RU2167425C2

RU2167425C2 - Method for identifying proteins

Info

Publication number: RU2167425C2
Application number: RU98113214A
Authority: RU
Inventors: И.Ю. Малышев
Original assignee: Малышев Игорь Юрьевич
Priority date: 1998-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2001-05-20
Also published as: WO2000004385A1; AU1514499A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves dividing nitrocellulose membrane into cells (to 1000) sized 3-5 mm. The cells are marked in to-dimensional coordinate space. Known antibodies to various proteins are put in the middle of every cell, one antibody kind in a cell, and fixed. The membrane being washed, proteins labeled in samples are put on the membrane. The preparation is hold during 1-2 h and the membrane is washed to remove non-bound proteins. Protein content is determined using radiography method. Protein is identified by its cell number. EFFECT: enhanced accuracy of method. 7 cl

Description

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение в различных отраслях промышленности и науки. The invention relates to biology, in particular to biochemistry and molecular biology, and may find application in various industries and science.

Широко известны различные методы разделения белков, основанные на различии молекул по размеру: это диализ, ультрафильтрация, центрифугирование и гель-хроматография, электрофорез и ионообменная хроматография. Various methods for separating proteins based on the difference in molecular size are widely known: dialysis, ultrafiltration, centrifugation and gel chromatography, electrophoresis and ion exchange chromatography.

На биоселективном взаимодействии с лигандами, фиксированными на носителе, основано разделение белков с помощью афинной хроматографии. Взаимодействие белка с лигандом облегчается встраиванием между лигандом и матрицей гибкой "ножки". В качестве матрицы применяются агароза, пористое стекло, целлюлоза, сшитые декстрины и др. Афинная хроматография нашла широкое применение при разделении белков (Х.- Д. Якубке, Х.Ешкайт "Аминокислоты. Пептиды. Белки", М., Мир, 1985, с. 345-356). The separation of proteins by affinity chromatography is based on bioselective interaction with ligands fixed on a carrier. The interaction of the protein with the ligand is facilitated by the incorporation of a flexible “leg” between the ligand and the matrix. Agarose, porous glass, cellulose, crosslinked dextrins, etc. are used as matrices. Affinity chromatography has been widely used in protein separation (H.-J. Jakubke, H. Eschert “Amino acids. Peptides. Proteins”, M., Mir, 1985, p. 345-356).

Наиболее близким к изобретению является способ определения белков с использованием иммобилизованных антител против данного белка, включающий иммобилизацию антител на сорбенте, отмывку сорбента, забивку мест неспецифического связывания на сорбенте, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные на сорбенте антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку сорбента от несвязавшихся белков и идентификацию белков методом радиографии (Т. Чард. Радиоиммунологические методы. М., Мир, 1981, с. 126-127). Closest to the invention is a method for determining proteins using immobilized antibodies against this protein, including immobilizing antibodies on a sorbent, washing the sorbent, blocking sites of nonspecific binding on the sorbent, applying a sample containing pre-labeled proteins to antibodies immobilized on the sorbent, holding for a while sufficient for the interaction of antibodies with proteins, washing the sorbent from unbound proteins and identification of proteins by radiography (T. Chard. Radioimmunologists RP G methods. M., Mir, 1981, p. 126-127).

Недостатками указанных способов являются сложность осуществления, использование дорогостоящего стационарного оборудования и, соответственно, невозможность проведения исследований в полевых условиях, в условиях космического полета и малых клиниках, использование большого количества разных реактивов, включая вредные и канцерогенные, ограниченная возможность одновременного определения содержания разных белков в одной пробе. The disadvantages of these methods are the difficulty of implementation, the use of expensive stationary equipment and, accordingly, the inability to conduct research in the field, in space flight and small clinics, the use of a large number of different reagents, including harmful and carcinogenic ones, the limited ability to simultaneously determine the content of different proteins in one sample.

Техническим результатом заявленного способа является устранение вышеуказанных недостатков и возможность определять одновременно большое количество разных белков (до 1000 видов) в одной пробе при одновременном обеспечении количественного сравнения содержания белков в пробе и сохранения наглядного визуального результата анализа на длительное время. The technical result of the claimed method is the elimination of the above disadvantages and the ability to simultaneously determine a large number of different proteins (up to 1000 species) in one sample while providing a quantitative comparison of the protein content in the sample and maintaining a visual visual analysis result for a long time.

Для достижения указанного технического результата в способе определения белков, включающем иммобилизацию антител, отмывку, забивку мест неспецифического связывания, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку от несвязавшихся белков и идентификацию белков, иммобилизацию антител осуществляют на мембране, которую предварительно разбивают на ячейки, и в середину каждой ячейки наносят антитела к разным белкам по одному виду антител в ячейку, после отмывки мембраны, забивки мест неспецифического связывания на мембране, нанесения пробы на иммобилизованные на мембране антитела, выдержки и отмывки мембраны от несвязавшихся белков определяют количество белка, связавшегося с каждым видом антител. To achieve the specified technical result in a method for determining proteins, including immobilization of antibodies, washing, blocking sites of non-specific binding, applying a sample containing pre-labeled proteins to immobilized antibodies, holding for a time sufficient for the antibodies to interact with proteins, washing from unbound proteins and the identification of proteins, the immobilization of antibodies is carried out on the membrane, which is previously divided into cells, and antibodies to different proteins are applied in the middle of each cell For one type of antibody per cell, after washing the membrane, clogging the sites of non-specific binding on the membrane, applying a sample to antibodies immobilized on the membrane, holding and washing the membrane from unbound proteins determine the amount of protein bound to each type of antibody.

Кроме того, идентификацию белков осуществляют по антителу в соответствующей ячейке, а количество белка в ячейке могут определять методом радиографии или хемилюминесцентным методом. In addition, proteins are identified by the antibody in the corresponding cell, and the amount of protein in the cell can be determined by radiography or chemiluminescent.

Кроме того, можно использовать нитроцеллюлозную мембрану, а в качестве жидкости для забивки мест неспецифического связывания используют молоко порошкообразное 5%-ной концентрации или TWIN-20. In addition, a nitrocellulose membrane can be used, and milk powder 5% concentration or TWIN-20 is used as a liquid to clog nonspecific binding sites.

Помимо нитроцеллюлозной мембраны можно также использовать и другие мембраны для иммобилизации белков, например активированную бумагу или активированный нейлон. In addition to the nitrocellulose membrane, other membranes can also be used to immobilize proteins, for example, activated paper or activated nylon.

Сущность изобретения поясняется на примере. The invention is illustrated by example.

Пример. Способ осуществляется следующим образом. Вся площадь нитроцеллюлозной мембраны разбивается на ячейки, например, размером 3-5 мм. Количество ячеек на одной мембране может достигать 1000 и выше. Каждая ячейка маркируется с помощью цифровых и буквенных координат. В середину каждой ячейки наносят и иммобилизуют антитела к разным белкам по одному виду антител в одну ячейку. Диаметр пятна нанесенных антител составляет ~ 3 мм. После этого осуществляют забивку мест неспецифического связывания на мембране порошкообразным молоком 5%-ной концентрации или TWIN- 20. На следующем этапе на иммобилизованные антитела наносят пробы, содержащие меченые радиоактивной меткой белки. Далее, например, через 1-2 часа, в течение которых происходит взаимодействие белков со специфическими антителами, производят отмывку мембраны от несвязавшихся белков пробы. На мембране в конкретной ячейке остаются только белки, связавшиеся со своими антителами. Дальше определяют количество белка, связавшегося с каждым типом антител, с помощью стандартных методов подсчета радиоактивности счетчиком или радиографии на рентгеновской пленке, накладываемой на мембрану, с последующим денситометрированием. Example. The method is as follows. The entire area of the nitrocellulose membrane is divided into cells, for example, 3-5 mm in size. The number of cells on one membrane can reach 1000 and higher. Each cell is marked using numeric and alphabetic coordinates. In the middle of each cell, antibodies to different proteins are applied and immobilized, one type of antibody per cell. The spot diameter of the applied antibodies is ~ 3 mm. After this, nonspecific binding sites on the membrane are clogged with powdered milk of 5% concentration or TWIN-20. In the next step, samples containing radiolabeled proteins are applied to immobilized antibodies. Further, for example, after 1-2 hours, during which the interaction of proteins with specific antibodies occurs, the membrane is washed from unbound sample proteins. Only proteins bound to their antibodies remain on the membrane in a particular cell. Next, determine the amount of protein bound to each type of antibody using standard methods for counting radioactivity by a counter or radiography on an x-ray film applied to the membrane, followed by densitometry.

В случае использования люминесцентной метки накладывают на мембрану пленку и определяют количество белка хемилюминесцентным методом. In the case of using a luminescent label, a film is applied to the membrane and the amount of protein is determined by the chemiluminescent method.

Заявленный способ обеспечивает удобство документирования результатов анализа в виде мембраны с наложенным на нее регистрирующим покрытием (пленкой) с пятнами, параметры которых (размеры, плотность) позволяют осуществить количественное сравнение содержания различных белков в пробе. The claimed method provides the convenience of documenting the results of the analysis in the form of a membrane with a recording coating (film) applied to it with spots, the parameters of which (dimensions, density) allow a quantitative comparison of the content of various proteins in the sample.

Claims

1. The method of determining proteins, including immobilization of antibodies, washing, blocking sites of non-specific binding, applying a sample containing pre-labeled proteins to immobilized antibodies, exposure for a time sufficient for the interaction of antibodies with proteins, washing from unbound proteins and identification of proteins, different the fact that the immobilization of antibodies is carried out on the membrane, which is previously divided into cells, and in the middle of each cell is applied antibodies to different proteins, one type of antibody in the cell Ku, after washing the membrane, clogging places nonspecific binding on the membrane, sample application on the antibodies immobilized on the membrane, soaking and washing unbound proteins from the membrane is determined amount of protein bound to each antibody species.

2. The method according to claim 1, characterized in that the identification of the proteins is carried out by the antibody in the corresponding cell.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the amount of protein in the cell is determined by radiography.

4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the nitrocellulose membrane is used.

5. The method according to PP. 1 to 4, characterized in that as a liquid for nonspecific binding using milk powder 5% concentration or TWIN-20.

6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that the membrane is divided into cells with a size of 3-5 mm and marked in two coordinates.

7. The method according to PP.1 to 6, characterized in that the specified exposure is carried out for 1 to 2 hours