RU2173167C2 - Method of direction of cellular immune response against hiv-infected mammalian cell, protein membrane-bound chimeric receptor, dna - Google Patents
Method of direction of cellular immune response against hiv-infected mammalian cell, protein membrane-bound chimeric receptor, dnaInfo
- Publication number
- RU2173167C2 RU2173167C2 RU96118239A RU96118239A RU2173167C2 RU 2173167 C2 RU2173167 C2 RU 2173167C2 RU 96118239 A RU96118239 A RU 96118239A RU 96118239 A RU96118239 A RU 96118239A RU 2173167 C2 RU2173167 C2 RU 2173167C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptor
- cells
- hiv
- cell
- infected
- Prior art date
Links
- 108020001747 chimeric receptor Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 25
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 title claims abstract 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 370
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 claims abstract description 65
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims abstract description 41
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 208000005721 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000001820 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 108060001251 CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100016492 CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100019453 CD7 Human genes 0.000 claims description 63
- 101700063101 CD7 Proteins 0.000 claims description 63
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 54
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 31
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 claims description 11
- 108091008154 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002463 transducing Effects 0.000 claims description 7
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 5
- 102000005781 Nogo Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108020003872 Nogo Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 15
- 230000002934 lysing Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001976 improved Effects 0.000 abstract description 2
- 102000027634 intracellular receptors Human genes 0.000 abstract 1
- 108091007905 intracellular receptors Proteins 0.000 abstract 1
- 101710044656 FCGR3A Proteins 0.000 description 147
- 102100015541 FCGR3A Human genes 0.000 description 147
- 101710044657 FCGR3B Proteins 0.000 description 147
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 65
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 description 52
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 47
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 47
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 44
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 37
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 34
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 33
- 101710023234 Segment 5 Proteins 0.000 description 32
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 31
- 230000004044 response Effects 0.000 description 31
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 31
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 30
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 30
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 27
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 26
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 26
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 25
- 239000002609 media Substances 0.000 description 22
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 21
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 21
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 20
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 19
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 18
- 102100005828 CD5 Human genes 0.000 description 17
- 101700066525 CD5 Proteins 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 102200036154 HBE1 D15G Human genes 0.000 description 15
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 11
- 101700026084 THY1 Proteins 0.000 description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 11
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 11
- 102100013077 CD4 Human genes 0.000 description 10
- 102000033180 ERVK-6 Human genes 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 9
- 108090001095 Immunoglobulin G Proteins 0.000 description 9
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 9
- 101710038044 ERVK-6 Proteins 0.000 description 8
- 101710027967 ERVW-1 Proteins 0.000 description 8
- 102200035590 MAP6D1 C11G Human genes 0.000 description 8
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 8
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 8
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 8
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 7
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 7
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 101710042981 SHMT1 Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- 102100001172 TPPP Human genes 0.000 description 5
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 5
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 4
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 210000003714 Granulocytes Anatomy 0.000 description 4
- 101710006403 HSPA5 Proteins 0.000 description 4
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 4
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 4
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 4
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 4
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 102100004936 MRO Human genes 0.000 description 4
- 101710017556 MRO Proteins 0.000 description 4
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 4
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Destomysin Chemical compound OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 229940097277 Hygromycin B Drugs 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N Indo-1 dye Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 210000000138 Mast Cells Anatomy 0.000 description 3
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 101700028070 VPX Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 101700042113 tap Proteins 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 102200027876 ACTL6A D63N Human genes 0.000 description 2
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004366 CD4-Positive T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 2
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 2
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102200047493 HLA-DQB1 Y62S Human genes 0.000 description 2
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N Iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 229940057428 LACTOPEROXIDASE Drugs 0.000 description 2
- 102000028880 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229960004452 Methionine Drugs 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000393 Muromonab-CD3 Proteins 0.000 description 2
- 229960000951 Mycophenolic Acid Drugs 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 2
- 102200100443 OR5I1 L50S Human genes 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102200003612 SELPLG Y51F Human genes 0.000 description 2
- 102200033271 SULT1A2 Y62F Human genes 0.000 description 2
- 208000000389 T-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 2
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 2
- 102200041287 WBP11 E60Q Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- -1 inositol phosphates Chemical class 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000644 propagated Effects 0.000 description 2
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting Effects 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000003369 syncitium Anatomy 0.000 description 2
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102200014712 AMD1 E61Q Human genes 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003651 Basophils Anatomy 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010015776 EC 1.1.3.4 Proteins 0.000 description 1
- 102000016615 EC 2.7.7.49 Human genes 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102100016044 FAM162A Human genes 0.000 description 1
- 101710039389 FAM162A Proteins 0.000 description 1
- 101710044633 FCER1G Proteins 0.000 description 1
- 102100007619 FCER1G Human genes 0.000 description 1
- 101700009480 Fcgr3 Proteins 0.000 description 1
- 229940116332 GLUCOSE OXIDASE Drugs 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100005616 HLA-DQA2 Human genes 0.000 description 1
- 101710031486 HLA-DQA2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000777 Hematopoietic System Anatomy 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010021460 Immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229960000367 Inositol Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 101710013542 MDV050 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000282 Nails Anatomy 0.000 description 1
- 229920002332 Noncoding DNA Polymers 0.000 description 1
- 101700083447 OCT3 Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002741 Palatine Tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000009182 Parasitemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006551 Parasitic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 108050006987 Poxvirus Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710019780 SLC22A3 Proteins 0.000 description 1
- 102100017016 SLC22A3 Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 210000003283 T-Lymphocytes, Helper-Inducer Anatomy 0.000 description 1
- 101710028952 TP_0022 Proteins 0.000 description 1
- 210000000538 Tail Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 101710043875 Vi01_157c Proteins 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 1
- 102000030793 Zeta family Human genes 0.000 description 1
- 108091014342 Zeta family Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 101700029313 bag Proteins 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001201 calcium accumulation Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002083 cellular DNA Polymers 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 108090001120 delta Opioid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000528 effect on cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 108010044294 eta-kappa antigen T cell receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 101710037048 gene 20 Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000014725 late viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 201000005505 measles Diseases 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003606 oligomerizing Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 101710014076 phi32_20 Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000896 plasminic Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 1
- 201000002367 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory Effects 0.000 description 1
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 102000035402 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005683 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000004450 types of analysis Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108010065816 zeta chain antigen T cell receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000037229 δ-opioid receptors Human genes 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение было сделано при поддержке Правительства по Контракту N A1 27849, присужденному Национальными Институтами Здоровья. Правительство имеет определенные права в этом изобретении. The invention was made with the support of the Government under Contract N A1 27849, awarded by the National Institutes of Health. The government has certain rights in this invention.
Данное изобретение касается функциональных химер между фрагментами CD4 и рецепторами иммунокомпетентных клеток (иммуноцитов), которые способны направлять иммунокомпетентные клетки на лизис инфицированных ВИЧ клеток, но не делают эти иммунокомпетентные клетки чувствительными к инфекции ВИЧ. Таким образом, это изобретение обеспечивает новое и эффективное терапевтическое средство против ВИЧ. The present invention relates to functional chimeras between CD4 fragments and receptors for immunocompetent cells (immunocytes), which are capable of directing immunocompetent cells to the lysis of HIV-infected cells, but do not make these immunocompetent cells susceptible to HIV infection. Thus, this invention provides a new and effective therapeutic agent against HIV.
Предпосылки изобретения
Узнавание T-клетками антигена через T-клеточный рецептор является основой ряда иммунологических феноменов. T-клетки управляют так называемым клеточно-опосредованным иммунитетом. Он включает в себя разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существуют различные T-клетки, в том числе "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические (или "убийцы") клетки, которые могут непосредственно убивать патологические клетки.BACKGROUND OF THE INVENTION
T-cell recognition of an antigen through a T-cell receptor is the basis of a number of immunological phenomena. T cells control the so-called cell-mediated immunity. It involves the destruction by cells of the immune system of foreign tissues or infected cells. There are various T cells, including helper and suppressor cells that modulate the immune response, and cytotoxic (or "killer") cells that can directly kill pathological cells.
T-клетка, которая узнает и связывает уникальный антиген, обнаруживаемый на поверхности другой клетки, становится активированной; она может затем размножаться и, если она является цитотоксической клеткой, она может убить связанную ею клетку. A T cell that recognizes and binds a unique antigen found on the surface of another cell becomes activated; it can then multiply and, if it is a cytotoxic cell, it can kill the cell bound by it.
ВИЧ и иммунопатогенез
В 1984 году было показано, что ВИЧ является этиологическим агентом СПИДа. С этого времени определение СПИДа пересматривали несколько раз в отношении того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на неустойчивость в диагностических параметрах, простое общее название СПИДа - это инфекция ВИЧ и последующее развитие стойких конституциональных симптомов и определяющих СПИД заболеваний, таких как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологическое заболевание. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., McGraw Hill (1991).HIV and immunopathogenesis
In 1984, it was shown that HIV is the etiological agent of AIDS. Since then, the definition of AIDS has been revised several times regarding what criteria should be included in the diagnosis. However, despite the instability in the diagnostic parameters, the simple common name for AIDS is HIV infection and the subsequent development of persistent constitutional symptoms and AIDS-determining diseases such as secondary infections, neoplasms and neurological disease. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., McGraw Hill (1991).
ВИЧ является человеческим ретровирусом группы лентивирусов. Четыре признанных человеческих ретровирусов принадлежат к двум различным группам: T-лимфотропные (или лейкозные) ретровирусы человека, HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2 (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). Первые являются трансформирующими вирусами, тогда как последние являются цитопатическими вирусами. HIV is a human lentivirus retrovirus. Four recognized human retroviruses belong to two different groups: human T-lymphotropic (or leukemic) retroviruses, HTLV-1 and HTLV-2, and human immunodeficiency viruses, HIV-1 and HIV-2 (HIV-1 and HIV-2). The former are transformative viruses, while the latter are cytopathic viruses.
ВИЧ-1 был идентифицирован как наиболее общая причина СПИДа по всему миру. Гомология последовательности между ВИЧ-1 и ВИЧ-2 составляет приблизительно 40%, причем ВИЧ-1 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV). CM. Curran, J. et al. Science, 329:1357- 1359 (1985); Weiss, R. et al. Nature, 324:572-575 (1986). HIV-1 has been identified as the most common cause of AIDS worldwide. The sequence homology between HIV-1 and HIV-2 is approximately 40%, with HIV-1 being closer to some members of the monkey immunodeficiency virus (SIV) group. CM Curran, J. et al. Science, 329: 1357-1359 (1985); Weiss, R. et al. Nature 324: 572-575 (1986).
ВИЧ имеет обычные ретровирусные гены , а также шесть экстрагенов, участвующих в репликации и других биологических активностях этого вируса. Как утверждалось ранее, общим определением СПИДа является глубокая иммуносупрессия преимущественно клеточно-опосредованного иммунитета. Эта иммуносупрессия (супрессия иммунного ответа) приводит к различным заболеваниям, вызываемым условно-патогенными микроорганизмами, в частности некоторым инфекциям и неоплазмам.HIV has the usual retroviral genes as well as six extragens involved in replication and other biological activities of this virus. As stated earlier, the general definition of AIDS is deep immunosuppression of predominantly cell-mediated immunity. This immunosuppression (suppression of the immune response) leads to various diseases caused by opportunistic microorganisms, in particular some infections and neoplasms.
В качестве основной причины иммунной недостаточности в СПИДе была идентифицирована количественная и качественная недостаточность в субпопуляции образуемых тимусом (Т) лимфоцитов, популяции T4. Эта субпопуляция клеток определяется фенотипически присутствием поверхностной молекулы CD4, которая, как было показано, является клеточным рецептором ВИЧ. Dalgleish et al. Nature 312:763 (1984). Хотя T4-клетка является основным клеточным типом, инфицируемым ВИЧ, по существу любая клетка человека, экспрессирующая молекулу CD4 на ее поверхности, способна связываться с ВИЧ и инфицироваться ВИЧ. As the main cause of immune deficiency in AIDS, quantitative and qualitative deficiency was identified in a subpopulation of lymphocytes formed by the thymus (T), the T4 population. This subpopulation of cells is determined phenotypically by the presence of a surface CD4 molecule, which has been shown to be a cellular receptor for HIV. Dalgleish et al. Nature 312: 763 (1984). Although a T4 cell is the main HIV-infected cell type, essentially any human cell expressing a CD4 molecule on its surface is able to bind to and become infected with HIV.
Традиционно, CD4+Т-клеткам приписывают роль хелпера/индуктора, что указывает на их функцию в обеспечении активирующего сигнала для B-клеток или в индуцировании T-лимфоцитов, несущих соответствующий CD8-маркер, с превращением их в цитотоксичные/супрессорные клетки. Reinherz and Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).Traditionally, CD4 + T cells have been assigned the role of helper / inducer, indicating their function in providing an activating signal for B cells or in inducing T lymphocytes carrying the corresponding CD8 marker, converting them into cytotoxic / suppressor cells. Reinherz and Schlossman, Cell 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).
ВИЧ связывается специфически и с высокой аффинностью, через участок аминокислот в оболочке вируса (gp120), с частью района VI молекулы CD4, расположенной вблизи ее N-конца. После связывания вирус сливается с клеточной мембраной-мишенью- и интернализуется. После интернализации он использует фермент обратную транскриптазу для транскрибирования его геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК, где и существует в течение жизни этой клетки в виде "провируса". HIV binds specifically and with high affinity, through a stretch of amino acids in the envelope of the virus (gp120), to part of region VI of the CD4 molecule located near its N-terminus. After binding, the virus fuses with the target cell membrane and is internalized. After internalization, he uses the enzyme reverse transcriptase to transcribe its genomic RNA into DNA, which integrates into cellular DNA, where it exists during the life of this cell as a “provirus”.
Провирус может оставаться латентным или активироваться для транскрибирования мРНК и геномной РНК, что ведет к синтезу, сборке белка, образованию новых вирионов и активной репликации вируса (бадинга) в результате проникновения из клеточной поверхности в клетку. Хотя точный механизм, при помощи которого вирус индуцирует смерть клетки, не был установлен, считают, что основным механизмом является массированный вирусный бадинг из клеточной поверхности, приводящий к разрушению плазменной мембраны и к нарушению осмотического баланса. Provirus can remain latent or be activated to transcribe mRNA and genomic RNA, which leads to synthesis, protein assembly, the formation of new virions and active virus replication (bading) as a result of penetration from the cell surface into the cell. Although the exact mechanism by which the virus induces cell death has not been established, it is believed that the main mechanism is massive viral badging from the cell surface, leading to the destruction of the plasma membrane and the disruption of the osmotic balance.
Во время процесса инфицирования организм хозяина вырабатывает антитела против вирусных белков, в том числе против основных гликопротеинов gp120 и gp41 оболочки. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, болезнь прогрессирует, приводя к летальной иммуносупрессии, характеризующейся множественными инфекциями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, паразитемией, деменцией и смертью. Неспособность антивирусных антител хозяина остановить прогрессирование заболевания является одним из наиболее неприятных и тревожных аспектов этой инфекции и дает плохие прогнозы для усилий по вакцинации, основанной на общепринятых подходах. During the infection process, the host organism produces antibodies against viral proteins, including the major gp120 and gp41 membrane glycoproteins. Despite this humoral immunity, the disease progresses, leading to lethal immunosuppression, characterized by multiple infections caused by opportunistic microorganisms, parasitemia, dementia and death. The inability of the host antiviral antibodies to stop the progression of the disease is one of the most unpleasant and disturbing aspects of this infection and gives poor predictions for vaccination efforts based on generally accepted approaches.
Два фактора могут играть роль в эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита. Во-первых, подобно другим РНК-вирусам (и, в частности, подобно ретровирусам) вирусы иммунодефицита обнаруживают высокую скорость мутации в ответ на иммунологический контроль хозяина. Во-вторых, сами гликопротеины оболочки являются сильно гликозилированными молекулами, предоставляющими немного эпитопов, пригодных для высокоаффинного связывания антител. Бедная антигенами мишень, которую представляет вирусная оболочка, дает малую возможность хозяину для ограничения вирусной инфекции посредством продуцирования специфических антител. Two factors may play a role in the effectiveness of the humoral response to immunodeficiency viruses. First, like other RNA viruses (and, in particular, like retroviruses), immunodeficiency viruses exhibit a high mutation rate in response to the immunological control of the host. Secondly, the envelope glycoproteins themselves are highly glycosylated molecules that provide few epitopes suitable for high-affinity antibody binding. The antigen-poor target, which is the viral envelope, provides little opportunity for the host to limit viral infection by producing specific antibodies.
Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют на их поверхности гликопротеин gp120. gp120 медиирует события слияния среди CD4+-клеток посредством реакции, сходной с реакцией, при помощи которой вирус входит в неинфицированные клетки, что приводит к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития зависит от прямого взаимодействия гликопротеина оболочки gp120 с белком CD4. Dalgleish et al., supra; Klatzman, D. et al., Nature; 312:763 (1984); McDougal, J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et al. Nature 322:470 (1986); Lifson J.D. et al. Nature 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321:412 (1986).HIV-infected cells express gp120 glycoprotein on their surface. gp120 mediates fusion events among CD4 + cells through a reaction similar to the reaction by which the virus enters uninfected cells, resulting in the formation of short-lived multinucleated giant cells. The formation of syncytium depends on the direct interaction of the gp120 membrane glycoprotein with the CD4 protein. Dalgleish et al., Supra; Klatzman, D. et al., Nature; 312: 763 (1984); McDougal, JS et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et al. Nature 322: 470 (1986); Lifson JD et al. Nature 323: 725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321: 412 (1986).
Доказательство, что связывание CD4-gp120 ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих антиген CD4, включает в себя открытие, что между gp120 и CD4 образуется специфический комплекс. McDougal et al., supra. Другие исследователи показали, что клеточные линии, которые были неинфицируемыми для ВИЧ, превращались в инфицируемые клеточные линии после трансфекции и экспрессии кДНК-гена CD4 человека. Maddon et al. Cell 46:333-348 (1986). The evidence that CD4-gp120 binding is responsible for viral infection of cells carrying the CD4 antigen includes the discovery that a specific complex forms between gp120 and CD4. McDougal et al., Supra. Other researchers showed that cell lines that were uninfected for HIV turned into infected cell lines after transfection and expression of the human CD4 cDNA gene. Maddon et al. Cell 46: 333-348 (1986).
Были предложены и успешно продемонстрированы in vitro рядом групп терапевтические программы, основанные на растворимом CD4 в качестве пассивного агента для противодействия вирусного поглощения и опосредованной синцитием клеточной передачи вируса (Deen et al. Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al. Nature 331:76- 78 (1988); Hussey et al. Nature 331:78-81 (1988); Smith et al. Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al. Nature 331:84-86 (1988)); и впоследствии были обеспечены слитые белки CD4-иммуноглобулина с увеличенными полупериодами жизни и умеренной биологической активностью (Capon et al. Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al. Nature 339:68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)). Хотя конъюгаты CD4-иммунотоксин или слитые белки обнаруживают сильную цитотоксичность для инфицированных клеток in vitro (Chaudary et al. Nature 335: 369-372 (1988); Till et al. Science 242:1166-1168 (1988)), латентное состояние синдрома иммунодефицита делает маловероятным, что какая-либо одного типа терапия будет эффективной в устранении вирусной нагрузки, и антигенность чужеродных слитых белков, по-видимому, ограничивает их приемлемость в лечении, требующем повторяющегося дозирования. Испытания на мартышках, пораженных вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) показали, что растворимый CD4 при введении без заметной CD4 цитопении может снижать титр SIV и улучшать измерения in vitro миелоидного потенциала (Watanabe et al. Nature 337:267-270 (1989)). Однако после прерывания обработки наблюдали незамедлительное повторное появление вируса, что заставляет предполагать, что для предотвращения прогрессивного истощения иммунной системы может быть необходимым введение в течение всей жизни. Therapeutic programs based on soluble CD4 as a passive agent to counteract viral uptake and syncytia-mediated cell transmission of the virus have been proposed and successfully demonstrated in vitro by a number of groups (Deen et al. Nature 331: 82-84 (1988); Fisher et al. Nature 331: 76-78 (1988); Hussey et al. Nature 331: 78-81 (1988); Smith et al. Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al. Nature 331: 84-86 (1988) ); and subsequently CD4 immunoglobulin fusion proteins with increased half-lives and moderate biological activity were provided (Capon et al. Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker et al. Nature 339: 68-70 (1989); Byrn et al. , Nature 344: 667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)). Although CD4-immunotoxin conjugates or fusion proteins show strong cytotoxicity for infected cells in vitro (Chaudary et al. Nature 335: 369-372 (1988); Till et al. Science 242: 1166-1168 (1988)), the latent state of immunodeficiency syndrome makes it unlikely that any one type of therapy will be effective in eliminating the viral load, and the antigenicity of foreign fusion proteins appears to limit their acceptability in treatment requiring repeated dosing. Tests on monkeys infected with monkey immunodeficiency virus (SIV) have shown that soluble CD4 when administered without noticeable CD4 cytopenia can lower SIV titer and improve in vitro measurements of myeloid potential (Watanabe et al. Nature 337: 267-270 (1989)). However, after interruption of treatment, an immediate reappearance of the virus was observed, suggesting that lifelong administration may be necessary to prevent progressive depletion of the immune system.
T-клеточные и Fc-рецепторы
Экспрессия клеточной поверхностью наиболее обильной формы T-клеточного рецептора антигенов (TCR) требует одновременной экспрессии по меньшей мере 6 отличающихся полипептидных цепей (Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi et al. Nature 316:606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman et al. Cell 52:85-95 (1988)), α/β антиген связывающих цепей, трех полипептидов комплекса CD3 и ζ. Если любая из этих цепей отсутствует, то стабильная экспрессия остальных членов комплекса не происходит. ζ является лимитирующим полипептидом поверхностной экспрессии полного комплекса (Sussman et al. Cell 52:85-95 (1988)), и считают, что эта цепь медиирует по меньшей мере часть клеточной программы активации, запускаемой узнаванием лиганда рецептором (Weissman et al., EМBO J. 8: 3651-3656 (1989); Frank et al. Science 249:174-177 (1990)). Интегральный мембранный гомодимер 32 кДа типа 1, ζ (дзета), имеет внеклеточный домен из 9 остатков без сайтов для добавления (присоединения) N-связанного гликана и внутриклеточный домен из 112 остатков (мышь) или 113 остатков (человек) (Weissman et al. Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). Изоформа ζ, названная η (эта) (Baniyash et al. , J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264: 14812-14817 (1989)), которая возникает из чередующегося пути сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3233 (1990)), присутствует в уменьшенных количествах в клетках, экспрессирующих рецептор антигена. Гетеродимеры ζ-η, как считают, опосредуют образование инозитфосфатов, а также инициируемую рецептором программированную смерть клеток, называемую апоптозом (Mercep et al. Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).T cell and Fc receptors
Cell surface expression of the most abundant form of T-cell antigen receptor (TCR) requires the simultaneous expression of at least 6 distinct polypeptide chains (Weiss et al., J. Exp. Med. 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al. Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528-8536 (1988); Sussman et al. Cell 52: 85-95 (1988)), α / β antigen binding chains , three polypeptides of the complex CD3 and ζ. If any of these chains is absent, then stable expression of the remaining members of the complex does not occur. ζ is a limiting surface expression polypeptide of the complete complex (Sussman et al. Cell 52: 85-95 (1988)), and it is believed that this chain mediates at least part of the cellular activation program triggered by ligand recognition by the receptor (Weissman et al., EMBO J. 8: 3651-3656 (1989); Frank et al. Science 249: 174-177 (1990)). The
Подобно ζ и η, ассоциированная с рецептором Fc γ-цепь, экспрессируется в комплексах клеточной поверхности с дополнительными полипептидами, некоторые из которых медиируют узнавание лиганда, а другие имеют неопределенную функцию. γ (гамма) имеет гомодимерную структуру и общую организацию, очень похожую на структуру и организацию ζ, и является компонентом высокоаффинного рецептора IgE мастоцитов/базофилов, FceRI, который состоит по меньшей мере из трех отличающихся полипептидных цепей (Blank et al. Nature 337:187-189 (1989); Ra et al. Nature 241:752-754 (1989)), а также компонентом рецепторов низкой аффинности для IgG, представленных в мышах Fc γ RII α (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), в человеке экспрессией подтипа CD16 макрофагами и природными клетками-убийцами, CD16TM (CD16 трансмембранный) (Lanier et al. Nature 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) и полипептидом неидентифицированной функции (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Недавно сообщалось, что γ экспрессируется мышиной T-клеточной линией, CTL, в которой он образует гомодимеры, а также гетepoдимepы γ-ζ и γ-η (Orloff et al. Nature 347:189-191 (1990)).Like ζ and η, the γ chain associated with the Fc receptor is expressed in cell surface complexes with additional polypeptides, some of which mediate ligand recognition, while others have an undefined function. γ (gamma) has a homodimeric structure and general organization very similar to the ζ structure and organization, and is a component of the high affinity mast cell / basophil IgE receptor, FceRI, which consists of at least three distinct polypeptide chains (Blank et al. Nature 337: 187 -189 (1989); Ra et al. Nature 241: 752-754 (1989)), as well as a component of the low affinity receptors for IgG present in Fc γ RII α mice (Ra et al., J. Biol. Chem. 264 : 15323-15327 (1989)), in humans, expression of the CD16 subtype by macrophages and natural killer cells, CD16 TM (transmembrane CD16) (Lanier et al. Nature 342: 803-805 (1989); Ander son et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) and an unidentified function polypeptide (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990) ) It has recently been reported that γ is expressed by the mouse T-cell line, CTL, in which it forms homodimers, as well as heterodimers γ-ζ and γ-η (Orloff et al. Nature 347: 189-191 (1990)).
Fc-рецепторы медиируют фагоцитоз иммунных комплексов, трансцитоз и зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeles et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); и Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Недавно было показано, что одна из мышиных изоформ рецептоpa Fc низкой аффинности, FcR γ IIIBl, медиирует интернализацию покрытых Ig мишеней в покрытые клатрином углубления и что другой рецептор низкой аффинности, Fci γ lllA, медиирует ADCC посредством его связывания с одним или более членами небольшого семейства "триггерных молекул" (Miettinen et al., Cell 58:317-327 (1989); и Huziker and Mellman, J. Cell Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти триггерные (запускающие) молекулы, T-клеточный рецептор (TCR), ζ -цепь, η -цепь TCR и γ -цепь рецептора Fc, взаимодействуют с доменами узнавания лигандов различных рецепторов иммунной системы и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, в том числе цитолиз, после агрегации (Samelson et al. Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al. Science 239:1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Blank et al. Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al. Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al. Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); и Irwing and Weiss, Cell 64:891-901 (1991)). Fc receptors mediate phagocytosis of immune complexes, transcytosis, and antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Unkeles et al., Annu. Rev. Immunol. 6 : 251-281 (1988); and Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16-25 (1988)). It has recently been shown that one of the murine isoforms of the low affinity Fc receptor, FcR γ IIIBl, mediates the internalization of Ig coated targets in clathrin-coated depressions and that another low affinity receptor, Fci γ lllA, mediates ADCC by binding to one or more members of a small family “trigger molecules” (Miettinen et al., Cell 58: 317-327 (1989); and Huziker and Mellman, J. Cell Biol. 109: 3291-3302 (1989)). These trigger (triggering) molecules, the T cell receptor (TCR), the ζ chain, the TCR η chain, and the Fc receptor γ chain interact with the ligand recognition domains of various receptors of the immune system and can autonomously initiate cellular effector programs, including cytolysis, after aggregation (Samelson et al. Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al. Science 239: 1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319 -3323 (1990); Blank et al. Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al. Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al. Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990); and Irwing and Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)) .
Однако при проведении параллелей между семействами рецепторов Fc низкой аффинности мышей и человека становится ясно, что FcR γ IIA и C-изоформы человека не имеют копии в мышах. Отчасти вследствие этого их функция еще должна быть определена. However, when parallels are drawn between the Fc receptor families of low affinity in mice and humans, it becomes clear that FcR γ IIA and human C-isoforms do not have a copy in mice. Partly as a result of this, their function has yet to be determined.
Вследствие того, что гуморальные агенты на основе одного CD4 имеют ограниченную применимость in vivo, предшествующие исследования выясняли возможность увеличения клеточного иммунитета к ВИЧ. Были идентифицированы препараты белковых химер, в которых внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами T-клеточного рецептора, рецептора Fc lgG или элементами трансдукции сигнала B-клеточного рецептора (U.S.S.N. 07/847566 и 07/665961). Цитолитические T-клетки, экспрессирующие химеры, которые включают в себя внеклеточный домен CD4, обнаруживают сильную MHC-независимую деструкцию клеточных мишений, экспрессирующих белки оболочки ВИЧ. Чрезвычайно важным и новым компонентом этого подхода была идентификация отдельных цепей T-клеточного рецептора, рецептора Fc и B-клеточного рецептора, агрегация которых достаточна для инициации клеточного ответа. Одним из особенно ценных приложений этого подхода было изобретение химер между CD4 и ζ,η, или γ, которые нацеливают цитолитические T-лимфоциты на узнавание и убивание клеток, экспрессирующих gp120 ВИЧ (U.S.S.N. 07/847 566 и 07/665 961). Due to the fact that humoral agents based on one CD4 have limited applicability in vivo, previous studies have identified the possibility of increasing cellular immunity to HIV. Protein chimera preparations were identified in which the extracellular domain of CD4 is fused to the transmembrane and / or intracellular domains of the T-cell receptor, Fc IgG receptor, or B-cell receptor signal transduction elements (U.S.S.N. 07/847566 and 07/665961). Cytolytic T cells expressing chimeras that include the extracellular domain of CD4 show strong MHC-independent destruction of cellular targets expressing HIV envelope proteins. An extremely important and new component of this approach was the identification of individual T-cell receptor, Fc receptor, and B-cell receptor chains, the aggregation of which is sufficient to initiate a cellular response. One particularly valuable application of this approach has been the invention of chimeras between CD4 and ζ, η, or γ, which target cytolytic T lymphocytes to recognize and kill cells expressing HIV gp120 (U.S.S.N. 07/847 566 and 07/665 961).
Краткое изложение существа изобретения
В общем, данное изобретение описывает способ направления клеточного иммунного ответа против инфицированной ВИЧ клетки в млекопитающем. Способ предусматривает введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, экспрессирующих мембрано-связанный белковый химерный рецептор, содержащий (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, способный специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирующий инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке о разрушении связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки.Summary of the invention
In general, this invention describes a method for directing a cellular immune response against an HIV-infected cell in a mammal. The method comprises administering to the mammal an effective amount of therapeutic cells expressing a membrane-bound protein chimeric receptor containing (a) an extracellular portion that includes a CD4 fragment capable of specifically recognizing and binding an HIV-infected cell but not mediating HIV infection, and (b) the intracellular part, which is capable of signaling a therapeutic cell about the destruction of an HIV-infected cell bound to a receptor.
В родственном способе изобретение описывает использование терапевтических клеток, экспрессирующих мембрано-связанный белковый химерный рецептор, включающий в себя (а) внеклеточную часть, содержащую фрагмент CD4, который способен специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирует инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке для разрушения связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки, в приготовлении лекарственного средства для лечения родственных ВИЧ заболеваний. In a related method, the invention describes the use of therapeutic cells expressing a membrane-bound protein chimeric receptor comprising (a) an extracellular portion containing a CD4 fragment that is able to specifically recognize and bind an HIV-infected cell but does not mediate HIV infection, and (b) the intracellular portion, which is capable of signaling a therapeutic cell to destroy a receptor-bound HIV-infected cell, in the preparation of a medicament for the treatment of HIV-related diseases evaniy.
Во втором аспекте, изобретение описывает клетку, которая экспрессирует белковый мембрано-связанный химерный рецептор, который содержит (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который способен специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирует инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке для разрушения связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки. In a second aspect, the invention describes a cell that expresses a protein membrane-bound chimeric receptor that contains (a) an extracellular portion that includes a CD4 fragment that is able to specifically recognize and bind an HIV-infected cell but does not mediate HIV infection, and ( b) an intracellular portion that is capable of signaling a therapeutic cell to destroy a receptor-bound HIV infected cell.
В предпочтительных вариантах обоих аспектов фрагмент CD4 представляет собой аминокислоты 1-394 CD4 или аминокислоты 1-200 CD4; этот фрагмент CD4 отделен от внутриклеточной части трансмембранным доменом CD7, показанным на фиг. 26, или шарнирной областью, CH2, и доменами CH3 молекулы lgGl человека, показанными на фиг. 25; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD7; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD5; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD34; фрагмент CD4 отделен от мембраны терапевтической клетки одной или более белковыми α - спиралями; фрагмент CD4 отделен от мембраны терапевтической клетки по меньшей мере 48 ангстремами (10-10 м) или по меньшей мере 72 ангстремами; внутриклеточная часть является трансдуцирующей сигнал частью белка T-клеточного рецептора (например, ζ ) белка B-клеточного рецептора или белка рецептора Fc; и терапевтические клетки выбраны из группы, состоящей из: (а) T- лимфоцитов; (b) цитотоксических T-лимфоцитов; (c) природных клеток-убийц; (d) нейтрофилов; (e) гранулоцитов; (f) макрофагов; (g) мастоцитов; (h) HeLa клеток; и (i) эмбриональных стволовых клеток (ES).In preferred embodiments of both aspects, the CD4 fragment is amino acids 1-394 CD4 or amino acids 1-200 CD4; this CD4 fragment is separated from the intracellular portion by the CD7 transmembrane domain shown in FIG. 26, or the hinge region, CH2, and the CH3 domains of the human IgGl molecule shown in FIG. 25; the receptor includes the transmembrane portion of CD7; the receptor includes the transmembrane portion of CD5; the receptor includes the transmembrane portion of CD34; the CD4 fragment is separated from the membrane of the therapeutic cell by one or more protein α-helices; a CD4 fragment is separated from the therapeutic cell membrane by at least 48 angstroms (10 -10 m) or at least 72 angstroms; the intracellular portion is a signal transducing portion of a T-cell receptor protein (eg, ζ) of a B-cell receptor protein or Fc receptor protein; and therapeutic cells selected from the group consisting of: (a) T-lymphocytes; (b) cytotoxic T lymphocytes; (c) natural killer cells; (d) neutrophils; (e) granulocytes; (f) macrophages; (g) mast cells; (h) HeLa cells; and (i) embryonic stem cells (ES).
В других аспектах, изобретение описывает ДНК, кодирующую химерный рецептор данного изобретения; и вектор, включающий в себя ДНК химерного рецептора. In other aspects, the invention describes DNA encoding a chimeric receptor of the present invention; and a vector comprising chimeric receptor DNA.
Хотя характерным вариантом данного изобретения является химера между CD4 и дзета, любая цепь рецептора, имеющая функцию, подобную функции этих молекул, например, в гранулоцитах или B- лимфоцитах, могла бы быть использована для описанных здесь целей. Отличительные признаки желаемой триггерной молекулы иммунокомпетентной клетки включают в себя способность автономной экспрессии (т. е. в виде отдельной цепи), способность сливаться с внеклеточным доменом CD4, так что полученная химера присутствует на поверхности терапевтической клетки, и способность инициировать клеточные эффекторные программы при вторичной агрегации для столкновения с лигандом-мишенью. Although a characteristic embodiment of the invention is a chimera between CD4 and zeta, any receptor chain having a function similar to that of these molecules, for example, in granulocytes or B-lymphocytes, could be used for the purposes described here. Distinctive features of the desired trigger molecule of an immunocompetent cell include the ability to autonomously express (i.e., as a separate chain), the ability to fuse with the extracellular domain of CD4, so that the resulting chimera is present on the surface of the therapeutic cell, and the ability to initiate cell effector programs during secondary aggregation to collide with the target ligand.
В настоящее время наиболее удобным способом доставки химерных белков к клеткам иммунной системы является использование формы генной терапии. Однако реконституирование клеток иммунной системы с химерными рецепторами смешиванием этих клеток с солюбилизированным подходящим образом очищенным химерным белком привело бы также к образованию популяции сконструированных клеток, способных отвечать на ВИЧ-инфицированные мишени. Подобные подходы использовали, например, для введения молекулы CD4 в эритроциты для терапевтических целей. В этом случае популяция сконструированных клеток не была бы способна к самообновлению. Currently, the most convenient way to deliver chimeric proteins to cells of the immune system is to use a form of gene therapy. However, reconstitution of immune system cells with chimeric receptors by mixing these cells with a suitably solubilized suitably purified chimeric protein would also result in a population of engineered cells capable of responding to HIV-infected targets. Similar approaches have been used, for example, to introduce a CD4 molecule into red blood cells for therapeutic purposes. In this case, the population of engineered cells would not be capable of self-renewal.
Данное изобретение касается функциональных и упрощенных химер между фрагментами CD4 и T-клеточным рецептором, B-клеточным рецептором и субъединицами рецептора Fc, которые способны направлять иммунокомпетентные клетки для узнавания и лизиса ВИЧ- инфицированных клеток. Способ направления клеточного ответа в млекопитающих предусматривает введение эффективного количества терапевтических клеток (например, цитотоксических T-лимфоцитов) млекопитающему, причем эти клетки способны узнавать и разрушать ВИЧ-инфицированную клетку. The present invention relates to functional and simplified chimeras between fragments of a CD4 and a T-cell receptor, a B-cell receptor, and Fc receptor subunits that are capable of directing immunocompetent cells to recognize and lyse HIV-infected cells. A method for directing a cellular response in mammals involves administering an effective amount of therapeutic cells (eg, cytotoxic T lymphocytes) to a mammal, which cells are able to recognize and destroy the HIV-infected cell.
Изобретение также включает в себя химерные рецепторные белки, которые направляют цитотоксические T-лимфоциты для узнавания и лизиса ВИЧ-инфицированных клеток, клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим эти химерные рецепторы, и антитела, направленные против химерных рецепторов. The invention also includes chimeric receptor proteins that direct cytotoxic T lymphocytes for recognition and lysis of HIV-infected cells, host cells transformed with a vector containing these chimeric receptors, and antibodies directed against chimeric receptors.
Эти и другие нелимитирующие варианты данного изобретения будут очевидны специалистам в этой области из следующего далее подробного описания изобретения. These and other non-limiting variations of this invention will be apparent to those skilled in the art from the following detailed description of the invention.
В следующем далее подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологии, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, представляющие такие известные методологии, на которые делается ссылка, включены здесь в виде полных ссылок. In the following detailed description, reference will be made to various methodologies known to those skilled in the field of molecular biology and immunology. Publications and other materials representing such well-known referenced methodologies are hereby incorporated by reference in their entireties.
Стандартные справочные работы, излагающие основные принципы технологии рекомбинантных ДНК, включают в себя Watson et al. Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menio Park, CA (1987); Darnell et al. Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genesll, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old et al. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Ergineering, 2d edition. University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); и Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y. (1989). Standard reference works outlining the basic principles of recombinant DNA technology include Watson et al. Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menio Park, CA (1987); Darnell et al. Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genesll, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old et al. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Ergineering, 2d edition. University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y. (1989).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Под "клонированием" имеют в виду использование способов рекомбинации in vitro для встраивания определенного гена или другой последовательности ДНК в векторную молекулу.DEFINITIONS
By "cloning" is meant the use of in vitro recombination methods to insert a particular gene or other DNA sequence into a vector molecule.
Под "кДНК" подразумевают комплементарную или копию-ДНК, продуцируемую из РНК-матрицы под действием РНК-зависимой ДНК- полимеразы (обратной транскриптазы). Таким образом, "клон кДНК" обозначает дуплексную последовательность ДНК, комплементарную представляющей интерес молекуле РНК, переносимую в клонирующем векторе. By "cDNA" is meant a complementary or copy-DNA produced from an RNA template by the action of an RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase). Thus, a “cDNA clone” refers to a duplex DNA sequence complementary to an RNA molecule of interest carried in a cloning vector.
Под "библиотекой кДНК" подразумевают коллекцию рекомбинантных молекул ДНК, содержащих встроенные кДНК, которые содержат ДНК, являющиеся копиями мРНК, экспрессируемыми клеткой при создании этой библиотеки кДНК. Такая библиотека кДНК может быть получена способами, известными специалистам в этой области и описанными, например, в Ausubel et al., supra и Maniatis et al. , supra. В общем виде, РНК сначала выделяют из клеток организма, из генома которого желательно клонировать конкретный ген. Для целей данного изобретения предпочтительны клеточные линии лимфоцитов млекопитающего и, в частности, человека. В настоящее время предпочтительным вектором для этой цели является штамм WR вируса коровьей оспы. By "cDNA library" is meant a collection of recombinant DNA molecules containing inserted cDNAs that contain DNA that are copies of the mRNA expressed by the cell when the cDNA library is created. Such a cDNA library can be obtained by methods known to those skilled in the art and described, for example, in Ausubel et al., Supra and Maniatis et al. supra. In general terms, RNA is first isolated from the cells of an organism from the genome of which it is desirable to clone a particular gene. For the purposes of this invention, mammalian and, in particular, human lymphocyte cell lines are preferred. Currently, the preferred vector for this purpose is the vaccinia virus strain WR.
"Вектором" называют молекулу ДНК, полученную, например, из плазмиды, бактериофага или вируса млекопитающего или насекомого, в которую могут быть встроены или клонированы фрагменты ДНК. Вектор должен содержать один или более уникальных сайтов рестрикции и может быть способным автономно реплицироваться в определенном организме хозяина или переносчика, так что клонированная последовательность может размножаться. Таким образом, под "экспрессирующим ДНК-вектором" подразумевают любой автономный элемент, способный управлять синтезом рекомбинантного пептида. Такие экспрессирующие ДНК- векторы включают в себя бактериальные плазмиды и фаги и плазмины и вирусы млекопитающих и насекомых. “Vector” refers to a DNA molecule obtained, for example, from a plasmid, bacteriophage or mammalian virus or insect, into which DNA fragments can be inserted or cloned. The vector must contain one or more unique restriction sites and may be able to autonomously replicate in a particular host or carrier, such that the cloned sequence can propagate. Thus, by “expressing DNA vector” is meant any autonomous element capable of driving the synthesis of a recombinant peptide. Such DNA expression vectors include bacterial plasmids and phages and plasmins and viruses of mammals and insects.
"Фактически чистым" называют соединение, например белок, полипептид или антитело, которые фактически не содержат компонентов, сопровождающих их в природе. В общем виде, соединение является фактически чистым, если по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% всего материала в пробе представляют собой целевое соединение. Чистота может быть измерена любым подходящим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или анализом ЖХВР (HPLC). В связи с последовательностью нуклеиновой кислоты "фактически чистая" означает последовательность нуклеиновой кислоты, сегмент или фрагмент которой не является непосредственно смежным (т.е. ковалентно связанным) с обеими кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно связан (т.е. с одной при 5'-конце и с другой при 3'-конце) в природно существующем геноме организма, из которого получена ДНК изобретения. “Actually pure” refers to a compound, for example a protein, polypeptide or antibody, which does not actually contain the components that accompany them in nature. In general terms, the compound is actually pure if at least 60%, more preferably at least 75% and most preferably at least 90% of the total material in the sample is the target compound. Purity can be measured by any suitable method, for example, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis. In connection with a nucleic acid sequence, “substantially pure” means a nucleic acid sequence whose segment or fragment is not directly adjacent (i.e., covalently linked) to both coding sequences to which it is directly linked (i.e., to one at 5 '-end and the other at the 3'-end) in the naturally existing genome of the organism from which the DNA of the invention was obtained.
Под "фрагментом" молекулы, такой как любая из последовательностей кДНК данного изобретения, подразумевают любую часть смежных нуклеотидов этой молекулы. "Аналог" молекулы обозначает неприродную молекулу, существенно сходную либо с целой молекулой, либо с ее фрагментом. О молекуле говорят, что она "существенно сходна" с другой молекулой, если последовательность аминокислот в обеих молекулах по существу одинакова. Существенно сходные аминокислотные молекулы будут обладать сходной биологической активностью. В применении здесь, молекулу называют "химическим производным" другой молекулы, когда она содержит химические части молекулы, не являющиеся обычно частью этой молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость молекулы, абсорбцию, биологический полупериод жизни и т.п. Эти части молекулы могут, альтернативно, уменьшать токсичность молекулы, исключать или аттенюировать нежелательное побочное действие молекулы и т.д. Молекулярные части, способные медиировать такие эффекты, описаны, например, в Remington's Phanmaceutical Sciences, 16th ed. Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980). By "fragment" of a molecule, such as any of the cDNA sequences of the present invention, is meant any portion of the adjacent nucleotides of the molecule. An “analog” of a molecule refers to a non-natural molecule that is substantially similar to either the whole molecule or its fragment. A molecule is said to be “substantially similar” to another molecule if the sequence of amino acids in both molecules is essentially the same. Essentially similar amino acid molecules will have similar biological activity. As used herein, a molecule is called a “chemical derivative” of another molecule when it contains chemical parts of a molecule that are not usually part of that molecule. Such parts of the molecule can improve the solubility of the molecule, absorption, biological half life, and the like. These parts of the molecule can, alternatively, reduce the toxicity of the molecule, eliminate or attenuate the unwanted side effect of the molecule, etc. Molecular moieties capable of mediating such effects are described, for example, in Remington's Phanmaceutical Sciences, 16th ed. Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
"Функциональным производным" химерного гена рецептора данного изобретения называют "фрагменты" или "аналоги" этого гена, которые "существенно сходны" по нуклеотидной последовательности и кодируют молекулу, обладающую сходной активностью, например, с химерой рецептора T-клетки, B-клетки или Fc. Наиболее предпочтительно, чтобы это производное имело 90%, более предпочтительно 70%, и предпочтительно 40% активности химеры рецептора дикого типа. Активность функционального производного химерного рецептора включает в себя специфическое связывание (с его внеклеточной частью CD4) с ВИЧ-инфицированной клеткой и в конечном счете разрушение этой клетки; кроме того, химерный рецептор не делает несущую рецептор клетку восприимчивой к инфекции ВИЧ. Активность химерного рецептора может определяться, например, любым из описанных здесь способов. "Functional derivative" of a chimeric receptor gene of the present invention refers to "fragments" or "analogues" of this gene that are "substantially similar" in nucleotide sequence and encode a molecule that has similar activity, for example, a chimera of a receptor for a T cell, B cell or Fc . Most preferably, this derivative has 90%, more preferably 70%, and preferably 40%, of the wild-type receptor chimera activity. The activity of a functional derivative of a chimeric receptor includes specific binding (with its extracellular portion of CD4) to an HIV-infected cell and ultimately destruction of that cell; in addition, the chimeric receptor does not make the receptor-bearing cell susceptible to HIV infection. Chimeric receptor activity may be determined, for example, by any of the methods described herein.
Последовательность ДНК, кодирующая рецепторную химеру CD4 данного изобретения или ее функциональное производное, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с общепринятыми способами, включающими в себя затупленные или ступенчатые концы для лигирования, расщепление рестриктазами для обеспечения подходящих концов, заполнение в "липкие" концы, обработку щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения и лигирование подходящими лигазами. Способы для таких манипуляций описаны Maniatis, Т., et al., supra и хорошо известны в этой области. The DNA sequence encoding the CD4 receptor chimera of the present invention or its functional derivative can be recombined with vector DNA in accordance with conventional methods, including blunt or step ends for ligation, restriction enzyme digestion to provide suitable ends, sticky ends, treatment with alkaline phosphatase to avoid undesired compounds; and ligation with suitable ligases. Methods for such manipulations are described by Maniatis, T., et al., Supra, and are well known in the art.
О молекуле нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, говорят, что она "способна экспрессировать" полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые включают в себя регуляторную информацию для транскрипции и трансляции, и такие регуляторные последовательности "оперативно соединены" с нуклеотидными последовательностями, кодирующими данный полипептид. "Оперативным соединением" является такое соединение, в котором регуляторные последовательности ДНК и последовательности ДНК, которые должны быть экспрессированы, соединены таким образом, чтобы сделать возможной экспрессию гена. Точная природа регуляторных районов, необходимых для генной экспрессии, может варьировать от организма к организму, но в общем виде будет включать в себя промотор (который управляет инициацией транскрипции РНК), а также последовательности ДНК, которые при транскрибировании в РНК будут сигнализировать об инициации синтеза белка. Такие районы обычно включают в себя 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как TATA-блок, кэпирующие последовательность, последовательность CAAT и т.п. A nucleic acid molecule such as DNA is said to be “capable of expressing” a polypeptide if it contains nucleotide sequences that include regulatory information for transcription and translation, and such regulatory sequences are “operably linked” to nucleotide sequences encoding this polypeptide. An “operative compound” is one in which the regulatory DNA sequences and the DNA sequences to be expressed are linked in such a way as to enable gene expression. The exact nature of the regulatory regions necessary for gene expression may vary from organism to organism, but in general terms will include a promoter (which controls the initiation of RNA transcription), as well as DNA sequences that, when transcribed into RNA, will signal the initiation of protein synthesis . Such regions typically include 5 ′ non-coding sequences involved in transcription and translation initiation, such as a TATA block, capping sequences, CAAT sequences, and the like.
Если желательно, некодирующий район 3 (справа) от генной последовательности, кодирующей белок, может быть получен описанными выше способами. Этот район может быть сохранен для его регуляторных последовательностей терминации транскрипции. Так, путем сохранения этого 3'-района, в природе смежного с последовательностью ДНК, кодирующей белок, могут быть обеспечены сигналы терминации транскрипции. В случае, если эти сигналы терминации транскрипции не функционируют удовлетворительно в экспрессирующей клетке-хозяине, вместо них может быть введен 3'- район, функциональный в клетке-хозяине. If desired, non-coding region 3 (to the right) of the protein coding gene sequence can be obtained by the methods described above. This region can be maintained for its regulatory transcription termination sequences. So, by preserving this 3′-region, in nature adjacent to the DNA sequence encoding the protein, transcription termination signals can be provided. In case these transcription termination signals do not function satisfactorily in the expressing host cell, a 3 ′ region functional in the host cell may be introduced instead.
Две последовательности ДНК (такие, как последовательность промоторного района и последовательность, кодирующая химерный рецептор CD4) называют оперативно соединенными, если природа соединения между этими двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации сдвига рамки, (2) не мешает способности последовательности промоторного района направлять транскрипцию последовательности гена рецепторной химеры или (3) не мешает способности последовательности гена химеры рецептора транскрибироваться последовательностью промоторного района. Промоторный район будет оперативно соединен с последовательностью ДНК, если промотор способен инициировать транскрипцию этой ДНК. Таким образом, для экспрессии белка необходимы сигналы транскрипции и трансляции, узнаваемые соответствующим хозяином. Two DNA sequences (such as a promoter region sequence and a CD4 chimeric receptor coding sequence) are called operably linked if the nature of the connection between these two DNA sequences (1) does not introduce a frame shift mutation, (2) does not interfere with the ability of the promoter region sequence direct transcription of the receptor chimera gene sequence or (3) does not interfere with the ability of the receptor chimera gene sequence to be transcribed by the promoter sequence district. The promoter region will be operatively linked to the DNA sequence if the promoter is able to initiate transcription of this DNA. Thus, transcription and translation signals recognized by the corresponding host are necessary for protein expression.
Данное изобретение включает в себя экспрессию химерного белка рецептора CD4 (или его функционального производного) в прокариотических или эукариотических клетках, хотя предпочтительна эукариотическая экспрессия (и, в частности, в лимфоцитах человека). The invention includes the expression of a chimeric CD4 receptor protein (or a functional derivative thereof) in prokaryotic or eukaryotic cells, although eukaryotic expression (and in particular in human lymphocytes) is preferred.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены любым из множества способов. Например, клетки, экспрессирующие химерный белок рецептора CD4 или его функциональное производное, могут быть введены животному для индуцирования образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела, способные связывать эти химерные белки. Antibodies in accordance with this invention can be obtained in any of a variety of ways. For example, cells expressing a chimeric CD4 receptor protein or functional derivative thereof can be administered to an animal to induce the formation of serum containing polyclonal antibodies capable of binding these chimeric proteins.
В предпочтительном способе антитела в соответствии с данным изобретением являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела могут быть получены с применением технологии гибридом (Kohler et al. Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Haimnerling et al. In: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Else-vier, N.Y., pp. 563-684 (1981)). В общем виде, такие процедуры включают в себя иммунизацию животного антигеном химеры рецептора CD4. Спленоциты таких животных экстрагируют и сливают с подходящей линией миеломных клеток. Любая подходящая линия миеломных клеток может быть использована в соответствии с данным изобретением. После слияния полученные гибридомные клетки селективно поддерживают в HAT-среде и затем клонируют серийным разведением, как описано Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Гибридомные клетки, полученные таким отбором, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные связывать химеры. In a preferred method, the antibodies of this invention are monoclonal antibodies. Such monoclonal antibodies can be obtained using hybridoma technology (Kohler et al. Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Haimnerling et al. In: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, NY, pp. 563-684 (1981)). In general terms, such procedures include immunization of an animal with an antigen of a CD4 receptor chimera. The splenocytes of such animals are extracted and fused to a suitable myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line may be used in accordance with this invention. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in a HAT medium and then cloned by serial dilution as described by Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Hybridoma cells obtained by this selection are then analyzed to identify clones that secrete antibodies capable of binding to chimeras.
Антитела согласно данному изобретению также могут быть поликлональными или предпочтительно район-специфическими поликлональными антителами. Antibodies according to this invention can also be polyclonal or preferably region-specific polyclonal antibodies.
Антитела против химеры рецептора CD4 в соответствии с данным изобретением могут быть использованы для мониторинга количества химерного рецептора (или клеток, несущих химерный рецептор) в больном. Такие антитела очень удобны для использования в стандартном иммунодиагностическом тесте, известном в этой области, включающем в себя такие иммунометрические или "сэндвич" анализы, как прямой сэндвич, обратный сэндвич и одновременные сэндвич- тесты. Эти антитела могут быть применены в любом количестве комбинаций, что может быть определено специалистами без чрезмерного экспериментирования для проведения иммунотестов приемлемой специфичности, чувствительности и точности. Antibodies against the CD4 receptor chimera of the invention can be used to monitor the amount of a chimeric receptor (or cells carrying a chimeric receptor) in a patient. Such antibodies are very convenient for use in a standard immunodiagnostic assay known in the art, including immunometric or sandwich assays such as direct sandwich, reverse sandwich and simultaneous sandwich tests. These antibodies can be used in any number of combinations, which can be determined by experts without undue experimentation to conduct immunoassays of acceptable specificity, sensitivity and accuracy.
Стандартные работы, излагающие общие принципы иммунологии, включают в себя Roitt, Essential Immunology, 6th ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2d ed., Macrnillan Publishing Co., Publisher, New York (1986); Roitt et al. Immunology, GoWer Medical Publishing Ltd. , Publisher, London (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon et al., eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); и Kennet et al., eds. , Monoclonal Antibodies, Nyb-ridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980). Standard works setting forth general principles of immunology include Roitt, Essential Immunology, 6th ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2d ed., Macrnillan Publishing Co., Publisher, New York (1986); Roitt et al. Immunology, GoWer Medical Publishing Ltd. Publisher, London (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon et al., Eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Под "обнаружением" ("детектированием") подразумевают определение присутствия или отсутствия вещества или определение количества вещества. Термин, следовательно, относится к применению материалов, композиций и способов данного изобретения для качественных и количественных определений. By "detection" ("detection") is meant the determination of the presence or absence of a substance or the determination of the amount of a substance. The term, therefore, refers to the use of the materials, compositions and methods of this invention for qualitative and quantitative determinations.
Антитела и фактически очищенный антиген данного изобретения идеально пригодны для изготовления кита (набора). Такой кит может содержать носитель (держатель), в котором размещены один или несколько контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., причем каждый из контейнеров содержит отдельные элементы анализа, который должен быть выполнен. Antibodies and actually purified antigen of the present invention are ideally suited for the manufacture of a whale (kit). Such a whale may contain a carrier (holder) in which one or more containers, such as bottles, tubes, etc., are placed, each container containing individual elements of the analysis that must be performed.
Многие типы тестов могут быть включены в киты, например конкурентный и неконкурентный анализы. Типичными примерами анализов, которые могут использовать антитела этого изобретения, являются радиоиммуноанализ РИА (RIA), ферментные иммуноанализы (EIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) и иммунометрические, или сэндвич, иммуноанализы. Many types of tests can be included in whales, such as competitive and non-competitive analyzes. Typical examples of assays that can use the antibodies of this invention are RIA radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassays (EIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and immunoassays, or sandwich immunoassays.
Под термином "иммунометрический анализ" (количественный иммуноанализ), или "сэндвич-иммуноанализ", подразумевают одновременный сэндвич-, прямой сэндвич-, обратный сэндвич-иммуноанализ. Эти термины хорошо понятны специалистам в данной области. Им также понятно, что антитела в соответствии с данным изобретением будут применимы в других вариациях и формах анализов, которые известны в настоящее время и которые могут быть разработаны в будущем. Подразумевается, что они входят в объем данного изобретения. By the term “immunometric assay” (quantitative immunoassay), or “sandwich immunoassay”, is meant a simultaneous sandwich, direct sandwich, reverse sandwich immunoassay. These terms are well understood by those skilled in the art. They also understand that the antibodies in accordance with this invention will be applicable in other variations and forms of assays that are currently known and which may be developed in the future. It is implied that they are included in the scope of this invention.
Фраза "специфически узнает и связывает" означает, что антитело узнает и связывает химерный рецепторный полипептид, но фактически не узнает и не связывает другие, не относящиеся к этому полипептиду молекулы в пробе, например в биологической пробе. The phrase “specifically recognizes and binds” means that the antibody recognizes and binds a chimeric receptor polypeptide, but does not actually recognize and does not bind other molecules that are not related to this polypeptide in the sample, for example, in a biological sample.
"Терапевтической клеткой" называют клетку, которая была трансформирована химерой рецептора CD4 этого изобретения таким образом, что она способна узнавать и разрушать ВИЧ-инфицированную клетку; предпочтительно такие терапевтические клетки являются клетками гемопоэтической системы. “Therapeutic cell” refers to a cell that has been transformed by the CD4 receptor chimera of this invention in such a way that it is able to recognize and destroy an HIV-infected cell; preferably such therapeutic cells are cells of the hematopoietic system.
Термин "внеклеточный" означает, что по меньшей мере часть молекулы экспонирована на поверхности клетки. "Внутриклеточный" означает имеющий по меньшей мере часть молекулы, находящуюся в цитоплазме терапевтической клетки. "Трансмембранный" означает, что по меньшей мере часть молекулы находится в мембране плазмы. "Внеклеточная часть", "внутриклеточная часть" и "трансмембранная часть" могут включать в себя фланкирующие аминокислотные последовательности, которые простираются в прилегающие клеточные компартменты. The term "extracellular" means that at least a portion of the molecule is exposed on the surface of the cell. "Intracellular" means having at least a portion of a molecule located in the cytoplasm of a therapeutic cell. "Transmembrane" means that at least a portion of the molecule is in the plasma membrane. The "extracellular part", "intracellular part" and "transmembrane part" may include flanking amino acid sequences that extend into adjacent cell compartments.
"Олигомеризоваться" означает образовывать комплекс с другими белками с образованием димеров, тримеров, тетрамеров или олигомеров более высокого порядка. Такие олигомеры могут быть гомоолигомерами или гетероолигомерами. "Олигомеризующая часть" представляет собой район молекулы, который управляет образованием комплекса (т.е. олигомера). “Oligomerization” means to complex with other proteins to form higher order dimers, trimers, tetramers or oligomers. Such oligomers may be homo-oligomers or hetero-oligomers. The "oligomerizing portion" is a region of a molecule that controls the formation of a complex (i.e., oligomer).
"Цитолитический" означает способный разрушать клетку (например, ВИЧ-инфицированную клетку) или способный разрушать инфекционный агент (например, вирус ВИЧ). “Cytolytic” means capable of destroying a cell (eg, an HIV-infected cell) or capable of destroying an infectious agent (eg, an HIV virus).
Под "вирусом иммунодефицита" подразумевают ретровирус, который в форме дикого типа способен инфицировать T4-клетки хозяина-примата и обладает вирусным морфогенезом и морфологией, характерными для подсемейства лентивирусов. Этот термин включает в себя, без ограничений, все варианты HIV (ВИЧ) и SIV, в том числе HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand и SIVcpz. By "immunodeficiency virus" is meant a retrovirus that, in the wild-type form, is capable of infecting T4 cells of a primate host and has viral morphogenesis and morphology characteristic of the lentivirus subfamily. This term includes, without limitation, all variants of HIV (HIV) and SIV, including HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand and SIVcpz.
"MHC-независимый" означает, что клеточный цитолитический ответ не требует присутствия антигена главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II на поверхности клетки-мишени. "MHC-independent" means that the cellular cytolytic response does not require the presence of a major histocompatibility complex (MHC) class II antigen on the surface of the target cell.
"Функциональное передающее (трансдуцирующее) цитолитический сигнал производное" обозначает функциональное производное (определенное выше), которое способно направлять по меньшей мере 40%, более предпочтительно 70% или наиболее предпочтительно 90% биологической активности молекулы дикого типа. В применении здесь, "функциональное передающее цитолитический сигнал производное" может действовать путем прямой подачи сигнала терапевтической клетке разрушить связанный рецептором агент или клетку (например, в случае внутриклеточной части химерного рецептора) или может действовать опосредованно путем усиления олигомеризации с передающими цитолитический сигнал белками терапевтической клетки (например, в случае трансмембранного домена). Такие производные могут быть испытаны на их эффективность, например, с применением описанных здесь тестов in vitro. "Functional transmitting (transducing) cytolytic signal derivative" means a functional derivative (as defined above) that is capable of directing at least 40%, more preferably 70% or most preferably 90% of the biological activity of a wild-type molecule. As used herein, a “functional cytolytic signal transducing derivative” can act by directly signaling to a therapeutic cell to destroy an agent or cell bound to the receptor (for example, in the case of the intracellular portion of a chimeric receptor), or it can act indirectly by enhancing oligomerization with cytolytic signal-transmitting proteins of the therapeutic cell ( for example, in the case of a transmembrane domain). Such derivatives can be tested for their effectiveness, for example, using the in vitro tests described herein.
"Функциональным связывающим оболочку ВИЧ производным" называют функциональное производное (определенное выше), которое способно связывать любой белок оболочки ВИЧ. A “functional HIV envelope binding derivative" is a functional derivative (as defined above) that is capable of binding any HIV envelope protein.
Функциональные производные могут быть идентифицированы с применением, например, описанных здесь тестов in vitro. Functional derivatives can be identified using, for example, the in vitro tests described herein.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ
Трансформированные клетки данного изобретения применяют для терапии вируса иммунодефицита. Текущие способы введения таких трансформированных клеток включают в себя адоптивную иммунотерапию или терапию переноса клеток. Эти способы позволяют возврат трансформированных клеток иммунной системы в кровоток. Rosenberg, Scientific American 62 (May 1009); Rosenberg et al. The New England Journal of Medicine 323(9):570 (1990).THERAPEUTIC INTRODUCTION
Transformed cells of the present invention are used for the treatment of immunodeficiency virus. Current methods of administering such transformed cells include adoptive immunotherapy or cell transfer therapy. These methods allow the return of transformed cells of the immune system into the bloodstream. Rosenberg, Scientific American 62 (May 1009); Rosenberg et al. The New England Journal of Medicine 323 (9): 570 (1990).
Фармацевтические композиции этого изобретения могут быть введены любому животному, которое может испытывать благоприятное действие соединений этого изобретения. Основными среди таких животных являются люди, хотя изобретение не лимитировано таким образом. The pharmaceutical compositions of this invention can be administered to any animal that may experience the beneficial effects of the compounds of this invention. The main among these animals are humans, although the invention is not limited in this way.
Подробное описание
Сначала будут описаны чертежи
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A - аминокислотная последовательность около сайта слияния между CD4 (остатки 1-369) и различными цепями рецептора. Подчеркнутая последовательность показывает положение аминокислот, кодируемых внутри сайта BamHl, используемого для конструирования слияния. Начало трансмембранного домена отмечено вертикальной чертой. Последовательность η идентична последовательности ζ при амино-конце, но отличается при карбоксильном конце (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)).Detailed description
First, drawings will be described.
Brief Description of the Drawings
FIG. 1A is the amino acid sequence near the fusion site between CD4 (residues 1-369) and various receptor chains. The underlined sequence indicates the position of the amino acids encoded within the BamHl site used to construct the fusion. The beginning of the transmembrane domain is marked with a vertical line. The sequence η is identical to the sequence ζ at the amino end, but differs at the carboxyl end (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990)).
Фиг. 1B - проточный цитометрический анализ поверхностной экспрессии CD4, CD4: ζ CD4: γ и CD4: η в клетках CVI. Клетки инфицировали вирусом, экспрессирующим химеры CD4 или CD16PI, инкубировали в течение 9 часов при 37oC и окрашивали конъюгированными с фикоэритрином анти-CD4 MAb Leu3A.FIG. 1B is a flow cytometric analysis of surface expression of CD4, CD4: ζ CD4: γ, and CD4: η in CVI cells. Cells were infected with a virus expressing CD4 or CD16 PI chimeras, incubated for 9 hours at 37 ° C and stained with anti-CD4 MAb Leu3A conjugated with phycoerythrin.
Фиг. 2 показывает поверхностную экспрессию CD16TM после ко-инфицирования одним CD16TM (плотные точки) или ко- инфицирования вирусом, экспрессирующим CD4: γ (штрихи) или CD4: ζ (сплошная линия). Редкие точки - клетки, инфицированные одним CD4: ζ окрашенные 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982)) (анти-CD16 MAb).FIG. 2 shows the surface expression of CD16 ™ after co-infection with one CD16 ™ alone (solid points) or co-infection with a virus expressing CD4: γ (streaks) or CD4: ζ (solid line). Rare points are cells infected with one CD4: ζ stained with 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275-3279 (1982)) (anti-CD16 MAb).
Фиг. 3 показывает поверхностную экспрессию CD16TM после ко-инфицирования вирусами, экспрессирующими CD16TM и следующими ζ химерами: CD4: ζ (жирная линия), CD4: ζ CllG (сплошная линия); CD4: ζ (штриховая линия); CD4: ζ C11G/D15G (плотные точки); без ко-инфицирования (CD16TM только, редкие точки). Клетки инкубировали с анти-CD16 MAb 3G8 и конъюгированными с фикоэритрином Fab'2 козьими антителами к мышиному IgG. Уровень экспрессии ζ химер был по существу идентичен для различных анализированных мутантов и ко-инфицирование клеток вирусами, экспрессирующими CD16TM и ζ химерами не изменяло ощутимо поверхностную экспрессию химер.FIG. 3 shows the surface expression of CD16 ™ after co-infection with viruses expressing CD16 ™ and the following ζ chimeras: CD4: ζ (bold line), CD4: ζ CllG (solid line); CD4: ζ (dashed line); CD4: ζ C11G / D15G (dense points); no coinfection (CD16 TM alone, sparse dots). Cells were incubated with anti-CD16 MAb 3G8 and goat anti-mouse IgG conjugated with phycoerythrin Fab'2. The expression level of ζ chimeras was essentially identical for the various mutants analyzed, and co-infection of cells with viruses expressing CD16 TM and ζ chimeras did not significantly alter the surface expression of chimeras.
Фиг. 4A-D показывают увеличение внутриклеточного иона свободного кальция после сшивания мутантных ζ химер в T-клеточной линии. Клетки Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunology 133:123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантными вирусами коровьей оспы и анализировали проточной цитометрией. Представлены результаты для популяции CD4+, так что анализировали только клетки, экспрессирующие соответствующий химерный белок (установкой дискриминационного окна в сортере). Среднее отношение фиолетовой к синей флуоресценции Indo-I отражает концентрацию внутриклеточного свободного кальция в популяции в целом, а процент отвечающих клеток отражает фракцию клеток, которая превышает заданное пороговое отношение (установленное таким образом, что 10% необработанных клеток являются положительными).FIG. 4A-D show an increase in the intracellular free calcium ion after crosslinking of mutant ζ chimeras in the T cell line. Jurkat E6 cells (Weiss et al., J. Immunology 133: 123-128 (1984)) were infected with recombinant vaccinia viruses and analyzed by flow cytometry. The results for the CD4 + population are presented, so only cells expressing the corresponding chimeric protein are analyzed (by setting a discriminatory window in the sorter). The average ratio of violet to blue fluorescence Indo-I reflects the concentration of intracellular free calcium in the population as a whole, and the percentage of responding cells reflects a fraction of cells that exceeds a predetermined threshold ratio (set so that 10% of untreated cells are positive).
Фиг. 4A и 4B показывают клетки Jurkat, экспрессирующие CD4: ζ (сплошная линия) или CD16: ζ (штриховая линия), которые выдерживали с анти-CD4 MAb Leu3a (конъюгированными с фикоэритрином) с последующим сшиванием с козьими антителами к мышиному IgG. Линия в виде точек показывает ответ неинфицированных клеток на анти-CD3 MAb ОКТ3. Фиг. 4C и 4D показывают клетки Jurkat, экспрессирующие CD4: ζ D15G (сплошная линия); CD4: ζ C11G/D15G (штрихи) или CD4: ζ C11G (точки), которые были обработаны и анализировались, как на фиг. 4A и 4B. FIG. 4A and 4B show Jurkat cells expressing CD4: ζ (solid line) or CD16: ζ (dashed line), which were incubated with anti-CD4 MAb Leu3a (conjugated to phycoerythrin) followed by crosslinking with goat anti-mouse IgG antibodies. A dotted line shows the response of uninfected cells to anti-CD3 MAb OCT3. FIG. 4C and 4D show Jurkat cells expressing CD4: ζ D15G (solid line); CD4: ζ C11G / D15G (dashes) or CD4: ζ C11G (dots) that were processed and analyzed as in FIG. 4A and 4B.
Фиг. 5A-C показывают, что рецепторы CD4: ζ, CD4: η и CD4: γ позволяют цитолитическим T-лимфоцитам (CTL) убивать
мишени, экспрессирующие gp120/41 ВИЧ-1. Фиг. 5A: сплошные кружки - CTL, экспрессирующие CD4: ζ , инкубировали с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4: ζ , инкубировали с неинфицированными клетками HeLa; сплошные квадраты - неинфицированные CTL, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые квадраты - неинфицированные CTL, инкубированные с неинфицированными клетками HeLa. Фиг. 5B: сплошные кружки - CTL, экспрессирующие CD4: η , инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4: γ , инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые квадраты - CTL, экспрессирующие C11G/D15G двойную мутантную химеру CD4: ζ , инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41. Фиг. 5C: проточный цитометрический анализ экспрессии CD4 CTL, используемыми в фиг. 5B. Для корректировки отношений мишени к эффектору процент клеток, экспрессирующих химерный CD4, определяли вычитанием масштабированной негативной (неинфицированной) популяции наложением гистограмм; для целей сравнения на этом рисунке неинфицированные клетки были определены как произвольный порог, что дает грубо ту же самую фракцию, позитивную, для других клеточных популяций, какую дало бы вычитание гистограмм.FIG. 5A-C show that receptors CD4: ζ, CD4: η and CD4: γ allow cytolytic T lymphocytes (CTL) to kill
targets expressing HIV-1 gp120 / 41. FIG. 5A: solid circles — CTL expressing CD4: ζ were incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41; open circles - CTLs expressing CD4: ζ were incubated with uninfected HeLa cells; solid squares — uninfected CTLs incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41; open squares - uninfected CTLs incubated with uninfected HeLa cells. FIG. 5B: solid circles — CTL expressing CD4: η incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41; open circles - CTL expressing CD4: γ incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41; open squares are CTLs expressing the C11G / D15G double mutant CD4: ζ chimera incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41. FIG. 5C: Flow cytometric analysis of the CD4 CTL expression used in FIG. 5B. To adjust the target to effector ratios, the percentage of cells expressing the chimeric CD4 was determined by subtracting the scaled negative (uninfected) population by superimposing histograms; for comparison purposes, in this figure, uninfected cells were defined as an arbitrary threshold, which gives roughly the same fraction, positive for other cell populations, which would result in the subtraction of histograms.
Фиг. 6A-B показывают специфичность CD4-направляемого цитолиза. Фиг. 6A: сплошные кружки - CTL, экспрессирующие CD4: ζ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими CD16PI; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41. Фиг. 6B: сплошные кружки - CTL, экспрессирующие CD4: ζ , инкубированные с клетками Raji (MHC класса II+); открытые кружки - неинфицированные CTL клетки, инкубированные с RJ2.2.5 (мутант MHC класса II- Raji) клетками; сплошные квадраты - неинфицированные CTL, инкубированные с клетками Raji (MHC класса 11+); открытые квадраты - CTL, экспрессирующие CD4: ζ , инкубированные с клетками RJ2.2.5 (MHC класса II-). Масштаб ординаты увеличен.FIG. 6A-B show the specificity of CD4-directed cytolysis. FIG. 6A: solid circles — CTL expressing CD4: ζ incubated with HeLa cells expressing CD16 PI ; open circles are CTLs expressing CD4 incubated with HeLa cells expressing gp120 / 41. FIG. 6B: solid circles — CTL expressing CD4: ζ incubated with Raji cells (MHC class II + ); open circles - uninfected CTL cells incubated with RJ2.2.5 (MHC class II mutant - Raji) cells; solid squares - uninfected CTLs incubated with Raji cells (MHC class 11 + ); open squares are CTLs expressing CD4: ζ incubated with RJ2.2.5 cells (MHC class II - ). The scale of the ordinate is increased.
Фиг. 7A-B дают характеристику химерного рецептора CD16: ζ. Фиг. 7A - схематическая диаграмма слитого белка CD16: ζ. Внеклеточная часть соединенной с фосфатидилинозитом формы мономерного CD16 была соединена с димерным ζ непосредственно снаружи по отношению к трансмембранному домену. Последовательность белка при соединении показана в нижней части. Фиг. 7B показывает проточный цитометрический анализ мобилизации кальция после сшивания химеры CD16: ζ либо в TCR-положительной, либо в TCR-отрицательной клеточной линии. Среднее отношение фиолетовой к голубой флуоресценции (мера относительной концентрации иона кальция) показано среди клеточных популяций, обработанных антителами, при времени 0. Сплошные квадраты - ответ клеток Jurkat на анти-CD3 MAb ОКТ3; сплошные треугольники - ответ CD16: ζ на анти- CD16 MAb 3G8, сшитых в мутанте REX33A TCR-; открытые квадраты - ответ на сшивание CD16: ζ в TCR- мутантной линии клеток Jurkat JRT3.T3.5; открытые треугольники - ответ на сшивание CD16: ζ в клетках Jurkat; крестики - ответ на нехимерный CD16 в клетках Jurkat; точки - ответ на нехимерный CD16 в REX33A TCR клеточной линии.FIG. 7A-B characterize the chimeric receptor CD16: ζ. FIG. 7A is a schematic diagram of a CD16: ζ fusion protein. The extracellular portion of the phosphatidylinositol-conjugated form of monomeric CD16 was coupled to the dimeric ζ directly externally with respect to the transmembrane domain. The protein sequence of the compound is shown at the bottom. FIG. 7B shows a flow cytometric analysis of calcium mobilization after crosslinking of the CD16: ζ chimera in either a TCR-positive or TCR-negative cell line. The average ratio of violet to blue fluorescence (a measure of the relative concentration of calcium ion) is shown among cell populations treated with antibodies at
Фиг. 8A-B показывает делеционный анализ цитолитического потенциала. Фиг. 8A показывает местоположения концевых точек делеций ζ. Здесь, как и в других местах, мутации в ζ представлены так: первоначальный остаток - местоположение - остаток мутанта, так что D66*, например, обозначает замену Asp-66 кодоном терминации. Фиг. 8B показывает результаты анализа цитолиза неделетированного CD16: ζ и выделяющихся делеций ζ. Гибридомные клетки, экспрессирующие поверхностные антитела к CD16, нагружали 51Cr и инкубировали с увеличивающимися количествами цитолитических лимфоцитов (CTL) человека, инфицированных рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими химеры CD16: ζ Процент выделенного 51Cr нанесен на график как функция отношения эффекторных клеток (CTL) к клеткам-мишеням (гибридомным клеткам) (e/t). Сплошные кружки - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими CD16: ζ (mfi 18.7); сплошные квадраты - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими CD16: ζ Asp66* (mfi 840.2); открытые квадраты - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими CD16: ζ Glu60+ (mfi 16.0); открытые кружки - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими CD16: ζ Tyr51* (mfi 17.4); сплошные треугольники - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими CD16: ζ Phe34* (mfi 17.8); и открытые треугольники - цитолиз, медиируемый клетками, экспрессирующими нехимерный CD16 (mfi 591). Хотя в этом эксперименте экспрессия CD16: ζ Asp66* не была сравнима с экспрессией других слитых белков, цитолиз клетками, экспрессирующими CD16: ζ при эквивалентных уровнях в том же самом эксперименте дал результаты, по существу одинаковые с результатами, обнаруживаемыми клетками, экспрессирующими CD16: ζ Asp66.FIG. 8A-B shows a deletion analysis of cytolytic potential. FIG. 8A shows the locations of the end points of the deletions ζ. Here, as elsewhere, mutations in ζ are represented as follows: the initial residue — location — residue of the mutant, so that D66 * , for example, means replacing Asp-66 with a termination codon. FIG. 8B shows the results of cytolysis analysis of undeleted CD16: ζ and secreting ζ deletions. Hybridoma cells expressing surface antibodies to CD16 were loaded with 51 Cr and incubated with increasing amounts of human cytolytic lymphocytes (CTL) infected with vaccinia virus recombinants expressing CD16 chimeras: ζ The percentage of isolated 51 Cr is plotted as a function of effector cell ratio (CTL) to target cells (hybridoma cells) (e / t). Solid circles — cytolysis mediated by cells expressing CD16: ζ (mfi 18.7); solid squares — cytolysis mediated by cells expressing CD16: ζ Asp66 * (mfi 840.2); open squares - cytolysis mediated by cells expressing CD16: ζ Glu60 + (mfi 16.0); open circles — cytolysis mediated by cells expressing CD16: ζ Tyr51 * (mfi 17.4); solid triangles - cytolysis mediated by cells expressing CD16: ζ Phe34 * (mfi 17.8); and open triangles — cytolysis mediated by cells expressing non-chimeric CD16 (mfi 591). Although in this experiment the expression of CD16: ζ Asp66 * was not comparable with the expression of other fusion proteins, cytolysis by cells expressing CD16: ζ at equivalent levels in the same experiment yielded results substantially identical to those found by cells expressing CD16: ζ Asp66.
Фиг. 9A-D показывают, что элиминация потенциала для трансмембранных взаимодействий обнаруживает короткий сегмент ζ, способный медиировать цитолиз. Фиг. 9A - схематическая диаграмма мономерных состоящих из двух и трех частей химер. В верхней части находится конструкция CD16: ζ, укороченная при остатке 65 и не имеющая трансмембранных остатков Cys и Asp. Ниже находятся конструкции CD16:CD5: ζ и CD16: CD7: ζ и соответствующие контроли. Пептидные последовательности внутриклеточных доменов показаны ниже. Фиг. 9B показывает цитолитическую активность мономерных химерных делеционных мутантов. Цитолитическую активность клеток, экспрессирующих CD16: ζ (сплошные кружки; mfi 495), сравнивали с цитолитической активностью клеток, экспрессирующих CD16: ζ Asp66* (сплошные квадраты; mfi 527) или мутантов CD16: ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (открытые квадраты; mfi 338) и CD16: ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60* (заполненные треугольники; mfi 259). Фиг. 9C показывает цитолитическую активность, медиируемую слитыми белками, состоящими из трех частей. Сплошные треугольники - CD16: ζ Asp66*; открытые квадраты - CD16: 5: ζ (48-65); сплошные квадраты - CD16:7: ζ (48-65); открытые треугольники - CD16: 7: ζ (48-59); открытые кружки - CD16:5; сплошные кружки - CD16: 5. Фиг. 9D показывает мобилизацию кальция мутантами и состоящими из трех частей химерами в TCR- линии мутантных клеток Jurkat JRT3.T3.5. Открытые кружки - ответ клеток, экспрессирующих димерный CD16: ζ Asp66*; сплошные квадраты - ответ клеток, экспрессирующих CD16: ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*; открытые квадраты - ответ клеток, экспрессирующих CD16: ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60*; сплошные треугольники - ответ клеток, экспрессирующих CD16: 7: ζ (48-65); и открытые треугольники - ответ клеток, экспрессирующих CD16: ζ (48-59).FIG. 9A-D show that elimination of the potential for transmembrane interactions reveals a short ζ segment capable of mediating cytolysis. FIG. 9A is a schematic diagram of monomeric two and three part chimeras. At the top is the CD16: ζ construct, shortened at
Фиг. 10A-F показывают вклад отдельных аминокислот в активность передающего цитолитический сигнал мотива из 18 остатков. Фиг. 10A и 10B показывают цитолитическую активность, а фиг. 10C показывает мобилизацию иона кальция, медиируемую химерами, несущими точковые мутации вблизи карбоксил-концевого тирозина (Y62). Фиг. 10A и 10B представляют данные, полученные на клетках, экспрессирующих низкие и высокие количества, соответственно, слитых белков CD16: ζ. Идентичные символы использованы для мобилизации кальция и анализов цитолиза и они показаны в однобуквенном коде справа. Сплошные кружки - клетки, экспрессирующие CD16: ζ (mfi в A, 21; В,376); сплошные квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7: ζ (48-65) (mfi А, 31; В, 82); открытые квадраты - CD16: 7: ζ (48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; В, 92); крестики - CD16:7: ζ (48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; В, 74); сплошные треугольники - CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; В, 88); открытые кружки - CD16:7: ζ (48-65)Glu6lGln (mfi A, 20; В, 62); и открытые треугольники - CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Ser (mfi В, 64). Фиг. 10D и 10E показывают цитолитическую активность, а фиг. 10F показывает мобилизацию иона кальция химерами, несущими точковые мутации вблизи амино-концевого тирозина (Y51). Идентичные символы использованы для мобилизации кальция и анализов цитолиза и они показаны справа. Сплошные кружки-клетки, экспрессирующие CD16: ζ (mfi в D, 21.2; в E, 672); сплошные квадраты-клетки, экспрессирующие CD16: 7: ζ (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); сплошные треугольники - CD16:7: ζ (48-65)-Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); открытые квадраты - CD16: 7: ζ (48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); и открытые треугольники - CD16:7: ζ (48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294). FIG. 10A-F show the contribution of individual amino acids to the activity of a cytolytic signal-transmitting motif of 18 residues. FIG. 10A and 10B show cytolytic activity, and FIG. 10C shows the mobilization of calcium ion mediated by chimeras carrying point mutations near the carboxyl terminal tyrosine (Y62). FIG. 10A and 10B present data obtained on cells expressing low and high amounts, respectively, of CD16: ζ fusion proteins. Identical symbols are used to mobilize calcium and cytolysis assays and are shown in the single letter code on the right. Solid circles are cells expressing CD16: ζ (mfi in A, 21; B, 376); solid squares - cells expressing CD16: 7: ζ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); open squares - CD16: 7: ζ (48-65) Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); crosses - CD16: 7: ζ (48-65) Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); solid triangles - CD16: 7: ζ (48-65) Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); open circles - CD16: 7: ζ (48-65) Glu6lGln (mfi A, 20; B, 62); and open triangles - CD16: 7: ζ (48-65) Tyr62Ser (mfi B, 64). FIG. 10D and 10E show cytolytic activity, and FIG. 10F shows the mobilization of calcium ion by chimeras carrying point mutations near the amino terminal tyrosine (Y51). Identical symbols are used to mobilize calcium and cytolysis assays and are shown on the right. Continuous circles-cells expressing CD16: ζ (mfi in D, 21.2; in E, 672); solid square cells expressing CD16: 7: ζ (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); solid triangles - CD16: 7: ζ (48-65) -Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); open squares - CD16: 7: ζ (48-65) Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); and open triangles - CD16: 7: ζ (48-65) Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).
Фиг. 11A-B показывают сравнительный анализ внутренних повторов ζ и сравнение их способности поддерживать цитолиз. Фиг. 11A - схематическая диаграмма химер, образованных разделением внутриклеточного домена ζ на трети и присоединением их к трансмембранному домену химеры CD16:7. Последовательности этих внутриклеточных доменов показаны ниже, с общими остатками, заключенными в блоки, и близкими остатками, отмеченными звездочками. Фиг. 11B показывает цитолитическую активность трех субдоменов ζ. Сплошные кружки - клетки, экспрессирующие CD16: ζ (mfi 476); сплошные квадраты - CD16:7: ζ (71-104) (mfi 114); и сплошные треугольники - CD16:7: ζ (104-138) (mfi 104). FIG. 11A-B show a comparative analysis of internal ζ repeats and a comparison of their ability to support cytolysis. FIG. 11A is a schematic diagram of chimeras formed by dividing the intracellular domain ζ into thirds and joining them to the transmembrane domain of the CD16: 7 chimera. The sequences of these intracellular domains are shown below, with common residues enclosed in blocks and close residues marked with asterisks. FIG. 11B shows the cytolytic activity of three subdomains of ζ. Solid circles are cells expressing CD16: ζ (mfi 476); solid squares - CD16: 7: ζ (71-104) (mfi 114); and solid triangles - CD16: 7: ζ (104-138) (mfi 104).
Фиг. 12 - схема химер CD16:FcRγII. FIG. 12 is a schematic of the CD16: FcRγII chimeras.
Фиг. 13A-B показывает мобилизацию кальция после сшивания химер CD4:FcR γ II и CD16:FcRγII. Фиг. 13A показывает отношение фиолетовой к синей флуоресценции, испускаемой клетками, загруженными чувствительным к кальцию флуорофором Indo-1, представленное как функция времени после сшивания внеклеточного домена CD16 с антителами. Фиг. 13B показывает подобный анализ увеличения в отношении фиолетовой к синей флуоресценции клеток, несущих химеры CD4: FcRγII, после сшивания с антителами. FIG. 13A-B shows calcium mobilization after crosslinking of CD4: FcR γ II and CD16: FcRγII chimeras. FIG. 13A shows the ratio of violet to blue fluorescence emitted by cells loaded with calcium-sensitive Indo-1 fluorophore, presented as a function of time after crosslinking of the extracellular domain of CD16 with antibodies. FIG. 13B shows a similar analysis of the increase in the ratio of violet to blue fluorescence of cells bearing CD4: FcRγII chimeras after crosslinking with antibodies.
Фиг. 14A-B показывает анализ цитолиза химер CD4:FcR γ II и CD16:FcR γ II. Фиг. 14A показывает процент 51Cr, выделенного из анти-CD16 гибридомных клеток при выдерживании клеток с увеличивающимися количествами цитотоксических T-лимфоцитов, экспрессирующих химеры CD16:FcR γ II (эффекторных клеток). Фиг. 14B показывает подобный анализ цитотоксичности, медиируемой химерами CD4: FcR γ II, против клеток-мишеней, экспрессирующих гликопротеины оболочки ВИЧ.FIG. 14A-B shows an analysis of the cytolysis of chimeras CD4: FcR γ II and CD16: FcR γ II. FIG. 14A shows the percentage of 51 Cr isolated from anti-CD16 hybridoma cells upon incubation of cells with increasing amounts of cytotoxic T lymphocytes expressing CD16 chimeras: FcR γ II (effector cells). FIG. 14B shows a similar analysis of the cytotoxicity mediated by CD4: FcR γ II chimeras against target cells expressing HIV envelope glycoproteins.
Фиг. 15A-E показывает идентификацию остатков в хвосте FcR γ II А, который важен для цитолиза. Фиг. 15A - схема делеционных конструкций. Фиг. 15B и 15C показывают мобилизацию кальция и цитолиз карбоксил-концевыми делеционными вариантами CD16:FcR γ II А. Фиг. 15B и 15E показывают мобилизацию кальция и цитолиз химерами из трех частей, несущими прогрессивно уменьшающийся амино-конец внутриклеточного хвоста, CD16:FcR γ II А. FIG. 15A-E shows the identification of residues in the tail of FcR γ II A, which is important for cytolysis. FIG. 15A is a diagram of deletion constructs. FIG. 15B and 15C show calcium mobilization and cytolysis of the carboxyl-terminal deletion variants of CD16: FcR γ II A. FIG. 15B and 15E show the mobilization of calcium and cytolysis by three-part chimeras carrying the progressively decreasing amino end of the intracellular tail, CD16: FcR γ II A.
Фиг. 16 (SEQ ID N 24) показывает аминокислотную последовательность рецепторного белка CD3 дельта; заключенная в блок последовательность представляет собой предпочтительную передающую сигнал часть. FIG. 16 (SEQ ID N 24) shows the amino acid sequence of the CD3 delta receptor protein; the block sequence is a preferred signal transmitting portion.
Фиг. 17 (SEQ ID N 25) показывает аминокислотную последовательность рецепторного белка T3 гамма; заключенная в блок последовательность представляет собой предпочтительную передающую цитолитический сигнал часть. FIG. 17 (SEQ ID N 25) shows the amino acid sequence of the T3 gamma receptor protein; the boxed sequence is a preferred cytolytic signal transmitting portion.
Фиг. 18 (SEQ ID N 26) показывает аминокислотную последовательность рецепторного белка mbi; заключенная в блок последовательность представляет собой предпочтительную передающую цитолитический сигнал часть. FIG. 18 (SEQ ID N 26) shows the amino acid sequence of the mbi receptor protein; the boxed sequence is a preferred cytolytic signal transmitting portion.
Фиг. 19 (SEQ ID 27) показывает аминокислотную последовательность рецепторного белка B29; заключенная в блок последовательность представляет собой предпочтительную передающую цитолитический сигнал часть. FIG. 19 (SEQ ID 27) shows the amino acid sequence of the B29 receptor protein; the boxed sequence is a preferred cytolytic signal transmitting portion.
Фиг. 20A-E показывает схему химер CD4. Молекула "А" -CD4(D1- D4):Ig:CD7; молекула "В" - CD4(D1,D2):Ig:CD7; молекула "С" - CD4(D1-D4):Ig:CD7: ζ ; молекула "D" - CD4(D1,D2): Ig:CD7: ζ ; и молекула "E" - CD4: ζ . Внеклеточный домен молекулы CD4 человека, соответствующий аминокислотам 1-394 предшественника, соединяли при помощи сайта BamHI с шарнирной
областью, CH1 и CH2 доменами человеческого IgG1, как описано ранее (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), за исключением того, что использовали кДНК-версию последовательностей человеческого Ig для того, чтобы происходила экспрессия в рекомбинантных вирусах коровьей оспы. Двухдоменную версию химер CD4 создавали встраиванием BamHI-адаптора в уникальном сайте NheI (соответствующем аминокислоте 200) в кДНК предшественника CD4. Последовательности присоединения к мембране состояли из 22 остатков из первого экзона человеческого мембрано-связанного IgG1, за которыми следовали остатки CD7 146-203. Аминокислоты 55- 163 ζ служили в качестве триггерного мотива конструкций из четырех частей (C и D). В состоящих из четырех частей конструкциях, содержащих цепь ζ, была документирована внутриклеточная экспрессия ζ c коммерчески доступными антителами против внутриклеточного домена (Coulter).FIG. 20A-E shows a diagram of the CD4 chimeras. Molecule "A" -CD4 (D1-D4): Ig: CD7; molecule "B" - CD4 (D1, D2): Ig: CD7; molecule "C" - CD4 (D1-D4): Ig: CD7: ζ; molecule "D" - CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ; and the E molecule is CD4: ζ. The extracellular domain of the human CD4 molecule, corresponding to amino acids 1-394 of the precursor, was connected using the BamHI site with a hinge
region, CH1 and CH2 domains of human IgG1, as previously described (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)), except that the cDNA version of human Ig sequences was used to allow expression in recombinant cowpox viruses. A two-domain version of the CD4 chimeras was created by embedding the BamHI adapter at the unique NheI site (corresponding to amino acid 200) in the cDNA of the CD4 precursor. Membrane accession sequences consisted of 22 residues from the first exon of human membrane-bound IgG1, followed by CD7 residues 146-203. Amino acids 55-163 ζ served as the trigger motif of four-part constructs (C and D). In four-part constructs containing the ζ chain, intracellular expression of ζ with commercially available antibodies against the intracellular domain (Coulter) has been documented.
Фиг. 21 показывает цитолиз клеток-мишеней, экспрессирующих гликопротеин оболочки ВИЧ, медиируемый клоном цитотоксических T- клеток, WH3, экспрессирующих различные произведенные из CD4 химеры в качестве эффекторных молекул. Для анализов на цитотоксичность CD8+ CD4-HLA B44 рестриктированную T-клеточную линию человека, WH3, поддерживали в среде IMDM, дополненную 10% человеческой сывороткой, как описано здесь ранее. Клетки стимулировали облученными гамма-лучами (3000 рад), несущими B44 мононуклеарными клетками и фитогемагглютинином (РНА) при концентрации 1 мкг/мл. После одного дня стимулирования PHA разводили до 0.5 мкг/мл добавлением свежей среды; после 3 дней среду заменяли полностью. Клетки выращивали по меньшей мере в течение 10 дней перед использованием в анализах цитотоксичности. Клетки инфицировали подходящими рекомбинантными вирусами коровьей оспы, как описано здесь для VPE16. Инфекции происходили в течение дополнительных 3-4 часов в полной среде, после чего клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали при плотности 1 • 107 клеток/мл. По 100 мкл добавляли в каждую лунку микротитрационного планшета с U-образной нижней частью, содержащую 100 мкл на лунку полной среды и разводили в 2-кратных серийных стадиях. Две лунки для каждой пробы не содержали лимфоцитов для измерения спонтанного выделения хрома и общего поглощения хрома. Клетки-мишени, HeLa сублинию S3 (HeLa-S3, ATCC), инфицировали, как описано выше, в чашках 10 см с vPE16 • 106 инфицированных клеток отделяли при помощи PBS и 1 мМ ЭДТА, центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл 51Cr-хромата натрия (1 мКи/мл в PBS) и выдерживали в течение 1 часа при 37oC и затем промывали 3 раза PBS. 100 мкл меченых клеток-мишеней добавляли к каждой лунке. Микротитрационный планшет откручивали при 750 х g в течение 1 минуты и инкубировали в течение 4 часов при 37oC. В конце инкубационного периода клетки в каждой лунке ресуспендировали осторожным пипетированием, брали пробу для определения общего числа включенных импульсов и микротитрационный планшет откручивали при 750 х g в течение 1 минуты. Брали аликвоты (100 мкл) супернатанта и считали в гамма-лучевом сцинтилляционном счетчике. Отношение эффектор: мишень корректировали на процент инфицированных клеток, измеренных при помощи проточной цитометрии.FIG. 21 shows the cytolysis of target cells expressing an HIV envelope glycoprotein mediated by a clone of cytotoxic T cells, WH3 expressing various chimera derived from CD4 as effector molecules. For cytotoxicity assays, CD8 + CD4 - HLA B44, the restricted human T cell line, WH3, was maintained in IMDM supplemented with 10% human serum as previously described here. Cells were stimulated with irradiated gamma rays (3000 rad) carrying B44 mononuclear cells and phytohemagglutinin (PHA) at a concentration of 1 μg / ml. After one day of stimulation, the PHA was diluted to 0.5 μg / ml by the addition of fresh medium; after 3 days, the medium was completely replaced. Cells were grown for at least 10 days before being used in cytotoxicity assays. Cells were infected with suitable recombinant vaccinia viruses as described here for VPE16. Infections occurred for an additional 3-4 hours in complete medium, after which the cells were collected by centrifugation and resuspended at a density of 1 • 10 7 cells / ml. 100 μl was added to each well of a microtiter plate with a U-shaped lower part containing 100 μl per well of complete medium and diluted in 2-fold serial steps. Two wells for each sample did not contain lymphocytes to measure spontaneous chromium excretion and total chromium uptake. Target cells, HeLa subline S3 (HeLa-S3, ATCC), were infected as described above, in 10 cm plates with vPE16 • 10 6 infected cells were separated using PBS and 1 mM EDTA, centrifuged and resuspended in 100 μl 51 Cr- sodium chromate (1 mCi / ml in PBS) and kept for 1 hour at 37 ° C and then washed 3 times with PBS. 100 μl of labeled target cells were added to each well. The microtiter plate was unscrewed at 750 x g for 1 minute and incubated for 4 hours at 37 ° C. At the end of the incubation period, the cells in each well were resuspended by careful pipetting, a sample was taken to determine the total number of pulses included, and the microtiter plate was unscrewed at 750 x g within 1 minute. Aliquots (100 μl) of the supernatant were taken and counted in a gamma ray scintillation counter. The effector: target ratio was corrected for the percentage of infected cells measured by flow cytometry.
Фиг. 22 показывает репликацию ВИЧ-1 в трансфицированных клеточных линиях. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие CD4 дикого типа и различные рекомбинантные химеры, были созданы в сублинии линии 293 эмбриональных почечных клеток человека. Исходный раствор вируса изолята ВИЧ-1IIIB готовили с титром приблизительно 106 инфекционных частиц/мл, как измерено анализом конечных результатов разведения с применением линии C8166 T-клеток человека в качестве индикатора. Инфицирования проводили при приблизительной множественности заражения 1 в течение периода 8-12 часов при 37oC. На следующий день клетки промывали PBS три раза, трипсинизировали, пересевали в новые чашки и культуральный супернатант брали для определения титра (обозначенного как день 0). С интервалами 3-4 дня после этого супернатанты клеточных культур собирали и сохраняли для анализа p24. Клетки снабжали свежей средой, содержащей гигромицин B в концентрации 100 мкг/мл. Анализ культуральных супернатантов проводили с применением коммерческого кита для анализа на основе ELISA антигена p24 ВИЧ-1 (Coulter) в соответствии с инструкциями, поставляемыми изготовителем. Результаты являются репрезентативными данными двух независимых экспериментов сходной продолжительности.FIG. 22 shows HIV-1 replication in transfected cell lines. Cell lines stably expressing wild-type CD4 and various recombinant chimeras were created in the subline of the 293 human embryonic kidney cell line. The stock solution of the HIV-1IIIB isolate virus was prepared with a titer of approximately 10 6 infectious particles / ml as measured by analysis of the final dilution results using the human T-cell line C8166 as an indicator. Infections were carried out with an approximate multiplicity of
Фиг. 23 показывает последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность доменов D1-D4 CD4 (CD4 Bam). FIG. 23 shows the nucleic acid sequence and amino acid sequence of the D1-D4 CD4 domains (CD4 Bam).
Фиг. 24 показывает последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность доменов D1-D2 CD4 (CD4 Nhe). FIG. 24 shows the nucleic acid sequence and amino acid sequence of the D1-D2 CD4 domains (CD4 Nhe).
Фиг. 25 показывает последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность шарнирной области, CH2 и CH3 доменов человеческого IgG1 (Igh23 Bam). FIG. 25 shows the nucleic acid sequence and the amino acid sequence of the hinge region, CH2 and CH3 domains of human IgG1 (Igh23 Bam).
Фиг. 26 показывает последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность трансмембранного домена CD7 (ТМ7 Barn Mlu). FIG. 26 shows the nucleic acid sequence and amino acid sequence of the transmembrane domain of CD7 (TM7 Barn Mlu).
Фиг. 27 показывает последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность внутриклеточного домена дзета (Zeta Mlu Not). FIG. 27 shows the nucleic acid sequence and amino acid sequence of the intracellular domain of zeta (Zeta Mlu Not).
Фиг. 28 показывает последовательность ДНК и первичную аминокислотную последовательность синтетической альфа-спирали. FIG. 28 shows a DNA sequence and a primary amino acid sequence of a synthetic alpha helix.
ПРИМЕР 1
Конструирование химер человеческий IgGl: рецептор
Последовательности тяжелых цепей IgGl человека получали соединением последовательностей в CH3 домене с фрагментом кДНК, произведенным из 3'-конца трансмембранной формы мРНК антитела. 3'-концевой фрагмент получали при помощи полимеразной цепной реакции с применением библиотеки кДНК миндалин в качестве субстрата и олигонуклеотидов, имеющих последовательности:
CGC GGG GTG АСС GTG CCC ТСС AGC AGC TTG GGC (SEQ ID N 7)
CGC GGG GAT CCG TCG ТСС AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT CCT CA (SEQ ID N 8),
соответствующих 5'- и 3'-концам желаемых фрагментов ДНК соответственно/ 5'-олиго комплементарен сайту в домене CH1 человеческого IgGl, а 3'-олиго комплементарен сайту, расположенному непосредственно 5' от последовательностей, кодирующих пересекающий мембрану домен. Продукт ПЦР расщепляли при помощи BstXI и BamHI и лигировали между сайтами BstXI и BamHI полусинтетического гена IgGl антитела, несущего вариабельную и константную области. После встраивания фрагмента BstXI-BamHI амплифицированные части этой конструкции вводили в сайт Smal в CH3 обменом рестрикционных фрагментов, так что только часть между сайтом SmaI и 3'-олиго была произведена из реакции ПЦР.EXAMPLE 1
Construction of human IgGl chimeras: receptor
Human IgGl heavy chain sequences were obtained by connecting sequences in the CH3 domain with a cDNA fragment derived from the 3 ′ end of the transmembrane form of an antibody mRNA. The 3'-terminal fragment was obtained by polymerase chain reaction using the tonsil cDNA library as a substrate and oligonucleotides having the sequence:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID N 7)
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT CCT CA (SEQ ID N 8),
corresponding to the 5'- and 3'-ends of the desired DNA fragments, respectively, the 5'-oligo is complementary to the site in the CH1 domain of human IgGl, and the 3'-oligo is complementary to the site located directly 5 'from sequences encoding the membrane-crossing domain. The PCR product was digested with BstXI and BamHI and ligated between the BstXI and BamHI sites of the semi-synthetic IgGl gene of the antibody carrying the variable and constant regions. After inserting the BstXI-BamHI fragment, the amplified parts of this construct were introduced into the Smal site in CH3 by exchange of restriction fragments, so that only the part between the SmaI site and the 3'-oligo was produced from the PCR reaction.
Для создания химерного рецептора человеческий IgGl: ζ ген тяжелой цепи, заканчивающийся сайтом BamHI, соединяли с сайтом BamHI описанной ниже ζ -химеры, так что последовательности антитела образовали внеклеточную часть. Проточная цитометрия клеток COS, трансфицированных плазмидой, кодирующей эту химеру, показала высокие уровни экспрессии детерминат антитела при ко-трансфекции экспрессирующей плазмиды, кодирующей кДНК легкой цепи, и умеренную экспрессию детерминант антитела при отсутствии экспрессирующей плазмиды легкой цепи. To create a chimeric receptor, human IgGl: ζ heavy chain gene ending at the BamHI site was linked to the BamHI site of the ζ chimera described below, so that the antibody sequences formed the extracellular part. Flow cytometry of COS cells transfected with a plasmid encoding this chimera showed high levels of expression of the determinate antibodies upon co-transfection of the expression plasmid encoding the light chain cDNA and moderate expression of the determinants of the antibody in the absence of the light chain expressing plasmid.
Подобные химеры, включающие в себя IgG1 человека, слитый с η или γ (см. ниже) или любой трансдуцирующей сигнал частью белка T-клеточного рецептора или Fc-рецептора, могут быть сконструированы в общем, как описано выше, с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Such chimeras, including human IgG1 fused to η or γ (see below) or any signal transducing portion of a T-cell receptor or Fc receptor protein, can be constructed generally, as described above, using standard molecular biology methods .
Для создания отдельной транскрипционной единицы, которая позволила бы как тяжелым, так и легким цепям экспрессироваться от одного промотора, была создана плазмида, кодирующая бицистронную мРНК из последовательностей, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь, и 5'-нетранслируемой части этой мРНК, кодирующей регулируемый глюкозой белок 78 кДа, известный иначе как grp78 или BiP. Последовательности grp78 получали при помощи ПЦР из геномной ДНК человека с применением праймеров, имеющих последовательности:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID N 9) и
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID IP 10)
при 5'- и 3'- концах соответственно. Полимеразные цепные реакции выполняли с этими олигонуклеотидами в присутствии 10% диметилсульфоксида. Полученный при помощи ПЦР фрагмент расщепляли NotI и HincII и встраивали между NotI и HpaI по ходу транскрипции от последовательностей, кодирующих IgGl человека. Затем последовательности, кодирующие кДНК легкой каппа-цепи IgG человека, встраивали по ходу транскрипции от лидера grp78 с использованием сайта HincII и другого сайта в векторе. Полученная в результате этих манипуляций экспрессионная плазмида состояла из полусинтетического гена тяжелой цепи, за которым следовали лидерные последовательности grp78, а затем последовательности кДНК легкой цепи каппа и сигналы полиаденилирования, полученные из фрагмента ДНК SV40. Трансфекция клеток COS этой экспрессирующей плазмидой дала заметно улучшенную экспрессию детерминант тяжелой цепи по сравнению с трансфекцией плазмиды, кодирующей только детерминанты тяжелой цепи.To create a separate transcriptional unit that would allow both heavy and light chains to be expressed from a single promoter, a plasmid encoding a bicistronic mRNA was created from sequences encoding a heavy chain and light chain, and a 5'-untranslated part of this mRNA encoding glucose-regulated 78 kDa protein, otherwise known as grp78 or BiP. The grp78 sequences were obtained by PCR from human genomic DNA using primers having the sequences:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID N 9) and
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID IP 10)
at the 5'- and 3'-ends, respectively. Polymerase chain reactions were performed with these oligonucleotides in the presence of 10% dimethyl sulfoxide. The fragment obtained by PCR was digested with NotI and HincII and inserted between NotI and HpaI during transcription from sequences encoding human IgGl. Subsequently, sequences encoding human IgG kappa light chain cDNA were inserted upstream of the grp78 leader using the HincII site and another site in the vector. The expression plasmid obtained as a result of these manipulations consisted of a semi-synthetic heavy chain gene, followed by grp78 leader sequences, followed by kappa light chain cDNA sequences and polyadenylation signals obtained from the SV40 DNA fragment. Transfection of COS cells with this expression plasmid yielded markedly improved expression of heavy chain determinants compared to transfection of a plasmid encoding only heavy chain determinants.
Для создания бицистронного гена, содержащего химеру тяжелая цепь/рецептор и легкую цепь, последовательности тяжелой цепи против хода транскрипции могут быть заменены любым описанным здесь химерным геном тяжелой цепи/рецептора. To create a bicistronic gene containing a heavy chain / receptor chimera and a light chain, the heavy chain upstream sequences can be replaced by any heavy chain / receptor chimera gene described herein.
ПРИМЕР II
Конструирование химер CD4 рецептора
кДНК ζ (Weissman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709- 9713 (1988)) и γ (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990)) человека выделяли с применением полимеразной цепной реакции из библиотек, полученных из линии опухолевых клеток HPB- ALL (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)) и из природных клеток-убийц человека, тогда как кДНК η (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)) выделяли из библиотеки мышиных тимоцитов, кДНК ζ,η и γ соединяли с внеклеточным доменом сконструированной формы CD4, обладающим сайтом BamHI сразу против хода транскрипции от пересекающего мембрану домена (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)), который соединяли с сайтом BamHI, природно присутствующим в кДНК ζ и η в сходном положении на расстоянии нескольких остатков против хода транскрипции от пересекающего мембрану домена (SEQ ID N 1, N 3, N 4 и N 6). Для образования слитого белка с γ сайт BamHI был сконструирован в последовательности при том же самом приблизительном положении (фиг. 1; SEQ ID N 2 и 5). Эти генные слияния вводили в экспрессирующую плазмиду вируса коровьей оспы, несущую ген Е. coli в качестве селектируемого маркера, и встраивали в геном штамма WR вируса коровьей оспы посредством гомологичной рекомбинации и отбора на рост в микофенольной кислоте (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle et al. Gene 65:123-128 (1988)). Проточная цитометрия показала, что рекомбинанты вируса коровьей оспы направляют обильное образование слитых белков CD4: ζ и CD4: γ при клеточной поверхности, тогда как экспрессия CD4: η была значительно более слабой (фиг. 1B). Последнее открытие согласуется с недавним сообщением, что трансфекция экспрессионной плазмиды кДНК η в мышиную гибридомную клеточную линию дала значительно меньшую экспрессию, чем трансфекция сравнимой экспрессионной плазмиды ζ (Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243- 1253 (1990)). Иммунопреципитация клеток, инфицированных рекомбинантами вируса коровьей оспы, выявила, что эти слитые белки образуют ковалентные димеры в отличие от природно встречающегося антигена CD4. Было найдено, что мол. массы мономерных слитых белков CD4: ζ и CD4: γ и нативного CD4 равны 63, 55 и 53 кД соответственно. Большие массы слитых белков приблизительно согласуются с большей длиной внутриклеточной части, которая превышает длину внутриклеточной части нативного CD4 на 75 (CD4: ζ) или 5 (CD4: γ ) остатков.EXAMPLE II
Construction of chimeras CD4 receptor
ζ cDNA (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988)) and γ (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990)) were isolated using polymerase chain reaction from libraries obtained from the HPB-ALL tumor cell line (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)) and from natural human killer cells, then As η cDNA (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990)) was isolated from a mouse thymocyte library, ζ, η and γ cDNA were connected to the extracellular domain of the designed form CD4 with the BamHI site immediately opposite the transcription from the membrane-crossing domain (Aruffo et al., Proc. Natl.
ПРИМЕР III
Химеры CD4 могут связываться с другими рецепторными цепями
Экспрессия на поверхности клеток типа макрофагов/природных клеток убийц человеческого Fc γ RIII (CD16TM) на трансфектантах облегчается ко-трансфекцией с мышиным (Kurosaki et al. Nature 342:805-807 (1989)) или человеческим (Hibbs el al. Science 246:1608-1611 (1989)) γ, а также человеческим ζ (Lanier et al. Nature 342:803-805 (1989)).EXAMPLE III
CD4 chimeras can bind to other receptor chains
Cell surface expression of macrophage / natural killer cells of human FcγRIII (CD16 TM ) on transfectants is facilitated by co-transfection with murine (Kurosaki et al. Nature 342: 805-807 (1989)) or human (Hibbs el al. Science 246 : 1608-1611 (1989)) γ as well as human ζ (Lanier et al. Nature 342: 803-805 (1989)).
В соответствии с этими сообщениями экспрессия химер также делала возможной поверхностную экспрессию CD16TM при доставке к клетке-мишени либо посредством ко-трансфекции, либо посредством ко-инфицирования с рекомбинантными вирусами коровьей оспы (фиг. 2). Усиление поверхностной экспрессии CD16TM при помощи ζ было более выраженным, чем усиление при помощи γ (фиг. 2) в испытанных клеточных линиях, в то время как нативный CD4 не усиливал поверхностную экспрессию CD16TM.In accordance with these reports, the expression of chimeras also made possible the surface expression of CD16 TM upon delivery to the target cell either by co-transfection or by co-infection with recombinant vaccinia viruses (Fig. 2). The enhancement of surface expression of CD16 TM by ζ was more pronounced than the amplification by γ (Fig. 2) in the tested cell lines, while native CD4 did not enhance the surface expression of CD16 TM .
ПРИМЕР IV
Asp ζ мутанты не связываются с Fc-рецептором
Для создания химер, которые не связывались бы с существующим антигеном или Fc-рецепторами, получали мутантные ζ слитые белки, которые не содержали либо внутримембранного Asp, либо внутримембранного Cys или обоих. Проточная цитометрия показала, что интенсивность поверхностной экспрессии различными мутантными химерами не была ощутимо отличающейся от немутированного предшественника, и эксперименты с иммунопреципитацией показали, что общая экспрессия химерами была одинаковой. Как и ожидалось, было обнаружено, что мутантные химеры, не имеющие трансмембранных остатков цистеина, не образуют связанных дисульфидными связями димеров. Две мутантные химеры, не имеющие Asp, были неспособны поддерживать поверхностную экспрессию CD16TM, тогда как мономерные химеры, не имеющие Cys, но несущие Asp, делали возможной ко-экспрессию CD16TM, но при более низкой эффективности, чем в случае родительского димера (фиг. 3).EXAMPLE IV
Asp ζ mutants do not bind to the Fc receptor
To create chimeras that would not bind to an existing antigen or Fc receptor, mutant ζ fusion proteins were obtained that did not contain either an intram Membrane Asp, an Intram Membrane Cys, or both. Flow cytometry showed that the surface expression intensity of the various mutant chimeras was not significantly different from the unmuted predecessor, and immunoprecipitation experiments showed that the total expression of the chimeras was the same. As expected, it was found that mutant chimeras lacking transmembrane cysteine residues do not form disulfide-bonded dimers. Two mutant chimeras lacking Asp were unable to support surface expression of CD16 TM , while monomeric chimeras lacking Cys but bearing Asp made co-expression of CD16 TM possible, but at a lower efficiency than the parent dimer (FIG. . 3).
ПРИМЕР V
Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать ответную реакцию кальция
Для определения, позволит ли сшивание слитых белков накопление свободного внутриклеточного кальция, подобное накоплению, имеющему место в случае T-клеточного рецептора антигенов, клетки T-клеточной лейкозной линии человека, Jurkat E6 (АТСС Accession N TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) инфицировали рекомбинантами вируса коровьей оспы и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после сшивания внеклеточного домена с антителами. Измерения проточной цитометрии проводили с клетками, загруженными чувствительным к кальцию красителем Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. limnunol. 137: 952-961 (1986)). Фиг. 4A-D показывает результаты экспериментов с выделением кальция клетками, инфицированными CD4: ζ и Asp- и Cys- мутантами ζ. Сшивание химер воспроизводимо увеличивало внутриклеточные количества кальция. CD4: η и CD4: γ также делали возможным накопление внутриклеточного кальция в инфицированных клетках. Клетки Jurkat экспрессируют низкие уровни CD4 на клеточной поверхности, однако сшивание нативного CD4 в присутствии или в отсутствие CD16: ζ не изменяет уровней внутриклеточного кальция (фиг. 4A-B).EXAMPLE V
Mutant receptors retain the ability to initiate a calcium response
To determine whether cross-linking of fusion proteins would allow accumulation of free intracellular calcium, similar to that occurring in the case of a T-cell antigen receptor, human T-cell leukemia cell lines, Jurkat E6 (ATCC Accession N TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) were infected with vaccinia virus recombinants and the relative concentration of calcium in the cytoplasm was measured after crosslinking of the extracellular domain with antibodies. Flow cytometry measurements were performed with cells loaded with calcium-sensitive Indo-1 dye (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. limnunol. 137: 952-961 (1986)). FIG. 4A-D shows the results of experiments with the release of calcium by cells infected with CD4: ζ and Asp - and Cys - ζ mutants. Crosslinking of chimeras reproducibly increased intracellular amounts of calcium. CD4: η and CD4: γ also made possible the accumulation of intracellular calcium in infected cells. Jurkat cells express low levels of CD4 on the cell surface, however, crosslinking of native CD4 in the presence or absence of CD16: ζ does not alter intracellular calcium levels (Fig. 4A-B).
ПРИМЕР VI
Химеры CD4: ζ,η и γ медиируют цитолиз клеток-мишеней, экспрессирующих gp 120/41 ВИЧ
Для определения, запускают ли химерные рецепторы цитолитические эффекторные программы, была создана система, основанная на узнавании CD4 комплекса gp120/gp41 оболочки ВИЧ. Клетки HeLa инфицировали рекомбинантными вирусами коровьей оспы, экспрессирующими gp120/gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320: 535- 537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64:2448-2451 (1990)), и метили 51Cr. Меченые клетки инкубировали с клетками из линии аллоспецифеческих (CD8+, CD4-) цитотоксических T-лимфоцитов, которые были инфицированы рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими химеры CD4: ζ CD4: η или CD4: γ или двойные мутантные химеры CD4: ζ CysllGly: Asp15Gly. Фиг. 5A-C показывает, что клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41, специфически лизировались цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL), экспрессирующими химеры CD4. Неинфицированные клетки HeLa не были мишенями CTL, несущими химеры CD4: ζ, а клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41 не узнавались неинфицированными CTL. Для сравнения эффективности разных химер отношения эффектор: мишень корректировали на фракцию CTL, экспрессирующих химеры CD4, и на фракцию клеток NeLa, экспрессирующих gp120/41, измеренных проточной цитометрией. Фиг. 5C показывает цитометрический анализ экспрессии CD4 CTL, используемыми в эксперименте по цитолизу, показанному в фиг. 5A и 5B. Хотя средняя плотность поверхностного CD4: ζ значительно превышала среднюю плотность CD4: η, цитолитические эффективности клеток, экспрессирующих любую форму, были сходными. При корректировании на фракцию клеток-мишеней, экспрессирующих gp20, эффективность цитолиза, медиируемого белками CD4; ζ и CD4: η, была сравнима с наивысшими эффективностями, сообщенными для пар мишень: эффектор специфического T-клеточного рецептора (среднее отношение эффектор: мишень для 50% выделения T-клетками, экспрессирующими CD4: ζ, было 1.9 ± 0.99, n = 10. Слитый белок CD4: γ был менее активным, как и слитый белок CD4: ζ, не имеющий трансмембранных остатков Asp и Cys. Однако в обоих случаях наблюдали значительный цитолиз (фиг. 5B-C).EXAMPLE VI
Chimeras CD4: ζ, η and γ mediate cytolysis of target cells expressing
To determine whether chimeric receptors trigger cytolytic effector programs, a system was created based on recognition of the CD4 complex of the gp120 / gp41 HIV envelope. HeLa cells were infected with recombinant vaccinia viruses expressing gp120 / gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320: 535-537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64: 2448-2451 (1990)) and 51 Cr. Labeled cells were incubated with cells from the line of allospecific (CD8 + , CD4 - ) cytotoxic T lymphocytes that were infected with vaccinia virus recombinants expressing CD4: ζ CD4: η or CD4: γ chimeras or double mutant CD4: ζ CysllGly: Asp15Gly chimeras . FIG. 5A-C shows that HeLa cells expressing gp120 / 41 were specifically lysed by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) expressing CD4 chimeras. Uninfected HeLa cells were not CTL targets carrying CD4: ζ chimeras, and HeLa cells expressing gp120 / 41 were not recognized by uninfected CTL. To compare the effectiveness of different chimeras, the effector: target ratios were adjusted for the CTL fraction expressing CD4 chimeras and the fraction of NeLa cells expressing gp120 / 41, measured by flow cytometry. FIG. 5C shows a cytometric analysis of CT4 CD4 expression used in the cytolysis experiment shown in FIG. 5A and 5B. Although the average density of surface CD4: ζ was significantly higher than the average density of CD4: η, the cytolytic efficiencies of cells expressing any form were similar. When corrected for the fraction of target cells expressing gp20, the efficiency of cytolysis mediated by CD4 proteins; ζ and CD4: η, was comparable to the highest efficiencies reported for target: effector specific T-cell receptor pairs (average effector: target ratio for 50% excretion by T-cells expressing CD4: ζ was 1.9 ± 0.99, n = 10 The CD4: γ fusion protein was less active, as was the CD4: ζ fusion protein lacking Asp and Cys transmembrane residues, however, significant cytolysis was observed in both cases (Fig. 5B-C).
Для контролирования того, что инфекция вирусом коровьей оспы может усиливать артефактное узнавание CTL, сходные эксперименты по цитолизу выполняли с клетками-мишенями, инфицированными рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими связанную с фосфатидилинозитом форму CD16 (CD16PI) и меченными 51Cr, и с CTL, инфицированными контрольными рекомбинантами, экспрессирующими либо CD16PI, либо CD16: ζ Фиг. 6A показывает, что T-клетки, экспрессирующие не-CD4-химеры, не узнают клетки HeLa, экспрессирующие другие поверхностные белки, кодируемые вирусом коровьей оспы. Кроме того, CTL, экспрессирующие нехимерный CD4, не лизируют значительно клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41 (фиг. 6A).To control that vaccinia virus infection can enhance CTL artifact recognition, similar cytolysis experiments were performed with target cells infected with vaccinia virus recombinants expressing phosphatidylinositol bound form CD16 (CD16 PI ) and labeled with 51 Cr, and with CTL, infected control recombinants expressing either CD16 PI or CD16: ζ FIG. 6A shows that T cells expressing non-CD4 chimeras do not recognize HeLa cells expressing other surface proteins encoded by vaccinia virus. In addition, CTLs expressing non-chimeric CD4 did not significantly lyse HeLa cells expressing gp120 / 41 (FIG. 6A).
ПРИМЕР VII
Клетки, несущие MHC класса II, не являются мишенями химер
Считают, что CD4 взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессируемой антигеном MHC класса II (Gay et al. Nature 328:626-629 (1987); SlecKman et al. , Nature 328:351-353 (1987)). Хотя специфическое взаимодействие между CD4 и антигеном класса II никогда не было документировано с очищенными белками, при определенных условиях можно продемонстрировать адгезию между клетками, экспрессирующими CD4, и клетками, экспрессирующими молекулы класса II (Doyle et al. Nature 330:256-259 (1987); Clayton et al. , J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245: 743-746 (1989)). Затем нужно было испытать, можно ли обнаружить убивание клеток, несущих антиген класса II. Фиг. 6B показывает, что нет специфического цитолиза, направленного химерой CD4: ζ против B-клеточной линии Raji, которая экспрессирует большие количества антигена класса II. Хотя и наблюдали умеренный цитолиз (приблизительно 5%), не содержащий антигена класса II мутант Raji, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)) обнаруживает сходную чувствительность, что и клетки Raji, инкубированные с неинфицированными T-клетками.EXAMPLE VII
Cells carrying MHC class II are not targets of chimeras
CD4 is believed to interact with a non-polymorphic sequence expressed by the MHC class II antigen (Gay et al. Nature 328: 626-629 (1987); SlecKman et al., Nature 328: 351-353 (1987)). Although the specific interaction between CD4 and class II antigen has never been documented with purified proteins, under certain conditions, adhesion can be demonstrated between cells expressing CD4 and cells expressing class II molecules (Doyle et al. Nature 330: 256-259 (1987) ; Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245: 743-746 (1989)). Then it was necessary to test whether it was possible to detect the killing of cells carrying the class II antigen. FIG. 6B shows that there is no specific cytolysis directed by the CD4: ζ chimera against the Raji B cell line, which expresses large amounts of class II antigen. Although moderate cytolysis (approximately 5%) was observed, a class II antigen-free Raji mutant, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157: 1053-1058 (1983)) showed a similar sensitivity as incubated Raji cells with uninfected T cells.
ПРИМЕР VIII
Требования к последовательностям для индукции цитолиза химерной T-клеточный антиген/дзета цепь Fc-рецептора
Хотя химеры между CD4 и ζ могут вооружить цитотоксические T-лимфоциты (CTL) для убивания клеток-мишеней, экспрессирующих gp120 ВИЧ, были предприняты поиски альтернативы для CD4, чтобы однозначно сравнить свойства дзета-химер, вводимых в линии T-клеток человека. Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя специфическое определение взаимоотношения между типом или степенью мобилизации кальция и цитотоксическим потенциалом различных химер. Для преодоления этого были созданы химеры между ζ и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 присоединен к трансмембранной и внутриклеточной последовательностям ζ (фиг. 7A). Эти генные слияния вводили в экспрессионную плазмиду вирус коровьей оспы, несущую ген Е. coli в качестве селектирующего маркера, и встраивали в геном штамма WR вируса коровьей оспы гомологичной рекомбинацией и отбором на рост в микофенольной кислоте (Falkner and Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle and Coupar, Gene 65:123 (1988)).EXAMPLE VIII
Sequence Requirements for the Induction of Cytolysis of the Chimeric T-Cell Antigen / Zeta Fc Receptor Chain
Although chimeras between CD4 and ζ can arm cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to kill target cells expressing HIV gp120, alternatives have been sought for CD4 to unambiguously compare the properties of the zeta chimeras introduced into human T cell lines. Such lines can express CD4, making it difficult to specifically determine the relationship between the type or degree of calcium mobilization and the cytotoxic potential of various chimeras. To overcome this, chimeras between ζ and CD16 were created in which the extracellular domain of CD16 is attached to the transmembrane and intracellular ζ sequences (Fig. 7A). These gene fusions introduced the vaccinia virus carrying the gene into the expression plasmid E. coli as a selection marker, and was inserted into the genome of the WR strain of vaccinia virus by homologous recombination and selection for growth in mycophenolic acid (Falkner and Moss, J. Virol. 62: 1849 (1988); Boyle and Coupar, Gene 65: 123 (1988)).
T-клеточные линии инфицировали рекомбинантами вируса коровьей оспы и измеряли относительные концентрации свободного иона кальция в цитоплазме после сшивания внеклеточных доменов с антителами. Как спектрофлуориметрические (общая популяция), так и проточно-цитометрические (отдельные клетки) измерения проводили с клетками, загруженными красителем Indo-I (Glynkiewicz et al. , J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch et al., J.Immunol. 137:952 (1986)). Фиг. 7B показывает анализ данных, собранных от клеток T-клеточной лейкозной линии человека, Jurkat, инфицированных рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующих слитый белок CD16: ζ. Сшивание этих химер воспроизводимо увеличивало внутриклеточный кальций, тогда как подобная обработка клеток, экспрессирующих нехимерный CD16, дала небольшой эффект или отсутствие эффекта. При экспрессии этой химеры в мутантных клеточных линиях, не имеющих рецептора антигена, либо REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), либо Jurkat мутанте JRT3. T3.5 (Weiss et al. , J. Immunol. 135:123 (1984)), наблюдали сильный ответ на сшитый с антителом CD16. Подобные данные были получены на мутантной клеточной линии REX20A (Breitmeyer et al., supra, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) и CD3/Ti негативном мутанте клеток Jurkat, полученном в этой лаборатории. Инфицирование рекомбинантами, экспрессирующими CD16: ζ, не восстанавливало ответной реакции на aнти-CD3 антитела, показывая, что этот слитый белок не действовал путем спасения внутриклеточных цепей комплекса CD3. T cell lines were infected with vaccinia virus recombinants and the relative concentrations of the free calcium ion in the cytoplasm were measured after crosslinking of the extracellular domains with antibodies. Both spectrofluorimetric (general population) and flow cytometric (single cells) measurements were performed with cells loaded with Indo-I dye (Glynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immmunol. 137: 952 (1986)). FIG. 7B shows an analysis of data collected from human Jurkat T cell leukemia cells infected with vaccinia virus recombinants expressing a CD16: ζ fusion protein. Crosslinking of these chimeras reproducibly increased intracellular calcium, while a similar treatment of cells expressing non-chimeric CD16 gave little or no effect. When expressing this chimera in mutant cell lines lacking an antigen receptor, either REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989) ), or Jurkat mutant JRT3. T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 135: 123 (1984)), a strong response to crosslinked with antibody CD16 was observed. Similar data were obtained on the mutant cell line REX20A (Breitmeyer et al., Supra, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990)) and the CD3 / Ti negative Jurkat cell mutant obtained in this laboratory . Infection with recombinants expressing CD16: ζ did not restore the response to anti-CD3 antibodies, indicating that this fusion protein did not act by rescuing the intracellular chains of the CD3 complex.
Для оценки способности этих химер изменять направленность клеточно-опосредованного иммунитета CTL инфицировали рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими химеры CD16, и использовали для специфического лизиса гибридомных клеток, экспрессирующих мембрано-связанные анти-CD16 антитела. Этот анализ является продолжением анализа гибридомной цитотоксичности, разработанного первоначально для анализа эффекторных механизмов клеток, несущих Fc-рецепторы (Graziano and Fanger, J. Immunol. 138:945, 1987; Graziano and Fanger, J. Immunol. 129: 35-36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol, 26:959, 1989; Fander et al., Immunol. Today 10:92, 1989). Фиг. 8B показывает, что экспрессия CD16: ζ цитотоксических T-лимфоцитах позволяет CTL с рецептором убивать 3G8 (анти-CD16; Fleit et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 79:3275, 1982) гибридомные клетки, тогда как CTL, экспрессирующие соединенную с фосфатидилинозитом форму CD16, являются неактивными. CTL, соединенные с CD16: ζ, также не убивают гибридомные клетки, экспрессирующие не относящиеся к рассматриваемым антитела. To assess the ability of these chimeras to change the direction of cell-mediated immunity, CTLs were infected with vaccinia virus recombinants expressing CD16 chimeras and used for specific lysis of hybridoma cells expressing membrane-bound anti-CD16 antibodies. This assay is a continuation of the hybridoma cytotoxicity assay, originally developed to analyze the effector mechanisms of cells carrying Fc receptors (Graziano and Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano and Fanger, J. Immunol. 129: 35-36, 1987 ; Shen et al., Mol. Immunol, 26: 959, 1989; Fander et al., Immunol. Today 10:92, 1989). FIG. 8B shows that the expression of CD16: ζ cytotoxic T lymphocytes allows CTL with a receptor to kill 3G8 (anti-CD16; Fleit et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982) hybridoma cells, whereas CTL, Expressing the phosphatidylinositol-associated form of CD16 are inactive. CTLs coupled to CD16: ζ also do not kill hybridoma cells expressing non-relevant antibodies.
Для идентификации минимальных последовательностей ζ, необходимых для цитолиза, получали ряд делеционных мутантов, в которых последовательно все большую часть внутриклеточного домена ζ удаляли из карбоксил-конца (фиг. 8A). Большую часть внутриклеточного домена дзета можно было удалить с малыми последствиями для цитолитического потенциала; полноразмерная химера CD16: ζ была по существу равна по эффективности химере, делетированной до остатка 65, CD16: ζ Asp66* (фиг. 8B). Существенное уменьшение цитотоксичности наблюдали при делеции до остатка 59 ζ (химера CD16: ζ Glu60*) и дальнейшая делеция до остатка 50 приводила к слегка более низкой активности. Однако полной потери активности не наблюдали, даже при уменьшении внутриклеточного домена до трех остатков трансмембранного якоря (фиг. 8B).To identify the minimal ζ sequences necessary for cytolysis, a series of deletion mutants were obtained in which a successively larger part of the intracellular domain ζ was removed from the carboxyl terminus (Fig. 8A). Most of the intracellular domain of zeta could be removed with little effect on the cytolytic potential; the full-length chimera CD16: ζ was essentially equal in efficiency to the chimera deleted to
Поскольку ζ является связанным дисульфидной связью димером, одним из объяснений сохранения цитолитической активности было то, что эндогенный ζ образовывал гетеродимеры с химерной ζ делецией, тем самым восстанавливая активность. Для проверки этой идеи остатки 11 и 15 ζ были заменены (вместо Asp и Cys был введен Gly) (CysllGly/Asp15Gly) и иммунопреципитации проводили следующим образом. Приблизительно 2 • 106 клеток CVI инфицировали в течение 1 часа в бессывороточной среде DME рекомбинантным вирусом коровьей оспы при множественности заражения (moi) по меньшей мере 10. Спустя 6-8 часов после инфицирования клетки отделяли от чашек при помощи PBS/1 мМ ЭДТА и поверхностно метили 0.2 мКи 125I на 2 • 106 клеток с применением лактопероксидазы и H2O2 по методу Кларка и Айнфельда (Laucocyte Typing II, рр 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Меченые клетки собирали центрифугированием и лизировали в 1% NP-40, 0.1% ДСН, 0.15 М NaCl, 0.05 М Трис, pH 8.0, 5 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 0.2 М иодацетамид и 1 мМ PMSF. Ядра удаляли центрифугированием и белки CD16 иммунопреципитировали агарозой с антителом 3G8 (Fleit et al., supra, 1982; Medarex) и с антимышиными lgG (Cappel, Durham, NC). Пробы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидном геле с ДСН при невосстанавливающих условиях или на 10% геле при восстанавливающих условиях. Эти иммунопреципитации подтвердили, что химера CD16: ζ CysllGly/Asp15Gly не ассоциирована в связанные дисульфидной связью димерные структуры.Since ζ is a disulfide-bonded dimer, one of the explanations for the conservation of cytolytic activity was that endogenous ζ formed heterodimers with a chimeric ζ deletion, thereby restoring activity. To test this idea,
Также тестировали цитолитическую активность мутантных рецепторов. Мутированная химера, делетированная до остатка 65 (CD16: ζ CysllGly/Asp15Gly/Asp66*), была, в зависимости от условий тестирования, в 2-8 раз менее активна в анализе цитолиза, чем сравнимая немутированная химера (CD16: ζ Asp66*), которая была обычно примерно в 2 раза активнее или не отличима по активности от CD16: ζ (фиг. 9B). Снижение активности мутантных химер сравнимо со снижением, наблюдаемым с химерами CD4 сходной структуры (см. выше) и, наиболее вероятно, связано с более низкой эффективностью мономеров ζ по сравнению с димерами. В противоположность этому Asp-, Cys- мутированная химера, делетированная до остатка 59, не имела цитолитической активности, подтверждая гипотезу о том, что ассоциация с другими цепями, медиируемая трансмембранными остатками Cys и/или Asp, была ответственна за слабую стойкость цитолитической активности при делеции амино-конца далее, чем до остатка 65.The cytolytic activity of mutant receptors was also tested. The mutated chimera deleted to residue 65 (CD16: ζ CysllGly / Asp15Gly / Asp66 * ) was, depending on the test conditions, 2-8 times less active in the analysis of cytolysis than the comparable non-mutated chimera (CD16: ζ Asp66 * ), which was usually about 2 times more active or indistinguishable in activity from CD16: ζ (Fig. 9B). The decrease in the activity of mutant chimeras is comparable to the decrease observed with CD4 chimeras of a similar structure (see above) and is most likely due to the lower efficiency of ζ monomers compared to dimers. In contrast, the Asp - , Cys - mutated chimera deleted to residue 59 did not have cytolytic activity, confirming the hypothesis that the association with other chains mediated by transmembrane residues of Cys and / or Asp was responsible for the poor persistence of cytolytic activity in deletion amino end further than to
Исследования с применением проточной цитометрии показали, что делеционные мутанты, не имеющие трансмембранных остатков Asp и Cys, вес еще могли ускорять увеличение в количестве свободного иона кальция внутри клетки в ответ на сшивание с антителами в TCR мутантной Jurkat клеточной линии (фиг. 9D). Подобные результаты были получены для химер, экспрессируемых в родительской линии Jurkat. В случае CD16: ζ CysllGly/Asp15Gly/Glu60* эти данные показывают, что способность медиировать "кальциевый" ответ может быть мутационно отделена от способности поддерживать цитолиз.Studies using flow cytometry showed that deletion mutants lacking Asp and Cys transmembrane residues could still accelerate the increase in the amount of free calcium ion inside the cell in response to cross-linking with antibodies in the TCR of the mutant Jurkat cell line (Fig. 9D). Similar results were obtained for chimeras expressed in the Jurkat parent line. In the case of CD16: ζ CysllGly / Asp15Gly / Glu60 *, these data show that the ability to mediate a “calcium” response can be mutationally separated from the ability to maintain cytolysis.
Для определенного исключения возможного вклада трансмембранных остатков ζ трансмембранные и первые 17 цитоплазматических остатков ζ были заменены последовательностями, кодирующими проходящие через мембрану и первые 14 или первые 17 цитоплазматических остатков CD5- или CD-антигенов, соответственно (фиг. 9А). Полученные слитые из трех частей белки CD16:5: ζ (48-65) и CD16: 7: ζ (48-65) не образовали связанных дисульфидом димеров, которые образуют более простые химеры CD16: ζ , поскольку они не содержат остатка цистеина в трансмембранном домене ζ . Обе состоящие из трех частей химеры были способны мобилизовать кальций в линиях клеток Jurkat и TCR- -клеток (фиг. 9D) и увеличивать цитолитический ответ в CTL (фиг. 9C и не представленные данные). Однако укорочение ζ части до остатка 59 в химере CD16: ζ (48-59) отменяет способность состоящего из трех частей слитого белка вызывать реакцию мобилизации кальция в TCR позитивных или негативных клетках Jurkat или цитолиз в зрелых CTL (фиг. 9C и 9D и не представленные данные).To specifically exclude the possible contribution of transmembrane ζ residues, the transmembrane and first 17 cytoplasmic ζ residues were replaced by sequences encoding the CD5 or CD antigens passing through the membrane and the first 14 or first 17 cytoplasmic residues, respectively (Fig. 9A). The obtained three-part fusion proteins CD16: 5: ζ (48-65) and CD16: 7: ζ (48-65) did not form disulfide-bound dimers, which form simpler CD16: ζ chimeras, since they do not contain a cysteine residue in the transmembrane domain ζ. Both consist of three parts chimeras were able to mobilize calcium in Jurkat and TCR lines cells - -cells (. Figure 9D) and increase the cytolytic response in CTL (Fig 9C and data not shown.). However, shortening the ζ part to residue 59 in the CD16: ζ chimera (48-59) cancels the ability of the three-part fusion protein to trigger a calcium mobilization reaction in TCR positive or negative Jurkat cells or cytolysis in mature CTLs (Figs. 9C and 9D and not shown data).
Для исследования вкладов отдельных остатков внутри мотива из 18 остатков мы получили ряд мутантных вариантов путем сайтспецифического мутагенеза и оценили их способность медиировать направленное рецептором убивание в условиях низкой (фиг. 10A и 10D) или высокой (фиг. 10B и 10E) экспрессии химерного рецептора. Фиг. 10A-F показывает, что хотя ряд относительно консервативных замещений (т.е. замещений кислых остатков их родственными амидами или замены тирозина фенилаланином) в остатках 59-63 дал умеренное снижение цитолитической эффективности, в целом эти варианты сохраняли способность мобилизовать кальций. Однако вместе взятые эти остатки содержат важный субмотив ввиду того, что их делеция исключает цитолитическую активность. Превращение Tyr 62 либо в Phe, либо в Ser исключало как цитолитическую ответную реакцию, так и реакцию мобилизации кальция. При амино-конце сегмента из 18 остатков замена Tyr 51 на Phe отменяла как мобилизацию кальция, так и цитолитическую активность, тогда как замена Leu на Ser при положении 50 исключала ответную реакцию кальция, тогда как лишь частично ослабляла цитолиз. Без привязывания к конкретной гипотезе, предполагается, что неспособность мутанта Leu50Ser мобилизовать кальций в кратковременных проточноцитометрических анализах неполно отражает его способность медиировать значительное увеличение в свободном внутриклеточном кальции в более длинном промежутке времени анализа цитолиза. Однако нечувствительная к кальцию цитолитическая активность сообщалась для некоторых цитолитических T-клеточных линий, и не исключена возможность, что подобное явление лежит в основе описанных здесь результатов. Замена Asn 48 на Ser ослабляла цитотоксичность в некоторых экспериментах, в то время как в других экспериментах оказывала слабое действие. To study the contributions of individual residues within the motif from 18 residues, we obtained a number of mutant variants by site-specific mutagenesis and evaluated their ability to mediate receptor-directed killing under conditions of low (Fig. 10A and 10D) or high (Fig. 10B and 10E) chimeric receptor expression. FIG. 10A-F shows that although a number of relatively conservative substitutions (i.e., substituting acidic residues with their related amides or replacing tyrosine with phenylalanine) at residues 59-63 gave a moderate decrease in cytolytic efficacy, in general these options retained the ability to mobilize calcium. However, when taken together, these residues contain an important submotif because their deletion excludes cytolytic activity. The conversion of Tyr 62 to either Phe or Ser excluded both the cytolytic response and the calcium mobilization reaction. At the amino terminus of a segment of 18 residues, the replacement of
Для исследования потенциальной роли избыточных элементов последовательности внутриклеточный домен ζ делили на три сегмента, охватывающие остатки 33-65, 71-104 и 104-138. Каждый из этих сегментов присоединяли к химере CD16: CD7 посредством сайта MluI, введенным дистально по отношению к основным мембранным якорным последовательностям внутриклеточного домена CD7 (см. ниже; Фиг. 11A). Сравнение цитолитической эффективности этих трех элементов показало, что они по существу эквипотентны (фиг. 11B). Сравнение последовательностей (фиг. 11A) показывает, что второй мотив несет 11 остатков между тирозинами, тогда как первый и второй мотивы несут 10. To study the potential role of excess elements of the sequence, the intracellular domain ζ was divided into three segments, covering
Хотя точная оценка процесса T-клеточной активации не была сделана, ясно, что агрегация рецептора антигена или рецепторных химер, несущих внутриклеточные последовательности ζ, запускает мобилизацию кальция, выделение цитокина и гранул и появление поверхностных маркеров активации. Активный сайт ζ, короткая линейная пептидная последовательность, возможно, слишком маленькая, чтобы иметь собственную ферментативную активность, по-видимому, взаимодействует с одним или, самое большее, с несколькими белками для медиирования клеточной активации. Ясно также, что мобилизация свободного кальция сама по себе недостаточна для клеточной активации, т.к. способность медиировать цитолиз можно при помощи мутаций отделить от способности медиировать накопление кальция. Although an accurate assessment of the T-cell activation process has not been made, it is clear that aggregation of the antigen receptor or receptor chimeras carrying intracellular ζ sequences triggers the mobilization of calcium, the release of cytokines and granules, and the appearance of surface activation markers. The active site ζ, a short linear peptide sequence, perhaps too small to have its own enzymatic activity, apparently interacts with one or at most several proteins to mediate cell activation. It is also clear that mobilization of free calcium alone is insufficient for cellular activation, because the ability to mediate cytolysis can be separated by mutations from the ability to mediate calcium accumulation.
Как показано здесь, добавление 18 остатков из внутриклеточного домена ζ к трансмембранному и внутриклеточному домену двух неродственных белков позволяет полученным химерам заново направлять цитолитическую активность против клеток-мишеней, которые связываются с внеклеточной частью слитых белков. Хотя химеры, несущие мотив из 18 остатков, приблизительно в 8 раз менее активны, чем химеры на основе полноразмерного ζ, пониженная активность может быть отнесена за счет потери трансмембранных взаимодействий, которые обычно позволяют ζ дикого типа образовать связанные дисульфидными связями димеры. Т.е. делеционные конструкции ζ , которые имеют такой же карбоксил-конец, что и этот мотив, и не имеют трансмембранных остатков Cys и Asp, обычно обнаруживают несколько меньшую активность, чем химеры, несущие только мотив из 18 остатков. As shown here, the addition of 18 residues from the intracellular domain ζ to the transmembrane and intracellular domain of two unrelated proteins allows the obtained chimeras to redirect cytolytic activity against target cells that bind to the extracellular portion of fusion proteins. Although chimeras carrying a motif of 18 residues are approximately 8 times less active than full-length ζ chimeras, reduced activity can be attributed to the loss of transmembrane interactions, which usually allow wild-type ζ to form dimers bound by disulfide bonds. Those. deletion constructs ζ, which have the same carboxyl end as this motif and do not have transmembrane residues Cys and Asp, usually exhibit slightly lower activity than chimeras bearing only the motif of 18 residues.
Элемент цитолитической компетентности, на котором мы сконцентрировали внимание, имеет два тирозина и не имеет остатков серина или треонина, исключающих возможные вклады фосфорилирования в активность. Мутация любого тирозина разрушает активность, и хотя предварительные эксперименты не показывают значительного фосфорилирования тирозина после сшивания с химерными поверхностными антигенами, несущими мотив из 18 остатков, возможное участие такого фосфорилирования при низком уровне не может быть исключено. Кроме отмеченных эффектов в отношении двух остатков тирозина, ряд замен аминокислот при амино- и карбокси- конце этого мотива ослабляет активность в условиях низкой плотности рецептора. The element of cytolytic competence on which we have concentrated attention has two tyrosines and does not have serine or threonine residues that exclude possible phosphorylation contributions to activity. A mutation of any tyrosine disrupts activity, and although preliminary experiments do not show significant tyrosine phosphorylation after crosslinking with chimeric surface antigens bearing a motif of 18 residues, the possible participation of such phosphorylation at a low level cannot be ruled out. In addition to the noted effects with respect to the two tyrosine residues, a number of amino acid substitutions at the amino and carboxy-terminus of this motive weaken activity in conditions of low receptor density.
Последовательности, сходные с активным мотивом ζ, могут быть обнаружены в цитоплазматических доменах некоторых других трансмембранных белков, в том числе CD3 δ- и γ-молекулах, белков mb1 и B29, находящихся на поверхности клеток и связанных с IgM, и β- и γ-цепей высокоаффинного рецептора IgE, Fc ∈ RI (Reth, Nature 338:383, 1989). Хотя функция этих последовательностей неясна, при их эффективной экспрессии каждый из них может быть способным к автономной активации T-клеток, и такая активность может объяснять остаточную ответную реакцию TCR, наблюдаемую в дзета-негативной мутантной клеточной линии (Sussman et al. Cell 52:85, 1988). Sequences similar to the ζ active motif can be found in the cytoplasmic domains of some other transmembrane proteins, including CD3 δ and γ molecules, mb1 and B29 proteins located on the cell surface and associated with IgM, and β and γ IgE high affinity receptor chains, Fc ∈ RI (Reth, Nature 338: 383, 1989). Although the function of these sequences is unclear, when expressed efficiently, each of them may be capable of autonomously activating T cells, and such activity may explain the residual TCR response observed in the zeta-negative mutant cell line (Sussman et al. Cell 52:85 1988).
Сам дзета несет три таких последовательности, приблизительно на одинаковом расстоянии одна от другой, и грубое рассечение на три части внутриклеточного домена показывает, что каждый из них способен инициировать цитолитический ответ. η образованная сплайсингом изоформа ζ (Jin et. al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991), не имеет карбоксил-половины третьего мотива. Поскольку удаление карбоксил-половины первого мотива уничтожает активность, кажется вероятным, что основная часть биологической эффективности η может быть связана с первыми двумя мотивами. Хотя по различным измерениям η так же активен, как ζ , в усилении медиируемого антигеном выделения цитокинов (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842, 1991) или изменении направления цитолиза (см. выше), η не фосфорилируется в ответ на стимуляцию рецептора (Bauer et al., supra, 1991). Таким образом, либо для фосфорилирования требуются все три мотива, либо третий мотив является предпочтительным субстратом для неидентифицированной пока тирозинкиназы. The zeta itself carries three such sequences, at approximately the same distance from one another, and a rough dissection into three parts of the intracellular domain shows that each of them is capable of initiating a cytolytic response. η formed by splicing the ζ isoform (Jin et. al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5202, 1991) does not have a carboxyl half of the third motive. Since the removal of the carboxyl half of the first motive destroys the activity, it seems likely that the bulk of the biological effectiveness of η may be associated with the first two motives. Although η is as active as ζ in various dimensions, in enhancing antigen-mediated cytokine release (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) or in changing the direction of cytolysis (see above), η not phosphorylated in response to receptor stimulation (Bauer et al., supra, 1991). Thus, either all three motifs are required for phosphorylation, or the third motif is the preferred substrate for the unidentified tyrosine kinase.
ПРИМЕР IX
Трансдукция (передача) цитолитического сигнала Fc- рецептором человека
Для оценки действий различных подтипов Fc-рецептора человека были созданы химерные молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов CD4, CD5 или CD16 человека были соединены с трансмембранным и внутриклеточным доменами подтипов B1, B2 и С FcR11 γ A (номенклатура Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991). В частности, последовательности кДНК, соответствующие трансмембранному и цитоплазматическому доменам описанных ранее изоформ B1 и B2 FcR11A, амплифицировали из предсуществующего клона PC23 или из библиотеки кДНК минадин человека (сконструированной стандартными способами) с применением следующих синтетических олигонуклеотидных праймеров:
CCC GGA ТСС CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID N 18; FcR11 А прямой);
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID N 19; FcR11 А обратный);
GCG GGG GGA ТСС CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID N 20; FcR11 B1 и FcR11 B2 обратный);
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID N 21; FcR11 B1 и FcR11 B2 обратный).EXAMPLE IX
Transduction (transmission) of cytolytic signal by human Fc receptor
To evaluate the actions of the various subtypes of the human Fc receptor, chimeric molecules were created in which the extracellular domain of the human CD4, CD5, or CD16 antigens were connected to the transmembrane and intracellular domains of the B1, B2, and C subtypes of FcR11 γ A (nomenclature Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Ann. Immunol. 9: 457, 1991). In particular, cDNA sequences corresponding to the transmembrane and cytoplasmic domains of the previously described B1 and B2 FcR11A isoforms were amplified from a preexisting PC23 clone or from a human minadine cDNA library (constructed by standard methods) using the following synthetic oligonucleotide primers:
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (
Эти праймеры содержали сайты расщепления для ферментов BamHI и NotI, соответственно, выступающие 6 остатков от 5'-конца. За сайтом NotI непосредственно следовал антисмысловой стоп-кодон, либо CTA, либо TTA. Все праймеры содержали 18 или более остатков, комплементарных 5'- и 3'-концам желаемых фрагментов. Фрагмент кДНК, соответствующий цитоплазматическому домену FcR11 γ C, который отличается от изоформы 11A только по одной аминокислоте (L вместо P при остатке 268), был получен сайт-специфическим мутагенезом при помощи перекрывающейся ПЦР с использованием праймеров, имеющих последовательности:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA А (SEQ ID N 22) и
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG А (SEQ ID N 23).These primers contained cleavage sites for the BamHI and NotI enzymes, respectively, protruding 6 residues from the 5 ′ end. The NotI site was directly followed by the antisense stop codon, either CTA or TTA. All primers contained 18 or more residues complementary to the 5 ′ and 3 ′ ends of the desired fragments. The cDNA fragment corresponding to the cytoplasmic domain of FcR11 γ C, which differs from the 11A isoform in only one amino acid (L instead of P at residue 268), was obtained by site-specific mutagenesis using overlapping PCR using primers having the sequences:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID N 22) and
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID N 23).
Эти фрагменты PCR (ПЦР) встраивали в экспрессирующие векторы (вирусы коровьей оспы), которые содержали внеклеточные домены CD16 или CD4 соответственно, и затем встраивали в вирус коровьей оспы дикого типа путем рекомбинации в локусе тимидинкиназы, с использованием отбора на ко-интеграцию Е. coli для облегчения идентификации желаемых рекомбинантов. Идентичность всех изоформ (показанных в фиг. 12) подтверждали дидезокси-секвенированием.These PCR fragments (PCR) were inserted into expression vectors (vaccinia viruses) that contained the extracellular domains of CD16 or CD4, respectively, and then inserted into wild-type vaccinia virus by recombination at the thymidine kinase locus using co-integration selection E. coli to facilitate identification of the desired recombinants. The identity of all isoforms (shown in FIG. 12) was confirmed by dideoxy sequencing.
Получение химерных рецепторных белков далее подтверждалось исследованиями иммунопреципитации. Приблизительно 107 клеток JRT3.T3.5 инфицировали в течение 1 часа в бессывороточной среде IMDM рекомбинантным вирусом коровьей оспы при множественности заражения (moi) по меньшей мере 10. Спустя 12 часов после инфекции клетки собирали и поверхностно метили 0.5 мКи 125I на 107 клеток с применением лактопероксидазно/глюкозооксидазного метода (Clark and Einfeld, supra). Меченые клетки собирали центрифугированием и лизировали 1% NP-40, 0.1 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 0.2 М иодацетамид и 1 мМ PMSF. Ядра удаляли центрифугированием и слитые белки CD16 иммунопреципитировали агарозой с антителами 4G8 и антимышиным IgG. Пробы подвергали электрофорезу при восстанавливающих условиях. Все иммунопреципитированные химерные рецепторные молекулы имели ожидаемые молекулярные массы.The preparation of chimeric receptor proteins was further confirmed by immunoprecipitation studies. Approximately 10 7 JRT3.T3.5 cells were infected for 1 hour in serum-free IMDM medium with recombinant vaccinia virus with a multiplicity of infection (moi) of at least 10. 12 hours after infection, cells were harvested and superficially labeled with 0.5 mCi 125 I at 10 7 cells using the lactoperoxidase / glucose oxidase method (Clark and Einfeld, supra). Labeled cells were collected by centrifugation and lysed with 1% NP-40, 0.1 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 0.2 M iodoacetamide and 1 mM PMSF. Nuclei were removed by centrifugation and CD16 fusion proteins were immunoprecipitated with agarose with 4G8 antibodies and anti-mouse IgG. Samples were subjected to electrophoresis under reducing conditions. All immunoprecipitated chimeric receptor molecules had the expected molecular weights.
Для испытания способности химерных рецепторов опосредовать увеличение в цитоплазматическом свободном ионе кальция эти рекомбинантные вирусы использовали для инфицирования TCR- мутантной клеточной линии Jurkat JRT3.T3.5 (описанной выше) и цитоплазматический свободный кальций измеряли в этих клетках (как описано здесь) после сшивания внеклеточных доменов рецептора с моноклональным телом 3G8 или Leu-3A (как описано здесь). Эти эксперименты обнаружили, что внутриклеточные домены FcR γ 11 А и С были способны опосредовать увеличение в цитоплазматическом свободном ионе кальция после сшивания внеклеточных доменов, тогда как внутриклеточные домены FcR γ 11 B1 и B2 были неактивными при сравнимых условиях (фиг. 13A и 13B). Гибридомы CD4, CD5 и CD16 FcR γ 11 А разделяли фактически равную способность усиливать кальциевый ответ (фиг. 13A-B). Другие клеточные линии, как моноцитарной, так и лимфоцитарной линий дифференцировки, были способны отвечать на сигнал, инициируемый сшиванием внеклеточных доменов.To test the ability of the chimeric receptors to mediate an increase in cytoplasmic free calcium ion, the recombinant viruses were used for infection TCR - mutant cell line Jurkat JRT3.T3.5 (as described above) and cytoplasmic free calcium was measured in the cells (as described herein) following crosslinking of the extracellular domains monoclonal receptor 3G8 or Leu-3A (as described here). These experiments found that the intracellular domains of
Для выяснения участия различных внутриклеточных доменов FcR γ 11 в цитолизе цитотоксические T-лимфоциты человека (CTR) инфицировали рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими химеры CD16:FcR γ 11 А, B1, B2 и С. Затем инфицированные клетки ко-культивировали с нагруженными 51Cr гибридомными клетками (т.е. клетками 3G8 10-2), которые экспрессировали на клеточной поверхности антитело к CD16. В этом анализе CTL, несущие химеру CD16, убивали гибридомные клетки-мишени (позволяя выделяться свободному 51Cr), если внеклеточный домен химеры был соединен с внутриклеточным сегментом, способным активировать эффекторную программу лимфоцитов; этот анализ цитолиза описан подробно ниже. Фиг. 14A показывает, что CTL, соединенные с CD16: FcR γ 11A и С, но не FcR γ 11 B1 или B2, способны лизировать клетки-мишени, экспрессирующие поверхностные анти-CD16 антитела.To determine the involvement of various intracellular domains of
Для исключения возможности, что этот специфический цитолиз был связан с взаимодействием с CD16-частью, проводили эксперименты по цитолизу, в которых внутриклеточные домены FcR11 были присоединены к внеклеточному домену CD4. В этом случае клетками-мишенями были клетки HeLa, экспрессирующие белки gp120/41 оболочки ВИЧ (в частности, клетки HeLa, инфицированные вектором вируса коровьей оспы vPE16 (доступным из National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Как и в системе CD16, клетки-мишени, экспрессирующие антигены оболочки ВИЧ, были чувствительны к лизису T-клетками, экспрессирующими химеру CD4:FcR γ 11 А, но не FcR γ 11 B1 или B2 (фиг. 14B). To exclude the possibility that this specific cytolysis was associated with interaction with the CD16 part, cytolysis experiments were carried out in which the intracellular domains of FcR11 were joined to the extracellular domain of CD4. In this case, the target cells were HeLa cells expressing HIV membrane gp120 / 41 proteins (in particular, HeLa cells infected with the vPE16 vaccinia virus vector (available from the National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Like in the CD16 system, target cells expressing HIV envelope antigens were susceptible to lysis by T cells expressing the CD4 chimera:
Внутриклеточные домены FcR γ 11 А и С не имеют поддающейся оценке гомологии последовательности с каким-либо другим белком, в том числе с членами расширенного семейства FcR γ/TCR ζ. Для определения элементов последовательности, ответственных за индукцию цитолиза, получали 5'- и 3'-делеции кодирующих внутриклеточный домен последовательностей (описанных ниже и показанных на фиг. 15A) и их оценивали на эффективность в мобилизации кальция и цитолизе (как описано здесь). В экспериментах, в которых удаляли амино-концевую часть внутриклеточного домена, трансмембранный домен FcR γ 11 заменяли трансмембранным доменом неродственного антигена CD7 для исключения возможного вклада взаимодействий, опосредованных пересекающим мембрану доменом. The intracellular
Фиг. 15B и 15C показывают, что удаление 14 карбоксил-концевых остатков, в том числе тирозина 298, приводило к полной потере цитолитической способности и существенному уменьшению потенциала мобилизации кальция. Далее делеция до положения перед тирозином 282 дала идентичный фенотип (фиг. 15B и 15C). Делеция из N-конца внутриклеточного домена до остатка 268 не оказывала значительного действия ни на профиль кальция, ни на цитолитическую активность, тогда как делеция до остатка 275 заметно ослабляла выделение свободного кальция, но мало влияла на цитолиз (фиг. 15D и 15E). Дальнейшая делеция, до остатка 282, дала хвосты FcR γ 11, которые не обладали способностью ни мобилизовать кальций, ни запускать цитолиз (фиг. 15D и 15E). "Активный элемент", определяемый этими грубыми измерениями, является относительно большим (36 аминокислот) и содержит два тирозина, разделенных 16 остатками. FIG. 15B and 15C show that the removal of 14 carboxyl-terminal residues, including tyrosine 298, resulted in a complete loss of cytolytic ability and a significant decrease in calcium mobilization potential. Further, a deletion to a position in front of tyrosine 282 gave an identical phenotype (Fig. 15B and 15C). Deletion from the N-terminus of the intracellular domain to residue 268 had no significant effect on either the calcium profile or cytolytic activity, while deletion to
ПРИМЕР X
Направленный цитолиз лимфоцитами, несущими химерные CD4-рецепторы, которые не поддерживают инфекцию
Как обсуждалось выше, могут быть сконструированы эффекторные молекулы, которые направляют цитолитическую активность CTL MHC-независимым образом. Например, химера, составленная из внеклеточного домена CD4, слитого с ζ -цепью в клоне CTL человека, WH3, специфически убивает клетки-мишени, обнаруживающие поверхностный гликопротеин оболочки ВИЧ-1, gp120. Однако, поскольку внеклеточный домен молекулы CD4 придает чувствительность к инфекции ВИЧ, такие CTL с перенесенными на них иммуноглобулиновыми рецепторами могут стать мишенями для вируса, что приводит к уменьшению их активности (Dalg-leish et al. Nature 312:767 (1984); Klatzman et al. Nature 312:767 (1984)). Для предотвращения такого результата были сконструированы эффекторные молекулы на основе CD4, которые эффективны в специфическом нацеливании на инфицированные ВИЧ клетки для клеточно- опосредованного убивания, но которые не придают чувствительность к инфекции ВИЧ.EXAMPLE X
Directed cytolysis by lymphocytes carrying chimeric CD4 receptors that do not support infection
As discussed above, effector molecules can be constructed that direct the cytolytic activity of CTL in an MHC-independent manner. For example, a chimera composed of the extracellular domain of CD4 fused to the ζ chain in the human CTL clone, WH3, specifically kills target cells that detect HIV-1 surface glycoprotein, gp120. However, since the extracellular domain of the CD4 molecule confers sensitivity to HIV infection, such CTLs with immunoglobulin receptors transferred to them can become targets for the virus, resulting in a decrease in their activity (Dalgleish et al. Nature 312: 767 (1984); Klatzman et al. Nature 312: 767 (1984)). To prevent such a result, CD4-based effector molecules were designed that are effective in specifically targeting HIV-infected cells for cell-mediated killing, but which do not confer sensitivity to HIV infection.
Слитый белок из трех частей был создан генетической аппозицией внеклеточного домена CD4 (фиг. 23) к шарнирной области, второму и третьему константным доменам тяжелой цепи lgG1 человека (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) (фиг. 25), которые в этом случае были присоединены к части первого трансмембранного экзона мембрано-связанного lgGI человека, за которым следовала часть антигена CD7 человека, состоящая из последовательностей между единственным Ig-подобным доменом и стоп- последовательностью передачи после трансмембранного домена (Aruffo and Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (фиг. 26). Первичная аминокислотная последовательность внеклеточной части сегмента CD7 состояла из богатого пролином района, предполагающего стеблеподобную структуру, которая выдвигает Ig-подобный домен прочь от поверхности клетки (Aruffo and Seed EMBO J. 6:3313 (1987)) (фиг. 26). Рекомбинантные вирусы коровьей оспы готовили для экспрессии этого слитого белка и родственных химер, как описано здесь. В частности, рекомбинантные вирусы коровьей оспы получали гомологичной рекомбинацией в клетках CV-1. По меньшей мере два цикла визуализации бляшек выполняли для каждого штамма перед получением штаммов с высоким титром в клетках CV-1. A three-part fusion protein was created by genetic apposition of the extracellular domain of CD4 (FIG. 23) to the hinge region, the second and third constant domains of the human IgG1 heavy chain (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) (FIG. 25), which in this case were attached to a portion of the first transmembrane exon of a membrane-bound human IgGI, followed by a portion of the human CD7 antigen consisting of sequences between a single Ig-like domain and a stop transmission sequence after the transmembrane domain (Aruffo and Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)) (f 26 g). The primary amino acid sequence of the extracellular portion of the CD7 segment consisted of a proline-rich region suggesting a stem-like structure that pushes the Ig-like domain away from the cell surface (Aruffo and Seed EMBO J. 6: 3313 (1987)) (FIG. 26). Recombinant vaccinia viruses were prepared for expression of this fusion protein and related chimeras, as described herein. In particular, recombinant vaccinia viruses were obtained by homologous recombination in CV-1 cells. At least two plaque visualization cycles were performed for each strain before obtaining high titer strains in CV-1 cells.
Химера из трех частей (CD4(D1-D4):lg:CD7) (фиг. 20, молекула "А") обнаружила эффективную поверхностную экспрессию и была испытана на способность действовать как рецептор ВИЧ в тесте образования синцитиев на основе вируса коровьей оспы (Lifson et al. Nature 323:725 (1986)); Ashorn et al., J. Virol. 64:2149 (1990)). Клетки HeLa, инфицированные peкомбинантным вирусом коровьей оспы (VPE16), кодирующим гликопротеин оболочки ВИЧ-1 (Earl et al., J. Virol. 64: 2448 (1990)), ко-культивировали с клетками HeLa, инфицированными либо CD4, CD4: ζ, либо CD4(D1-D4):Iq:CD7. Чашки 6 см с клетками HeLa (ATCC, Rockville, MD) при 50% конфлюэнтности инфицировали в бессывороточной среде в течение 1 часа при приблизительной множественности заражения (moi) 10. Клетки инкубировали еще в течение 5-6 часов в полной среде и затем отделяли содержащим фосфат солевым раствором (PBS) с 1 мМ ЭДТА. Клетки, экспрессирующие оболочку и химеру CD4, смешивали в отношении 1:1 и пересевали в чашки 6 см с полной средой. Синцитии оценивали в баллах при 6-8 часа совместного культивирования и фотографировали. A three-part chimera (CD4 (D1-D4): lg: CD7) (Fig. 20, molecule “A”) showed effective surface expression and was tested for its ability to act as an HIV receptor in a vaccinia virus test for measles pox virus (Lifson et al. Nature 323: 725 (1986)); Ashorn et al., J. Virol. 64: 2149 (1990)). HeLa cells infected with recombinant vaccinia virus (VPE16) encoding HIV-1 sheath glycoprotein (Earl et al., J. Virol. 64: 2448 (1990)) were co-cultured with HeLa cells infected with either CD4, CD4: ζ or CD4 (D1-D4): Iq: CD7. 6 cm plates with HeLa cells (ATCC, Rockville, MD) at 50% confluency were infected in serum-free medium for 1 hour with an approximate multiplicity of infection (moi) 10. Cells were incubated for another 5-6 hours in complete medium and then separated containing phosphate saline (PBS) with 1 mM EDTA. Cells expressing the membrane and CD4 chimera were mixed in a 1: 1 ratio and subcultured into 6 cm plates with complete medium. Syncytia was scored at 6-8 hours of co-cultivation and photographed.
Ко-культуры CD4 и vPE16 привели к образованию легко детектируемых многоядерных гигантских клеток. Также, химера, состоящая из внеклеточного домена CD4, слитого с ζ-цепью TCR (фиг. 27), (CD4: ζ) была способна опосредовать образование синцитиев, тогда как клетки, экспрессирующие CD4(D1-D4): Ig:CD7, не показали признаков клеточного слияния. Мы также испытывали конструкцию, экспрессирующую только первый и второй домены CD4 (фиг. 24), CD4(D1,D2):Ig: CD7 (фиг. 20, молекула "В"), так как в другой связи было показано, что амино-концевые два домена CD4 являются необходимыми для инфективности ВИЧ (Landau et al. Nature 334:159 (1988)). Эта молекула также показала невосприимчивость к индуцируемому ВИЧ образованию синцитиев. Исследованию связывания с растворимым 125I-меченым gpl20 показали, что как CD4(D1-D4):Ig:CD7, так и CD4(D1,D2):Ig:CD7 имели ненарушенную аффинность в отношении gp120.Co-cultures of CD4 and vPE16 led to the formation of easily detectable multinucleated giant cells. Also, a chimera consisting of the extracellular domain of CD4 fused to the TCR ζ chain (FIG. 27) (CD4: ζ) was able to mediate the formation of syncytia, while cells expressing CD4 (D1-D4): Ig: CD7 are not showed signs of cell fusion. We also tested a construct expressing only the first and second domains of CD4 (Fig. 24), CD4 (D1, D2): Ig: CD7 (Fig. 20, molecule “B”), since in another connection it was shown that amino terminal two CD4 domains are necessary for HIV infectivity (Landau et al. Nature 334: 159 (1988)). This molecule also showed immunity to HIV-induced syncytia formation. A study of binding to soluble 125 I-labeled gpl20 showed that both CD4 (D1-D4): Ig: CD7 and CD4 (D1, D2): Ig: CD7 had undisturbed affinity for gp120.
Затем мы определили, будут ли способны химерные молекулы, которые противостояли образованию синцитиев, к нацеливанию убивания клеток при обеспечении их триггерной частью, как описано здесь. Мы слили внутриклеточный домен ζ (фиг. 27) с 3'-концом CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7 и приготовили соответствующие вирусы коровьей оспы. Эти конструкции, CD4(D1-D4):Ig:CD7: ζ CD4(D1, D2): Ig:CD7: ζ (фиг. 20, молекулы "С" и "D") экспрессировали в клоне WH3 CTL человека и тестировали на их способность нацеливаться и убивать клетки HeLa, экспрессирующие поверхностный гликопротеин оболочки ВИЧ (при помощи описанных здесь способов). Фиг. 21 показывает, что внутриклеточный домен ζ, слитый либо с CD4-(D1-D4):Ig:CD7, либо с CD4(D1,D2):Ig:CD7, может сообщать способность убивания; конструкции, не имеющие ζ - цепи, были неспособны опосредовать эту активность. CD4: ζ, положительный контроль, опосредовал слегка более эффективную цитотоксичность, а CD4(D1,D2):Ig:CD7: ζ - несколько менее эффективную цитотоксичность, чем CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ (фиг. 21). Однако ясно, что как CD4(D1-D4):Ig:CD7: ζ, так и CD4(D1,D2):Ig:CD7:ζ имеют способность медиировать специфическое убивание клеток, экспрессирующих белки оболочки ВИЧ на их поверхности. Эти химеры, состоящие из четырех частей, стойко неспособны медиировать образование синцитиев в тесте на основе вируса коровьей оспы. Мы также продемонстрировали, что единственного ζ -мотива, показанного в фиг. 11А, достаточно для придания цитолитической активности химере CD4(D1-D4). We then determined whether chimeric molecules that resisted the formation of syncytia would be able to target killing cells while providing them with a trigger part, as described here. We fused the intracellular domain ζ (Fig. 27) with the 3'-end of CD4 (D1-D4): Ig: CD7 and CD4 (D1, D2): Ig: CD7 and prepared the corresponding vaccinia viruses. These constructs, CD4 (D1-D4): Ig: CD7: ζ CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ (Fig. 20, molecules "C" and "D") were expressed in human WH3 clone CTL and tested for their ability to target and kill HeLa cells expressing the surface envelope glycoprotein of the HIV membrane (using the methods described here). FIG. 21 shows that the intracellular domain ζ, fused with either CD4- (D1-D4): Ig: CD7 or CD4 (D1, D2): Ig: CD7, can report killing ability; constructs lacking a ζ chain were unable to mediate this activity. CD4: ζ, a positive control, mediated slightly more effective cytotoxicity, and CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ - a slightly less effective cytotoxicity than CD4 (D1-D4): Ig: CD7: ζ (Fig. 21) . However, it is clear that both CD4 (D1-D4): Ig: CD7: ζ and CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ have the ability to mediate the specific killing of cells expressing HIV envelope proteins on their surface. These four-part chimeras are persistently unable to mediate the formation of syncytia in the vaccinia virus test. We also demonstrated that the only ζ motif shown in FIG. 11A is sufficient to impart cytolytic activity to the CD4 chimera (D1-D4).
Эксперименты по радиоиммунопреципитации показали, что слитые молекулы были преимущественно (если не всегда) димерами. В этих экспериментах использовали гранулы протеин-А-агарозы для иммунопреципитации солюбилизированного экстракта метаболически меченных клеток HeLa, инфицированных рекомбинантным вирусом коровьей оспы, экспрессирующим химеры CD4-(D1-D4):Ig:CD7:ζ и CD4(D1, D2): Ig: CD7: ζ. Иммунопреципитированный материал фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. В частности, приблизительно 5 • 106 клеток HeLa-S3 инфицировали, как описано выше для vPE16, подходящим штаммом вируса коровьей оспы. Клетки были метаболически меченными 200 мкКи/мл Tran35S- Меткой (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) в течение 6-8 часов в не содержащей цистеина и метионина среде. Их отделяли при помощи PBS, содержащего 1 мМ ЭДТА. Затем клетки осаждали и лизировали в 150 мМ NaCl, 50 мМ Трисе pH 7.5, 5 мМ ЭДТА, 0.5% NP-40, 0.1% ДСН, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF.Radioimmunoprecipitation experiments showed that fusion molecules were predominantly (if not always) dimers. In these experiments, protein A agarose granules were used to immunoprecipitate a solubilized extract of metabolically labeled HeLa cells infected with recombinant vaccinia virus expressing chimeras CD4- (D1-D4): Ig: CD7: ζ and CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ. The immunoprecipitated material was fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. In particular, approximately 5 x 10 6 HeLa-S3 cells were infected, as described above for vPE16, with a suitable strain of vaccinia virus. Cells were metabolically labeled with 200 μCi / ml Tran 35 S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, Calif.) For 6-8 hours in cysteine and methionine-free medium. They were separated using PBS containing 1 mm EDTA. Then the cells were besieged and lysed in 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF.
После удаления ядер центрифугированием одну пятую каждого клеточного экстракта адсорбировали на промытых гранулах конъюгированной с протеином-А агарозы в течение 2 часов при 4oC. Затем гранулы промывали PBS, содержащим 1% NP-40 и элюировали в буфере для проб, содержащем ДСН, в присутствии или в отсутствии меркаптоэтанола. Результаты этих экспериментов показали, что большая часть иммунопреципитированных химер CD4(D1,D2):Ig:CD7: ζ мигрировала в виде димеров ожидаемой молекулярной массы при невосстанавливающих условиях.After removing the nuclei by centrifugation, one fifth of each cell extract was adsorbed on washed granules of protein-A conjugated agarose for 2 hours at 4 ° C. Then, the granules were washed with PBS containing 1% NP-40 and eluted in SDS sample buffer in the presence or absence of mercaptoethanol. The results of these experiments showed that most of the immunoprecipitated CD4 (D1, D2): Ig: CD7: ζ chimeras migrated as dimers of the expected molecular weight under non-reducing conditions.
Для прямой оценки способности клеток, экспрессирующих слитые молекулы CD4, поддерживать инфекцию ВИЧ, мы проводили долгосрочные исследования инфективности на трансфектантах, экспрессирующих CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4:(D1, D2):Ig:CD7. Стабильные трансфектанты CD4(D1-D4):lg:CD7 и CD4(D1,D2):lg:CD7 и CD4 готовили в сублинии клеток 293, легко трансфицируемой клеточной линии эмбриональных почечных клеток человека. Химерные молекулы субклонировали в двунаправленных векторах, в которых ген гигромицина В был под контролем промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса. Чашки 10 см с 60-70% конфлюэнтности трансфицировали 10 мкг этой плазмидной ДНК ко-преципитацией фосфатом кальция. Перед трансфекцией плазмиды линеаризовали при уникальном сайте Sfi 1 и концы дополняли при помощи ДНК-полимеразы T4. При 24 часах после трансфекции клетки разводили в 4 раза и при 48 часах после трансфекции проводили отбор с гигромицином В (Sigma, St. Louis, МО) при 400 мкг/мл. Каждые 3-4 дня клетки снабжали свежей средой, содержащей гигромицин. To directly assess the ability of cells expressing CD4 fusion molecules to support HIV infection, we conducted long-term studies of infectivity on transfectants expressing CD4 (D1-D4): Ig: CD7 and CD4: (D1, D2): Ig: CD7. Stable transfectants CD4 (D1-D4): lg: CD7 and CD4 (D1, D2): lg: CD7 and CD4 were prepared in a subline of 293 cells, an easily transfected human embryonic kidney cell line. Chimeric molecules were subcloned in bidirectional vectors in which the hygromycin B gene was controlled by the herpes simplex virus thymidine kinase promoter. 10 cm plates with 60-70% confluency were transfected with 10 μg of this plasmid DNA co-precipitated with calcium phosphate. Before transfection, plasmids were linearized at the
Устойчивые колонии выскребали, размножали и их экспрессию оценивали непрямой иммунофлуоресценцией с применением конъюгированного с флуоресцеином антител против Fc IgG человека (Organon Teknika, West Chester, PA) или Q4120, антитела, реактивного с CD4 человека (Sigma), с последующей проточной цитометрией (Coulter, Hialeah, FH). Для анализа были отобраны два независимых клона из каждой конструкции с уровнями поверхностного CD4, сравнимыми с уровнем, обнаруживаемым другими клеточными линиями. Фиг. 22 показывает, что после выдерживания с ВИЧ р24 обнаруживали в стабильных CD4 трансфицированных культурах уже при 3 днях после инфицирования. Присутствие многоядерных гигантских клеток и характерного раздувания наблюдали так рано, как 5 дней после инфицирования в этих культурах. Не обнаруживали значительных уровней p24 или многоядерных гигантских клеток в нетрансфицированных родительских клетках или в любом из двух независимо полученных изолятов трансфектантов CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7 после 32 дней культивирования (фиг. 22). Resistant colonies were scrubbed, propagated, and their expression was evaluated by indirect immunofluorescence using fluorescein conjugated anti-human Fc IgG antibodies (Organon Teknika, West Chester, PA) or Q4120, an antibody reactive with human CD4 (Sigma), followed by flow cytometry (Coul Hialeah, FH). Two independent clones from each construct were selected for analysis with surface CD4 levels comparable to those detected by other cell lines. FIG. 22 shows that after exposure to HIV, p24 was detected in stable CD4 transfected cultures as early as 3 days after infection. The presence of multinucleated giant cells and characteristic bloating was observed as early as 5 days after infection in these cultures. No significant levels of p24 or multinucleated giant cells were found in the non-transfected parent cells or in either of the two independently obtained transfectant isolates CD4 (D1-D4): Ig: CD7 and CD4 (D1, D2): Ig: CD7 after 32 days of cultivation (Fig. 22).
После завершения исследований инфективности клетки анализировали на экспрессию CD4 на клеточной поверхности. Плотность поверхностного эпитопа CD4 была значительно снижена в инфицированных культурах, экспрессирующих CD4, что согласуется с вирусной отрицательной модуляцией, но была ненарушенной в культурах, экспрессирующих CD4(D1-D4):Ig:CD7 и CD4(D1,D2):Ig:CD7. Эти эксперименты показывают, что можно создать химерные молекулы, несущие два апикальных домена CD4, которые при слиянии с ζ -цепью T-клеточного рецептора способны нацеливаться на ВИЧ-инфицированные клетки и убивать их, не поддерживая в то же время CD4-мeдииpуeмoй инфекции ВИЧ. After completion of the infectivity studies, the cells were analyzed for expression of CD4 on the cell surface. The density of the surface CD4 epitope was significantly reduced in infected cultures expressing CD4, which is consistent with viral negative modulation, but was undisturbed in cultures expressing CD4 (D1-D4): Ig: CD7 and CD4 (D1, D2): Ig: CD7. These experiments show that it is possible to create chimeric molecules that carry two apical CD4 domains, which, when fused with the ζ-chain of the T-cell receptor, can target HIV-infected cells and kill them, while not supporting a CD4-mediated HIV infection.
Дополнительные эксперименты позволяют предположить, что именно физическое расстояние между внеклеточным доменом молекулы CD4 и липидным бислоем придает способность противостоять инфекции ВИЧ. В первом эксперименте мы сконструировали химерную молекулу, имеющую делецию стебля и трансмембранного домена CD7; эта деления удаляла богатый пролином район трансмембранной части CD7. При слиянии этого домена с внеклеточным доменом CD4 он сохранял свою способность эффективно прикреплять внеклеточный домен молекулы CD4, как было измерено по поверхностной экспрессии молекулы CD4 (как описано здесь). Однако способность противостоять образованию синцитиев, индуцируемому гликопротеином оболочки ВИЧ, была утрачена. Таким образом, делеция богатой пролином части молекулы CD7, района, способного, по-видимому, образовывать α -спиральную закрученную структуру, эффективно уменьшала расстояние между внеклеточным доменом CD4 и липидным бислоем и уничтожала способность химеры противостоять образованию синцитиев. Additional experiments suggest that it is the physical distance between the extracellular domain of the CD4 molecule and the lipid bilayer that makes it possible to resist HIV infection. In the first experiment, we constructed a chimeric molecule having a deletion of the stem and transmembrane domain of CD7; this division removed the proline-rich region of the transmembrane portion of CD7. Upon fusion of this domain with the extracellular domain of CD4, it retained its ability to efficiently attach to the extracellular domain of the CD4 molecule, as measured by surface expression of the CD4 molecule (as described here). However, the ability to withstand the formation of syncytia induced by the HIV envelope glycoprotein has been lost. Thus, the deletion of the proline-rich part of the CD7 molecule, a region capable of apparently forming an α-helical twisted structure, effectively reduced the distance between the extracellular domain of CD4 and the lipid bilayer and destroyed the ability of the chimera to resist the formation of syncytia.
Во втором эксперименте мы показали, что способность противостоять индуцируемому ВИЧ образованию синцитиев может быть обеспечена для химеры CD4/CD5, которая, как было показано ранее, служит трансмембранным якорем для внеклеточного домена CD4, но не способна противостоять индуцируемому ВИЧ образованию синцития. В этом эксперименте шарнирная область, CH2- и CH3-домены тяжелой цепи человеческого IgG1 были встроены в молекулу CD4/CD5; полученная химера противостояла образованию синцития, что опять-таки предполагает, что расстояние, предоставляемое доменами иммуноглобулина, является достаточным для придания устойчивости к индуцируемому ВИЧ образованию синцития. In the second experiment, we showed that the ability to withstand HIV-induced syncytia formation can be provided for the CD4 / CD5 chimera, which, as shown earlier, serves as a transmembrane anchor for the extracellular domain of CD4, but is not able to withstand the HIV-induced syncytium formation. In this experiment, the hinge region, the CH2 and CH3 domains of the human IgG1 heavy chain were inserted into the CD4 / CD5 molecule; the resulting chimera resisted the formation of syncytium, which again suggests that the distance provided by the immunoglobulin domains is sufficient to confer resistance to HIV-induced syncytium formation.
В третьем эксперименте домен CD4 был удален на варьирующие расстояния от клеточной мембраны с применением синтетических α - спиралей различной длины. В частности, были сконструированы синтетические олигонуклеотиды, несущие повторяющиеся α -спиральные мотивы остатков лизина и глутаминовой кислоты, фланкированные двумя остатками аланина (см. фиг. 28 в отношении первичных последовательностей нуклеиновой кислоты и аминокислот). В более ранних исследованиях было найдено, что такие аминокислотные последовательности встречаются с высокой частотой в альфа-спиралях, что позволяет предположить, что такие повторяющиеся мотивы могли бы принимать альфа-спиральную конформацию и что помещение таких альфа-спиралей между трансмембранным доменом и внеклеточными доменами CD4 выдвигало бы CD4 прочь от клеточной мембраны. Путем варьирования длины альфа- спирального сегмента было рассчитано расстояние выдвигания, необходимое для противостояния вхождению ВИЧ, на основании известных величин высоты альфа-спирали и витка. Эти результаты представлены в Таблице 1. In the third experiment, the CD4 domain was removed at varying distances from the cell membrane using synthetic α-helices of various lengths. In particular, synthetic oligonucleotides were constructed that carried repeating α-helical motifs of lysine and glutamic acid residues flanked by two alanine residues (see FIG. 28 for primary nucleic acid and amino acid sequences). In earlier studies, it was found that such amino acid sequences occur with high frequency in alpha helices, suggesting that such repeating motifs might take an alpha-helical conformation and that placing such alpha-helices between the transmembrane domain and the extracellular domains of CD4 advanced would CD4 away from the cell membrane. By varying the length of the alpha-helical segment, the extension distance necessary to withstand HIV entry was calculated based on the known alpha-helix and turn heights. These results are presented in Table 1.
В этой таблице "CD4" обозначает CD4(D1-D4), если нет других указаний; "H", "CH2" и "CH3" обозначают шарнирную область, районы CH2 и CH3 тяжелой цепи IgG1 человека, соответственно; "CD7-tm" и "stk" обозначают трансмембранный район и район стебля CD7; "CD7tm (long version)" и "CD7tm (short version)" обозначают, соответственно, трансмембранный район CD7 и трансмембранный район CD7, имеющий делецию богатого пролином домена, как обсуждалось выше; "CD5tm" обозначает трансмембранный район CD5; и "CD34tm" обозначает трансмембранный район CD34. В строках J-L длина альфа-спирального района дана в ангстремах; эти величины основаны на факте, что 3.6 остатка приходятся на виток альфа-спирали, что соответствует 5.4 ангстрема (или 1.5 А на остаток). In this table, “CD4” means CD4 (D1-D4), unless otherwise indicated; "H", "CH2" and "CH3" denote the hinge region, regions of the human IgG1 heavy chain CH2 and CH3, respectively; "CD7-tm" and "stk" denote the transmembrane region and the region of the CD7 stem; "CD7tm (long version)" and "CD7tm (short version)" respectively denote the transmembrane region of CD7 and the transmembrane region of CD7 having a deletion of a proline-rich domain, as discussed above; "CD5tm" refers to the transmembrane region of CD5; and "CD34tm" refers to the transmembrane region of CD34. In lines J-L, the length of the alpha-helical region is given in angstroms; these values are based on the fact that 3.6 residues per turn of the alpha helix, which corresponds to 5.4 angstroms (or 1.5 A per residue).
В соответствии с этим альфа-спираль из 16 остатков должна выдвигать внеклеточный домен CD4 приблизительно на 24 ангстрема. Были сконструированы альфа-спирали 48 и 72 ангстрем путем последовательной конкатемеризации фрагмента BstYl в уникальный сайт BamH1 фрагмента (см.фиг. 28) с последующим отбором клонов с правильной ориентацией. Accordingly, an alpha helix of 16 residues should extend the extracellular domain of CD4 by approximately 24 angstroms.
Образование синцитиев оценивали в тестах совместного культивирования с клетками HeLa, экспрессирующими гликопротеин оболочки ВИЧ-1, из конструкции вируса коровьей оспы vPE-16 (см. выше). Syncytia formation was evaluated in co-culture tests with HeLa cells expressing HIV-1 sheath glycoprotein from the vPE-16 vaccinia virus construct (see above).
Экспрессию Thy-1 измеряли следующим образом. Конструировали живой ретровирусный вектор на основе клона hxb.2 ВИЧ-1. В этом векторе несущественный ген nef заменяли кодирующей последовательностью крысиного thy-1, эффективно экспрессируемой клеточной поверхностью молекулы, которая прикрепляется к мембране фосфатидилинозитной связью. Вирус, полученный из этого молекулярного клона, обозначенный hxb/thy-1, был инфекционным, как было показано цитопатологическими эффектами и продуцированием p24 в культуральных супернатантах инфицированных клеток C8166 (CD4+ лейкозная T-клеточная линия человека). Кроме того, при выдерживании с hxb/thy-1 клетки HeLa, временно трансфицированные CD4, обнаружили признаки экспрессии thy-1 уже при 18 часах после инфицирования, как это и ожидалось от сигнала, регулируемого по способу регуляции nef гена. Сигналы, кодируемые геном nef, обычно относятся к классу вирусных регуляторных белков, которые подвергаются множественному сплайсингу и не содержат отвечающего на rev элемента. Такие сигналы могут накапливаться конститутивно в цитоплазме в виде продуктов ранних вирусных генов. Ожидалось, что thy-1-сигналы регулируются подобным образом, т.е. появляются рано в жизненном цикле вируса. Короче говоря, эта система облегчала анализ вхождения ВИЧ, поскольку экспрессия thy-1 была применена как заменитель вхождения вируса. Различные основанные на CD4 химеры нестабильно трансфицировали в клетки HeLa с применением стандартных ДЭАЭ-декстрановых методов. Трансфицированные клетки подвергали действию вируса hxb/thy-1 при 48 часах после трансфекции и оценивали на экспрессию thy-1 при 24-48 часах после инфицирования. В результатах, показанных в таблице 1, экспрессию thy-1 измеряли при 24 часах после инфекции с применением коммерчески доступных моноклональных антител против Thy-1.Thy-1 expression was measured as follows. A live retroviral vector based on HIV-1 clone hxb.2 was constructed. In this vector, the non-essential nef gene was replaced by the rat thy-1 coding sequence, which is efficiently expressed on the cell surface of the molecule, which attaches to the membrane with a phosphatidylinositol bond. The virus derived from this molecular clone, designated hxb / thy-1, was infectious, as shown by cytopathological effects and p24 production in the culture supernatants of infected C8166 cells (human CD4 + leukemia T cell line). In addition, upon exposure to hxb / thy-1, HeLa cells temporarily transfected with CD4 showed signs of thy-1 expression already at 18 hours after infection, as was expected from a signal regulated by the method of regulation of the nef gene. Signals encoded by the nef gene typically belong to the class of viral regulatory proteins that undergo multiple splicing and do not contain a rev-responsive element. Such signals can accumulate constitutively in the cytoplasm in the form of products of early viral genes. Thy-1 signals were expected to be regulated in this way, i.e. appear early in the life cycle of the virus. In short, this system facilitated the analysis of HIV entry, since thy-1 expression was used as a substitute for virus entry. Various CD4-based chimeras were unstably transfected into HeLa cells using standard DEAE-dextran methods. Transfected cells were exposed to hxb / thy-1 virus at 48 hours after transfection and evaluated for thy-1 expression at 24-48 hours after infection. In the results shown in table 1, the expression of thy-1 was measured at 24 hours after infection using commercially available monoclonal antibodies against Thy-1.
На основании данных, представленных в Таблице 1, мы сделали вывод, что внеклеточные домены CD4 оптимально должны быть отодвинуты от клеточной мембраны по меньшей мере на 48 ангстремов и предпочтительно по меньшей мере на 72 ангстрема для противостояния инфицированию ВИЧ-1. Based on the data presented in Table 1, we concluded that the extracellular domains of CD4 should optimally be moved away from the cell membrane by at least 48 angstroms and preferably at least 72 angstroms to counter HIV-1 infection.
С применением стратегии, подобной описанной здесь общей стратегии, могут быть сконструированы химеры на основе антител против оболочки ВИЧ, которые нацелены на ВИЧ-инфицированные клетки. Примеры таких антител описаны в Gorny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) и Marasco et al., J. Clin. Invest. 90:1467 (1992). Using a strategy similar to the general strategy described here, chimeras can be constructed based on anti-HIV membrane antibodies that target HIV-infected cells. Examples of such antibodies are described in Gorny et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 1624 (1989) and Marasco et al., J. Clin. Invest. 90: 1467 (1992).
ПРИМЕР XI
Дополнительные триггерные белки T-клеточного рецептора и B-клеточного рецептора
Другие внутриклеточные и трансмембранные передающие сигнал домены, в соответствии с этим изобретением, могут быть произведены из белков T-клеточного рецептора, CD3 дельта и T3 гамма, и белков B-клеточного рецептора, mbi и B29. Аминокислотные последовательности этих белков показаны на фиг. 16 (CD3 дельта; SEQ ID N 24), фиг. 17 (T3 гамма; SEQ ID N 25), фиг. 18 (mD1; SEQ ID N 26) и фиг. 19 (B29; SEQ ID N 27). Части этих последовательностей, достаточные для трансдукции цитолитического сигнала (и, следовательно, предпочтительно включаемые в химерный рецептор этого изобретения) показаны в скобках (блоках). Химерные рецепторы, включающие в себя эти белковые домены, конструируются и используются в терапевтических способах этого изобретения, как описано в общем виде выше.EXAMPLE XI
Additional trigger proteins of the T-cell receptor and B-cell receptor
Other intracellular and transmembrane signal transduction domains in accordance with this invention can be derived from T-cell receptor, CD3 delta and T3 gamma proteins, and B-cell receptor proteins, mbi and B29. The amino acid sequences of these proteins are shown in FIG. 16 (CD3 delta; SEQ ID N 24), FIG. 17 (T3 gamma; SEQ ID N 25), FIG. 18 (mD1; SEQ ID N 26) and FIG. 19 (B29; SEQ ID N 27). Parts of these sequences sufficient for transduction of the cytolytic signal (and, therefore, preferably included in the chimeric receptor of this invention) are shown in brackets (blocks). Chimeric receptors comprising these protein domains are constructed and used in the therapeutic methods of this invention, as described in general terms above.
ПРИМЕР XII
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Инфицирование и радиоиммунопреципитация для вируса коровьей оспы
Приблизительно 5 • 106 клеток CVI инфицировали в течение 1 часа в бессывороточной среде DME рекомбинантным вирусом коровьей оспы при множественности заражения (moi) не менее 10. Клетки помещали в свежую среду после инфицирования и метили метаболически 200 мкКи/мл 35S-метионином плюс цистеином (Tran-36S-метка, ICN; Costo Mesa, CA) в не содержащей метионина и цистеина DMEM (Gibco; Grand Island, NY) в течение 6 часов. Меченые клетки отделяли PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА, собирали центрифугированием и лизировали в 1% NP-40, 1% ДСН, 0.15 М NaCl, 0.05 М Трис pH 8.0, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ PMSF. Ядра удаляли центрифугированием и белки CD4 иммунопреципитировали с агарозой с антителами ОКТ4 и антимышиным IqG (Cappel, Durham, NC). Пробы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидных с ДСН гелях при невосстанавливающих (NR) и восстанавливающих (R) условиях. Гели, содержащие 35S-меченые пробы, пропитывали En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA) перед радиоавтографией. Облегченную экспрессию трансмембранной формы CD16, CD16TM, измеряли сравнением ее экспрессии в клетках CVI, отдельно инфицированных CD16TM, с экспрессией в клетках, совместно инфицированных вирусами, кодирующими CD16TM и химеры ζ или γ. После инфекции и инкубирования в течение 6 часов или более клетки отделяли из чашек при помощи PBS, 1 мМ ЭДТА и экспрессию CD16TM и химер измеряли непрямой флуоресценцией и проточной цитометрией.EXAMPLE XII
EXPERIMENTAL METHODS
Infection and radioimmunoprecipitation for vaccinia virus
About 5 x 10 6 CVI cells were infected for 1 hour in serum-free DME with recombinant vaccinia virus with a multiplicity of infection (moi) of at least 10. Cells were placed in fresh medium after infection and metabolically labeled with 200 μCi / ml 35 S-methionine plus cysteine (Tran- 36 S-label, ICN; Costo Mesa, CA) in methionine and cysteine-free DMEM (Gibco; Grand Island, NY) for 6 hours. Labeled cells were separated by PBS containing 1 mM EDTA, collected by centrifugation and lysed in 1% NP-40, 1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.05 M Tris pH 8.0, 5 mM EDTA and 1 mM PMSF. Nuclei were removed by centrifugation and CD4 proteins were immunoprecipitated with agarose with OKT4 antibodies and anti-mouse IqG (Cappel, Durham, NC). Samples were subjected to electrophoresis on 8% SDS gels with non-reducing (NR) and reducing (R) conditions. Gels containing 35 S-labeled samples were impregnated with En 3 Hance (New England Nuclear, Boston, MA) before radiography. Facilitated expression of the transmembrane form of CD16, CD16 TM , was measured by comparing its expression in CVI cells individually infected with CD16 TM with expression in cells co-infected with viruses encoding CD16 TM and ζ or γ chimeras. After infection and incubation for 6 hours or more, cells were separated from the dishes using PBS, 1 mM EDTA, and the expression of CD16 ™ and chimeras was measured by indirect fluorescence and flow cytometry.
Тест выхода кальция
Клетки сублинии Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантными вирусами коровьей оспы в течение 1 часа в бессывороточной среде IMDM при множественности заражения (moi) 10 и инкубировали в течение 3-9 часов в IMDM, 10% плодной телячьей сыворотке (FBS). Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали при 3 • 106 клеток/мл в полной среде, содержащей 1 мМ ацетометоксиэфир Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985)) (Молекулярные зонды) и инкубировали при 37oC в течение 45 минут. Нагруженные Indo-I клетки осаждали и ресуспендировали при 1 • 106 клеток/мл в бессывороточной среде IMDM и хранили при комнатной температуре в темноте. Клетки анализировали на свободный ион кальция путем одновременного измерения фиолетовой и синей флуоресценции при помощи проточной цитометрии (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Для инициации выхода кальция к клеточной суспензии добавляли конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) антитела Leu-3A (антитела против CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) при 1 мкг/мл с последующим добавлением 10 мкг-мл неконъюгированного козьего антимышиного IgG при времени 0 или неконъюгированного моноклонального антитела 3G8 (анти-CD16) при 1 мкг/мл, с последующим добавлением 10 мкг/мл конъюгированного с фикоэритрином (РЕ) Fab2, козьего антимышиного IgG при времени 0. Гистограммы отношения фиолетового к синему излучения получали из РЕ позитивной (инфицированной) клеточной популяции, которая в типичном случае составляла 40-80% всех клеток. Ответная реакция T-клеточного рецептора антигенов в неинфицированных клетках запускалась антителом ОКТ3, без сшивания. Для экспериментов с участием CD16 химерных рецепторов пробы, показывающие смещение базовой линии в направлении более низкого внутриклеточного кальция (без антител), исключали из анализа. Данные гистограмм затем анализировали преобразованием бинарных данных в ASC11 с применением программного обеспечения Write Hand Man (Cooper City, FL), с последующим анализом с коллекцией программ FORTRAN. Отношение фиолетовой к синей эмиссии перед добавлением второго антитела использовали для установления нормализованного первоначального отношения, принимаемого за единицу, и порогового отношения покоя, устанавливаемого таким образом, чтобы 10% покоящейся популяции превышали пороговое значение.Calcium yield test
Jurkat E6 subline cells (Weiss et al., J. Immunol. 133: 123-128 (1984)) were infected with recombinant vaccinia viruses for 1 hour in serum-free IMDM at a multiplicity of infection (moi) of 10 and incubated for 3-9 hours in IMDM, 10% fetal calf serum (FBS). Cells were harvested by centrifugation and resuspended at 3 x 10 6 cells / ml in complete medium containing 1 mM Indo-1 acetomethoxy ester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) and incubated at 37 o C for 45 minutes. Loaded Indo-I cells were pelleted and resuspended at 1 x 10 6 cells / ml in serum-free IMDM and stored at room temperature in the dark. Cells were analyzed for free calcium ion by simultaneously measuring violet and blue fluorescence using flow cytometry (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952-961 (1986)). To initiate calcium release, Leu-3A antibodies (anti-CD4 antibodies) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) conjugated with phycoerythrin (PE) were added to the cell suspension at 1 μg / ml followed by 10 μg ml of unconjugated goat anti-mouse IgG at
Анализ цитолиза
Человеческую T-клеточную линию WH3, CD8+ CD4- HLA B44 рестриктированную цитолитическую линию, поддерживали в IMDM с 10% человеческой сывороткой с 100 E/мл интерлейкина-2 (IL-2) и периодически стимулировали либо неспецифически облученными (3000 рад) не содержащими HLA лимфоцитами периферической крови и 1 мкг/мл фитогемагглютинина либо специфически облученными несущими B44 мононуклеарными клетками. После одного дня неспецифической стимуляции PHA (ФГА) (фитогемагглютинин) разводили до 0.5 мкг/мл добавлением свежей среды и через 3 дня среду заменяли. Клетки выращивали по меньшей мере в течение 10 дней после стимуляции перед использованием в анализах цитотоксичности. Эти клетки инфицировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы при множественности заражения не менее 10 в течение 1 часа в бессывороточной среде с последующим инкубированием в полной среде в течение 3 часов. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали при плотности 1 • 107 клеток/мл. 200 мкл добавляли к каждой лунке микротитрационного планшета с U-образным дном, содержащей 100 мкл/лунку полной среды. Клетки разводили в серийных 2-кратных разведениях. Две лунки для каждой пробы не содержали лимфоцитов, чтобы получить самопроизвольное выделение хрома и измерить общее поглощение хрома. Клетки-мишени, из сублинии S3HeLa, инфицировали в чашках 6.0 или 10.0 см при множественности заражения 10 в течение 1 часа в бессывороточной среде и инкубировали затем в полной среде в течение 3 часов. Затем их отделяли из клеток при помощи PBS, 1 мМ ЭДТА и считали. Аликвоту 106 клеток-мишеней (HeLa, Raji или RJ2.2.5 для экспериментов с CD4-химерным рецептором и клетки 3G8 10-2 (Shel et al., Mol. Immunol. 26:959 (1989) для экспериментов с CD16-химерным рецептором) центрифугировали и ресуспендировали в 50 мкл стерильного 51Cr-хромата натрия (1 мКи/мл, Dupont Wilmington, DE) в течение 1 часа при 37oC с периодическим перемешиванием, затем промывали три раза PBS. 100 мкл меченых клеток, ресуспендированных в среде при 105 клеток/мл, добавляли к каждой лунке. Клетки-мишени Raji и RJ2.2.5 метили так же, как и клетки HeLa. Микротитрационный планшет откручивали при 750 х g в течение 1 минуты и инкубировали в течение 4 часов при 37oC. В конце инкубационного периода клетки в каждой лунке ресуспендировали осторожным пипетированием, брали пробу для определения общего включения и микротитрационный планшет откручивали при 750 х g в течение 1 минуты. Аликвоты 100 мкл супернатанта удаляли и считали в гамма-лучевом сцинтилляционном счетчике. Процент убивания корректировали на фракцию инфицированных клеток-мишеней (обычно 50-90%), измеренную проточной цитометрией. Для инфицированных эффекторных клеток отношение эффектор/мишень корректировали на процент инфицированных клеток (обычно 20-50% для экспериментов с CD4-химерным рецептором и более 70% для экспериментов с CD16- химерным рецептором).Cytolysis assay
The human WH3 T cell line, CD8 + CD4 - HLA B44 restricted cytolytic line was maintained in IMDM with 10% human serum with 100 E / ml interleukin-2 (IL-2) and periodically stimulated or non-specifically irradiated (3000 rad) not containing HLA with peripheral blood lymphocytes and 1 μg / ml phytohemagglutinin or specifically irradiated with B44-bearing mononuclear cells. After one day of non-specific stimulation, PHA (PHA) (phytohemagglutinin) was diluted to 0.5 μg / ml by adding fresh medium and after 3 days the medium was replaced. Cells were grown for at least 10 days after stimulation before use in cytotoxicity assays. These cells were infected with recombinant vaccinia virus with a multiplicity of infection of at least 10 for 1 hour in serum-free medium, followed by incubation in complete medium for 3 hours. Cells were harvested by centrifugation and resuspended at a density of 1 x 10 7 cells / ml. 200 μl was added to each well of a microtiter plate with a U-shaped bottom containing 100 μl / well of complete medium. Cells were diluted in serial 2-fold dilutions. Two wells for each sample did not contain lymphocytes in order to obtain spontaneous release of chromium and measure the total absorption of chromium. Target cells, from the S3HeLa subline, were infected in 6.0 or 10.0 cm plates at a multiplicity of 10 infection for 1 hour in serum free medium and then incubated in complete medium for 3 hours. Then they were separated from the cells using PBS, 1 mm EDTA and counted. An aliquot of 10 6 target cells (HeLa, Raji or RJ2.2.5 for experiments with the CD4 chimeric receptor and 3G8 10-2 cells (Shel et al., Mol. Immunol. 26: 959 (1989) for experiments with the CD16 chimeric receptor ) were centrifuged and resuspended in 50 μl of sterile 51 Cr-sodium chromate (1 mCi / ml, Dupont Wilmington, DE) for 1 hour at 37 ° C. with periodic stirring, then washed three times with PBS. 100 μl of labeled cells resuspended in medium at 10 5 cells / ml were added to each well. Raji and RJ2.2.5 target cells were labeled in the same way as HeLa cells. The microtiter plate was untwisted at 750 x g for 1 minute and incubated for 4 hours at 37 ° C. At the end of the incubation period, the cells in each well were resuspended by careful pipetting, a sample was taken to determine the total incorporation, and the microtiter plate was unscrewed at 750 x g for 1 minute. and counted in a gamma ray scintillation counter. The kill percentage was adjusted for the fraction of infected target cells (usually 50-90%) measured by flow cytometry. For infected effector cells, the effector / target ratio was adjusted by the percentage of infected cells (usually 20-50% for experiments with the CD4 chimeric receptor and more than 70% for experiments with the CD16 chimeric receptor).
Мутагенез in vitro последовательности ζ (дзета)
Для создания точковых мутаций в аминокислотных остатках 11 и/или 15 последовательности ζ получали синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от сайта BamHI
против хода транскрипции от трансмембранного домена ζ и превращающие остаток 11 нативного ζ из Cys в Gly (CllG) или остаток 15 из Asp в Gly (D15G) или оба (CllG/D15G). Их использовали в ПЦР-реакциях для генерирования мутированных фрагментов, которые встраивали в конструкции CD4: ζ дикого типа.In vitro mutagenesis of the ζ (zeta) sequence
To create point mutations in
against the transcription from the transmembrane domain ζ and converting
Для создания делеций ζ последовательности кДНК ζ амплифицировали при помощи ПЦР с применением синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для создания стоп-кодона (UAG) после остатков 50, 59 или 65. Эти праймеры содержали сайт расщепления для фермента NotI в виде выступающих 5 или 6 остатков от 5'-конца, обычно в последовательности вида CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID N 11), где последние три остатка соответствуют стоп-антикодону. За последовательностями NotI и стоп-антикодона следовали 18 или более остатков, комплементарных целевому 3'-концу этого фрагмента. Полученные химеры были названы CD16: ζ Y51*, CD16: ζ E60* и CD16: ζ D66* соответственно. Сайт BamHI против хода транскрипции от трансмембранного домена и сайт NotI использовали для генерирования фрагментов, которые повторно вводили в конструкцию CD16: ζ дикого типа. Мономерные ζ -химеры создавали высвобождением транс-мембранных и мембрано-проксимальных внутриклеточных последовательностей ζ расщеплением при помощи BamHI и SacI конструкции Asp- и Cys- CD4: ζ, описанной выше, и встраиванием этого фрагмента в конструкции CD16: ζ E60* и CD16: ζ D66* соответственно.To create ζ deletions, ζ cDNA sequences were amplified by PCR using synthetic oligonucleotide primers designed to create a stop codon (UAG) after
Состоящие из трех частей химерные конструкции CD16:7: ζ (48-65) и CD16: 7: ζ (48-59)
Для получения конструкции CD16: ζ D66* последовательность кДНК ζ, соответствующую трансмембранному домену и 17 следующим остаткам цитоплазматического домена, заменяли соответствующим трансмембранным и цитоплазматическим доменом, полученным из кДНК CD5 и CD7. Фрагменты CD5 и CD7 получали при помощи реакции ПЦР с применением прямых олигонуклеотидов, включающих в себя сайт расщепления BamHI и соответствующих району против хода транскрипции от трансмембранного домена CD5 и CD7 соответственно и следующих обратных олигонуклеотидов, перекрывающих последовательности CD5 и CD7 соответственно и последовательность ζ, содержащую сайт расщепления SacI.Three-part chimeric constructs CD16: 7: ζ (48-65) and CD16: 7: ζ (48-59)
To obtain the CD16 construct: ζ D66 * , the ζ cDNA sequence corresponding to the transmembrane domain and the 17 following residues of the cytoplasmic domain was replaced with the corresponding transmembrane and cytoplasmic domain obtained from CD5 and CD7 cDNA. Fragments of CD5 and CD7 were obtained by PCR using direct oligonucleotides, including the BamHI cleavage site and corresponding to the region opposite the transcription from the transmembrane domain of CD5 and CD7, respectively, and the following reverse oligonucleotides that overlap the CD5 and CD7 sequences, respectively, and the ζ sequence containing the site cleavage of SacI.
SD5: ζ : CGC GGG CTC CTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID N 12)
CD7: ζ : CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAC CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID N 13).SD5: ζ: CGC GGG CTC CTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID N 12)
CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAC CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID N 13).
Продукты ПЦР CD5 и CD7 расщепляли BamHI и SacI и лигировали с расщепленным BamHI и SacI CD16: ζ E60* и заменяли последовательность ζ от BamHI до SacI фрагментом CD7. Для получения конструкций CD16:CD5 и CD16:CD7 фрагменты CD5 и CD7 получали при помощи ПЦР с применением олигонуклеотида, содержащего сайт расщепления NotI и кодирующего стоп-кодон (UAA) после остатка Gln416 и Ala193 CD5 и CD7 соответственно. ПЦР фрагмент CD5 и CD7 расщепляли BamHI и NotI и встраивали в конструкцию CD16: ζ Asp66*.PCR products CD5 and CD7 were digested with BamHI and SacI and ligated with digested BamHI and SacI CD16: ζ E60 * and the ζ sequence from BamHI to SacI was replaced with a CD7 fragment. To obtain CD16: CD5 and CD16: CD7 constructs, CD5 and CD7 fragments were obtained by PCR using an oligonucleotide containing a NotI cleavage site and an encoding stop codon (UAA) after residue Gln416 and Ala193 CD5 and CD7, respectively. The PCR fragment of CD5 and CD7 was digested with BamHI and NotI and built into the CD16: ζ Asp66 * construct.
Мутагенез in vitro N-концевых остатков внутри трансдуцирующего цитолитический сигнал мотива ζ (дзета)
Синтетически олигонуклеотидные праймеры, удлиняющиеся от сайта SacI внутри мотива ζ и превращающие нативный остаток 48 из Asn в Ser (N48S), остаток 50 из Leu в Ser (L50S) и остаток 51 из Tyr в Phe (Y51F), были синтезированы и использованы в реакции ПЦР для генерирования фрагментов, которые вновь вводили в конструкцию CD16:7: ζ (48-65) дикого типа.In vitro mutagenesis of N-terminal residues within the transducing cytolytic signal of the ζ motif (zeta)
Synthetically, oligonucleotide primers extending from the SacI site within the ζ motif and converting
Мутагенез in vitro C-концевых остатков внутри трансдуцирующего цитолитический сигнал мотива ζ (дзета)
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, удлиняющиеся от сайта NotI 3' по отношению к стоп-кодону и превращающие нативный остаток 60 из Glu в Gln (E60Q), остаток 61 из Glu в Gin (E61Q), остаток 62 из Tyr в Phe или Ser (Y62F или Y62S) и остаток 63 из Asp в Asn (D63N), были синтезированы и использованы в ПЦР для генерирования фрагментов, которые субклонировали в конструкцию дикого типа CD16: ζ D66* от сайта BamHI до сайта NotI.In vitro mutagenesis of C-terminal residues within the transducing cytolytic signal of the ζ motif (zeta)
Synthetic oligonucleotide primers extending from the
Химерные конструкции CD16: 7: ζ (33-65), CD16:7: ζ (71-104), DC16:7: ζ (104-137)
Трансмембранный фрагмент CD7, несущий сайты MluI и NotI в месте соединения между трансмембранным и внутриклеточным доменами, получали при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотида следующей последовательности: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N 14). Полученный фрагмент ПЦР расщепляли BamHI и NotI и повторно встраивали в конструкцию CD16:7: ζ (48-65). Фрагменты ζ,, кодирующие остатки 33-65, 71-104 и 104-137, получали реакцией ПЦР с применением пары праймеров, содержащих сайты MluI при 5'- конце прямых праймеров и стоп-кодоны, за которыми следуют сайты NotI при 5'-конце обратных праймеров. В каждом случае сайты рестрикции имели 6 остатков от 5'-конца праймера для гарантии расщепления рестриктазой.Chimeric constructs CD16: 7: ζ (33-65), CD16: 7: ζ (71-104), DC16: 7: ζ (104-137)
The CD7 transmembrane fragment carrying the MluI and NotI sites at the junction between the transmembrane and intracellular domains was obtained by PCR using the oligonucleotide of the following sequence: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N 14). The resulting PCR fragment was digested with BamHI and NotI and re-integrated into the CD16: 7: ζ construct (48-65). Fragments ζ ,, encoding residues 33-65, 71-104 and 104-137, were obtained by PCR using a pair of primers containing MluI sites at the 5'-end of the direct primers and stop codons, followed by NotI sites at 5'- end of reverse primers. In each case, the restriction sites had 6 residues from the 5'-end of the primer to ensure restriction enzyme digestion.
ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N 15)
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID N 16) и
ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID N 17).ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N 15)
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID N 16) and
ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID N 17).
Конструирование делеционных мутантов FcR γ 11A
Карбоксил-концевые делеционные мутанты FcR γ 11A конструировали при помощи ПЦР так же, как и полноразмерные конструкции, превращая последовательности, кодирующие тирозин в положениях 282 и 298, в стоп-кодоны (ТАА). N-концевые делеции генерировали амплификацией фрагментов, кодирующих все меньшую часть внутриклеточного домена, при помощи ПЦР с применением олигонуклеотидов, позволяющих встраивать полученные фрагменты между сайтами рестрикции MluI и NotI в предварительно сконструированную экспрессионную плазмиду, кодирующую внеклеточный домен CD16, слитый с трансмембранным доменом CD7, причем последний заканчивается в сайте MluI и месте соединения между трансмембранным и внутриклеточным доменами.Construction of deletion
The carboxyl-terminal deletion mutants FcR γ 11A were constructed by PCR in the same way as full-length constructs, converting the sequences encoding tyrosine at positions 282 and 298 into stop codons (TAA). N-terminal deletions were generated by amplification of fragments encoding a smaller part of the intracellular domain by PCR using oligonucleotides that allow the fragments to be inserted between the MluI and NotI restriction sites in a predesigned expression plasmid encoding the CD16 extracellular domain fused to the transmembrane domain the latter ends at the MluI site and the junction between the transmembrane and intracellular domains.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ
Описанные выше примеры показывают, что агрегация химер ζ,η или γ является достаточной для инициации цитолитического эффекторного клеточного ответа в T-клетках. Известный диапазон экспрессии ζ,η и γ, который включает в себя T-лимфоциты, природные клетки-убийцы, базофильные гранулоциты, макрофаги и мастоциты, предполагает, что консервативные мотивы последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток гемопоэтического происхождения, и что важный компонент иммунной защиты организма в иммунной системе может быть медиирован событиями агрегации рецептора.OTHER OPTIONS
The examples described above show that the aggregation of ζ, η or γ chimeras is sufficient to initiate a cytolytic effector cell response in T cells. The well-known expression range of ζ, η and γ, which includes T-lymphocytes, natural killer cells, basophilic granulocytes, macrophages and mast cells, suggests that conservative sequence motifs can interact with a sensory apparatus common to cells of hematopoietic origin, and that is important a component of the body's immune defenses in the immune system can be mediated by receptor aggregation events.
Активность цитолитического ответа и отсутствие ответа на клетки-мишени, несущие рецепторы MHC класса II, демонстрируют, что химеры на основе ζ,η или γ образуют основу для генетического воздействия на СПИД через адоптивную иммунотерапию. Широкое распространение эндогенных ζ и γ и доказательство того, что Fc-рецепторы, связанные с γ, медиируют цитотоксичность в различных типах клеток (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989)), позволяют рассматривать многие клетки, как пригодные, возможно, для этой цели. Например, нейтрофильные гранулоциты, которые имеют очень короткую продолжительность жизни (приблизительно 4 часа) в циркуляционном кровотоке и представляют собой интенсивно цитолитические клетки, являются заманчивыми клетками-мишенями для экспрессии химер. Инфицирование нейтрофилов ВИЧ, по-видимому, не приводит к выделению вируса, и обилие этих клеток (наиболее предпочтительно, лейкоцитов) должно облегчать иммунную защиту организма. Другой заманчивой возможностью в отношении клеток-хозяев являются зрелые T-клетки, популяция, доступная в настоящее время для ретровирусной генной инженерии (Rosenberg, S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). При помощи рекомбинантного IL-2 T-клеточные популяции могут быть размножены в культуре с относительной легкостью, и размноженные популяции имеют ограниченную продолжительность жизни при реинфузии (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990)). The activity of the cytolytic response and the lack of response to target cells carrying MHC class II receptors demonstrate that ζ, η or γ-based chimeras form the basis for a genetic effect on AIDS through adoptive immunotherapy. The widespread occurrence of endogenous ζ and γ and the evidence that Fc receptors associated with γ mediate cytotoxicity in various types of cells (Fanger et al., Immunol. Today 10: 92-99 (1989)) allow us to consider many cells as suitable perhaps for this purpose. For example, neutrophilic granulocytes, which have a very short lifespan (approximately 4 hours) in the circulation and are intensely cytolytic cells, are attractive target cells for the expression of chimeras. Infection with HIV neutrophils does not appear to result in virus isolation, and the abundance of these cells (most preferably white blood cells) should facilitate the body's immune defense. Another tempting opportunity for host cells is mature T cells, a population currently available for retroviral genetic engineering (Rosenberg, S. A. Sci. Am. 262: 62-69 (1990)). Using recombinant IL-2, T-cell populations can be propagated in culture with relative ease, and multiplied populations have a limited lifespan during reinfusion (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570-578 (1990) )
При подходящих условиях узнавание ВИЧ клетками, экспрессирующими химеры CD4, должно также обеспечивать митогенные стимулы, предоставляющие возможность клеточной популяции с иммуноглобулиновыми рецепторами динамично отвечать на вирусную нагрузку. Хотя мы сконцентрировали здесь внимание на поведении слитых белков в цитолитических T-лимфоцитах, экспрессия этих химер в хелперных лимфоцитах может обеспечить мобилизуемый ВИЧ источник цитокинов, которые могли бы противодействовать коллапсу субпопуляции хелперных клеток при СПИДе. Недавнее описание нескольких схем для конструирования устойчивости к инфекции на стадиях, иных, чем проникновение вируса (Friedman et al. Nature 335:452-454 (1988); Green et al. Cell 58:215-223 (1989); Malim et al. , Cell 58:205-214 (1989); Trono et al. Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al. Nature 345: 625-628 (1990)), предполагает, что клетки, несущие химеры CD4, могли бы быть сконструированы таким образом, чтобы снижать образование вируса экспрессией соответствующих агентов, имеющих внутриклеточный сайт действия. Under suitable conditions, HIV recognition by cells expressing CD4 chimeras should also provide mitogenic stimuli, enabling the cell population with immunoglobulin receptors to respond dynamically to viral load. Although we have focused on the behavior of fusion proteins in cytolytic T lymphocytes, the expression of these chimeras in helper lymphocytes can provide an HIV-mobilized source of cytokines that could counteract the collapse of the helper cell subpopulation in AIDS. A recent description of several schemes for constructing resistance to infection at stages other than virus penetration (Friedman et al. Nature 335: 452-454 (1988); Green et al. Cell 58: 215-223 (1989); Malim et al. Cell 58: 205-214 (1989); Trono et al. Cell 59: 113-120 (1989); Buonocore et al. Nature 345: 625-628 (1990)) suggests that cells carrying CD4 chimeras could be designed in such a way as to reduce the formation of the virus by expression of appropriate agents having an intracellular site of action.
Возможность передачи сигналов к T-лимфоцитам через автономные химеры также обеспечивает возможность регуляции сконструированных при помощи ретровирусов лимфоцитов in vivo. Сшитые стимулы, медиируемые, например, специфическими IgM антителами, сконструированными для удаления комплемент-связывающих доменов, могут позволить таким лимфоцитам увеличиться в числе in situ, тогда как обработка подобными специфическими IgM антителами (например, узнающими аминокислотную вариацию, сконструированную в химерной цепи) могла бы селективно истощать сконструированную популяцию. Кроме того, IgM антитела против CD4 не требуют дополнительного сшивания для мобилизации кальция в клетках Jurkat, экспрессирующих химеры CD4: ζ. Возможность регуляции клеточных популяций без обращения к повторяющимся экстракорпореальным амплификациям может значительно расширить диапазон и эффективность текущих применений, предложенных для генетически сконструированных T-клеток. The ability to transmit signals to T-lymphocytes through autonomous chimeras also provides the ability to regulate lymphocytes constructed using retroviruses in vivo. Crosslinked stimuli mediated, for example, with specific IgM antibodies designed to remove complement-binding domains, can allow such lymphocytes to increase in number in situ, while treatment with similar specific IgM antibodies (for example, recognizing the amino acid variation constructed in the chimeric chain) could selectively deplete the engineered population. In addition, anti-CD4 IgM antibodies do not require additional crosslinking to mobilize calcium in Jurkat cells expressing CD4: ζ chimeras. The ability to regulate cell populations without resorting to repeated extracorporeal amplifications can significantly expand the range and effectiveness of current applications proposed for genetically engineered T cells.
Хотя это изобретение было описано в связи с его характерными вариантами, должно быть понятно, что оно может быть модифицировано далее, и эта заявка предназначена для охвата вариаций, применений или адаптаций этого изобретения, и включает в себя такие отклонения от данного описания, которые входят в область, к которой относится это изобретение, и могут быть отнесены к основным изложенным здесь признакам, как это следует из объема прилагаемой формулы изобретения. Although this invention has been described in connection with its characteristic variants, it should be understood that it can be modified further, and this application is intended to cover the variations, applications or adaptations of this invention, and includes such deviations from this description that are included in the field to which this invention relates, and can be attributed to the main features set forth herein, as follows from the scope of the attached claims.
Claims (14)
13. Химерный рецептор по п.8, отличающийся тем, что указанный рецептор включает в себя трансмембранную часть CD7, трансмембранную часть CD5 или трансмембранную часть CD34.12. The chimeric receptor of claim 8, wherein the T-cell receptor is ξ.
13. The chimeric receptor of claim 8, characterized in that the receptor includes the transmembrane part of CD7, the transmembrane part of CD5 or the transmembrane part of CD34.
14.02.1994 по пп.1-3, 5, 6, 8-10, 12, 13, 15;
02.08.1994 по пп.4, 7, 11, 14.Priority on points:
02/14/1994 according to claims 1-3, 5, 6, 8-10, 12, 13, 15;
08/02/1994 according to claims 4, 7, 11, 14.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/284,391 | 1994-08-02 | ||
US08/195,395 | 1994-08-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU96118239A RU96118239A (en) | 1999-04-20 |
RU2173167C2 true RU2173167C2 (en) | 2001-09-10 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5851828A (en) | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells | |
CA2209300C (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
EP0574512B1 (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
US5843728A (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
US7049136B2 (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
EP0781095B1 (en) | Cells bearing cd4 decoy receptors and related molecules and methods | |
RU2173167C2 (en) | Method of direction of cellular immune response against hiv-infected mammalian cell, protein membrane-bound chimeric receptor, dna | |
RU2165703C2 (en) | Method of suppression of hiv-infected mammalian cells and protein recombinant receptor for its realization | |
AU724652B2 (en) | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells | |
MXPA96003384A (en) | Objective cytolysis of cells infected by hiv via celulas caradoras receptoras cd4 quimeri |