours. Before measurement, the cells were looped off in LB liquid medium and the concentration was adjusted to 5 · 10 6 -10 7 cells / ml. 50 μl of a peptide solution in water (200 μg / ml concentration) and 100 μl of a cell suspension in LB medium were added to Costar sterile cell culture plates (96 cells) and 100 μl of the cell suspension in LB medium were further diluted in
Считали средний контроль (без пептида) и оценивали % подавления роста микроорганизма по сравнению с контролем. The average control (without peptide) was counted and the% inhibition of microorganism growth was evaluated compared to the control.
Результаты испытаний приведены в табл. 3. The test results are given in table. 3.
Пример 7. Гемолитическая активность пептидов. Example 7. Hemolytic activity of peptides.
Эритроциты человека (кровь берется на гепарин) отмывали 3 раза верональным буфером (VBS) и разводили до концентрации 0,5% (об.) в VBS. Образцы пептидов разводили в концентрации 200 мкг/мл в VBS, при этом начальная концентрация пептида в ячейке составляла 100 мкг. Human red blood cells (blood is taken on heparin) were washed 3 times with Veronal Buffer (VBS) and diluted to a concentration of 0.5% (vol.) In VBS. Peptide samples were diluted at a concentration of 200 μg / ml in VBS, while the initial concentration of the peptide in the cell was 100 μg.
Раствор пептида вносили в ячейки стерильной планшеты для клеточных культур фирмы "Costar", начиная с концентрации 100 мкг препарата и 50 мкг эритроцитов человека в ячейку. Проводили раститровывание с шагом 2. Планшеты инкубировали 1 час при 37oС, центрифугировали, отбирали супернатант и проводили скрининг оптической плотности при 415 нм.The peptide solution was added to the cells of a sterile Costar cell culture plate, starting at a concentration of 100 μg of the preparation and 50 μg of human red blood cells per cell. The rasterization was performed in
В качестве контроля использовали: К1 - VBS без пептида; К2 - VBS с 1% тритоном Х-100. Полученные показатели гемолиза обрабатывали по формуле:
Результаты испытаний приведены в табл. 4.As control was used: K 1 - VBS without peptide; K 2 - VBS with 1% Triton X-100. The obtained hemolysis parameters were processed according to the formula:
The test results are given in table. 4.
Полученные данные свидетельствуют, что пептиды заявляемой структуры сочетают более высокую по сравнению с индолицидином биоцидную активность с отсутствием повреждающего воздействия на клетки крови. Проведенные испытания пептидов при внутреннем введении в дозе до 1,5 мг/кг путем инъекции соединения в физиологическом растворе в хвостовую вену белых беспородных мышей показали отсутствие токсичности для всех предлагаемых пептидов. The data obtained indicate that the peptides of the claimed structure combine a higher biocidal activity compared to indolicidin with the absence of a damaging effect on blood cells. Tests of peptides when administered internally at a dose of up to 1.5 mg / kg by injection of the compound in saline into the tail vein of outbred mice showed no toxicity for all of the proposed peptides.
Claims (1)
H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys-;
с, d = -Lys- или -Trp-;
е = Arg или Ala,
обладающий биоцидной активностью.The peptide of the General formula
Ha-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH 2 ,
where a = -Ile- or -Lys-;
b = -Pro- or -Lys-;
c, d = -Lys- or -Trp-;
e = Arg or Ala,
possessing biocidal activity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000131492A RU2183643C1 (en) | 2000-12-18 | 2000-12-18 | Peptide showing biocide activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000131492A RU2183643C1 (en) | 2000-12-18 | 2000-12-18 | Peptide showing biocide activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2183643C1 true RU2183643C1 (en) | 2002-06-20 |
Family
ID=20243462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000131492A RU2183643C1 (en) | 2000-12-18 | 2000-12-18 | Peptide showing biocide activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2183643C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503685C2 (en) * | 2008-11-26 | 2014-01-10 | Литикс Биофарма Ас | Nonapeptide with antitumour activity |
| WO2018143840A1 (en) | 2017-02-06 | 2018-08-09 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" | Biocidal peptide and preparation based thereon |
-
2000
- 2000-12-18 RU RU2000131492A patent/RU2183643C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503685C2 (en) * | 2008-11-26 | 2014-01-10 | Литикс Биофарма Ас | Nonapeptide with antitumour activity |
| WO2018143840A1 (en) | 2017-02-06 | 2018-08-09 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" | Biocidal peptide and preparation based thereon |
| RU2678985C2 (en) * | 2017-02-06 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" | Biocidal peptide and the preparation on its basis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101413746B1 (en) | Cyclic antimicrobial peptides | |
| ES2532392T3 (en) | Antimicrobial peptides | |
| JP5688290B2 (en) | Antibacterial peptide | |
| CN101111256A (en) | Antimicrobial peptides and methods of use | |
| EP2735570B1 (en) | Antibiotic peptide and preparation method therefor and application thereof | |
| JP5524858B2 (en) | Antibacterial compounds | |
| DE102009007381A1 (en) | Antibiotic peptides | |
| US7745390B2 (en) | Antimicrobial peptides | |
| CN111363010B (en) | Symmetrical short-sequence antibacterial peptide analogue and application thereof | |
| US7262163B2 (en) | Short amphipathic peptides with activity against bacteria and intracellular pathogens | |
| TWI403330B (en) | Low hemolysis antibacterial peptide pharmaceutical compositions and use thereof | |
| JP6124139B2 (en) | Low erythrocyte lytic antimicrobial peptide, pharmaceutical composition and use thereof | |
| CN113045628B (en) | Application of antibacterial peptide or variant thereof in preparation of antibacterial product | |
| WO2003016339A1 (en) | A frog skin antibacterial peptide derivative | |
| US11059860B2 (en) | Biocidal peptide and preparation based thereon | |
| RU2183643C1 (en) | Peptide showing biocide activity | |
| CN110054664B (en) | Side chain fatty acid modified antibacterial peptide analogue containing D-type amino acid and synthesis and application thereof | |
| CN103288924B (en) | Catfish antimicrobial peptide mutant and preparation method thereof | |
| US20200071357A1 (en) | Antimicrobial peptides | |
| RU2302467C1 (en) | Latarcin peptides having antibacterial activity | |
| RU2302466C1 (en) | Latarcin peptides having antibacterial activity | |
| WO2024037263A1 (en) | Synthetic peptide having low toxicity in vivo for inhibiting generation of toxins of staphylococcus aureus and use thereof | |
| KR20010052664A (en) | Crosslink-stabilized indolicidin analogs | |
| CN115010788B (en) | N-terminal fatty acid modified low-toxicity broad-spectrum antibacterial peptide analogue with antibacterial film activity and application thereof | |
| WO2024018398A1 (en) | Lipooligoureas, pharmaceutical composition, and lipooligoureas for use as medicament |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081219 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191219 |