RU2165458C1

RU2165458C1 - Method of assay of irreversible choline esterase inhibitors in water and aqueous extracts

Info

Publication number: RU2165458C1
Application number: RU99121125A
Authority: RU
Inventors: Э.Т. Гайнуллина; С.А. Еремин; И.В. Рыбальченко; С.Б. Рыжиков; В.Ф. Таранченко
Original assignee: Гайнуллина Эра Тазетдиновна; Еремин Сергей Александрович; Рыбальченко Игорь Владимирович; Рыжиков Сергей Борисович; Таранченко Виктор Федорович
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2001-04-20

Abstract

FIELD: biochemistry, immunology, ecology. SUBSTANCE: method involves measurement of fluorescence intensity of complex formed by choline esterase with its reversible inhibitor photoluminophore in buffer medium in the presence and absence of water sample to be analyzed (aqueous extract). Analyte content in analyzed sample is determined by preliminary established dependence of fluorescence intensity of complex formed by choline esterase with its reversible inhibitor photoluminophore from concentration of irreversible inhibitor of choline esterase. Use of substrateless express-method of analysis of irreversible inhibitors of choline esterase in water and aqueous extracts do not require preliminary sample preparing and realized in monophase system that ensures to determine analyte concentration in the sample for some minutes. Invention can be used for environment protection. EFFECT: improved, rapid and simplified method of assay. 2 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды. The invention relates to the field of environmental pollution control.

Известен селективный иммуноферментный способ определения ингибитора холинэстеразы, предусматривающий последовательный синтез гаптена (соединения, близкого по структуре к аналиту), его конъюгата с белком для получения антигена с последующей иммунизацией полученным антигеном животных и выделением антител [1]. Данный способ является аналогом предлагаемого. A selective enzyme-linked immunosorbent method for determining a cholinesterase inhibitor is known, which involves the sequential synthesis of a hapten (a compound similar in structure to an analyte), its conjugate with a protein to produce antigen, followed by immunization with an animal antigen and isolation of antibodies [1]. This method is an analogue of the proposed.

Способ-аналог дорогой, трудоемкий, для его осуществления необходимо несколько часов. The analogue method is expensive, time-consuming, for its implementation it takes several hours.

Более близким к предлагаемому является способ определения ингибитора холинэстеразы, предусматривающий измерение степени поляризации флуоресценции комплекса антитела с трассером (соединения гаптена с флуоресцентной меткой) в отсутствии и присутствии анализируемой пробы [2]. Этот способ принят нами в качестве прототипа. Closer to the proposed one is a method for determining a cholinesterase inhibitor, comprising measuring the degree of polarization of the fluorescence of an antibody complex with a tracer (hapten compound with a fluorescent label) in the absence and presence of an analyzed sample [2]. This method is accepted by us as a prototype.

Способ-прототип, как и способ-аналог предусматривает синтез гаптена, антигена на его основе, иммунизацию животных, получение антител и т.д., то есть также является дорогим и сложным в исполнении. Стоимость анализа по способу-прототипу возрастает в связи с необходимостью использования моноклональных антител, поскольку при использовании поликлональных антител способ малоспецифичен. Однако даже использование моноклональных антител не обеспечивает высокую селективность анализа. The prototype method, as well as the analogue method, involves the synthesis of hapten, antigen based on it, immunization of animals, production of antibodies, etc., that is, it is also expensive and difficult to perform. The cost of the analysis according to the prototype method increases due to the need to use monoclonal antibodies, since when using polyclonal antibodies, the method is not very specific. However, even the use of monoclonal antibodies does not provide a high selectivity analysis.

Указанные выше недостатки ведут к увеличению как трудоемкости, так и стоимости анализа. Предлагаемое решение направлено на уменьшение стоимости и времени, необходимого на проведение анализа, а также на упрощение технологии анализа. The above disadvantages lead to an increase in both the complexity and cost of analysis. The proposed solution is aimed at reducing the cost and time required to conduct the analysis, as well as to simplify the analysis technology.

Технический результата достигается тем, что в предлагаемом экспресс-способе вместо комплекса антитела с трейсером используется комплекс холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором. The technical result is achieved by the fact that in the proposed express method, instead of the antibody complex with the tracer, a cholinesterase complex with a reversible photoluminophore inhibitor is used.

Нами установлено, что интенсивность флуоресценции фермент-ингибиторного комплекса холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором снижается в присутствии в анализируемой пробе необратимого ингибитора холинэстеразы. Аналогичный эффект наблюдается и при воздействии необратимого ингибитора на комплекс ацетилхолинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором. Однако использование в качестве реагента ацетилхолинэстеразы в данном случае не представляется целесообразным по причине низкой стабильности ее растворов. We found that the fluorescence intensity of the cholinesterase enzyme-inhibitor complex with a reversible photoluminophore inhibitor decreases in the presence of an irreversible cholinesterase inhibitor in the analyzed sample. A similar effect is observed when an irreversible inhibitor acts on a complex of acetylcholinesterase with a reversible photoluminophore inhibitor. However, the use of acetylcholinesterase as a reagent in this case does not seem appropriate due to the low stability of its solutions.

В качестве обратимых ингибиторов-фотолюминофоров в составе комплекса с холинэстеразой нами исследованы этакридин, аминостигмин, физостигмин и др. При наличии в пробе в качестве аналита необратимого ингибитора (I_ан) будет наблюдаться снижение интенсивности флуоресценции в результате образования фермент-ингибиторного комплекса с ингибитором-аналитом в соответствии со следующей системой уравнений:
E+I_об ⇄ EI_об; (1)
E+l_ан ⇄ EI_ан (2)
Холинэстераза отличается высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к ингибиторам. Как известно, скорость образования фермент-ингибиторного комплекса холинэстераза-ингибитор очень высока, равновесие в такой системе устанавливается за доли секунды. При этом с увеличением токсичности ингибитора холинэстеразы возрастает скорость образования фермент-ингибиторного комплекса. Особенно чувствителен предлагаемый способ по отношению к необратимым ингибиторам холинэстеразы, поскольку по мере связывания фермента в соответствии с уравнением
E + I_необ ⇄ [EI_необ--->EI_необ + p_i (3)
будет иметь место диссоциация флуоресцирующего комплекса холинэстеразы с обратимым ингибитором-фотолюминофором и равновесие в системе будет смещаться в сторону образования комплекса холинэстеразы с ингибитором-аналитом, что приведет к снижению интенсивности флуоресценции реакционного раствора.We studied ethacridine, aminostigmine, physostigmine, and others as reversible photoluminophore inhibitors in the complex with cholinesterase. If there is an irreversible inhibitor in the sample as an analyte (I _en ), a decrease in the fluorescence intensity as a result of the formation of an enzyme-inhibitor complex with an analyte inhibitor in accordance with the following system of equations:
E + I _about ⇄ EI _about ; (1)
E + l _en ⇄ EI _en (2)
Cholinesterase is highly sensitive and specific for inhibitors. As you know, the rate of formation of the enzyme-inhibitor complex cholinesterase-inhibitor is very high, the equilibrium in such a system is established in a split second. Moreover, with an increase in the toxicity of the cholinesterase inhibitor, the rate of formation of the enzyme-inhibitor complex increases. The proposed method is especially sensitive to irreversible cholinesterase inhibitors, because as the enzyme is bound in accordance with the equation
_Optionally E + I ⇄ [EI _optionally ---> EI _optionally + p _i (3)
there will be a dissociation of the fluorescent cholinesterase complex with a reversible photoluminophore inhibitor and the equilibrium in the system will shift towards the formation of a cholinesterase complex with an analyte inhibitor, which will lead to a decrease in the fluorescence intensity of the reaction solution.

Пример 1
Определение параоксона
Реактивы и приборы
Для работы использовались следующие реактивы и препараты: Параоксон, получен от фирмы "Сигма" (ФРГ); фармакопейный препарат этакридин; препараты холинэстеразы, получены от Института вакцин и сывороток им. Мечникова, г. Пермь.Example 1
Paraoxon determination
Reagents and devices
The following reagents and preparations were used for the work: Paraoxon, obtained from Sigma (Germany); pharmacopoeial drug ethacridine; cholinesterase preparations obtained from the Institute of Vaccines and Serums named after Mechnikov, Perm.

Исследования проводили на спектрофлуориметре фирмы Hitachi при длине возбуждающего света λ_ex 360 нм. Регистрация аналитического эффекта проводилась при длине волны 510 нм (эта длина волны соответствует максимуму интенсивности флуоресценции этакридина) при 20^oC.The studies were carried out on a Hitachi spectrofluorimeter with an excitation light length λ _ex 360 nm. Registration of the analytical effect was carried out at a wavelength of 510 nm (this wavelength corresponds to the maximum fluorescence intensity of ethacridine) at 20 ^o C.

Количественные соотношения реагентов выбраны таким образом, чтобы вся холинэстераза была связана комплекс с этакридином, не допуская при этом его значительного избытка. The quantitative ratios of the reagents were selected in such a way that all cholinesterase was bound to ethacridine complex, while avoiding its significant excess.

Рабочие растворы
1. Фосфатный буфер; pH 7,5; 0,07 моль/л
2. Раствор холинэстеразы в фосфатном буфере; 1,25 AE/мл
3. Раствор этакридина; 0,05 мг/мл
4. Раствор параоксона; 1·10^-4 мг/мл
Ход анализа
В пробирку вносили 0,4 мл раствора холинэстеразы и 0,1 мл раствора этакридина, реакционный раствор перемешивали и вносили 2 мл анализируемого раствора параоксона (в случае контрольного опыта, вместо анализируемой пробы вносили 2 мл дистиллированной воды). Реакционный раствор перемешивали, переливали в кювету и регистрировали интенсивность флуоресценции реакционного раствора.Working solutions
1. Phosphate buffer; pH 7.5; 0.07 mol / l
2. A solution of cholinesterase in phosphate buffer; 1.25 AE / ml
3. Ethacridine solution; 0.05 mg / ml
4. A solution of paraoxon; 1 · 10 ^-4 mg / ml
Analysis progress
0.4 ml of cholinesterase solution and 0.1 ml of ethacridine solution were added to the test tube, the reaction solution was stirred and 2 ml of the analyzed solution of paraoxone were added (in the case of the control experiment, 2 ml of distilled water was added instead of the analyzed sample). The reaction solution was stirred, poured into a cuvette and the fluorescence intensity of the reaction solution was recorded.

Во всех опытах интенсивность флуоресценции реакционного раствора возрастала мгновенно и последующие 5 мин изменение интенсивности флуоресценции не наблюдалось. Интенсивность флуоресценции оценивалась в условных единицах, за 100% принята исходная интенсивность комплекса холинэстеразы с этакридином. In all experiments, the fluorescence intensity of the reaction solution increased instantly and no change in fluorescence intensity was observed for the next 5 min. The fluorescence intensity was estimated in arbitrary units, the initial intensity of the complex of cholinesterase with ethacridine was taken as 100%.

Результаты анализа приведены ниже в табл. 1. The results of the analysis are given below in table. 1.

Приведенные в таблице данные позволяют сделать заключение о низкой погрешности результатов анализа предлагаемым бессубстратным способом. Предлагаемый экспресс-способ осуществляется в однофазной системе, не требует предварительной пробоподготовки, прост в исполнении, позволяет определять концентрацию аналита в течение нескольких минут. The data presented in the table allow us to make a conclusion about the low error of the analysis results by the proposed non-neutral method. The proposed express method is carried out in a single-phase system, does not require preliminary sample preparation, it is simple to perform, it allows determining the analyte concentration within several minutes.

Таким образом, совокупность существенных признаков предлагаемого решения (использование холинэстеразы вместо антитела и обратимого ингибитора-фотолюминофора) обеспечивает достижение заявленного технического результата: уменьшение стоимости и времени, необходимого для анализа, а также упрощение технологии анализа. Thus, the set of essential features of the proposed solution (using cholinesterase instead of antibodies and a reversible photoluminophore inhibitor) ensures the achievement of the claimed technical result: reducing the cost and time required for analysis, as well as simplifying the analysis technology.

В табл. 2 сопоставлены существенные признаки способа-прототипа и предлагаемого способа. In the table. 2, the essential features of the prototype method and the proposed method are compared.

Использованные литературные источники
1. Jean-Mare Grognet et al. Production and characterization of antibodies directed against organophosphorus nerve agent VX. Arch. Toxicol. 1993, c. 67, 66-77.Used literature
1. Jean-Mare Grognet et al. Production and characterization of antibodies directed against organophosphorus nerve agent VX. Arch. Toxicol. 1993, c. 67, 66-77.

2. Уильямз А. Т.Р. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ// Новые методы иммуноанализа/ Под редакцией Коллинз У.П. М.:Мир, c. 1991.138. 2. Williams A. T.R. Polarization fluorescence immunoassay // New methods of immunoassay / Edited by Collins U.P. M.: World, c. 1991.138.

Claims

A method for determining irreversible cholinesterase inhibitors in water and aqueous extracts, comprising measuring the fluorescence intensity of a protein complex with a photoluminophore in a buffer medium in the presence and absence of an analyzed water sample (aqueous extract), characterized in that a complex of cholinesterase with its complex is used as a protein complex with a photoluminophore a reversible photoluminophore inhibitor, and the analyte content in the analyzed sample is determined by the previously established dependence of the fluorescence intensity of the comp eksa cholinesterase with its reversible inhibitor concentration of photoluminescent phosphor-irreversible cholinesterase inhibitor.