RU2172636C2 - Anti-idiotypical antibodies that induce immune response against epidermal growth factor receptor - Google Patents
Anti-idiotypical antibodies that induce immune response against epidermal growth factor receptorInfo
- Publication number
- RU2172636C2 RU2172636C2 RU96109830A RU96109830A RU2172636C2 RU 2172636 C2 RU2172636 C2 RU 2172636C2 RU 96109830 A RU96109830 A RU 96109830A RU 96109830 A RU96109830 A RU 96109830A RU 2172636 C2 RU2172636 C2 RU 2172636C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- idiotypic
- egfr
- mab
- Prior art date
Links
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 133
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 102100010782 EGFR Human genes 0.000 title description 67
- 101700039191 EGFR Proteins 0.000 title description 66
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 32
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000017256 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Human genes 0.000 claims abstract 3
- 108040009258 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Proteins 0.000 claims abstract 3
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003278 mimic Effects 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 31
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 7
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 43
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 34
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 33
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 28
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 26
- 108010055216 Anti-Idiotypic Antibodies Proteins 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 19
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 101710038213 AKR1C4 Proteins 0.000 description 11
- 102100002977 CDR1 Human genes 0.000 description 11
- 101700073818 CDR1 Proteins 0.000 description 11
- 101710034060 RUNX1T1 Proteins 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 11
- 101700033006 EGF Proteins 0.000 description 10
- 102100010813 EGF Human genes 0.000 description 10
- 229940116977 Epidermal Growth Factor Drugs 0.000 description 10
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 108090000745 Immune Sera Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 5
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 5
- 102000001301 EGF receptors Human genes 0.000 description 5
- 108060006698 EGF receptors Proteins 0.000 description 5
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 5
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102100002976 CDR2L Human genes 0.000 description 4
- 101700065988 CDR2L Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N (+)-methoprene Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102200014718 B3GAT3 C33A Human genes 0.000 description 3
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-2,2,6,6-tetramethylcyclohex-3-en-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)(C)CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101700044316 A331 Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 108010086427 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 201000003963 colon carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 101700006259 tagF Proteins 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 2
- ZWUPPJBUPHOXQV-UHFFFAOYSA-M 2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoic acid;cyanate Chemical compound [O-]C#N.OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 ZWUPPJBUPHOXQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 1
- 240000005093 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N Carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 Carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108009000097 DNA Replication Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100014722 ERVS71-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N Ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 1
- 102100014519 GPNMB Human genes 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000012593 Hanks’ Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 1
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 210000004754 Hybrid Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 108010077608 Immunoglobulin Allotypes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 210000002264 Mammary Glands, Animal Anatomy 0.000 description 1
- 210000004293 Mammary Glands, Human Anatomy 0.000 description 1
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O PAF Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 229940100474 Polyethylene Glycol 1450 Drugs 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 229910018097 ScF Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000587 Small Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- JBUKJLNBQDQXLI-UHFFFAOYSA-N Sodium perborate Chemical compound [Na+].[Na+].O[B-]1(O)OO[B-](O)(O)OO1 JBUKJLNBQDQXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 108060008443 TPPP Proteins 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940098124 cesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin family Proteins 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- -1 however Proteins 0.000 description 1
- 101500002601 human Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 108091007206 transmembrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к антиидиотипическим антителам, которые индуцируют иммунный ответ против опухолей, несущих в качестве антигена рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Предлагаемое изобретение, главным образом, относится к антиидиотипическим антителам, имеющим "внутренний образ" антигена, и способным имитировать внешний домен EGFR человека. В предпочтительном варианте настоящего изобретения указанные антитела происходят от мышиного моноклонального антитела mAb 425, либо от его "очеловеченных" и химерных вариантов. Антитела настоящего изобретения могут быть использованы для иммунотерапии и иммунопрофилактики опухолей. The invention relates to anti-idiotypic antibodies that induce an immune response against tumors carrying the epidermal growth factor receptor (EGFR) as an antigen. The present invention mainly relates to anti-idiotypic antibodies having an “internal image” of an antigen and capable of mimicking the external domain of human EGFR. In a preferred embodiment of the present invention, said antibodies are derived from the murine
В описании настоящего изобретения используются некоторые сокращения и специальные термины, которые имеют следующие значения:
"FR" (каркасные участки) представляют собой четыре субрайона вариабельных областей легкой или тяжелой цепи, которые поддерживают при CDR-участка.In the description of the present invention, some abbreviations and special terms are used, which have the following meanings:
"FR" (frame sections) are four sub-regions of the variable regions of the light or heavy chain that support the CDR region.
"CDR (участки, определяющие комплементарность) представляют собой три субрайона вариабельных областей легкой и тяжелой цепи, которые имеют гипервариабельные последовательности, и образуют петлевые структуры, являющиеся, в основном, ответственными за осуществление непосредственного контакта с антигеном. "CDRs (complementarity determining regions) are three sub-regions of the light and heavy chain variable regions that have hypervariable sequences and form loop structures that are primarily responsible for direct contact with the antigen.
"EGF" и "EGFR" означают эпидермальный фактор роста и его рецептор. "EGF" and "EGFR" mean epidermal growth factor and its receptor.
"PCR" означает полимеразную цепную реакцию. "PCR" means polymerase chain reaction.
"ScFV " означает одноцепочечный FV - фрагмент антитела."ScF V " means a single chain F V fragment of an antibody.
"VL" означает вариабельную область легкой цепи."V L " means the variable region of the light chain.
"VK" означает вариабельную область легкой каппа-цепи."V K " means the variable region of the light Kappa chain.
"VH" означает вариабельную область тяжелой цепи."V H " means the variable region of the heavy chain.
"Химерные" или "частично очеловеченные" антитела представляют собой антитела, содержащие константные области, происходящие от иммуноглобулина человека, и вариабельные области (включая CDR), происходящие от антител, взятых от других источников, не относящихся к человеку, например, от мышиных антител. "Chimeric" or "partially humanized" antibodies are antibodies containing constant regions derived from human immunoglobulin and variable regions (including CDRs) derived from antibodies taken from other sources not related to humans, such as murine antibodies.
"Очеловеченные" или полностью очеловеченные антитела представляют собой антитела, которые содержат константные области и каркасные участки (FR), происходящие от иммуноглобулина человека; и гипервариабельные участки (CDR), происходящие от других источников, не относящихся к человеку. "Humanized" or fully humanized antibodies are antibodies that contain constant regions and framework regions (FR) derived from human immunoglobulin; and hypervariable regions (CDRs) originating from other non-human sources.
"Ab1" означает "первое" антитело или исходное антитело, которое индуцирует, при иммунизации, каскад последовательно продуцируемых антител. “Ab1” means the “first” antibody or parent antibody that induces, upon immunization, a cascade of sequentially produced antibodies.
"Ab2" означает типичное антиидиотипическое антитело (=антиидиотип), направленное против идиотипов Ab1. “Ab2” means a typical anti-idiotypic antibody (= anti-idiotype) directed against Ab1 idiotypes.
"Ab3" означает антиидиотипическое антитело, направленное против идиотипов Ab2, а поэтому по своей специфичности сравнимое с Ab1. “Ab3” means an anti-idiotypic antibody directed against Ab2 idiotypes and therefore comparable in specificity to Ab1.
PBS - означает забуференный фосфатом физиологический раствор. PBS - means phosphate buffered saline.
FCS - означает фетальную телячью сыворотку. FCS - means fetal calf serum.
HBSS - означает сбалансированный солевой раствор Хэнкса. HBSS - means Hanks balanced salt solution.
F1TC - означает флуоресцеинизоцианат. F1TC - means fluorescein isocyanate.
MTC - означает смешанную культуру клеток. MTC - means mixed cell culture.
KLH - означает гемоцианин лимфы улитки (хромопротеид, получаемый из моллюска Medathura crenulata, сильный иммуноген, - прим. пер.). KLH - means hemocyanin of the snail lymph (chromoprotein obtained from the mollusk Medathura crenulata, a strong immunogen, - approx.
CFA - полный адъювант Фрейнда (ПАФ). CFA - Freund's Complete Adjuvant (PAF).
HRPO - означает рекомбинантную пероксидазу человека. HRPO - means recombinant human peroxidase.
Антиидиотипические антитела (антиидиотипы) представляют собой антитела, направленные против эпитопов (называемых идиотипами), локализованных в антигенсвязывающей области или вариабельной области молекулы другого антитела. Взаимодействия между идиотипами (Ab1) и антиидиотипами (Ab2) играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза. Возникновение теории о сети идиотипов и антиидиотипов привело к объяснению явлений иммунорегуляции (Jerne F. G. 1974, Arn. Immunol. 125C: 373). Антиидиотипические антитела, несущие "внутренний образ" антигена, имитируют трехмерную структуру антигена, распознаваемого антителом Ab1. Введение антитела Ab2 может вызвать продуцирование антител Ab3 против исходного антигена. Идиотипические вакцины были успешно применены для лечения некоторых трансмиссивных болезней, и для лечения рака (см., например,
Uytdehaag, F. G. &., C.M.H.Osterhans, 1986, J.Immunol. 134: 1125; Kennedy, P. C. et al. 1986, Science 232: 220; Hiernaux, J.R., 1988; 56: 1407; Strein K.E. & T.Soder-strom, 1984, J.Exp. Med. 160: 1001).Anti-idiotypic antibodies (anti-idiotypes) are antibodies directed against epitopes (called idiotypes) located in the antigen-binding region or variable region of the molecule of another antibody. The interactions between idiotypes (Ab1) and anti-idiotypes (Ab2) play an important role in maintaining immune homeostasis. The emergence of the theory of a network of idiotypes and anti-idiotypes led to an explanation of the phenomena of immunoregulation (Jerne FG 1974, Arn. Immunol. 125C: 373). Anti-idiotypic antibodies carrying an “internal image” of the antigen mimic the three-dimensional structure of the antigen recognized by the Ab1 antibody. Administration of an Ab2 antibody may induce the production of Ab3 antibodies against the parent antigen. Idiotypic vaccines have been successfully used to treat some vector-borne diseases, and to treat cancer (see, for example,
Uytdehaag, FG &., CMHOsterhans, 1986, J. Immmunol. 134: 1125; Kennedy, PC et al. 1986, Science 232: 220; Hiernaux, JR 1988; 56: 1407; Strein KE & T. Soder-strom, 1984, J.Exp. Med. 160: 1001).
В опухолевой иммунологии идиотипическая вакцинация была использована для модуляции опухолевого роста в экспериментальных in vivo и in vitro - системах (Smorodinsky, N. I. et al., 1988, Eur J. Immunol. 18: 1713; Viale, G, et al. , 1987, J.Immunal. 139: 1438). Herlyn и др. (1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1438) сообщили о многообещающих результатах, полученных в клинических испытаниях, которые были проведены с участием пациентов, страдающих прогрессирующей карциномой толстой кишки, и в которых наблюдалось прекращение развития метастазов и частичная клиническая ремиссия у пациентов, подвергнутых лечению лишь одними антидиотипами. Антиидиотипические антитела и их использование в противоопухолевой терапии также описаны, например, в патентах США 4918164 и EP 0141783. In tumor immunology, idiotypic vaccination has been used to modulate tumor growth in experimental in vivo and in vitro systems (Smorodinsky, NI et al., 1988, Eur J. Immunol. 18: 1713; Viale, G, et al., 1987, J .Immunal. 139: 1438). Herlyn et al. (1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1438) reported promising results from clinical trials involving patients suffering from progressive colon carcinoma and in which cessation of development was observed. metastases and partial clinical remission in patients treated with only one antidiotype. Antiidiotypic antibodies and their use in antitumor therapy are also described, for example, in US patents 4918164 and EP 0141783.
Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой полипептидный гормон, который является митогенным для эпидермальных и эпителиальных клеток. При взаимодействии с чувствительными клетками, EGF связывается с мембранными рецепторами (EGFR). Рецептор для EGF представляет собой трансмембранный гликопротеин размером около 170 кДа, и является генным продуктом протоонкогена c-erb-B. Epidermal growth factor (EGF) is a polypeptide hormone that is mitogenic for epidermal and epithelial cells. When interacting with sensitive cells, EGF binds to membrane receptors (EGFR). The receptor for EGF is a transmembrane glycoprotein of about 170 kDa in size, and is a gene product of the c-erb-B proto-oncogen.
Mab 425 представляет собой мышиное моноклональное антитело, продуцируемое против хорошо известной клеточной линии карциномы человека A431 (ATCC CRL 1555); причем указанное антитело связывается с внешним доменом EGFR человека, и ингибирует связывание EGF. Было обнаружено, что MAb 425 (ATCC HB 9629) опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro, и подавляет in vitro - рост опухолевых клеток эпидермоида и клеточных линий, происходящих от карциномы толстой кишки (Rodeck et al., Cancer Res. 1987, 47: 3692). "Очеловеченные" и химерные варианты MAb 425 описаны в WO 92/15683. Mab 425 is a murine monoclonal antibody produced against the well-known A431 human carcinoma cell line (ATCC CRL 1555); moreover, the specified antibody binds to the external domain of human EGFR, and inhibits the binding of EGF. It has been found that MAb 425 (ATCC HB 9629) mediates in vitro tumor cytotoxicity and inhibits in vitro growth of epidermoid tumor cells and cell lines derived from colon carcinoma (Rodeck et al., Cancer Res. 1987, 47: 3692) . The “humanized” and chimeric variants of
Связывание EGF с рецептором активируют некоторые биохимические процессы, что приводит к репликации ДНК и делению клеток (Cargenter G., 1987, Annu. Rev. Biochem. 56: 881). Недавно было установлено, что система EGFR участвует в онкогенной трансформации клеток (Di Fiore, P.P. et al., 1987, Cell 51: 1063.10), Было высказано предположение, что рост некоторых опухолей, которые экспрессируют EGFR и секретируют EGF или TGF α, происходит за счет пролиферации аутостимулированных клеток (Ennis, B. W.et al., 1989, Mol. Endo. 3: 1830: причем повышенная экспрессия EGFR на клеточной поверхности была обнаружена в опухолях, происходящих от различных тканей, например, в опухолях молочной железы, мочевого пузыря, карциномах, меланомах, и опухолях головного мозга, не происходящих от нервных клеток (Neal D.E. et al., 1985; Lancet, 1, 366; Libermann T.A. et al., 1984, Cancer Res 44: 753; Herlyn M.et al., 1982, J.Clin. Immunol 2: 135). EGFR является терапевтической мишенью, поскольку он непосредственно участвует в клеточной пролиферации некоторых опухолей. Было показано, что чрезмерная экспрессия EGFR имеет плохое прогностическое значение, так как она коррелирует с повышенной инвазивной способностью опухоли (Sainsbury J.R. et al., 1985, Lancet I:364). Binding of EGF to the receptor activates certain biochemical processes, which leads to DNA replication and cell division (Cargenter G., 1987, Annu. Rev. Biochem. 56: 881). It has recently been found that the EGFR system is involved in the oncogenic transformation of cells (Di Fiore, PP et al., 1987, Cell 51: 1063.10). It has been suggested that the growth of some tumors that express EGFR and secrete EGF or TGFα occurs due to the proliferation of autostimulated cells (Ennis, BWet al., 1989, Mol. Endo. 3: 1830: moreover, increased expression of EGFR on the cell surface was detected in tumors originating from various tissues, for example, tumors of the mammary gland, bladder, carcinomas , melanomas, and brain tumors, did not occur neural cells (Neal DE et al., 1985; Lancet, 1, 366; Libermann TA et al., 1984, Cancer Res 44: 753; Herlyn M.et al., 1982, J. Clin. Immunol 2: 135 ). EGFR is a therapeutic target because it is directly involved in the cell proliferation of certain tumors. Over-expression of EGFR has been shown to have poor prognostic value, as it correlates with increased invasive capacity of the tumor (Sainsbury JR et al., 1985, Lancet I: 364).
Пассивная или активная иммунизация раковых больных против EGFR приводит к индуцированию в кровотоке этих больных специфических антител, которые действуют как антагонисты EGF и TGFα , блокируя их связывание с рецептором, и ингибируя, тем самым, рост опухолей, EGFR является хорошим кандидатом для идиотипической вакцины, поскольку он может быть выделен из опухолевых клеток, хотя и в недостаточном для терапевтических целей количестве. Passive or active immunization of cancer patients against EGFR induces specific antibodies in the bloodstream of these patients that act as EGF and TGFα antagonists, blocking their binding to the receptor, and thereby inhibiting tumor growth, EGFR is a good candidate for an idiotypic vaccine, since it can be isolated from tumor cells, although in a quantity insufficient for therapeutic purposes.
Несколькими группами исследователей изучались и обсуждались антиидиотипические антитела, и, главным образом, структурное сходство этих антител с их антигенами и "внутренними образами" (см., например, Tsjisaki, M. et.al., 1993, J. Immunol, 150-508; Raychandhuri S., et.al., 1990, J.Immunol 145-760; Bruck C., et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6578). Anti-idiotypic antibodies have been studied and discussed by several groups of researchers, and mainly the structural similarity of these antibodies to their antigens and "internal images" (see, for example, Tsjisaki, M. et.al., 1993, J. Immunol, 150-508 ; Raychandhuri S., et.al., 1990, J. Immunol 145-760; Bruck C., et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6578).
Предлагаемое изобретение относится, главным образом, к новым антиидиотипическим антителам (антиидиотипам), которые индуцирует иммунный ответ против рецептора эпидермального фактора роста. В частности, изобретение относится, по крайней мере, к двум таким антиидиотипам (обозначенным 5А6 и 3B6, которые имитируют область антигена на поверхности рецептора человеческого эпидермального фактора роста. Таким образом, антитела настоящего изобретения, а в частности, антитела, которые способны имитировать EGFR, могут быть использованы для индуцирования и усиления иммунного ответа против всех видов опухолей человека, экспрессирующих рецептор эпидермального фактора роста на своей клеточной поверхности, например таких опухолей, как меланома, глиома, и карцинома. Эти антитела могут быть также использованы в диагностических целях для определения локализации опухоли и для ee in vitro и in vivo-оценки. The present invention relates mainly to new anti-idiotypic antibodies (anti-idiotypes) that induce an immune response against an epidermal growth factor receptor. In particular, the invention relates to at least two such anti-idiotypes (designated 5A6 and 3B6, which mimic the antigen region on the surface of the human epidermal growth factor receptor. Thus, the antibodies of the present invention, and in particular antibodies that are capable of mimicking EGFR, can be used to induce and enhance the immune response against all types of human tumors expressing the epidermal growth factor receptor on their cell surface, for example, tumors such as melan ma, glioma and carcinoma. These antibodies may also be used for diagnostic purposes to determine tumor localization and ee in vitro and in vivo-evaluation.
Таким образом, целью настоящего изобретения является получение нового антитела, которое представляет собой моноклональное антиидиотипическое (Ab2) антитело, индуцирующее иммунный ответ против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Thus, the aim of the present invention is to provide a new antibody, which is a monoclonal anti-idiotypic (Ab2) antibody that induces an immune response against epidermal growth factor receptor (EGFR).
Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антиидиотипическому антителу, имитирующему "внутренний образ" EGFR - антигена, распознаваемого соответствующим мышиным, "очеловеченным" или химерным моноклональным идиотипическим (Ab1) антителом. Это антитело (Ab1) может не происходить от человека, то есть, оно может быть мышиным, "очеловеченным" или химерным моноклональным антителом, определенным выше. Поскольку указанное антитело является "образно воспроизводимым", т.е., по существу, имеется несколько антител Ab1, направленных против эпитопа EGFR, то настоящее изобретение также относится к антиидиотипическим антителам, которые могут распознавать эту группу антител Ab1 против EGFR. More specifically, the present invention relates to a monoclonal anti-idiotypic antibody that mimics the “internal image” of EGFR, an antigen recognized by the corresponding murine, “humanized” or chimeric monoclonal idiotypic (Ab1) antibody. This antibody (Ab1) may not be derived from humans, that is, it may be a murine, humanized, or chimeric monoclonal antibody as defined above. Since this antibody is “figuratively reproducible,” ie, there are essentially several Ab1 antibodies directed against the EGFR epitope, the present invention also relates to anti-idiotypic antibodies that can recognize this group of Ab1 antibodies against EGFR.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антиидитипическим антителам против EGFR, которые могут быть получены исходя из соответствующего антитела Ab1 против EGFR, например, путем иммунизации. In addition, the present invention relates to anti-idiotype antibodies against EGFR, which can be obtained from the corresponding Ab1 antibody against EGFR, for example, by immunization.
Таким образом, целью настоящего изобретения является получение моноклонального антиидиотипического антитела, которое может быть продуцировано путем иммунизации животного с использованием соответствующего мышиного, "очеловеченного", или химерного, идиотипического (Ab1) антитела. Thus, it is an object of the present invention to provide a monoclonal anti-idiotypic antibody that can be produced by immunizing an animal using an appropriate murine, humanized, or chimeric, idiotypic (Ab1) antibody.
Антиидиотипические антитела настоящего изобретения получают, предпочтительно, путем иммунизации животного посредством введения ему моноклонального анти-EGFR антитела 425, либо "очеловеченных" и химерных вариантов этого антитела. MAb 425 продуцируется известной клеточной линией, депонированной под номером допуска ATCC HB 9629. The anti-idiotypic antibodies of the present invention are obtained, preferably, by immunizing an animal by administering to it a monoclonal
Таким образом, целью настоящего изобретения является получение моноклонального антиидиотипического антитела, где идиотипическим антителом (Ab1) является mAb 425 (ANCC HB 9629) либо антитело, полученное из mAb 425 путем его "очеловечивания" или химеризации с использованием методики, описанной, например, в WO 92/15683. Thus, it is an object of the present invention to provide a monoclonal anti-idiotypic antibody, wherein the idiotypic antibody (Ab1) is mAb 425 (ANCC HB 9629) or an antibody derived from
Предлагаемое изобретение также относится к специфическим антиидиотипическим антителам, которые имеют хорошо известные аминокислотные последовательности в гипервариабельных (CDR) и вариабельных (FR) областях антител, и которые представлены на фиг. 5A-F. The present invention also relates to specific anti-idiotypic antibodies that have well-known amino acid sequences in the hypervariable (CDR) and variable (FR) regions of the antibodies, and which are shown in FIG. 5A-F.
Другой целью предлагаемого изобретения является получение антиидиотипического моноклонального антитела, где CDR-области и FR-области указанного антитела имеют аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 5A-F. Кроме того, целью настоящего изобретения, как предпочтительного варианта его осуществления, является получение антиидиотипического антитела, имеющего аминокислотную или нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 5A-F. Another objective of the invention is to provide an anti-idiotypic monoclonal antibody, wherein the CDR regions and FR regions of said antibody have the amino acid sequences shown in FIG. 5A-F. In addition, an object of the present invention, as a preferred embodiment thereof, is to provide an anti-idiotypic antibody having the amino acid or nucleotide sequence shown in FIG. 5A-F.
В соответствии с настоящим изобретением, описываемые последовательности могут также иметь модификации и изменения, возникающие в точно определенных последовательностях, изображеных на фиг. 5, вследствие спонтанных, либо химически или физически индуцированных мутаций, инсерций, делеций, и замещений отдельных аминокислотных или нуклеотидных остатков, при условии, что указанные модификации и изменения не оказывают заметного влияния на биологическую активность и свойства конечных антител. In accordance with the present invention, the sequences described may also have modifications and variations that occur in the well-defined sequences depicted in FIG. 5, due to spontaneous or chemically or physically induced mutations, insertions, deletions, and substitutions of individual amino acid or nucleotide residues, provided that these modifications and changes do not significantly affect the biological activity and properties of the final antibodies.
Термин "антиидиотипическое антитело" также относится к частям или фрагментам указанного антитела, например, к одноцепочечным Fv-фрагментам или F(ab)'2 - и Fab' - фрагментам, хорошо известным специалистам (Skerra & Plyckthum, Science, 1988, 240: 1038; Better et al., Science, 1988, 240: 1041). Одноцепочечные Fv - фрагменты (где VL и VH - участки соединены вместе) также описаны в литературе (например, Bird et al., Science 1988, 242: 423; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 5879).The term “anti-idiotypic antibody” also refers to portions or fragments of said antibody, for example, single-chain F v fragments or F (ab) ' 2 - and Fab' fragments well known to those skilled in the art (Skerra & Plyckthum, Science, 1988, 240: 1038; Better et al., Science, 1988, 240: 1041). Single chain F v fragments (where the V L and V H sites are joined together) are also described in the literature (e.g., Bird et al., Science 1988, 242: 423; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 5879).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антиидиотипического антитела, определенного в описании и формуле настоящего изобретения, заключающемуся в иммунизации животного путем введения этому животному соответствующего идиотипического антитела (Ab1), которое связывается с антигеном непосредственно при помощи своих гипервариабельных участков (CDR), с последующим выделением и очисткой синтезированного антиидиотипического антитела (Ab2), которое связывается с идиотипами антитела Ab1, стандартными методами. In addition, the present invention relates to a method for producing an anti-idiotypic antibody as defined in the description and claims of the present invention, which comprises immunizing an animal by administering to this animal an appropriate idiotypic antibody (Ab1), which binds to the antigen directly via its hypervariable regions (CDRs), subsequent isolation and purification of the synthesized anti-idiotypic antibody (Ab2), which binds to the Ab1 antibody idiotypes, by standard methods.
Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей антиидиотипическое моноклональное антитело, определенное в настоящем описании изобретения; и необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Another objective of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising an anti-idiotypic monoclonal antibody as defined herein; and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
И наконец, предлагаемое изобретение также относится к использованию указанного антиидиотипического антитела для изготовления лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием. Finally, the invention also relates to the use of said anti-idiotypic antibody for the manufacture of a medicament having an antitumor effect.
В предлагаемой заявке описано получение трех моноклональных антиидиотипических антител (5А6, 3В6 и 15Н8), которые распознают идиотипы, перекрывающиеся с антигенсвязывающим центром (паратопом) антитела mAb 425. Проведенные серологические и иммунологические исследования показали, что антитела 5А6 и 3В6 несут "внутренний образ" эпитопа, распознаваемого антителом mAb 425, индуцируя таким образом гуморальный ответ в сингенной (мыши Ba1b/c) и аллогенной (мыши В6-2F1) системе. Антиидиотипы с истинным внутренним образом должны действовать как суррогаты антигена в организме различных видов животных, однако, эти антиидиотипы были неэффективными в отношении генерирования Ab1-подобного ответа у кроликов и крыс. Клонирование и секвенирование их V - областей выявило наличие аминокислотной гомологии между CDR обеих (легкой и тяжелой) цепей и некоторыми остатками EGFR, локализованными в области связывания с лигандом, что дает основание предположить о имитации антигена. Исследование антигенности гомологичных областей позволило дать приемлемое объяснение отсутствию биологического эффекта в гетерогенной системе, и подтвердило потенциальную эффективность антиидиотипических антител в иммунной терапии. The proposed application describes the preparation of three monoclonal anti-idiotypic antibodies (5A6, 3B6 and 15H8) that recognize idiotypes that overlap with the antigen-binding center (paratope) of
Фиг. 1 показано ингибирование связывания 425 с EGFR антиидиотипами 5А6, 3В6, 15H8 или неродственными mАb. Процент ингибирования вычисляли как описано в главе "Материалы и методы" с использованием значений ОП, полученных из ELISA. FIG. 1 shows the inhibition of 425 binding to EGFR anti-idiotypes 5A6, 3B6, 15H8 or unrelated mab. The percent inhibition was calculated as described in the Materials and Methods chapter using OD values obtained from ELISA.
Фиг. 2 - кривые ингибирования антиидиотипами 5А6 (•) 3В6 (°), 15Н8 (▽) и мышиными иммуноглобулинами IgG1 (Sigma) 
Фиг. 3 - конкурентный ELISA-анализ на Ab3-Ab2-связывание. Серийные разведения крысиной антисыворотки Ab3 анализировали на связывание с нанесенными на твердую фазу Ab2 или неродственными mab 15, предварительно инкубированными с 5А6 (•), 3В6 (■), и 15H8 
Фиг. 4 - твердофазный ELISA: ингибирование антиидиотопами связывания Ab3 Balb/c и B6D2F1, полученных от 5A6 - и 3B6 - иммунизированных мышей, с очищенным EGF-рецептором. FIG. 4 - solid phase ELISA: inhibition of anti-idiotopes of Ab3 Balb / c and B6D2F1 binding obtained from 5A6 and 3B6 immunized mice with purified EGF receptor.
Фиг. 5 - полная последовательность вариабельной области (включая лидерную последовательность) тяжелой и легкой цепей мышиных моноклональных антител 15H8, 5A6 и 3B6, показаны нуклеотиданая и аминокислотная последовательности. Лидерная последовательность (где имеется надпись) обозначена жирным шрифтом; CDR - последовательности показаны курсивом; а последовательность, используемая для амплификации вариабельных областей, подчеркнута сплошной линией. Тяжелая цепь 15H8, 5A6 и 3B6 имеют характерную структуру группы IIID. Легкая цепь 15H8 и 5A6 имеют характерную структуру каппа-группы Y, тогда как 3B6 имеет структуру, характерную для каппа-группы III согласно классификации Кэбат:
A: тяжелая цепь 15H8
B: легкая цепь 15H8
C: тяжелая цепь 3B6
D: легкая цепь 3B6
E: тяжелая цепь 5A6
F: легкая цепь 5A6
Фиг. 6 - сравнение последовательностей CDR2H, CDR3H и CDR21 антитела Ab2 и внешнего домена EGF-рецептора. Идентичные аминокислоты показаны в сплошных рамках. В пунктирных рамках показаны подобные аминокислоты. Потенциальные антигенные области показаны в заштрихованных рамках.FIG. 5 is a complete sequence of the variable region (including leader sequence) of the heavy and light chains of murine monoclonal antibodies 15H8, 5A6 and 3B6, the nucleotide and amino acid sequences are shown. The leader sequence (where there is an inscription) is indicated in bold; CDR sequences are shown in italics; and the sequence used to amplify the variable regions is underlined by a solid line. The heavy chain 15H8, 5A6 and 3B6 have the characteristic structure of group IIID. The light chain 15H8 and 5A6 have the characteristic structure of the kappa group Y, while 3B6 has the structure characteristic of the kappa group III according to the Kabat classification:
A: heavy chain 15H8
B: light chain 15H8
C: heavy chain 3B6
D: light chain 3B6
E: 5A6 heavy chain
F: light chain 5A6
FIG. 6 is a comparison of the sequences of CDR2H, CDR3H and CDR21 of the Ab2 antibody and the external domain of the EGF receptor. Identical amino acids are shown in solid frames. In dotted frames, similar amino acids are shown. Potential antigenic regions are shown in shaded frames.
Таблица I. Константы аффинности 5A6, 3B6 и 15H8 по отношению к 425. Константы диссоциации были вычислены по графикам Скэтчарда, описывающим связывание Ab2 с 425, исходя из величин ОП, полученных путем анализа ELISA, который проводили как описано ниже, в главе "Материалы и методы". Table I. Affinity constants 5A6, 3B6, and 15H8 with respect to 425. Dissociation constants were calculated from Scatchard plots describing the binding of Ab2 to 425 based on the OD values obtained by ELISA, which was carried out as described below, in the chapter "Materials and methods. "
Таблица II. Ингибирование Ab1-Ab2- связывания антителами Ab3 и выявление перекрестно реагирующих идиотипов на Ab2. Двухкратные разведения антисывороток Ab3, полученных от мышей (A), кроликов (B) и крыс (C), иммунизированных антиидиотипами или неродственными mAb, анализировали на ингибирование, связывания иммунизирующих Ab2, других антиидиотипов, и мышиного изотипа и аллотипа, соответствующего mAbs. Указаны титры сыворотки, дающие 100%-ное ингибирование. Table II. Inhibition of Ab1-Ab2-binding by Ab3 antibodies and detection of cross-reacting idiotypes on Ab2. Two-fold dilutions of Ab3 antisera obtained from mice (A), rabbits (B), and rats (C) immunized with anti-idiotypes or unrelated mAbs were analyzed for inhibition, binding of immunizing Ab2, other anti-idiotypes, and a mouse isotype and allotype corresponding to mAbs. Serum titers giving 100% inhibition are indicated.
Таблица III. Иммунный ответ против EGFR у мышей Balb/c, определенный путем непрямой иммунофлуоресценции по отношению к EGFR-позитивным (A431) или негативным (С33А) нефиксированным клеткам, и путем ELISA - анализа по отношению к целым клеткам или очищенному внешнему домену. Table III. The immune response against EGFR in Balb / c mice, determined by indirect immunofluorescence against EGFR-positive (A431) or negative (C33A) unfixed cells, and by ELISA analysis against whole cells or a purified external domain.
a) Обнаружение кроличьих антимышиных IgM + IgG с помощью FITC (Флуоресцеин-изотиоцианата). a) Detection of rabbit anti-mouse IgM + IgG using FITC (fluorescein isothiocyanate).
b) Обнаружение кроличьих антимышиных IgG с помощью FITC. b) Detection of rabbit anti-mouse IgG using FITC.
c) Позитивные животные/иммунизированные животные. c) Positive animals / immunized animals.
5. Подробное описание изобретения
Биологические материалы и общие методы
Микроорганизмы, клеточные линии, плазмиды, фагмиды, промоторы, маркеры резистентности, сайты инициации репликации, или другие фрагменты векторов, которые упоминаются в настоящей заявке, были закуплены или получены другими доступными путями. При этом следует отметить, что если в настоящей заявке не приводится каких-либо других данных, то все указанные материалы используются лишь в иллюстративных целях, т.е. не имеют решающего значения для настоящего изобретения, и могут быть заменены другими подходящими средствами и биологическими материалами соответственно.5. Detailed description of the invention
Biological materials and general methods
Microorganisms, cell lines, plasmids, phagemids, promoters, resistance markers, replication initiation sites, or other fragments of vectors referred to in this application, were purchased or obtained in other accessible ways. It should be noted that if no other data are given in this application, then all of the indicated materials are used for illustrative purposes only, i.e. are not critical to the present invention, and can be replaced by other suitable means and biological materials, respectively.
Методы, используемые для осуществления настоящего изобретения, подробно описаны ниже. В предлагаемой заявке не проводится подробного описания стандартных методов, хорошо известных любому специалисту, либо детально описанных в цитируемых источниках, патентных заявках и в общеизвестных работах (например, Harlow E & D. Lane, 1988, Anfibodies, a laborafory mannal. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.). The methods used to implement the present invention are described in detail below. The proposed application does not provide a detailed description of standard methods well known to any specialist, or described in detail in cited sources, patent applications and well-known works (for example, Harlow E & D. Lane, 1988, Anfibodies, a laborafory mannal. Cold Spring Harbor Laboratory , NY).
Для in vivo-анализов были использованы мыши Balb/c (IFFA CREDO), гибридный штамм B6D2FI, полученный от мышей C57BL/6J и DBA/2 (IFFA CREDO), крысы Wistar (Interfanna Iberica), и белые новозеландские кролики (Biocentre). For in vivo analyzes, Balb / c mice (IFFA CREDO), a hybrid strain of B6D2FI obtained from C57BL / 6J and DBA / 2 mice (IFFA CREDO), Wistar rats (Interfanna Iberica), and white New Zealand rabbits (Biocentre) were used.
A431 представляет собой проскоклеточную (эпидермоидную) карциному (ATCC CRL 1555), экспрессирующую EGFR. C33A (ATCC HTB31) представляет собой карциному шейки матки, и является рецептор-негативной. В качестве "партнера" для слияния при получении гибридомы использовали HL1-Friendly-миелому-653 (Ventrex, bioventures group). Все клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640, в которую была добавлена 10%-ная фетальная телячья сыворотка и 2 мМ глутамина. A431 is a pro-cell (epidermoid) carcinoma (ATCC CRL 1555) expressing EGFR. C33A (ATCC HTB31) is a cervical carcinoma, and is receptor-negative. HL1-Friendly-myeloma-653 (Ventrex, bioventures group) was used as a "partner" for fusion upon receipt of the hybridoma. All cell lines were cultured in RPMI 1640 medium, to which 10% fetal calf serum and 2 mM glutamine were added.
Антитело mAb 425 (AbI) против EGFR продуцировали по методу Rodeck и др. (см. выше). В различных анализах в качестве контроля использовали несколько мышиных mAb неродственной специфичности, а именно: mab 15 (IgGI, k) против gp85/45 мелкоклеточного рака легких; R24 (IgG3,k) против GD3; 14F9 (IgG3,k) против GD3, и Me36I (IgG2f) против GD2, которые были описаны ранее (Kamma H. et. al. , 1989, Cancer Res. 49(8): 5118; Dippold W.G., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:6114, Masso O.et.al., 1991, Immunologia 10:36; Ihurin I. et.al., 1987, Cancer Res. 47:1229). Antibody mAb 425 (AbI) against EGFR was produced by the method of Rodeck et al. (See above). In various assays, several murine unrelated specificity mAbs were used as controls, namely: mab 15 (IgGI, k) against gp85 / 45 small cell lung cancer; R24 (IgG3, k) against GD3; 14F9 (IgG3, k) against GD3, and Me36I (IgG2f) against GD2, which were previously described (Kamma H. et. Al., 1989, Cancer Res. 49 (8): 5118; Dippold WG, 1980, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 77: 6114, Masso O.et.al., 1991, Immunologia 10:36; Ihurin I. et.al., 1987, Cancer Res. 47: 1229).
FIII (IgGl, k) получали путем ПЭГ-индуцированного слияния спленоцитов, взятых от иммунизированных РНКазой мышей Balb/c и Friengly-миеломы. FIII (IgGl, k) was obtained by PEG-induced fusion of splenocytes taken from Rbase-immunized Balb / c and Friengly myeloma mice.
Получение идиотипического mAb против mAb 425
Мышиные гибридомы продуцировали с использованием спленоцитов, взятых от мышей Balb/c, иммунизированных антителом mAb 425, и слитых с клетками Friendlu-миеломы 653. Супернатанты тестировали с помощью "сандвич"-анализа ELISA по отношению к mAb 425. Гибридомы 5A6, 3B6 и 15H были получены в результате двух слияний, что давало 2,8%-ную и 10,5%-ную специфическую эффективность, соответственно. После трехкратного клонирования методом серийного разведения, было установлено, их антитела относятся к классу IgGI,k.Obtaining idiotypic mAb against
Mouse hybridomas were produced using splenocytes taken from Balb / c mice immunized with
Характеризация 5A6, 3B6 и 15HB
Для характеризации Ab2 использовали неочищенные супернатанты или очищенные образцы белка A. Антиидиотипическая природа этого антитела была подтверждена его специфическим связыванием с mAb 425 при тестировании панели с неродственными mAb, имеющими различные антигенные специфичности (FIII, 361, 15 и 14F9).Characterization 5A6, 3B6 and 15HB
Ab2 supernatants or purified protein A samples were used to characterize Ab2. The anti-idiotypic nature of this antibody was confirmed by its specific binding to mAb 425 when testing the panel with unrelated mAb having different antigenic specificities (FIII, 361, 15 and 14F9).
Для определения локализации 425-идиотопов, распознаваемых антиидиотипами, они были подвергнуты тестированию по отношению к sEGFR посредством ELISA-анализа на ингибирование связывания 425 с EGFR. В результате наблюдалось полное ингибирование реактивности EGFR (фиг. 1), что указывает на то, что антиидиотипы распознают идиотопы внутри антигенсвязывающего сайта. To determine the localization of 425 idiotypes recognized by anti-idiotypes, they were tested for sEGFR by an ELISA assay for inhibiting 425 binding to EGFR. As a result, complete inhibition of EGFR reactivity was observed (FIG. 1), which indicates that anti-idiotypes recognize idiotypes within the antigen-binding site.
Для идентификации антиидиотипов 5A6, 3B6 и 15HB как Ab2b были проведены анализы в целях определения совпадают ли идиотопы, распознаваемые на mAb 425, с CDR или антигенсвязывающим сайтом. Для таких анализов путем непрямого ELISA-теста с использованием клеток A431, были построены кривые ингибирования связывания для мышиных (фиг. 2A) и "очеловеченных" (фиг. 2B) вариантов mAb 425. Все три антиидиотипа оказались способными ингибировать связывание обоих вариантов 425; причем каждое из Ab2 имели аналогичные кривые ингибирования связывания, что свидетельствует о том, что идиотопы 425, распознаваемые антителами 5A6, 3B6 и 15H8, непосредственно участвуют в распознавании антигена. В ингибировании связывания клеток 425 с клетками A431 антитело 15H8 обнаруживало эффективность, которая в 10 раз превышала эффективность 5A6 и 3B6. Для определения степени соответствия Ab2 паратопу 425 вычисляли константу диссоциации (KD) антиидиотипов. Константы диссоциации каждого из Ab2 представлены в табл. I. 15H8 обладает более высоким сродством к 425, что коррелирует с его более высокой способностью ингибировать связывание EGFR с 425. Эти результаты позволяют также предположить, что, по крайней мере, два различных идиотопа на mAb 425 распознаются антиидиотипическими антителами. To identify the anti-idiotypes 5A6, 3B6 and 15HB as Ab2b, analyzes were performed to determine if the idiotopes recognized on
Индукция сингенных (Balb/c), аллогенных (B6D 2FI) и ксеногенных (крыса, кролик) антител Ab3
Пригодность указанных Ab2 для использования в качестве идиотипических вакцин определяли путем оценки их иммуногенности. Антитела Ab2, несущие истинный "внутренний образ" антигена, должны обладать способностью индуцировать антитела Ab3 с Ab1-подобный специфичностью, выходящей за пределы видового барьера. Ab3 были продуцированы у мышей, крыс и кроликов в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше.Induction of syngeneic (Balb / c), allogeneic (B6D 2FI) and xenogenic (rat, rabbit) Ab3 antibodies
The suitability of these Ab2 for use as idiotypic vaccines was determined by assessing their immunogenicity. Ab2 antibodies that carry the true “internal image” of an antigen must have the ability to induce Ab3 antibodies with Ab1-like specificity that goes beyond the species barrier. Ab3 were produced in mice, rats, and rabbits in accordance with the immunization schedule described above.
Анти-антиидиотипические антитела были обнаружены через 2 недели после введения первой дозы и достигали максимального уровня через 6-8 недель после введения первой дозы. У крыс и у кроликов специфический ответ против иммунизирующего Ab2 поддерживался в течение почти 12 месяцев, тогда, как у мышей этот ответ был более кратковременным, и через 6 месяцев, титр Ab3 снижался. Все кролики продуцировали антимышинные Ig; причем титр антисыворотки Ab3 против иммунизирующего Ab2 был в 5-10 раз выше, чем титры, обнаруженные против изотипических и аллотипических Ig, что свидетельствует о том, что иммунные ответ против константной области Ab2 не нарушает иммунный ответ против v-области. Anti-anti-idiotypic antibodies were detected 2 weeks after the first dose and reached their maximum level 6-8 weeks after the first dose. In rats and rabbits, the specific response against immunizing Ab2 was maintained for almost 12 months, whereas in mice this response was shorter, and after 6 months, the Ab3 titer decreased. All rabbits produced anti-mouse Ig; moreover, the titer of the Ab3 antiserum against immunizing Ab2 was 5-10 times higher than the titers found against isotypic and allotypic Ig, which indicates that the immune response against the constant region of Ab2 does not violate the immune response against the v region.
Для определения эффективности иммунизации против тех детерминант Ab2, которые констактируют с паратопом mAb 425 (где должны находиться антиген-имитирующие идиотопы), был проведен анализ на ингибирование связывания, в котором связывание 5A6, 3B6 или 15H8 (антител Ab2) с mAb 425 измеряли в присутствии серийных разведений Ab3-содержащей сыворотки, взятой от животных, иммунизированных антителом Ab2, или неродственными мышиными mAb. В табл. 2-4 разведения Ab3-содержащей сыворотки, которые дают 100%-ное ингибирование связывания Ab2-Ab1, получены от мышей Balb/c (табл. 2), кроликов (табл. 3) и крыс (табл. 4). Как видно из табл. 2-4 все антисыворотки Ab3 против 5A6, продуцированные в этих 3 видах, ингибировали связывание mAb 425 с 5A6 и 3B6 с одинаковой эффективностью. Антисыворотка против 3B6 обнаруживала аналогичный характер ингибирования, что позволяет предположить, что оба эти антиидиотипа могут иметь общие эпитопы. Кроме того, было установлено, что некоторые крысиные и мышиные антисыворотки против 15H8 ингибируют связывание 5A6 и 3B6 с 425, что позволяет сделать вывод о их частичной идиотипический идентичности. Такая реактивность не наблюдалась в случае кроличьих антисывороток против 15H8, что, вероятно, указывает на то, что Ab3 - ответ, продуцируемый у кроликов, может быть направлен, в основном, против других, более иммунодоминантных идиотопов; причем это предположение подтверждается выявлением более высоких ингибирующих титров для кроличьей Ab3 - содержащей сыворотки по сравнению с крысиными и мышиными антисыворотками. To determine the effectiveness of immunization against those Ab2 determinants that contact the
Антигенную идентичность между 5A6 и 3B6 исследовали с помощью конкурентного ELISA-теста, где серийные разведения (10-3-10-5) кроличьих и крысиных антисывороток (Ab3) анализировали на связывание с Ab2 в присутствии равного объема (1 мг/мл) Ab2 или контрольных mAb. Кривые ингибирования связывания для крысиных Ab3-содержащих сывороток показаны на фиг. 3. 5A6 и 3B6 генерируют идентичный спектр Ab3 у крыс и кроликов: антисыворотка против 5A6 с одинаковой эффективностью реагируют с антителами 5A6 и 3B6, нанесенными на ELISA-планшеты, и в равной степени ингибируется обоими Ab2. Кроличья сыворотка Ab3 имеет кривую ингибирования, аналогичную кривым ингибирования, показанным на фиг. 3 для крысиных сывороток.Antigenic identity between 5A6 and 3B6 was investigated using a competitive ELISA test, where serial dilutions (10 -3 -10 -5 ) of rabbit and rat antisera (Ab3) were analyzed for binding to Ab2 in the presence of an equal volume (1 mg / ml) of Ab2 or control mAb. Binding inhibition curves for rat Ab3-containing sera are shown in FIG. 3. 5A6 and 3B6 generate an identical Ab3 spectrum in rats and rabbits: anti-5A6 antiserum reacts with the same efficiency with antibodies 5A6 and 3B6 applied to ELISA plates and is equally inhibited by both Ab2. Rabbit serum Ab3 has an inhibition curve similar to the inhibition curves shown in FIG. 3 for rat sera.
Идентификация антител Ab3 против EGFR
Антитела к рецептору были обнаружены в Ab3-содержащих сыворотках методом прямой иммунофлуоресценции с использованием клеток A431 и C33A. Полученные результаты представлены в табл. 5.Identification of Ab3 antibodies against EGFR
Receptor antibodies were detected in Ab3-containing sera by direct immunofluorescence using A431 and C33A cells. The results are presented in table. 5.
Антиидиотипическая вакцинация в мышиной системе индуцировала образование антител против EGFR, однако в Ab3-содержащих сыворотках от крыс и кроликов не должны обнаруживаться антитела к EGFR. Продуцирование антител к EGFR у мышей B6D 2FI подтверждает тот факт, что Ab2-вакцинация генетически не ограничивается мышиным штаммом Balb/c. При тестировании против SEGFR с помощью ELISA титры специфических антител достигали значений 1/50 - 1/1600. Anti-idiotypic vaccination in the mouse system induced the formation of antibodies against EGFR, however, antibodies to EGFR should not be detected in Ab3-containing sera from rats and rabbits. The production of antibodies to EGFR in B6D 2FI mice confirms the fact that Ab2 vaccination is not genetically limited to the mouse strain of Balb / c. When tested against SEGFR using ELISA, the titers of specific antibodies reached values of 1/50 - 1/1600.
Ингибирование связывания Ab3 с EGFR антиидиотипическими антителами 5A6, 3B6 и 15H8
Эти анализы осуществляли для того чтобы определить, имитируют ли антиидиотипы трехмерную структуру EGFR. Для этого различные разведения Ab3-содержащей сыворотки против EGFR, взятой от мышей Balb/c и B6D2F1, смешивали с антиидиотипами и оставляли для реакции на 4 ч при комнатной температуре, после чего их анализировали на антитела к рецептору с использованием SEGFR-покрытых планшетов, и, исходя из величин ОП, вычисляли процент ингибирования, который представлен на фиг. 4. 5П6 и 3B6 давали 100%-ное ингибирование, что свидетельствует о том, что эти антиидиотипы имитируют идентичную трехмерную структуру исходного антигена. Процент ингибирования анти-EGFR Ab3 идиотипом 15H8 составляли 15 - 35% по отношению к 5А6 или 3B6.Inhibition of Ab3 binding to EGFR by anti-idiotypic antibodies 5A6, 3B6 and 15H8
These assays were performed to determine if anti-idiotypes mimic the three-dimensional structure of EGFR. For this, various dilutions of Ab3-containing anti-EGFR serum taken from Balb / c and B6D2F1 mice were mixed with anti-idiotypes and allowed to react for 4 hours at room temperature, after which they were analyzed for antibodies to the receptor using SEGFR-coated plates, and Based on the OD values, the percent inhibition, which is shown in FIG. 4. 5P6 and 3B6 gave 100% inhibition, which suggests that these anti-idiotypes mimic the identical three-dimensional structure of the original antigen. The percentage inhibition of anti-EGFR Ab3 by idiotype 15H8 was 15–35% with respect to 5A6 or 3B6.
Было заявлено, что антиидиотипы, несущие истинный внутренний образ антигена, могут имитировать иммуногенные свойства антигена и индуцировать специфический ответ у различных видов животных, за исключением 5А6 и 3B6, которые не способны индуцировать анти-EGFR антитела у крыс и кроликов; однако, проведенные серологические анализы позволяют предположить, что антитела к рецептору, обнаруженные у мышей, были индуцированы идиотипическими детерминантами 5А6 и 3B6, схожими с EGFR. It has been stated that anti-idiotypes bearing the true internal image of the antigen can mimic the immunogenic properties of the antigen and induce a specific response in various animal species, with the exception of 5A6 and 3B6, which cannot induce anti-EGFR antibodies in rats and rabbits; however, serological analyzes suggest that receptor antibodies found in mice were induced by idiotypic determinants 5A6 and 3B6, similar to EGFR.
Первичные структуры Ab2 и сравнение их аминокислотных последовательностей с EGFR
Для выявления структурообразных особенностей, лежащих в основе иммуногенных свойств Ab2, проводили ДНК-секвенирование. VH и VL - последовательности 5А6, 3B6 и 15H8 представлены на фиг. 5. Аминокислотные последовательности VH-областей были классифицированы в соответствии с критерием Кэбата как относящиеся к подгруппе IIID. Согласно Кэбату VL - области 5А6 и 15H8 принадлежат к группе KV, а 3B6 - к группе kIII. CDR-последовательности сравнивали с аминокислотными последовательностями EGFR человека (GQHUE из банка данных SP1RS). Это сравнение проиллюстрировано на фиг. 6, где идентичные аминокислотные показаны в сплошных рамках, а эквивалентные аминокислоты показаны в пунктирных рамках. Максимальная гомология наблюдалась между остатками 77-84 от CDR2H и остатками 125-129. от CDR3H, и остатками 70-76 от 5А6 и 74-80 от CDR2L, причем области EGFR, имеющие наибольшую гомологию с CDR3H, располагались в гипотетических лиганд-связывающих доменах рецепторного белка, описанного A. Ullrich и др. (30). 15H8 имеет идентичную последовательность CDR2H, но отличающиеся последовательности CDR3H и CDR2L. Для определения какую роль играет каждый гомологичный CDR-участок в формировании "внутреннего образца" EGFR, было проведено сравнение последовательностей 5A6 и 3B6 с известными VH и VL-областями, описанными Кэбатом. В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что некоторые VH-цепи обладают высокой степенью гомологии с 5А6 и 3B6, в частности, они имеют аналогичные CDR1H и CDR2H, что дает основание предположить, что последовательности CDR3H играют главную роль в распознавании 425-паратопа и имитации EGFR. Было обнаружено, что CDR3H Ig 63 (в основном мышиного или человеческого происхождения) имеют частичную гомологию (50 - 87%) с CDR3H от 5А6 и 3B6. Гомологичные аминокислоты, очевидно, локализованы в остатках 100H-102, тогда как менее гомологичные аминокислоты были обнаружены в GYVG-сегменте, где наблюдалась максимальная гомология с EGFR. При этом, было установлено, что ни одно антитело мышиного или человеческого происхождения не имело остаток V в положении 100D за исключением 5А6 и 3B6. VL 5А6 и 3B6 обнаруживали гомологию с мышиными каппа-цепями, причем совершенно разные последовательности VL-цепи имели одинаковую специфичность. Очевидно, роль CDR2 не связана со строгой аминокислотной идентичностью. 5А6, 3B6 имеют разные последовательности, образующие идентичную структуру внутреннего образа EGFR, однако, аминокислотные гомологии с EGFR, очевидно, аккумулируются в этой области.Primary structures of Ab2 and comparison of their amino acid sequences with EGFR
To identify the structure-like features that underlie the immunogenic properties of Ab2, DNA sequencing was performed. V H and V L - sequences 5A6, 3B6 and 15H8 are shown in FIG. 5. The amino acid sequences of the V H regions were classified according to the Kabat criterion as belonging to subgroup IIID. According to Kabat, V L - regions 5A6 and 15H8 belong to the KV group, and 3B6 - to the kIII group. CDR sequences were compared with the amino acid sequences of human EGFR (GQHUE from databank SP1RS). This comparison is illustrated in FIG. 6, where identical amino acids are shown in solid frames, and equivalent amino acids are shown in dotted frames. Maximum homology was observed between residues 77-84 from CDR2H and residues 125-129. from CDR3H, and residues 70-76 from 5A6 and 74-80 from CDR2L, with the EGFR regions having the greatest homology to CDR3H located in the hypothetical ligand-binding domains of the receptor protein described by A. Ullrich et al. (30). 15H8 has the same CDR2H sequence, but different CDR3H and CDR2L sequences. To determine what role each homologous CDR region plays in the formation of the “internal sample” of EGFR, sequences 5A6 and 3B6 were compared with the known V H and V L regions described by Kabat. In accordance with the present invention, it was found that some V H chains have a high degree of homology with 5A6 and 3B6, in particular, they have similar CDR1H and CDR2H, which suggests that the CDR3H sequences play a major role in the recognition of 425 paratope and imitations of EGFR. It was found that CDR3H Ig 63 (mainly of mouse or human origin) have partial homology (50 - 87%) with CDR3H from 5A6 and 3B6. Homologous amino acids are obviously localized at residues 100H-102, while less homologous amino acids were found in the GYVG segment, where maximum homology with EGFR was observed. Moreover, it was found that not a single antibody of mouse or human origin had a V residue at position 100D with the exception of 5A6 and 3B6. V L 5A6 and 3B6 showed homology with mouse kappa chains, with completely different sequences of the V L chain having the same specificity. Obviously, the role of CDR2 is not associated with strict amino acid identity. 5A6, 3B6 have different sequences forming the identical structure of the internal image of EGFR, however, amino acid homology with EGFR, obviously, accumulate in this area.
Для оценки иммунологического действия этих антиидиотипов в качестве вакцин, были проанализированы доступность и антигенные свойства CDR2H-, CDR3H- и CDR2D -областей. Антигенный индекс (мера антигенной вероятности) вычисляли с использованием программы ANTIGENIC, а для определения доступности найденных гомологичных последовательностей определяли с использованием программы DSSP. To assess the immunological effect of these anti-idiotypes as vaccines, the availability and antigenic properties of the CDR2H, CDR3H, and CDR2D regions were analyzed. The antigenic index (a measure of antigenic probability) was calculated using the ANTIGENIC program, and to determine the availability of the found homologous sequences was determined using the DSSP program.
Анализ вторичной и первичной структуры показал, что указанные гомологичные остатки являются доступными, и, кроме того, совпадают с областями, имеющими положительный антигенный индекс, а поэтому они могут принимать непосредственное участие в продуцировании ответа против "внутреннего образца" антигена. VL5A6- и VL3B6-цепи, представляющие 7 неидентичных антигенных областей и 11024 и 11603 Ангстремов доступного поверхностного белка, соответственно, способы образовывать антигенные изотопы; однако, оба эти антитела генерируют идентичный Ab3-ответ у мышей, кроликов и крыс. Полученные результаты позволяют предположить, что анти-антиидиотипичный ответ, наблюдаемый в этой системе, направлен исключительно на идиотип, определенный VH-цепями 5А6 и 3B6.Analysis of the secondary and primary structure showed that these homologous residues are accessible, and, in addition, coincide with regions with a positive antigenic index, and therefore they can be directly involved in the production of the response against the “internal sample” of the antigen. VL5A6 and VL3B6 chains representing 7 non-identical antigenic regions and 11024 and 11603 Angstroms of the accessible surface protein, respectively, methods of generating antigenic isotopes; however, both of these antibodies generate an identical Ab3 response in mice, rabbits, and rats. The results obtained suggest that the anti-anti-idiotypic response observed in this system is directed exclusively to the idiotype determined by the V H chains of 5A6 and 3B6.
Поскольку иммунологический и структурный анализы антиидиотических антител 5А6 и 3B6 показали, что они несут внутренний образ внешнего домена EGFR, что были проведены исследования для того чтобы определить, почему ответ не индуцируется в других видах. Положительную антигенную CDR3H-область GYVGYAIDY, несущую EGFR-эквивалентную сегменты GYVGY, сравнивали с CDR3H-последовательностями мышиного, крысиного и кроличьего антител. Большая группа мышиных антител имеет в предсказанной антигенной области на CDR3H последовательность YAIDY; причем ожидалось, что у мыши, собственный иммуногенный идиотип определяют остатки GYVC. Было установлено, что Ig не имеют последовательность YAIDY, и, по всей вероятности, кроличий анти-антиидиотипический ответ направлен против других идиотипов, определяемых более крупными антигенными областями, что препятствует продуцированию ответа против "внутреннего образа". Since immunological and structural analyzes of anti-idiotic antibodies 5A6 and 3B6 showed that they carry an internal image of the external domain of EGFR, studies have been conducted to determine why the response is not induced in other species. The GYVGYAIDY positive antigenic CDR3H region carrying the EGFR-equivalent GYVGY segments was compared with the CDR3H sequences of murine, rat and rabbit antibodies. A large group of murine antibodies has the YAIDY sequence in the predicted antigenic region on CDR3H; moreover, it was expected that in the mouse, GYVC residues were determined by their own immunogenic idiotype. It was found that Ig does not have a YAIDY sequence, and in all likelihood, the rabbit anti-idiotypic response is directed against other idiotypes defined by larger antigenic regions, which prevents the production of a response against the "internal image".
Исходя из представленного выше описания изобретения, можно сделать следующий краткий обзор. Based on the above description of the invention, the following brief overview can be made.
Для активной иммунотерапии рака были использованы различные методы. Для получения специфического антиопухолевого ответа, регулируемого взаимодействием "идиотип-антиидиотип", раковым пациентам вводили антиидиотипические антитела, имитирующие иммунологический эффект опухолевых маркеров. Various methods have been used for active cancer immunotherapy. To obtain a specific anti-tumor response regulated by the idiotype-anti-idiotype interaction, anti-idiotypic antibodies imitating the immunological effect of tumor markers were administered to cancer patients.
Антиидиотипические mAb против mAb 425 были получены в целях разработки специфических вакцин для EGFR. Для этого были выбраны три антитела (5А6, 3B6 и 15Н8), распознающие сайтассоциированные идиотопы на mAb 425, определяемые их CDR-последовательностями, как было проиллюстрировано посредством ингибирования связывания "очеловеченного" варианта mAb 425 с EGFR. Anti-idiotypic anti-mAb 425 mAbs were obtained in order to develop specific vaccines for EGFR. Three antibodies (5A6, 3B6 and 15H8) were selected for this, recognizing site-associated idiotopes on
Иммунологические и серологические анализы показали, что 5А6 и 3B6 действую как "внутренние образцы" антигена, индуцирующие гуморальный специфический ответ у мышей. Ab1-подобные антитела из Ab3-сыворотки связываются с мембраноассоциированным EGF-рецептором на клетках A331, и реагируют против sEGFR. Эта реакция полностью ингибируется обоими антителами 5А6 и 3B6 (независимо от антиидиотипа, используемого для иммуноанализа), что дает основание предположить, что 5A6 и 3B6 несут один и тот же "внутренний образ" EGFR. Иммунологические данные позволяют предположить о частичном идиотипическом сходстве с идиотипом "внутреннего образа" у антител 5А6 и 3B6 и с 425-паратопассоциированными идиотопом от 15H8; и кроме того, серологические анализы свидетельствуют о частичном ингибировании связывания анти-5А6 и анти-3B6 мышиного Ab3 с Ab2 или EGFR в присутствии 15H8. Иммунологические исследования выявили отсутствие биологического эффекта, то есть были индуцированы антитела IgM (реагирующие с клетками А331, но не распознающие sEGFR), которые, однако, не ингибировались антителом 15H8. Полученные результаты позволяют предположить, что в процессе иммунизации были активированы неспецифические клоны. Immunological and serological tests showed that 5A6 and 3B6 act as "internal samples" of the antigen, inducing a humoral specific response in mice. Ab1-like antibodies from Ab3 serum bind to the membrane-associated EGF receptor on A331 cells and react against sEGFR. This reaction is completely inhibited by both 5A6 and 3B6 antibodies (regardless of the anti-idiotype used for immunoassay), suggesting that 5A6 and 3B6 carry the same “internal image” of EGFR. Immunological data suggest a partial idiotypic similarity with the idiotype of the "internal image" in antibodies 5A6 and 3B6 and with 425-paratopassociated idiotope from 15H8; and in addition, serological analyzes indicate partial inhibition of the binding of anti-5A6 and anti-3B6 of mouse Ab3 to Ab2 or EGFR in the presence of 15H8. Immunological studies revealed the absence of a biological effect, that is, IgM antibodies (reacting with A331 cells but not recognizing sEGFR) were induced, which, however, were not inhibited by the 15H8 antibody. The results obtained suggest that non-specific clones were activated during the immunization process.
Для того, чтобы выяснить какая именно структура в антиидиотипах участвует в индуцировании ответа против EGFR, были проведены исследования структурной корреляции между идиотипами и антигеном. In order to find out exactly which structure in anti-idiotypes is involved in inducing a response against EGFR, studies of the structural correlation between idiotypes and antigen were conducted.
После секвенирования 5А6, 3B6 и 15H8, и сравнительной оценки аминокислотных гомологий по отношению к EGFR была обнаружена серия гомологичных и эквивалентных аминокислотных в антигенных и доступных областях CDR2H, CDR3H и CDR2L. Полученные данные совпадали с несколькими уже имеющимися сведениями, указывающими на присутствие гомологичных последовательностей в CDR-участках (или в смежных участках) VL - VH-цепей, которые участвуют в структурном формировании идиотипов, несущих "внутренний образ" антигена (31-33). Обнаружение того фактора, что различные последовательности в 5A6 и 3B6 образуют два антитела с идентичным иммунологическим действием, послужило поводом для проведения анализа в целях выявления роли гипервариабельных и каркасных областей в индуцировании Ab3-ответа и в формировании структуры "внутреннего образа" EGFR.After sequencing 5A6, 3B6, and 15H8, and comparatively evaluating the amino acid homology with respect to EGFR, a series of homologous and equivalent amino acids was found in the antigenic and accessible regions of CDR2H, CDR3H and CDR2L. The obtained data coincided with several existing data indicating the presence of homologous sequences in the CDR regions (or in adjacent regions) of V L - V H chains that are involved in the structural formation of idiotypes carrying an “internal image” of antigen (31-33) . The discovery that the different sequences in 5A6 and 3B6 form two antibodies with identical immunological effects was the reason for the analysis to identify the role of hypervariable and frame regions in the induction of the Ab3 response and in the formation of the structure of the “internal image” of EGFR.
Очевидно, что CDR2L, CDR2H и CDR3H от 5А6 и 3B6 участвуют в конструировании "внутреннего образа" антигена, поскольку именно в этих областях была обнаружена максимальная гомология и аминокислотное соответствие с внешним доменом EGFR. Трехмерная имитация, очевидно, играет очень важную роль, что подтверждается следующими полученными данными:
a) CDR21 от 5А6 и 3В6 являются различными, но индуцируют идентичный ответ против EGFR.It is obvious that CDR2L, CDR2H, and CDR3H from 5A6 and 3B6 are involved in the construction of the “internal image” of the antigen, since it was precisely in these areas that the maximum homology and amino acid correspondence with the external EGFR domain was found. Three-dimensional imitation obviously plays a very important role, which is confirmed by the following data:
a) CDR21s from 5A6 and 3B6 are different, but induce an identical response against EGFR.
b) Гомологичные остатки в CDR2H были обнаружены у неродственных антител, а поэтому, их участие в формировании структуры "внутреннего образа" не зависит от исключительной линейной идентичности. b) Homologous residues in CDR2H were detected in unrelated antibodies, and therefore, their participation in the formation of the structure of the "internal image" does not depend on exceptional linear identity.
с) Установленное сродство между CDR -участками и остатками 148-154, 437-452 и 492-502 в EGFR основано, главным образом, на эквивалентности аминокислот. c) The established affinity between the CDR regions and residues 148-154, 437-452 and 492-502 in the EGFR is based mainly on amino acid equivalence.
d) Эквивалентные аминокислоты локализуются именно в CDR, а не в других областях. d) Equivalent amino acids are localized precisely in the CDR, and not in other areas.
Идиотипические анализы нескольких семейств антител (анти-PC, антидекстрановых, антигалактановых, анти-N1P антител), проведенные Davie и др. (34), показали, что, в методе антигенной стимуляции, экспрессия идиотипов предусматривает минимум аминокислот из CDR2H и CDR3H, и объединение со специфическими L-цепями. Данные, полученные авторами настоящей заявки в результате проведения иммунологического анализа и секвенирования, позволяют предположить о продуцировании каскада Ab1-Ab2-Ab3 Id, ограниченного лимитированным набором областей, определенных 425-паратопом
и Ab2-паратопом. Наиболее важным фактом, заслуживающим внимания, является получение двух Ab2, а именно 5А6 и 3В6, обладающих идентичными иммунологическими свойствами, а следовательно, и идиотипическими детерминантами, происходящими от идентичных VH-цепей, соединенных с различными VL-цепями.The idiotypic analyzes of several families of antibodies (anti-PC, anti-dextran, anti-galactan, anti-N1P antibodies) carried out by Davie et al. (34) showed that, in the method of antigenic stimulation, expression of idiotypes involves a minimum of amino acids from CDR2H and CDR3H, and the combination with specific L chains. The data obtained by the authors of this application as a result of immunological analysis and sequencing suggest the production of the Ab1-Ab2-Ab3 Id cascade, limited to a limited set of regions defined by the 425 paratope
and Ab2-paratope. The most important fact that deserves attention is the preparation of two Ab2, namely, 5A6 and 3B6, which have identical immunological properties and, therefore, idiotypic determinants derived from identical V H chains connected to different V L chains.
Биологическая эффективность антиидиотипических антител коррелирует с их аффинностью в отношении набора идиотипических детерминант в восприимчивых видах. Анализ остатков, участвующих в образовании структуры "внутреннего образа" у антител 5А6 и 3В6, показал, что эти остатки находятся в более крупной антигенной области (остатки 100F 101 в H-цепи), имеющей, как было установлено, гомологию с другими мышиными антителами (из базы данных белков NBPF), но не с кроличьими антителами. Таким образом, структура "внутреннего образа" определяет идиотип, "усматриваемый" мышиной иммунной системой, но замаскированный в более крупной идиотипической области при введении кроликами. Эта гипотеза также подтверждается данными иммунологического анализа; а именно, титры антисыворотки Ab3 против 5A6- и 3B6-паратопов у кроликов выше, чем у мышей. Было также обнаружено, что в антителах человека (из базы данных NBPF) присутствуют гомологичные остатки 100F -101, что дает теоретическую основу для предположения о эффективности 5A6 и 3B6, несущих "внутренний образ" антигена, в человеческой системе. The biological effectiveness of anti-idiotypic antibodies correlates with their affinity for a set of idiotypic determinants in susceptible species. Analysis of the residues involved in the formation of the “internal image” structure of antibodies 5A6 and 3B6 showed that these residues are in a larger antigenic region (residues 100F 101 in the H chain), which has been found to be homologous to other murine antibodies ( from the NBPF protein database), but not with rabbit antibodies. Thus, the structure of the “internal image” determines the idiotype “seen” by the mouse immune system, but disguised in a larger idiotypic region when introduced by rabbits. This hypothesis is also supported by immunological analysis; namely, titers of Ab3 antiserum against 5A6 and 3B6 paratopes in rabbits are higher than in mice. It was also found that in human antibodies (from the NBPF database) homologous residues 100F -101 are present, which provides a theoretical basis for assuming the efficacy of 5A6 and 3B6 carrying the “internal image” of the antigen in the human system.
Эффективность антиидиотипических антител, несущих "внутренний образ" антигена, в качестве вакцин была проиллюстрирована на различных моделях животных и в клинических испытаниях. О получении антиидиотипов, распознающих анти-EGF антитела, недавно сообщил Snarez (Snarez E. et al., 1993, Immunologia 12:122), который получил 4 mAb, не несущих внутренний образ. 5A6 и 3B6 являются первыми антиидиотипическими mAb, несущими "внутренний образ" антигена, о которых стало известно, что они имитируют внешний домен EGP-рецептора человека. Биологические свойства mAb 425 позволили определить, что 5A6 и 3B6 имитируют лиганд-связывающий сайт EGF-рецептора. Серологические исследования, биологическая активность в моделях животных, и структурный анализ этих антиидиотипических антител позволяют сделать вывод о возможности их эффективного использования для вакцинации человека. The efficacy of anti-idiotypic antibodies carrying an “internal image” of antigen as vaccines has been illustrated in various animal models and in clinical trials. The receipt of anti-idiotypes recognizing anti-EGF antibodies was recently reported by Snarez (Snarez E. et al., 1993, Immunologia 12: 122), which received 4 mAbs that did not carry an internal image. 5A6 and 3B6 are the first anti-idiotypic mAb to carry an “internal image” of antigen, which have become known to mimic the external domain of a human EGP receptor. The biological properties of
6. Терапевтическое и диагностическое использование
Антитела настоящего изобретения могут быть введены человеку в терапевтических целях. Поэтому целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента по крайней мере одно антитело или его фрагмент, определенные в описании и формуле изобретения, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями.6. Therapeutic and diagnostic use
The antibodies of the present invention can be administered to humans for therapeutic purposes. Therefore, the aim of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing as an active ingredient at least one antibody or fragment thereof, as defined in the description and claims, in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
Антитела настоящего изобретения обычно вводят путем внутривенной инъекции или парентерально. В основном диапазон доз вводимых фрагментов антител широко варьируется так, чтобы данная доза была достаточной для достижения нужного подавления роста опухоли и опухоль-лизирующего эффекта. Эти дозы зависят от возраста, состояния здоровья, пола и тяжести заболевания пациента, и могут варьироваться от 0,1 до 200 мг/кг, а предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг на одну дозу в день, которая может быть введена в виде единой или дробной дозы, в течение одного или нескольких дней. Antibodies of the present invention are usually administered by intravenous injection or parenterally. Basically, the dose range of the introduced antibody fragments varies widely so that this dose is sufficient to achieve the desired suppression of tumor growth and tumor-lysing effect. These doses depend on the age, health status, gender and severity of the patient’s disease, and can vary from 0.1 to 200 mg / kg, and preferably from 0.1 to 100 mg / kg per dose per day, which can be administered in the form of a single or fractional dose, for one or several days.
Препараты для парентерального введения представляют собой стерильный водный или безводный раствор, суспензию или эмульсию. Примерами безводных растворителей, которые могут быть использованы в этих целях, являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло; и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат; а также другие известные растворители. Антитела настоящего изобретения могут быть использованы в качестве ингредиентов, входящих в состав композиции, содержащей физиологически приемлемый носитель. Примерами подходящих носителей являются физиологический раствор, фосфатно-буферный раствор (PBS), раствор Рингера или лактат-содержащий раствор Ригнера. В фармацевтических композициях могут также присутствовать консерванты, и другие добавки, такие как антибиотики, антиоксиданты, и хелатообразующие агенты. Preparations for parenteral administration are a sterile aqueous or anhydrous solution, suspension or emulsion. Examples of anhydrous solvents that can be used for this purpose are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil; and injectable organic esters such as ethyl oleate; as well as other known solvents. The antibodies of the present invention can be used as ingredients in a composition containing a physiologically acceptable carrier. Examples of suitable carriers are saline, phosphate buffered saline (PBS), ringer's solution, or lignate-containing rigner solution. Preservatives and other additives such as antibiotics, antioxidants, and chelating agents may also be present in pharmaceutical compositions.
Антитело (или, необязательно, его фрагмент) может быть также коньюгировано известными методами с цитокинами, такими как 1L-2, в целях поддержания их цитотоксичности. An antibody (or, optionally, a fragment thereof) can also be conjugated by known methods with cytokines, such as 1L-2, in order to maintain their cytotoxicity.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть использованы для лечения опухолей любых типов, включая меланомы, глиомы, и карциномы, а также опухоли системы кровообращения, и твердые опухоли. В целях диагностики, антитела могут быть коньюгированы, например, с непроницаемым для рентгеновских лучей красителем, либо они могут быть подвергнуты радиоактивному мечению. Предпочтительным способом мечения является метод иодирования. Для диагностических целей, предпочтительно, если антитело будет введено в виде F(ab')2- или scFv-фрагментов. Введение таких антител дает наилучшие результаты, поскольку в этом случае не нужно вводить поправку за фон.The pharmaceutical compositions of the present invention can be used to treat tumors of any type, including melanomas, gliomas, and carcinomas, as well as tumors of the circulatory system, and solid tumors. For diagnostic purposes, antibodies can be conjugated, for example, with an X-ray-tight dye, or they can be radiolabelled. The preferred labeling method is iodination. For diagnostic purposes, it is preferred that the antibody be introduced as F (ab ') 2 or scFv fragments. The introduction of such antibodies gives the best results, since in this case there is no need to introduce a correction for the background.
Пример (1). "Очеловеченное" mAb 425
Получение "очеловеченных" mAb 425 было описано в литературе (Kettleborough, C.A. et al., 1991, Protein Eng. 4: 773). Реконструированная форма mAb 425 содержит мышиные CDR, вставленные в человеческие вариабельные области при сохранении структуры антигенсвязывающего центра. Это было сделано для более точного определения локализации идиотипов 425, распознаваемых антителом Ab2.Example (1).
The preparation of humanized
Пример (2). Продуцирование антиидиотипических mAb против анти-EGFR mAb 425
Мышей Balb/c примировали путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции 75 мг очищенных mAb 425, конъюгированных с KLH (Sigma), фиксированных глутаральдегидом, и смешанных с CFA (Difco). Повторные инъекции животным вводили через 7, 14, 21, 28 и 38 дней после первой инъекции с использованием того же самого иммуногена, эмульгированного в IFA. Слияние клеток проводили через 3 дня после последней инъекции. Слияние клеток селезенки, взятых от иммунизированных мышей, с клетками HL1-Friendly-миеломы 653 с использованием полиэтиленгликоля 1450 (Boehringer Mannheim) осуществляли в соответствии с известной схемой (Carceller A., 1988, Sangre 33 (3):220). Гибридные клетки культивировали в 39% RPMI 1640, 39% гибридомной среде (Gibro), 20% фетальной телячьей сыворотке и 2% среде ГАТ. Положительные гибриды подвергали трехкратному клонированию путем серийного разведения.Example (2). The production of anti-idiotypic mAb against
Balb / c mice were primed by ip injection of 75 mg of purified 425 mAb conjugated to KLH (Sigma), fixed with glutaraldehyde and mixed with CFA (Difco). Repeated injections of the animals were administered 7, 14, 21, 28 and 38 days after the first injection using the same immunogen emulsified in IFA. Cell fusion was performed 3 days after the last injection. The fusion of spleen cells taken from immunized mice with HL1-Friendly myeloma cells 653 using polyethylene glycol 1450 (Boehringer Mannheim) was carried out in accordance with a known scheme (Carceller A., 1988, Sangre 33 (3): 220). Hybrid cells were cultured in 39% RPMI 1640, 39% hybridoma medium (Gibro), 20% fetal calf serum, and 2% GAT medium. Positive hybrids were triple cloned by serial dilution.
Пример (3). Обнаружение и анализ Ab2- активности
Антиидиотипические антитела обнаруживали с помощью "сандвич"-теста ELISA, проводимого с использованием полистироловых планшетов для микротитрования (Nunc, Maxisorb), покрытых 1 мг/мл очищенных mAb 425. Эти планшеты блокировали 2% BSA-PBS и неочищенные супернатанты или сыворотки, разведенные в 0,2% BSA-PBS, инкубировали в течение ночи при 4oC. После промывки PBS - 0,05% Твином 20, добавляли (1 ч, 37oC) биотинилированное mAb 425, полученное методом Harlow и Lane (см. выше), затем планшеты три раза промывали и добавляли HRPO-стрептавидин (Dako), разведенный в отношении 1/1000 в 2% ВSA-PBS. В качестве субстрата использовали раствор 3,3,5,5-тетраметилбензидина (Sigma). Оптическую плотность (ОП) измеряли при 450 нм.Example (3). Detection and analysis of Ab2 activity
Anti-idiotypic antibodies were detected using an ELISA sandwich test using polystyrene microtiter plates (Nunc, Maxisorb) coated with 1 mg / ml purified 425 mAb. These plates blocked 2% BSA-PBS and crude supernatants or serum diluted in 0.2% BSA-PBS, incubated overnight at 4 o C. After washing with PBS - 0.05% Tween 20, was added (1 h, 37 o C)
Пример (4). Константа диссоциации (KD) для антиидиотипических Ab2, 5A6, 3B6 и 15H8
Определение констант диссоциации осуществляли по методу Friguet (Friguet B. , et al. , 1985, J. Immunol Methods 77:306), а короче говоря, серийные разведения mAb 425 (2 • 10-8 М - 2 • 10-11) инкубировали с фиксированными концентрациями mAb2 до тех пор, пока не было достигнуто равновесие. Концентрацию свободного Ab2 измеряли посредством непрямого ELISA с использованием планшетов для микротитрования, покрытых 1 мг/мл mAb 425 и коньюгированных с HRPO кроличьих антимышиных иммуноглобулинов IgCI (Zymed).Example (4). Dissociation constant (KD) for anti-idiotypic Ab2, 5A6, 3B6 and 15H8
The determination of dissociation constants was carried out according to the Friguet method (Friguet B., et al., 1985, J. Immunol Methods 77: 306), and in short, serial dilutions of mAb 425 (2 • 10 -8 M - 2 • 10 -11 ) were incubated with fixed concentrations of mAb2 until equilibrium is reached. Free Ab2 concentration was measured by indirect ELISA using microtiter plates coated with 1 mg /
Пример (5). Очищенный внешний домен EGFR человека (sEGFR)
Очистка внешнего домена EGFR человека и иммуноаффинная хроматография EGFR, секретируемого клетками A431, описаны в литературе (Weber W. et al., 1984, J. Biol. Chem 259 (23):14631). Этот внешний домен EGFR использовали для подтверждения специфичности Ab3 методами непрямого и конкурентного анализов.Example (5). Purified External Human EGFR Domain (sEGFR)
Purification of the external domain of human EGFR and immuno-affinity chromatography of EGFR secreted by A431 cells are described in the literature (Weber W. et al., 1984, J. Biol. Chem 259 (23): 14631). This external EGFR domain was used to confirm Ab3 specificity by indirect and competitive assays.
Пример (6). Анализ для определения локализации идиотипов, распознаваемых в антителах mAb 425
Для определения локализации идиотипов 425, определенных антителами 5A6, 3B6 и 15H8, был проведен тест на способность этих антител ингибировать связывание mAb 425 с EGF-рецептором. Сначала этот тест осуществляли с использованием очищенных sEGFR. Неочищенные супернатанты и 50 мг/мл очищенных Ab2 смешивали со 125 нг mAb 425. После 4-часового инкубирования при 37oC, 425-активность анализировали с помощью ELISA с использованием планшетов для микротитрования, покрытых 2,5 мг/мл sEGFR. Планшеты три раза промывали смешанным раствором PBS-1% BSA, и добавляли конъюгированные с щелочной фосфатазой (AP) кроличьи антимышиные Ig (Dako). В качестве субстрата использовали 3,3,5,5-тетраметилбензидин, а ОП при 405 нм регистрировали планшет-ридером Tifertek Multiscan.Example (6). Analysis to determine the localization of idiotypes recognized in
To determine the localization of 425 idiotypes defined by antibodies 5A6, 3B6 and 15H8, a test was performed on the ability of these antibodies to inhibit the binding of
Эти анализы были дополнены сравнением кривых их ингибирования связывания, построенных для мышиных и реконструированных 425: 100 нг/мл мышиного или реконструированного 425 смешивали с равными объемами возрастающих концентраций (2 • 10-2 М - 2 • 10-1 М) очищенных Ab2, 5A6, 3B6, 15H8 или неродственных мышиных антител IgGI. Остаточную активность оценивали с помощью непрямого клеточного ELISA с использованием клеток A431, предварительно фиксированных 0,1% глутаральдегидом на планшетах для микротитрования (5 • 105 на лунку). После 60-минутного инкубирования при 37oC, клетки 3 раза промывали PBS - 1% BSA - 0,05% Твином 20. Для обнаружения связываемых AbI использовали конъюгированные с HRPO козьи антимышиные IgG2а (Dianova) и конъюгированные с HRPO козьи античеловеческие IgG соответственно, а в качестве субстрата использовали ортофенилдиамид (Sigma).These assays were supplemented by comparing their binding inhibition curves constructed for murine and reconstituted 425: 100 ng / ml murine or reconstituted 425 were mixed with equal volumes of increasing concentrations (2 • 10 -2 M - 2 • 10 -1 M) of purified Ab2, 5A6 , 3B6, 15H8 or unrelated mouse IgGI antibodies. Residual activity was evaluated by indirect cell ELISA using A431 cells pre-fixed with 0.1% glutaraldehyde on microtiter plates (5 x 10 5 per well). After 60 minutes of incubation at 37 ° C, the cells were washed 3 times with PBS - 1% BSA - 0.05% Tween 20. To detect AbI, HRPO conjugated goat anti-mouse IgG2a (Dianova) and HRPO conjugated goat anti-human IgG were used, respectively. and orthophenyl diamide (Sigma) was used as a substrate.
Пример (7). Продуцирование Ab3 в сингенных (мыши Balb/c), аллогенных (F6D2F1-мыши), и ксеногенных (крысы Wistar и кроликах NZW) системах, и обнаружение Ab3
Очищенные Ab сшивали с KLH (Calbiochem) при помощи глутаральдегида (Sigma), и эмульгировали полным или неполным адъювантом Фрейнда (CFA или IFA), и вводили животным на 0, 15, 30 и 60 день. В некоторых анализах для изучения стабильности Ab3-ответа проводили дополнительные инъекции через 8-12 месяцев. Каждое животное получало дозу 75 мг (мыши), 150 мг (крысы) и 300 мг (кролики) полных иммуноглобулинов путем внутрибрюшинной инокуляции (мыши) или подкожно в несколько различных участков (крысы и кролики). Контрольные группы получали те же самые дозы неспецифических (иррелевантных) KLH-конъюгированных мышиных иммуноглобулинов, либо только KLH.Example (7). Ab3 production in syngeneic (Balb / c mice), allogeneic (F6D2F1 mice), and xenogenic (Wistar rats and NZW rabbits) systems, and Ab3 detection
Purified Ab was crosslinked with KLH (Calbiochem) using glutaraldehyde (Sigma) and emulsified with Freund's complete or incomplete adjuvant (CFA or IFA), and was administered to animals on
Пробы крови брали сразу после каждой инъекции и через неделю после инъекции. В планшеты для микротитрования, предварительно покрытые 1 мг/мл Ab2 или другими мышиными иммуноглобулинами, добавляли серийные разведения сыворотки (в смеси PBS и 0,15% сухого молока). Связанные анти-антиидиотопы детектировали с использованием биотинилированных Ab2 (мышиной Ab3-сыворотке); конъюгированных с HRPO кроличьих антикрысиных иммуноглобулинов (Dako), не способных к перекрестной реакции с мышиными Ig; и конъюгированных с HRPO свиных антикроличьих Ig (Dako). Антиидиотипические и аллотипические антитела, вырабатываемые у крыс и кроликов, были элиминированы эктенсивной адсорбцией 1/50-1/100-разведенных сывороточных проб мышиными иммуноглобулинами IgGI после инкубирования в течение ночи при 4oC.Blood samples were taken immediately after each injection and one week after the injection. Serial dilutions of serum (in a mixture of PBS and 0.15% milk powder) were added to microtiter plates pre-coated with 1 mg / ml Ab2 or other mouse immunoglobulins. Bound anti-anti-idiotopes were detected using biotinylated Ab2 (mouse Ab3 serum); HRPO conjugated rabbit anti-rat immunoglobulins (Dako) incapable of cross-reacting with mouse Ig; and HRPO conjugated pork anti-rabbit Ig (Dako). Anti-idiotypic and allotypic antibodies produced in rats and rabbits were eliminated by extensive adsorption of 1 / 50-1 / 100-diluted serum samples from mouse IgGI immunoglobulins after incubation overnight at 4 o C.
Пример (8). Инкубирование Ab2 с Ab1 антисывороткой Ab3
Этот анализ осуществляли в целях выявления антител, реагирующих с теми участками Ab2, которые контактируют с паратопом mAb 425. Для этого 8-16 нг/мл очищенных 5A6, 3B6, 15H8 и FIII смешивали с серийными разведениями Ab3-содержащей сыворотки, и после инкубирования в течение ночи при 4oC оценивали активность Ab2 с помощью непрямого ELISA с использованием 1 мг/мл 425, нанесенных на полистироловые планшеты. Связанные Ab2 детектировали с использованием конъюгированных со щелочной фосфатазой (PA) кроличьих антимышиных IgGI (Zymed).Example (8). Incubation of Ab2 with Ab1 Antiserum Ab3
This analysis was performed in order to identify antibodies that react with those Ab2 sites that are in contact with the
Пример (9). Оценка идиотипической идентичности Ab2 посредством взаимной конкуренции за связывание с Ab3
Для определения идиотипической идентичности между всеми антиидиотипическими антителами Ab2 анализировали на ингибирование связывания антисыворотки Ab3 с Ab2-покрытыми планшетами. Серийные разведения крысиной антисыворотки Ab3 (10-3 - 10-5) тестировали на связывание с Ab2 в присутствии равного объема (1 мг/мл) Ab2 или контрольных mAb, предварительно инкубированных в течение ночи при 4oC.Example (9). Evaluation of the idiotypic identity of Ab2 through mutual competition for binding to Ab3
To determine the idiotypic identity between all anti-idiotypic antibodies, Ab2 was analyzed for inhibition of the binding of Ab3 antiserum to Ab2-coated plates. Serial dilutions of the rat antiserum Ab3 (10 -3 - 10 -5 ) were tested for binding to Ab2 in the presence of an equal volume (1 mg / ml) of Ab2 or control mAbs pre-incubated overnight at 4 o C.
Пример (10). Обнаружение анти-EGFR антител при Ab3-ответе
Мышиные, крысиные и кроличьи антисыворотки Ab3 анализировали на Ab1-подобную активность посредством клеточного ELISA с использованием клеток A431, как описано выше, либо посредством прямого ELISA с использованием sEGFR (2,5 мг/мл). В качестве "второго" антитела были использованы конъюгированные с HRPO кроличьи антимышиные Ig (Dako), кроличьи антикрысиные Ig (Dako) и свиные антикроличьи Ig (Dako) соответственно. Антитела к рецептору были также проанализированы путем прямого иммунофлуоресцентного анализа с использованием нефиксированных живых клеток A 431, культивированных в планшетах Terasaki.Example (10). Detection of anti-EGFR antibodies in the Ab3 response
Ab3 mouse, rat, and rabbit antisera were assayed for Ab1-like activity by means of a cell ELISA using A431 cells as described above, or by direct ELISA using sEGFR (2.5 mg / ml). HRPO conjugated rabbit anti-mouse Ig (Dako), rabbit anti-rat Ig (Dako), and pork anti-rabbit Ig (Dako), respectively, were used as the “second” antibody. Antibodies to the receptor were also analyzed by direct immunofluorescence analysis using unfixed live A 431 living cells cultured in Terasaki plates.
Пример (11). Ингибирование связывания EGFR и Ab3 антиидиотипами 5A6, 3B6 и 15H8
Рецептор и антиидиотипы были исследованы путем конкурентного анализа на наличие общих детерминант. 120 - 240 мг/мл 5A6, 3B6, 15H8 или неродственных IgGI инкубировали в течение ночи при 4oC с 1/25 - 1/50-разведениями антисыворотки Ab3 против EGFR, а затем с помощью ELISA, клеточного ELISA и прямого иммунофлуоресцентного анализа проводили тестирование на противорецепторную активность. Процент ингибирования вычисляли следующим образом:
Пример (12). Получение РНК и кДНК
Полную РНК выделяли из 5A6-, 3B6- и 15H8-гибридомных клеточных линий. Клетки, промытые PBS, суспендировали в растворе тиоцианата гуанидиния, после чего выделяли РНК методом ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия (см. Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18, 5294). Первую цепь кДНК синтезировали с использованием набора Pharmacia. Синтез осуществляли в 15 мкл с 5 мкг РНК в течение 1 ч при 37oC. Первую цепь кДНК использовали непосредственно для амплификации без предварительного клонирования.Example (11). Inhibition of EGFR and Ab3 binding by anti-idiotypes 5A6, 3B6, and 15H8
Receptor and anti-idiotypes were investigated by competitive analysis for the presence of common determinants. 120 - 240 mg / ml 5A6, 3B6, 15H8 or unrelated IgGI were incubated overnight at 4 ° C with 1/25 - 1/50-dilutions of Ab3 anti-EGFR antiserum, and then ELISA, cell ELISA and direct immunofluorescence analysis were performed testing for antieceptor activity. The percent inhibition was calculated as follows:
Example (12). Obtaining RNA and cDNA
Complete RNA was isolated from 5A6, 3B6, and 15H8 hybridoma cell lines. Cells washed with PBS were suspended in a solution of guanidinium thiocyanate, and RNA was isolated by ultracentrifugation in a gradient of cesium chloride (see Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18, 5294). The first cDNA strand was synthesized using the Pharmacia kit. The synthesis was carried out in 15 μl with 5 μg of RNA for 1 h at 37 o C. The first cDNA strand was used directly for amplification without prior cloning.
Пример (13). PCR-амплификация
Для амплификации копий вариабельных областей легкой цепи мышиного иммуноглобулина и вариабельных областей тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина использовали серию PCR - праймеров. 5'- Праймеры были сконструированы для гибридизации с лидерной последовательностью. Эти праймеры представляли собой смесь из 61 олигонуклеотида для вариабельного домена тяжелой цепи и из 405 олигонуклеотидов для вариабельного домена каппа-цепи. 3'-Праймеры были сконструированы для гибридизации с константной областью. Были использованы праймеры, являющиеся специфическими по отношению к IgGI и каппа-цепи мыши.Example (13). PCR amplification
A series of PCR primers were used to amplify copies of mouse immunoglobulin light chain variable regions and mouse immunoglobulin heavy chain variable regions. 5'- Primers were designed for hybridization with leader sequence. These primers were a mixture of 61 oligonucleotides for the variable domain of the heavy chain and 405 oligonucleotides for the variable domain of the kappa chain. 3'-Primers were designed for hybridization with a constant region. Primers were used that are specific for IgGI and mouse kappa chains.
Для осуществления амплификации с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, 25 мкл реакционной смеси, содержащей: 1 мкл гибрида "кДНК-РНК", 250 нМ соответствующей смеси 5'- и 3'-праймеров, 200 мМ каждого dNTP, 1 мМ MgCl2 (для легкой цепи), 2 мМ MgCl2 (для тяжелой цепи), и 1 ед. Tag - полимеразы (Cetus), покрывали сверху минеральным маслом, и подвергали гибридизации при температуре, начиная с 60oC и кончая температурой отжига 55oC. 1/10 PCR - реакции подвергали электрофорезу на 1%-ном агарозном геле TAE, а затем окрашивали этидийбромидом для визуализации полученных PGR - продуктов.To amplify using a thermostable DNA polymerase, 25 μl of a reaction mixture containing: 1 μl of cDNA-RNA hybrid, 250 nM of the corresponding mixture of 5'- and 3'-primers, 200 mM of each dNTP, 1 mM MgCl 2 (for light chain), 2 mm MgCl 2 (for the heavy chain), and 1 unit Tag polymerases (Cetus), topcoated with mineral oil, and hybridized at a temperature ranging from 60 ° C to an annealing temperature of 55 ° C. 1/10 PCR reaction was electrophoresed on a 1% TAE agarose gel, and then stained with ethidium bromide to visualize the resulting PGR products.
Пример (14). Молекулярное клонирование и секвенирование
1 мкл каждого PCR-продукта лигировали в вектор TA (Invitrogen, San Diego). ДНК-продукты реакции лигирования для областей VH- и VL-цепей каждого Ab2 трансформировали путем теплового шока в компетентные клетки E.coli TGI. В результате было создано шесть ДНК-библиотек: одна для вариабельных областей легкой цепи, а другие для вариабельных областей тяжелой цепи каждого mAb. Колонии отбирали на чашках с LB-средой, содержащей 100 мг/мл карбенициллина, и некоторые из них собирали с помощью зубочистки для последующего анализа. Положительные колонии идентифицировали путем PCR-скрининга или путем плазмидного гидролиза как описано Gussov (Gussov D., Clackson T., 1989. Nucleic Acids Res.,17: 4000). Двухцепочечную плазмидную ДНК для секвенирования получали (Wizarol preps., Promega Corp.) из трансформентов. Затем в соответствии с методикой Сэнгера проводили дидезокси-секвенирование путем обрыва цепи с использованием Tag-полимеразы (Sanger F. et al., 1977, Proc Nat Arad. Sci, USA 74: 5463). Праймеры, используемые в реакциях секвенирования, отжигали в TA-векторе,
Пример (15). Компьютерный анализ и сравнение последовательностей
Для определения вторичной структуры Ab2 и его доступных остатков использовали систему программного обеспечения DSSP (Sybil). Для предварительного определения антигенных участков по методу Kalaskar и Tongaonkar (Kalaskar A. S. et al., 1990, FEBS-Lett 276 (1-2):172) использовали программу ANTIGENIC. Гомологию между Ab2 и EGFR определяли по программе BESTFIT с использованием диска Gencore для таблицы соответствия символов. Сравниваемая последовательность EGFR человека была ранее описана в литературе (Vllrich et al., Nature 309: 418). Ab2 сравнивали с другими известными иммуноглобулинами с использованием банка данных Protein Identification Resourel (PIR ), составленный Национальным фондом по биомедицинским исследованиям National Riomedical Ressarch Fundation (NBRE)) и программы PBPSIS.Example (14). Molecular Cloning and Sequencing
1 μl of each PCR product was ligated into the TA vector (Invitrogen, San Diego). DNA products of the ligation reaction for the V H and V L chains of each Ab2 were transformed by heat shock into competent E. coli TGI cells. As a result, six DNA libraries were created: one for the variable regions of the light chain, and the other for the variable regions of the heavy chain of each mAb. Colonies were selected on plates with LB medium containing 100 mg / ml carbenicillin, and some of them were collected using a toothpick for subsequent analysis. Positive colonies were identified by PCR screening or by plasmid hydrolysis as described by Gussov (Gussov D., Clackson T., 1989. Nucleic Acids Res., 17: 4000). Double-stranded plasmid DNA for sequencing was obtained (Wizarol preps., Promega Corp.) from transformations. Then, in accordance with the Sanger technique, dideoxy sequencing was performed by chain termination using Tag polymerase (Sanger F. et al., 1977, Proc Nat Arad. Sci, USA 74: 5463). The primers used in the sequencing reactions were annealed in a TA vector,
Example (15). Computer analysis and sequence comparison
The DSSP software system (Sybil) was used to determine the secondary structure of Ab2 and its available residues. For preliminary determination of antigenic sites by the method of Kalaskar and Tongaonkar (Kalaskar AS et al., 1990, FEBS-Lett 276 (1-2): 172), the ANTIGENIC program was used. The homology between Ab2 and EGFR was determined using the BESTFIT program using a Gencore disc for a character matching table. A comparable human EGFR sequence has been previously described in the literature (Vllrich et al., Nature 309: 418). Ab2 was compared with other known immunoglobulins using the Protein Identification Resourel (PIR) data bank compiled by the National Riomedical Ressarch Fundation (NBRE) and PBPSIS.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95107967.2 | 1995-05-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96109830A RU96109830A (en) | 1998-08-10 |
| RU2172636C2 true RU2172636C2 (en) | 2001-08-27 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОСТЕРМАН Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. - М.: Наука, 1983, с.101-103. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU630592B2 (en) | Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies | |
| US20070036798A1 (en) | Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response | |
| DE69635843T2 (en) | MONOCLONARY ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODY 11D10 FROM THE MOUSE AND METHODS OF USE THEREOF | |
| AU710159B2 (en) | Anti-idiotypic antibodies which induce an immune response against epidermal growth factor receptor | |
| CA2163868C (en) | Monoclonal anti-idiotypic anti-ca125 antibodies and pharmaceutical compositions containing them | |
| US6433148B1 (en) | Monoclonal anti-idiotypic antibodies (AB2) and their uses | |
| RU2172636C2 (en) | Anti-idiotypical antibodies that induce immune response against epidermal growth factor receptor | |
| EP0745612B1 (en) | Anti-idiotypic antibodies which induce an immune response against epidermal growth factor receptor | |
| Bhattacharya-Chatterjee et al. | Anti-idiotype antibodies as potential therapeutic agents for human breast cancer | |
| US20090202560A1 (en) | Method for diagnosing efficacy of xenotypic antibody therapy | |
| Tosi et al. | Anti-idiotypic response to antigrowth factor receptor monoclonal antibodies | |
| EP1027375B1 (en) | Anti-idiotypic monoclonal antibodies, their use in the active immunotherapy of malignant tumors, and compositions containing them | |
| AU711270C (en) | Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response | |
| AU2003204088B2 (en) | Anti-idiotypic monoclonal antibodies, their use in the active immunotherapy of malignant tumors, and compositions containing them | |
| WO1989011537A1 (en) | Antibodies | |
| MXPA98009586A (en) | Method and composition for the reconformation of multi-peptide antigens to start an animal response | |
| NZ503032A (en) | Use of a binding agent to reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response |