RU2160780C1

RU2160780C1 - Strain streptomyces avermitilis pbm 0004 producing oligomycins

Info

Publication number: RU2160780C1
Application number: RU99110493A
Authority: RU
Inventors: Н.Е. Березкина; В.А. Мосин; В.А. Дриняев; Е.Б. Кругляк
Original assignee: Мосин Владимир Александрович; Дриняев Виктор Антонович
Priority date: 1999-05-17
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2000-12-20

Abstract

FIELD: biotechnology and microbiology. SUBSTANCE: strain is obtained from population of strain Streptomyces avermitilis 003PBM by way of natural selection of variant according to oligomycin formation feature. Strain produces on average 1000 mcg/ml oligomycins that can be utilized in biological studies as oxidase phosphatation inhibitor. EFFECT: expanded biochemical possibilities. 2 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к получению биологически активных веществ микробиологическим путем, а именно к производству препаратов, применяемых в биологических исследованиях в качестве ингибиторов оксидазного фосфатирования. The invention relates to the production of biologically active substances by a microbiological method, namely the production of drugs used in biological research as oxidase phosphate inhibitors.

Предшествующий уровень техники
Известны штаммы Streptomyces avermitilis, продуцирующие помимо основного целевого продукта (авермектинов) и некоторое количество олигомицинов, в частности штамм S. avermitilis ВКМАс 1301 (Дриняев В.А., Кругляк Е.Б. и др., Streptomyces avermitilis - продуцент олигомицина. Биотехнология, 1994, N 7, с. 30-34) или S. avermitilis АТСС 31272 (Onishi J.C., Miller T.W. The lack ofantifungal activity by avermectin B_la. The journal of antibiotics. 1985, XXXVIII, 11, p. 1568-1572). Однако продуцируемые количества олигомицинов весьма малы для широкого практического использования, например, в биологических исследованиях.State of the art
Known strains of Streptomyces avermitilis, producing in addition to the main target product (avermectins) and a certain amount of oligomycin, in particular strain S. avermitilis VKMAc 1301 (Drinyaev V.A., Kruglyak E.B. et al., Streptomyces avermitilis - producer of oligomycin. Biotechnology, 1994, No. 7, pp. 30-34) or S. avermitilis ATCC 31272 (Onishi JC, Miller TW The lack of antifungal activity by avermectin B _la . The journal of antibiotics. 1985, XXXVIII, 11, p. 1568-1572). However, the produced amounts of oligomycins are very small for wide practical use, for example, in biological studies.

Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание штамма, Streptomyces avermitilis, продуцирующего олигомицины А (85-90%) и С (10-15%) в более значительных количествах. Предлагаемый штамм Streptomyces avermitilis 0004ФБМ получен из популяции штамма Streptomyces avermitilis 003ФБМ путем естественного отбора вариантов по признаку образования олигомицинов (фиг. 1). Штамм продуцирует в среднем 1000 мкг/мл олигомицинов.SUMMARY OF THE INVENTION
The aim of the present invention is to provide a strain, Streptomyces avermitilis, producing oligomycin A (85-90%) and C (10-15%) in more significant quantities. The proposed strain of Streptomyces avermitilis 0004 FBM obtained from a population of strain Streptomyces avermitilis 003 FBM by natural selection of options based on the formation of oligomycin (Fig. 1). The strain produces an average of 1000 μg / ml oligomycin.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками. The resulting strain is characterized by the following cultural, morphological and physiological characteristics.

Микроморфологические признаки штамма. Micromorphological signs of the strain.

Спороносцы образуются в виде правильных спиралей (более восьми витков). Spore-carriers form in the form of regular spirals (more than eight turns).

Макроморфологические и культуральные признаки. Macromorphological and cultural characteristics.

На 2%-ном глюкозо-картофельном агаре на 14-21 день роста при 28^oC, pH 6,8-7,2 образуются колонии диаметром 10-12 мм с серым воздушным и светло-желтым субстратным мицелием. Край колоний неровный.On 2% glucose-potato agar on days 14-21 of growth at 28 ^° C, pH 6.8-7.2, colonies 10-12 mm in diameter are formed with gray air and light yellow substrate mycelium. The edge of the colonies is uneven.

Данные о росте культуры на различных органических и синтетических агаризованных средах представлены в таблице 1. Data on the growth of culture on various organic and synthetic agarized media are presented in table 1.

Сведения о физиолого-биохимических признаках Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 приведены в таблице 2, где использованы следующие обозначения: (+++) - обильный вегетативный рост; (++) - умеренный рост; (+) - слабый рост; (-) - отсутствие роста. Information on the physiological and biochemical characteristics of Streptomyces avermitilis FBM 0004 are given in table 2, where the following notation is used: (+++) - abundant vegetative growth; (++) - moderate growth; (+) - weak growth; (-) - lack of growth.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Споры штамма Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 выращивали на овсяном агаре в течение 10 суток при 28^oC. Кусочек агаровой среды (≈ 1 см²) со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержавшие 75 мл посевной среды следующего состава, %: глюкоза - 4,0; соевая мука - 0,6; кукурузный экстракт - 0,3; сухие дрожжи - 1,0; CaCO₃ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,06. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,5 ати 30 минут и вносили в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизовали при 1,2 ати 40 минут. Значение pH до стерилизации 6,5-6,8.Information confirming the possibility of carrying out the invention
Example 1
Spores of Streptomyces avermitilis strain FBM 0004 were grown on oat agar for 10 days at 28 ^o C. A piece of agar medium (≈ 1 cm ² ) with spores was introduced into rocking flasks with a capacity of 750 ml containing 75 ml of inoculum medium of the following composition,%: glucose - 4.0; soy flour - 0.6; corn extract - 0.3; dry yeast - 1.0; CaCO ₃ - 0.1; K ₂ HPO ₄ - 0.06. Glucose was sterilized separately at 0.5 to 30 minutes and introduced into the flasks at the time of inoculation. The remaining components were sterilized at 1.2 at 40 minutes. The pH value before sterilization is 6.5-6.8.

Колбы устанавливали на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при 28^oC в течение 28 часов. Затем инокулят в количестве 5% переносили в колбы с ферментационной средой следующего состава, %: глюкоза - 7,0; кукурузный экстракт - 0,3; соевая мука - 0,9; сухие дрожжи - 1,0; вода водопроводная.The flasks were mounted on a shaker at a speed of 220 per minute and the inoculum was grown at 28 ^° C. for 28 hours. Then the inoculum in an amount of 5% was transferred into flasks with a fermentation medium of the following composition,%: glucose - 7.0; corn extract - 0.3; soy flour - 0.9; dry yeast - 1.0; tap water.

Ферментацию проводили а течение 192 - 240 часов при 28^oC.Fermentation was carried out and for 192 - 240 hours at 28 ^o C.

Олигомицины выделяли из мицелия следующим образом. Из 10 мл культуральной жидкости отделяли центрифугированием осадок. К влажному осадку добавляли 10 мл охлажденной водопроводной воды, тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к влажному и промытому осадку добавляли 10 мл этанола и проводили экстракцию олигомицинов при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 30 минут. После отделения при 3000 об/мин в центрифугатах определяли содержание олигомицинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), основанной на хроматографическом разделении олигомицинов на аналитической колонке с обращенной фазой Диасорб 130 с 16Т 4х250 мм. Элюирующей системой служила смесь метилового спирта и ацетонитрила с водой в соотношении 21,8 : 6,8 : 4,8. Детектирование компонентов вели в УФ-диапазоне при длине волны 225 нм. Oligomycins were isolated from mycelium as follows. From 10 ml of culture fluid, the precipitate was separated by centrifugation. 10 ml of chilled tap water was added to the wet cake, mixed thoroughly and centrifuged at 3000 rpm. The supernatant was removed, and 10 ml of ethanol was added to the wet and washed precipitate, and oligomycin was extracted at room temperature with constant stirring for 30 minutes. After separation at 3000 rpm, the content of oligomycins was determined in centrifuges using high performance liquid chromatography (HPLC) based on chromatographic separation of oligomycins on a Diasorb 130 reverse phase analytical column with 16T 4x250 mm. A mixture of methyl alcohol and acetonitrile with water in the ratio of 21.8: 6.8: 4.8 served as an eluting system. The components were detected in the UV range at a wavelength of 225 nm.

Среднее содержание олигомицинов в мицелии Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 составило 1000 мкг/мл при размахе изменчивости по данному признаку 800 - 1200 мкг/мл. The average oligomycin content in the mycelium of Streptomyces avermitilis FBM 0004 was 1000 μg / ml with a variability range of 800-1200 μg / ml for this trait.

Таким образом, предлагаемый штамм Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 позволяет получать 1000 мкг/мл олигомицинов в культуральной жидкости. Компонентный состав олигомицинов: олигомицин А - 85-90%; олигомицин С - 10-15% (фиг. 2). Thus, the proposed strain of Streptomyces avermitilis FBM 0004 allows to obtain 1000 μg / ml oligomycin in the culture fluid. The composition of oligomycin: oligomycin A - 85-90%; oligomycin C - 10-15% (Fig. 2).

Claims

Strain Streptomyces avermitilis FBM 0004 - Oligomycin producer.