RU2176392C2 - Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens - Google Patents
Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens Download PDFInfo
- Publication number
- RU2176392C2 RU2176392C2 RU99123796/13A RU99123796A RU2176392C2 RU 2176392 C2 RU2176392 C2 RU 2176392C2 RU 99123796/13 A RU99123796/13 A RU 99123796/13A RU 99123796 A RU99123796 A RU 99123796A RU 2176392 C2 RU2176392 C2 RU 2176392C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigens
- leukocytes
- immunogenicity
- mucor
- cytoplasmic fraction
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, в частности микологии, и может быть использовано для оптимизации контроля процесса культивирования культур грибов и иммунологической оценки антигенов. The invention relates to microbiology, in particular mycology, and can be used to optimize the control of the cultivation of fungal cultures and the immunological evaluation of antigens.
Иммуногенная активность микроорганизмов является определяющим моментом при изготовлении антигенов для диагностических наборов и лечебно-профилактических препаратов. The immunogenic activity of microorganisms is a defining moment in the manufacture of antigens for diagnostic kits and therapeutic drugs.
Известно, что в проявлении иммуногенных свойств у грибов родов: Candida, Aspergillus и Mucor основную роль играют растворимые антигены. Растворимые антигены цитоплазмы грибов на различных этапах культивирования имеют неоднородный состав. Поэтому при культивировании грибов целесообразно учитывать стадии их роста, которые влияют на антигенный состав и соответственно на проявление иммуногенных свойств. It is known that in the manifestation of immunogenic properties in fungi of the genera: Candida, Aspergillus, and Mucor, the main role is played by soluble antigens. The soluble antigens of the cytoplasm of fungi at different stages of cultivation have a heterogeneous composition. Therefore, when cultivating fungi, it is advisable to take into account the stages of their growth, which affect the antigenic composition and, accordingly, the manifestation of immunogenic properties.
Известен способ оценки иммуногенности культур (см. Карпухин Г.И., Шапиро Н. И., Андриевская Р.А. "Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций", Л., "Медицина", 1979, с. 99-112) путем расчета коэффициента иммунологической эффективности по тесту активной защиты мышей (АЗМ), заключающийся в иммунологической оценке защиты животных от летальных доз инфекции в сравнении с интактными мышами или с действием стандартных антигенов. A known method for assessing the immunogenicity of cultures (see Karpukhin G.I., Shapiro N.I., Andrievskaya R.A. "Chemical vaccines for the prevention of intestinal infections", L., "Medicine", 1979, S. 99-112) the calculation of the coefficient of immunological effectiveness according to the test of active protection of mice (AZM), which consists in the immunological assessment of the protection of animals from lethal doses of infection in comparison with intact mice or with the action of standard antigens.
Однако, способ оценки иммуногенности по тесту АЗМ недостаточно точен, что обусловлено своеобразием характера зависимости доза-эффект в системе антиген- организм. Это своеобразие определяется выраженной неоднородностью индивидуальных реакций животных на иммунизацию, которая зависит от гетерогенности используемых в опытах животных и специфики взаимодействия иммуногенных субстанций с физиологическими системами организма. В соответствии с законами статистики этот недостаток теста АЗМ может быть устранен только при использовании большего числа животных. However, the method for assessing immunogenicity by the AZM test is not accurate enough, due to the uniqueness of the nature of the dose-effect relationship in the antigen-organism system. This peculiarity is determined by the pronounced heterogeneity of individual animal responses to immunization, which depends on the heterogeneity of the animals used in the experiments and the specifics of the interaction of immunogenic substances with the physiological systems of the body. In accordance with the laws of statistics, this drawback of the AZM test can only be eliminated by using more animals.
Известен способ оценки иммуногенности микробных культур (см. а.с. СССР N 1818348 по кл. C 12 Q 1/00, опуб. 30.05.93 г.), заключающийся в подкожной иммунизации экспериментальных животных и оценке результатов, при этом на 6-8-е сутки после иммунизации выделяют перитонеальные макрофаги, разделяют их на субпопуляции, а иммуногенность оценивают по величине соотношения между популяциями. A known method for assessing the immunogenicity of microbial cultures (see AS USSR N 1818348 according to class C 12
Однако, способ трудоемок и не экономичен, поскольку для его реализации требуется много лабораторных животных, а процедура разделения перитонеальных макрофагов на субпопуляции длительна и сложна. Кроме этого, способ используется только для определения иммуногенности противочумных вакцин и не предназначен для определения иммуногенности антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor. However, the method is time-consuming and not economical, since many laboratory animals are required for its implementation, and the procedure for separating peritoneal macrophages into subpopulations is long and complicated. In addition, the method is used only to determine the immunogenicity of anti-plague vaccines and is not intended to determine the immunogenicity of antigens of fungi of the genus Candida, Aspergillus and Mucor.
Известен также способ оценки иммуногенности микробных культур (см. Карпухин Г.И., Шапиро Н.И., Андриевская Р.А. "Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций", Л., "Медицина", 1979 г.), заключающийся в иммунизации лабораторных животных, исследовании сыворотки крови этих животных с помощью серологических реакций и оценке отдельных показателей факторов иммунитета (например, титров агглютинации, фагоцитарной активности и пр.). There is also a method of assessing the immunogenicity of microbial cultures (see Karpukhin G.I., Shapiro N.I., Andrievskaya R.A. "Chemical vaccines for the prevention of intestinal infections", L., "Medicine", 1979), which consists in immunization of laboratory animals, the study of blood serum of these animals using serological reactions and the evaluation of certain indicators of immunity factors (for example, titres of agglutination, phagocytic activity, etc.).
Однако, данный метод неприменим при оценке иммуногенности антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor. Кроме этого, титры агглютининов не отражают степени эффективности иммунизации, а свидетельствуют только о подготовке антигенов грибов к действию комплемента и фагоцитов. Способ так же, как и предыдущий аналог, не экономичен и трудоемок, так как для его реализации требуются лабораторные животные, их иммунизация и серологические исследования сыворотки крови. However, this method is not applicable in assessing the immunogenicity of antigens of fungi of the genus Candida, Aspergillus and Mucor. In addition, agglutinin titers do not reflect the degree of effectiveness of immunization, but indicate only the preparation of fungal antigens for the action of complement and phagocytes. The method, like the previous analogue, is not economical and time-consuming, since its implementation requires laboratory animals, their immunization and serological studies of blood serum.
Наиболее близким к заявляемому является способ оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов (см. Федотов В.Б., Ласкавый В.Н. "Сравнительное определение иммуногенности эшерихий методом агломерации лейкоцитов", Бюллетень ВИЭВ, вып.5, М., 1985, с. 24-25), заключающийся в смешивании антигенов эшерихий с комплементом морской свинки, добавлении стабилизированной крови кролика, инкубировании смеси, приготовлении мазков, окрашивании их 0,1%-ным раствором метиленовой сини, выборе фиксированного анализируемого количества лейкоцитов (в данном методе - 1000 лейкоцитов), определении среди них количества склеенных лейкоцитов и оценке иммуногенности по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов. Closest to the claimed is a method for assessing the immunogenicity of antigens of microorganisms (see Fedotov VB, Laskavy VN "Comparative determination of the immunogenicity of Escherichia by the method of agglomeration of leukocytes", Bulletin VIEV,
Однако, способ направлен на решение задачи оценки иммуногенности эшерихий по определению К-антигена и не предназначен для определения степени иммуногенности антигенов культур грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, более того следует отметить, что К-антигены у культур грибов вообще отсутствуют. However, the method is aimed at solving the problem of assessing the immunogenicity of Escherichia by the definition of K-antigen and is not intended to determine the degree of immunogenicity of antigens of cultures of fungi of the genus Candida, Aspergillus and Mucor, moreover, it should be noted that there are no K-antigens in fungal cultures.
Кроме этого, способ трудоемок, так как предполагает подсчет не менее 1000 лейкоцитов вследствие получения низких коэффициентов агломерации (1,8-5,6) с антигенами эшерихий. In addition, the method is time-consuming, since it involves counting at least 1000 leukocytes due to obtaining low agglomeration coefficients (1.8-5.6) with Escherichia antigens.
Изобретение направлено на решение задачи оценки иммуногенности растворимых антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor при дешевизне и простоте способа. The invention is aimed at solving the problem of assessing the immunogenicity of soluble antigens of fungi of the genus Candida, Aspergillus and Mucor with the cheapness and simplicity of the method.
Для решения поставленной задачи в способе оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов, заключающемся в смешивании антигенов с комплементом морской свинки, добавлении стабилизированной крови кролика, инкубировании смеси и приготовлении мазков, выборе фиксированного анализируемого количества лейкоцитов, определении среди них числа склеенных (агломерированных) лейкоцитов и оценке результатов по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов, согласно изобретению, в качестве антигенов микроорганизмов используют цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, после инкубирования смеси дополнительно осуществляют фиксацию мазка метиловым спиртом, анализируемое количество лейкоцитов выбирают равным 100, а антигены считают иммуногенными при величине индекса агломерации 6-16%. При этом, антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Candida считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-10%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Aspergillus считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-16%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Mucor считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-15%. To solve this problem, in a method for assessing the immunogenicity of microorganism antigens, which consists in mixing antigens with complement of guinea pig, adding stabilized rabbit blood, incubating the mixture and preparing smears, choosing a fixed analyzed number of white blood cells, determining the number of glued (agglomerated) white blood cells among them and evaluating the results of the size of the agglomeration index as the ratio of the number of glued white blood cells to the analyzed number of white blood cells, according to the invention, in achestve microbial antigens using cytoplasmic fraction of fungi Candida, Aspergillus and Mucor, after incubation mixture further comprises methyl alcohol swab fixation, number of leukocytes analyte is selected to be 100, and the antigens are immunogenic when considered agglomeration index value of 6-16%. Moreover, the antigen in the form of the cytoplasmic fraction of a fungus of the genus Candida is considered immunogenic with an agglomeration index of 6-10%. The antigen in the form of the cytoplasmic fraction of the fungus of the genus Aspergillus is considered immunogenic with a white blood cell agglomeration index of 6-16%. The antigen in the form of the cytoplasmic fraction of a fungus of the genus Mucor is considered immunogenic with a leukocyte agglomeration index of 6-15%.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки иммуногенности антигенов в виде цитоплазматической фракции грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, позволяющего просто и с минимальными затратами оценивать иммуногенность путем определения индекса агломерации лейкоцитов. Более того, в доступных неограниченному кругу лиц литературных источниках не описано каких-либо методов оценки иммуногенности грибковых антигенов рода Candida, Aspergillus и Mucor, что позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом решении критериев "новизна" и "изобретательский уровень". The sources of patent and scientific and technical information known to the authors do not describe a method for assessing the immunogenicity of antigens in the form of a cytoplasmic fraction of fungi of the genus Candida, Aspergillus, and Mucor, which makes it possible to easily and cost-effectively assess immunogenicity by determining the white blood cell agglomeration index. Moreover, in literature available to an unlimited number of people, no methods for assessing the immunogenicity of fungal antigens of the genus Candida, Aspergillus and Mucor are described, which allows us to conclude that the proposed solution has the criteria of "novelty" and "inventive step".
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Получают цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, Aspergillus или Mucor. Для этого из авирулентных штаммов Candida albicans, Aspergillus fumigatus и Mucor racemosus через определенные промежутки культивирования отбирают пробы (не менее трех для каждого исследования). Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки мицелия. При этом, разрушение производят либо с помощью последовательного замораживания и оттаивания проб, либо посредством воздействия ультразвукового дезинтегратора в течение 90 с. Get the cytoplasmic fraction of fungi of the genus Candida, Aspergillus or Mucor. For this purpose, samples (at least three for each study) are taken from avirulent strains of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Mucor racemosus at certain culture intervals. Samples are diluted with saline in a ratio of 1: 5, after which the cell wall of the mycelium is destroyed. In this case, the destruction is carried out either by sequential freezing and thawing of samples, or by exposure to an ultrasonic disintegrator for 90 s.
К полученному антигену добавляют комплемент морской свинки, а затем стабилизированную кровь кролика. Смесь инкубируют, после чего наносят на предметные стекла и осуществляют фиксацию мазков метиловым спиртом в течение 20 мин. Затем мазки окрашивают 0,1%-ным раствором метиленовой сини. Полученные мазки анализируют при увеличении х 450. Для этого выбирают 100 лейкоцитов, среди которых подсчитывают число склеенных, при этом агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Определяют индекс агломерации как отношение числа склеенных в общем числе выбранных для анализа лейкоцитов, а антиген считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-16%. To the resulting antigen is added the complement of guinea pig, and then stabilized rabbit blood. The mixture is incubated, after which it is applied to slides and the smears are fixed with methyl alcohol for 20 minutes. Then the smears are stained with a 0.1% solution of methylene blue. The obtained smears are analyzed at a magnification of x 450. For this, 100 leukocytes are selected, among which the number of glued ones is counted, while those leukocytes that are glued in an amount of at least three are counted as agglomerated. The agglomeration index is determined as the ratio of the number of white blood cells glued in the total number selected for analysis, and the antigen is considered immunogenic with an agglomeration index of 6-16%.
Индекс агломерации для каждого из антигенов был подобран экспериментально путем внутримышечной иммунизации лабораторных кроликов вакцинными препаратами, приготовленными из полученных антигенов культур Candida, Aspergillus и Mucor. Иммунизацию осуществляли по стандартной методике - двукратно с интервалом 8-10 дней в дозе по 5 мл на каждое животное. The agglomeration index for each of the antigens was experimentally selected by intramuscular immunization of laboratory rabbits with vaccines prepared from the obtained antigens of Candida, Aspergillus and Mucor cultures. Immunization was carried out according to the standard method - twice with an interval of 8-10 days in a dose of 5 ml per animal.
Защитные функции организма животных оценивали для препаратов, полученных из антигенов культур Candida - по титру специфических антител с помощью иммуноферментной тест-системы, а из антигенов культур Aspergillus и Mucor - по числу выживших животных после контрольного заражения их вирулентными штаммами. The protective functions of the animal organism were evaluated for preparations obtained from antigens of Candida cultures using the titer of specific antibodies using an enzyme immunoassay system, and from antigens from Aspergillus and Mucor cultures according to the number of surviving animals after infection with their virulent strains.
Пример. Отбирают по 3 пробы культуры гриба из штамма Candida albicans через 8 ч культивирования. Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 90 с, в результате чего получают цитоплазматическую фракцию. Example. 3 samples of fungus culture were taken from the Candida albicans strain after 8 hours of cultivation. Samples are diluted with saline in a ratio of 1: 5, after which the mixture is exposed to an ultrasonic disintegrator for 90 s, resulting in a cytoplasmic fraction.
В пробирки вносят по 0,04 мл полученного антигена гриба рода Candida albicans, добавляют к нему по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 мин при 37oC, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика. При этом, контролем служат антигены с изотоническим раствором хлорида натрия и стабилизированной кровью кролика, а также стабилизированная кровь кролика с комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия.0.04 ml of the obtained antigen of the fungus of the genus Candida albicans are added to the tubes, 0.02 ml of complement of guinea pig is added to it. The mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C, then 0.2 ml of rabbit citrate blood was added. At the same time, antigens with isotonic sodium chloride solution and stabilized rabbit blood serve as control, as well as stabilized rabbit blood with guinea pig complement and isotonic sodium chloride solution.
Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37oC в течение 45 мин.The contents of the tubes are shaken and incubated at 37 o C for 45 minutes
Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, при этом мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 20 мин. Затем мазки окрашивают 0,1%-ным раствором метиленовой сини в течение 5 мин. The mixture of the tubes is applied to a glass slide and smears are made, while the smears are fixed with methyl alcohol for 20 minutes. Then the smears are stained with 0.1% methylene blue for 5 minutes.
Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 и выбирают для анализа 100 лейкоцитов. Среди них выявляют число склеенных - 11. Поскольку индекс агломерации равен 11%, антиген считают слабо иммуногенным. Stained smears are examined under a microscope at x450 magnification and 100 leukocytes are selected for analysis. Among them, the number of glued ones is revealed - 11. Since the agglomeration index is 11%, the antigen is considered weakly immunogenic.
Аналогичные исследования проводят с антигенами 16, 22, 28, 36, 47, 56, 64-часовых культур. Similar studies are carried out with
В таблицах 1-3 представлены результаты оценки иммуногенности антигенов цитоплазматической фракции грибов Candida albicans, Aspergillus fumigatus и Mucor racemosus, где n - количество проб для каждого времени отбора культур. Tables 1-3 show the results of the evaluation of the immunogenicity of the antigens of the cytoplasmic fraction of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Mucor racemosus fungi, where n is the number of samples for each culture time.
Таким образом, заявляемый способ позволяет при минимальных затратах быстро, эффективно и просто определять иммуногенность антигенов грибов рода Candida, Aspergillus, Mucor. Thus, the claimed method allows for minimal cost to quickly, efficiently and simply determine the immunogenicity of antigens of fungi of the genus Candida, Aspergillus, Mucor.
Для реализации способа не требуется использование лабораторных животных. To implement the method does not require the use of laboratory animals.
Предлагаемый способ позволил решить проблему определения иммуногенности грибковых антигенов. The proposed method allowed to solve the problem of determining the immunogenicity of fungal antigens.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99123796/13A RU2176392C2 (en) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99123796/13A RU2176392C2 (en) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2176392C2 true RU2176392C2 (en) | 2001-11-27 |
| RU99123796A RU99123796A (en) | 2001-11-27 |
Family
ID=20226871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99123796/13A RU2176392C2 (en) | 1999-11-10 | 1999-11-10 | Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2176392C2 (en) |
-
1999
- 1999-11-10 RU RU99123796/13A patent/RU2176392C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ФЕДОТОВ В.Б., ЛАСКАВЫЙ В.А. Сравнительное определение иммуногенности эшерихий методом агломерации лейкоцитов. Бюллетень ВИЭВ. Вып. 5. - М.: 1985, с. 24 и 25. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baldwin et al. | Demonstration of tumour-specific humoral antibody against aminoazo dye-induced rat hepatomata. | |
| Verwey | A type-specific antigenic protein derived from the Staphylococcus | |
| Smith et al. | Detection of delayed hypersensitivity in mice injected with ribonucleic acid-protein fractions of Salmonella typhimurium | |
| US4066744A (en) | Serological reagent, test slide and method for gonorrheal antibodies | |
| Denning et al. | Candida albicans and the chemotaxis of polymorphonuclear neutrophils | |
| Landau et al. | The rapid formation in serum of filaments by Candida albicans | |
| Langer et al. | Bacillus anthracis peptidoglycan stimulates an inflammatory response in monocytes through the p38 mitogen-activated protein kinase pathway | |
| Champer et al. | Protein targets for broad‐spectrum mycosis vaccines: quantitative proteomic analysis of Aspergillus and Coccidioides and comparisons with other fungal pathogens | |
| US3636192A (en) | Meningococcal polysaccharide vaccines | |
| Kasper et al. | Quantitative determination of the antibody response to the capsular polysaccharide of Bacteroides jragilis in an animal model of intraabdominal abscess formation | |
| Zarember et al. | Innate immunity against Granulibacter bethesdensis, an emerging gram-negative bacterial pathogen | |
| Smith et al. | The relationship between rubella hemagglutination inhibition antibody (HIA) and rubella induced in vitro lymphocyte tritiated thymidine incorporation | |
| RU2176392C2 (en) | Method of estimation of immunogenicity of microorganism antigens | |
| Campbell | Serology in the respiratory mycoses | |
| Rake et al. | A rapid method for estimation of penicillin | |
| Kemp et al. | Fluorescent antibody studies of pathogenesis in experimental Candida albicans infections of mice | |
| Seabury et al. | Characterization of thermophilic actinomycetes isolated from residential heating and humidification systems | |
| Cai et al. | Pathogenic effects of biofilm on Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection and its relationship to cytokines | |
| Philpot et al. | Detection of antibodies to Aspergillus fumigatus in agar gel with different antigens and immunodiffusion patterns | |
| SU1673973A1 (en) | Method for diagnosis of plant diseases, caused by pseudomonas syringae of iv serogroup | |
| Eldering | A STUDY OF THE ANTIGENIC PROPERTIES OF HEMOPHILUS PERTUSSIS AND RELATED ORGANISMS: I. AN ANTIGENIC FRACTION OBTAINED FROM BRUCELLA BRONCHISEPTICA | |
| JP2001141730A (en) | Diagnostic and preventive method of leptospirosis using mannan derived from phodotorula | |
| Widen et al. | Blastogenic responsiveness of spleen cells from guinea pigs sensitized to Legionella pneumophila antigens | |
| Galiullin et al. | Development of luminescent serum for diagnostics of animal bacillus anthracix agent | |
| Fujiwara et al. | The relationship of common saprophytic and pathogenic fungi to the Forssman and other antigens of the sheep erythrocyte |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041111 |