RU2178464C2

RU2178464C2 - Method to detect integration of foreign dna into animal genome at embryonic stage

Info

Publication number: RU2178464C2
Application number: RU99121128/13A
Authority: RU
Inventors: А.Р. Амиров; Г.О. Шайхаев; бых В.П. Р; В.П. Рябых
Original assignee: Амиров Абдурашид Рамазанович; Рябых Владимир Павлович; Шайхаев Гаджирамазан Омарович
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2002-01-20

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method includes the following stages: introduction of gene-engineering construction into an embryo, embryonic cultivation up to blastocyst stage, blastocystic trophoblast biopsy, isolation of total DNA out of a cut-off trophoblast fragment, total DNA microfractioning by a nonsubmarine electrophoresis variant due to sealing the holes with 0.8%-agarose at low temperature of solidification at division to low- and high- molecular fractions, detection of transgenic integration into embryonic genome. EFFECT: increased efficiency of technology in obtaining transgenic animals. 2 tbl

Description

Изобретение относится к области биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных, и может быть применено для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных. The invention relates to the field of biology, in particular to biotechnology for producing transgenic animals, and can be used to increase the efficiency of technology for producing transgenic animals.

В настоящее время получение трансгенных животных осуществляется, главным образом, путем микроинъекции генноинженерных конструкций в эмбрионы ранних стадий развития. Однако низкая вероятность интеграции чужеродной ДНК в геном эмбрионов и снижение жизнеспособности определенной части эмбрионов после введения генноинженерной конструкции создает необходимость в содержании большого числа животных-реципиентов, которым трансплантируются эти эмбрионы, что делает работы по получению трансгенных животных дорогостоящими. Currently, the production of transgenic animals is carried out mainly by microinjection of genetically engineered structures into embryos of the early stages of development. However, the low probability of the integration of foreign DNA into the embryo genome and the decrease in the viability of a certain part of the embryos after the introduction of the genetic engineering construct creates the need for the maintenance of a large number of recipient animals to which these embryos are transplanted, which makes the production of transgenic animals expensive.

В связи с этим важное значение придается поиску путей, позволяющих уменьшить поголовье животных, используемых в работах по получению первичных трансгенных животных. In this regard, great importance is attached to the search for ways to reduce the number of animals used in the production of primary transgenic animals.

Одним из путей решения проблемы может быть разработка эффективного способа определения интеграции чужеродной ДНК в геном эмбрионов животных на доимплантационных стадиях развития, то есть до их трансплантации животным-реципиентам, что даст возможность трансплантировать животным-реципиентам только эмбрионы с точно установленной интеграцией введенного чужеродного гена и существенно сократить число используемых животных-реципиентов и расходы на их приобретение и длительное содержание во время подготовки к трансплантации эмбрионов и периода беременности. One way to solve the problem may be to develop an effective method for determining the integration of foreign DNA into the genome of animal embryos at preimplantation stages of development, that is, prior to their transplantation to recipient animals, which will allow transplanting only embryos with precisely established integration of the introduced foreign gene and significantly reduce the number of recipient animals used and the costs of their acquisition and long-term maintenance during preparation for embryo transplantation and period of pregnancy.

Известно два основных способа определения интеграции чужеродной ДНК на стадии эмбрионов, до трансплантации их животным-реципиентам, с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ анализа с использованием прямого метода ПЦР (прототип). There are two main methods for determining the integration of foreign DNA at the stage of embryos, before transplantation to their recipient animals, using the polymerase chain reaction (PCR) method. The closest in technical essence to the proposed invention is a method of analysis using the direct PCR method (prototype).

Первый способ определения интеграции генноинженерных конструкций в геном животных на стадии доимплантационных эмбрионов основан на использовании прямого метода ПЦР, сущность которого заключается в следующем. Оплодотворенные яйцеклетки (зиготы) на стадии двух пронуклеусов микроинъецируют генноинженерной конструкцией (чужеродной ДНК) в один из пронуклеусов. После этого их культивируют in vitro до стадии расширенной или вылупившейся бластоцисты. От каждой бластоцисты отсекают фрагмент трофобласта (20-25 бластомеров), из этих бластомеров выделяют ДНК, которую используют для анализа интеграции введенной генноинженерной конструкции методом ПЦР. Данный способ анализа называется прямым, так как никаких дополнительных манипуляций с ДНК, выделенной из бластомеров, не производится. В то время, пока проводится анализ интеграции методом ПЦР, биопсированные эмбрионы продолжают культивировать до момента определения интеграции в их геном генноинженерной конструкции, введенной в зиготу. Эмбрионы с установленной интеграцией трансгена трансплантируют животным-реципиентам (King D. , Wall R. I. Identifikation of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplifikation: Detektion of a transgene. (Mol. Repr. Dev. - 1988/N1, p. 57-62). The first method for determining the integration of genetic engineering constructs in the animal genome at the stage of pre-implantation embryos is based on the use of the direct PCR method, the essence of which is as follows. Fertilized eggs (zygotes) at the stage of two pronuclei are microinjected by a genetic engineering construct (foreign DNA) into one of the pronuclei. After that, they are cultured in vitro to the stage of expanded or hatching blastocysts. A trophoblast fragment (20-25 blastomeres) is cut off from each blastocyst, and DNA is isolated from these blastomeres, which is used to analyze the integration of the introduced genetic engineering construct by PCR. This method of analysis is called direct, since no additional manipulations with DNA isolated from blastomeres are performed. While the analysis of integration by PCR is being carried out, biopsy embryos continue to be cultivated until the integration of the genetic engineering construct introduced into the zygote into their genome is determined. Embryos with established transgene integration are transplanted into recipient animals (King D., Wall RI Identifikation of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplifikation: Detektion of a transgene. (Mol. Repr. Dev. - 1988 / N1, p. 57-62 )

Однако как показали дальнейшие исследования, недостатком способа являлось то, что данный способ анализа методом прямого ПЦР выявлял слишком высокий процент интеграции трансгена в эмбрионы (до 70-80%), который затем не совпадал с количеством трансгенных потомков, родившихся из этих эмбрионов, то есть при этом способе определения наблюдался очень высокий ложноположительный результат. Выяснение причин этого эффекта показало, что неинтегрированная чужеродная ДНК имеет довольно длительный период "полужизни" как внутри эмбриона, так и на его поверхности, и отдельные участки ее хорошо сохраняются 6-8 дней, пока эмбрион развивается от зиготы до стадии бластоцисты. Поэтому, когда проводится анализ интеграции методом ПЦР, амплифицируется как ДНК, интегрированная в геном эмбриона, так и свободная - неинтегрированная. В результате чего и получается высокий ложноположительный результат. However, further studies showed that the disadvantage of this method was that this direct PCR analysis method revealed a too high percentage of transgene integration into embryos (up to 70-80%), which then did not coincide with the number of transgenic offspring born from these embryos, i.e. with this method of determination, a very high false-positive result was observed. Clarification of the causes of this effect showed that non-integrated foreign DNA has a rather long half-life period both inside the embryo and on its surface, and its individual parts are well preserved for 6-8 days, until the embryo develops from the zygote to the blastocyst stage. Therefore, when an analysis of integration by PCR is carried out, both the DNA integrated in the embryo genome is amplified, and the free - non-integrated one. As a result, a high false-positive result is obtained.

Второй способ. С целью исключения ложноположительных результатов был предложен модифицированный метод ПЦР, основанный на принципе биохимического различия между интегрированной и неинтегрированной генноинженерными конструкциями. Этот способ основан на использовании рестриктной эндонуклеазы Dpn-I. Это универсальная рестриктаза расщепляет последовательность GATC только в том случае, если аденин (А) в этой последовательности находится в метилированном состоянии. Клетки эукариот не обладают способностью метилировать аденин. Однако такой способностью обладают бактериальные клетки, поэтому генноинженерные конструкции перед введением их в эмбрионы метилируют бактериальной dam-метилазой и таким образом аденин в последовательности GATC делают метилированным. Если после введения генноинженерной конструкции в эмбрион она интегрируется в хромосомную ДНК эмбриона, то после репликации трансгена в процессе деления клеток эмбриона метилированный аденин в хромосомной ДНК в последовательности GATC заменяется на неметилированный, а неинтегрированная конструкция продолжает нести в своем составе метилированный аденин. Поэтому, когда ДНК, выделенную из фрагментов трофобласта эмбрионов, обрабатывают рестриктазой Dpn-I, неинтегрированная конструкция расщепляется в последовательностях GATC, а интегрированная и реплицированная остается нетронутой, что и позволяет определять интеграцию трансгена методом ПЦР. Ферментативный метод расщепления свободной (неинтегрированной) генноинженерной конструкции позволил несколько сократить процент полученных ложноположительных результатов. Однако, разрушить остатки неинтегрированной конструкции при этом способе полностью не удается, и оставшаяся часть этой ДНК амплифицируется при проведение ПЦР и тем самым создает условия для получения ложноположительного результата. Кроме того, проведение нескольких последовательных ферментативных реакций снижало выход конечного продукта амплификации в каждой реакции и, следовательно, эффективность метода в целом. (Cousens С. , Carver A. S. , Wilmut I. et. al. Use of PCR-based metod for selection of integration transgenes in preimplantation embryos. /Mol. Reprod. - 1994, N 39, p. 384-391). Поэтому для анализа требуется отсекать от эмбриона значительное число клеток трофобласта, что ведет к снижению жизнеспособности анализируемых эмбрионов. Таким образом, оба вышеприведенных способа определения интеграции в геном эмбрионов введенных генноинженерных конструкций не позволяют избавиться от остатков неинтегрированной конструкции и избежать получения ложноположительных результатов. The second way. In order to eliminate false positive results, a modified PCR method was proposed based on the principle of biochemical differences between integrated and non-integrated genetically engineered constructs. This method is based on the use of restriction endonuclease Dpn-I. This universal restriction enzyme cleaves the GATC sequence only if the adenine (A) in this sequence is in a methylated state. Eukaryotic cells do not have the ability to methylate adenine. However, bacterial cells have this ability, therefore, genetic engineering constructs are methylated with bacterial dam-methylase before introducing them into embryos and thus adenine is methylated in the GATC sequence. If, after the introduction of the genetic engineering construct into the embryo, it is integrated into the chromosomal DNA of the embryo, then after the transgene is replicated, the methylated adenine in the chromosomal DNA in the GATC sequence is replaced by unmethylated in the GATC sequence and the non-integrated construct continues to contain methylated adenine. Therefore, when DNA isolated from embryo trophoblast fragments is treated with restriction enzyme Dpn-I, the non-integrated construct is cleaved in the GATC sequences, and the integrated and replicated remains intact, which allows to determine the transgene integration by PCR. The enzymatic method of splitting the free (non-integrated) genetic engineering construct allowed us to slightly reduce the percentage of false-positive results. However, it is not possible to completely destroy the remnants of the non-integrated structure with this method, and the remainder of this DNA is amplified by PCR and thereby creates the conditions for obtaining a false-positive result. In addition, several consecutive enzymatic reactions reduced the yield of the final amplification product in each reaction and, consequently, the effectiveness of the method as a whole. (Cousens C., Carver A. S., Wilmut I. et. Al. Use of PCR-based method for selection of integration transgenes in preimplantation embryos. / Mol. Reprod. - 1994, N 39, p. 384-391). Therefore, the analysis requires cutting off a significant number of trophoblast cells from the embryo, which leads to a decrease in the viability of the analyzed embryos. Thus, both of the above methods for determining the integration of the introduced genetic engineering constructs into the embryo genome do not allow to get rid of the remnants of the non-integrated construct and avoid obtaining false positive results.

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения истинной интеграции в геном эмбрионов генноинженерных конструкций, введенных в эмбрионы, и исключения возможности получения ложноположительных результатов для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных. The aim of the present invention is to develop a method for determining the true integration into the genome of embryos of genetically engineered constructs introduced into embryos, and excluding the possibility of obtaining false-positive results to increase the efficiency of the technology for producing transgenic animals.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения интеграции чужеродной ДНК в геном животных на стадии эмбриона, включающем введение генноинженерных конструкций в эмбрионы, культивирование этих эмбрионов до стадии бластоцисты, биопсию определенной части трофобласта бластоцист и использование отсеченного фрагмента трофобласта для определения интеграции в геном животных введенной чужеродной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), перед проведением ПЦР-анализа производят микрофракционирование тотальной ДНК, выделенной из отсеченных фрагментов трофобласта эмбрионов методом электрофореза в агарозном геле, в результате которого происходит разделение тотальной ДНК на высокомолекулярную хромосомную ДНК, в которую входит интегрированная в геном генноинженерная конструкция, и низкомолекулярную фракцию, в состав которой входят остатки неинтегрированной конструкции, и затем для определения интеграции трансгена в геном эмбриона методом ПЦР используют фракцию высокомолекулярной ДНК. This goal is achieved by the fact that in the known method for determining the integration of foreign DNA into the animal genome at the embryo stage, including the introduction of genetic engineering constructs into embryos, culturing these embryos to the blastocyst stage, biopsy of a certain part of the blastocyst trophoblast and using a truncated trophoblast fragment to determine integration into the animal genome introduced foreign DNA by the method of polymerase chain reaction (PCR), before conducting PCR analysis, microfractionation of total D NK extracted from cutoff fragments of trophoblast of embryos by agarose gel electrophoresis, which results in the separation of total DNA into high molecular weight chromosomal DNA, which includes the genetic engineering construct integrated into the genome, and a low molecular weight fraction, which contains the remains of the non-integrated construct, and then for to determine the integration of the transgene into the embryo genome by PCR, a fraction of high molecular weight DNA is used.

После проведения электрофореза фракцию высокомолекулярной ДНК каждого образца вырезают из геля одноразовыми пластиковыми трубочками, диаметр которых не превышает ширины зубца гребенки. After electrophoresis, the fraction of high molecular weight DNA of each sample is cut out of the gel with disposable plastic tubes, the diameter of which does not exceed the width of the comb tooth.

Из полученных срезов агарозного геля проводят быструю элюцию высокомолекулярной ДНК, которую используют для дальнейшего анализа с помощью высокочувствительного варианта ПЦР (one tube nested PCR). Кроме того, для исключения перекрестной контаминации содержимого лунок между собой, в процессе проведения электрофореза лунки, заполненные тотальной ДНК, выделенной из бластомеров, сверху запечатывают 0,8% агарозой с низкой температурой застывания, и буфер, используемый для электрофореза, заливают только до верхнего уровня агарозного геля (несубмариновый электрофорез). From the obtained sections of the agarose gel, fast elution of high molecular weight DNA is carried out, which is used for further analysis using a highly sensitive variant of PCR (one tube nested PCR). In addition, to prevent cross-contamination of the contents of the wells with each other, during electrophoresis, the wells filled with total DNA isolated from blastomeres are sealed with 0.8% low pour point agarose on top, and the buffer used for electrophoresis is filled only to the upper level agarose gel (nonsubmarin electrophoresis).

Таким образом, основной отличительной особенностью вновь предлагаемого способа является микрофракционирование, перед проведением ПЦР-анализа, тотальной ДНК, выделенной из бластомеров эмбриона, на высокомолекулярную фракцию, в состав которой входит интегрированная в геном эмбриона чужеродная ДНК, и низкомолекулярную фракцию, в состав которой входит неинтегрированная генноинженерная конструкция. Для дальнейшего анализа методом ПЦР используют только фракцию высокомолекулярной ДНК. Thus, the main distinguishing feature of the newly proposed method is microfractionation, before PCR analysis, of the total DNA isolated from the blastomeres of the embryo into a high molecular weight fraction, which includes foreign DNA integrated into the embryo genome, and a low molecular weight fraction, which includes non-integrated genetic engineering design. For further analysis by PCR, only a fraction of high molecular weight DNA is used.

Пример 1. Для полной и всесторонней проверки эффективности разработанной системы анализа были проведены эксперименты по определению интеграции введенных чужеродных генов в геном эмбрионов. В пронуклеусы 80 мышиных зигот была микроинъецирована чужеродная ДНК. Из них 45% зародышей развилось in vitro до стадии бластоцисты, которые затем были разделены на два фрагмента. Две половинки одной бластоцисты являлись контролем и опытом по отношению друг к другу. Лизис клеток этих фрагментов и выделение из них ДНК проводились по общепринятым методам. Example 1. To fully and comprehensively verify the effectiveness of the developed analysis system, experiments were carried out to determine the integration of introduced foreign genes into the embryo genome. Foreign DNA was microinjected into pronuclei of 80 murine zygotes. Of these, 45% of the embryos developed in vitro to the blastocyst stage, which were then divided into two fragments. Two halves of one blastocyst were control and experience in relation to each other. Lysis of the cells of these fragments and isolation of DNA from them was carried out according to generally accepted methods.

Выделенную тотальную ДНК вносили в лунки 0,8% агарозного геля и запечатывали их сверху 0,8% агарозой с низкой температурой застывания. Буферный раствор заливали только до верхнего уровня агарозного геля. После проведения электрофореза высокомолекулярную ДНК каждого образца вырезали из геля одноразовыми трубочками. Из вырезанных фрагментов геля общепринятым методом проводили элюцию высокомолекулярной ДНК, которую использовали для дальнейшего анализа с помощью высокочувствительного варианта ПНР (one tube nested PCR). The isolated total DNA was added to the wells of 0.8% agarose gel and sealed on top with 0.8% low pour point agarose. The buffer solution was poured only to the upper level of the agarose gel. After electrophoresis, the high molecular weight DNA of each sample was excised from the gel with disposable tubes. High molecular weight DNA was eluted from the excised gel fragments by the standard method, which was used for further analysis using a highly sensitive version of the PNR (one tube nested PCR).

Анализ результатов этого эксперимента показал (табл. 1), что путем микрофракционирования тотальной ДНК эмбрионов в агарозном геле можно полностью отделить неинтегрированную ДНК генноинженерной конструкции от интегрированной в геном эмбриона. An analysis of the results of this experiment showed (Table 1) that by microfractionation of the total DNA of the embryos in an agarose gel, it is possible to completely separate the non-integrated DNA of the genetic engineering construct from the integrated into the embryo genome.

Пример 2. С целью проверки вновь предлагаемого способа в условиях практической работы проведен эксперимент на мышах. Для работы были использованы гибридные мыши (CBAхC57B1) первого поколения, эмбрионы которых достаточно хорошо проходят двуклеточный блок при культивировании вне организма до стадии бластоцисты. Эмбрионы на стадии зиготы, полученные от мышей-доноров, микроинъецировали генноинженерной конструкцией, включающей нуклеотидные последовательности гена эритропоэтина человека под промотором aS1-казеина. Микроинъецированные зиготы культивировали in vitro до стадии бластоцисты. После чего от каждой бластоцисты был отсечен фрагмент трофобласта (15-20 бластомеров), каждый из которых был разделен на две части и использован для определения интеграции инъецированной в зиготы генноинженерной конструкции. При этом в одной части фрагмента определение интеграции проводили прямым методом ПЦР, а в другой по вновь предлагаемому способу с микрофракционированием ДНК (пример 1). Example 2. In order to verify the newly proposed method in the conditions of practical work, an experiment was conducted on mice. For work, first-generation hybrid mice (CBAxC57B1) were used, the embryos of which pass the bicellular block quite well when cultured outside the body to the blastocyst stage. Zygotic embryos obtained from donor mice were microinjected with a genetic engineering construct comprising the nucleotide sequences of the human erythropoietin gene under the aS1-casein promoter. Microinjected zygotes were cultured in vitro to the blastocyst stage. After that, a trophoblast fragment (15–20 blastomeres) was cut off from each blastocyst, each of which was divided into two parts and used to determine the integration of the genetic engineering construct injected into zygotes. Moreover, in one part of the fragment, the determination of integration was carried out by direct PCR method, and in the other according to the newly proposed method with microfractionation of DNA (example 1).

После проведения ПЦР-анализа все оперированные бластоцисты были трансплантированы самкам-реципиентам по 6-7 штук каждому реципиенту. Сравнительный анализ эффективности вновь предложенного и известного способов показал (табл. 2), что при определении интеграции трансгена на стадии эмбриона вновь предложенным способом с признаками интеграции оказалось 17,6% эмбрионов, тогда как при определении прямым методом ПЦР с признаками интеграции оказалось 76,5% эмбрионов. Однако анализ интеграции трансгена, проведенный на мышах, родившихся из этих эмбрионов, показал, что только 15,8% потомков оказались трансгенными, т. е. это практически тот процент трансгенности (17,6%), который был определен при использовании вновь предлагаемого способа определения интеграции с микрофракционированием ДНК эмбрионов. Тогда как 76,5% интеграции, определенной прямым методом ПЦР, являлось явно завышенным и представляло собой ложноположительный результат. Кроме того, 6 эмбрионов с признаками интеграции трансгена, выявленные с помощью вновь предлагаемого способа, были трансплантированы трем из пяти самкам-реципиентам, и именно от этих трех самок были получены три трансгенных мышонка, что еще раз подтверждает правильность определения интеграции вновь предлагаемым способом. After PCR analysis, all operated blastocysts were transplanted to female recipients of 6-7 pieces for each recipient. A comparative analysis of the effectiveness of the newly proposed and known methods showed (Table 2) that when determining the transgene integration at the embryo stage, the newly proposed method with signs of integration turned out to be 17.6% of embryos, while when determining by direct PCR method with signs of integration, it turned out to be 76.5 % embryos. However, the analysis of transgene integration carried out on mice born from these embryos showed that only 15.8% of the offspring turned out to be transgenic, i.e. this is practically the percentage of transgenicity (17.6%) that was determined using the newly proposed method determination of integration with microfractionation of embryo DNA. Whereas 76.5% of the integration determined by the direct PCR method was clearly overpriced and represented a false positive result. In addition, 6 embryos with signs of transgene integration, identified using the newly proposed method, were transplanted into three out of five female recipients, and it was from these three females that three transgenic mice were obtained, which once again confirms the correctness of the determination of integration by the newly proposed method.

Таким образом, в эксперименте с рождением трансгенных мышей показано, что вновь предлагаемый способ определения интеграции трансгена на стадии эмбриона с использованием принципа микрофракционирования тотальной ДНК клеток трофобласта позволяет определять истинную интеграцию трансгена в геном животных, в то время как прямой метод ПЦР не позволяет выявить истинной картины интеграции и дает очень высокий процент ложноположительных результатов. Thus, in an experiment with the birth of transgenic mice, it was shown that the newly proposed method for determining transgene integration at the embryo stage using the principle of microfraction of the total DNA of trophoblast cells allows one to determine the true integration of the transgene into the animal genome, while the direct PCR method does not allow to reveal the true picture integration and gives a very high percentage of false positive results.

Claims

A method for determining the integration of foreign DNA into the animal genome at the embryo stage, including the introduction of a genetic engineering construct into embryos, culturing them to the blastocyst stage, blastocyst trophoblast biopsy, isolation of total DNA from the trofoblast fragment and using total DNA to determine the integration of introduced foreign DNA into the genome embryo by the method of polymerase chain reaction (PCR), characterized in that to determine the true integration of the transgene into the embryo genome and increase the efficiency of techno ogii producing transgenic animals for conducting PCR using high molecular weight DNA fraction, total DNA isolated from an embryo by pre mikrofraktsionirovaniya total DNA embryo nesubmarinovym one sealing electrophoresis 0.8% agarose wells with low pour point.