RU2160569C1

RU2160569C1 - Base for microinjection buffer for culturing transgenic animals

Info

Publication number: RU2160569C1
Application number: RU99108900A
Authority: RU
Inventors: Н.А. Зиновьева; Л.К. Эрнст; Готтфрид Брем
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства
Priority date: 1999-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2000-12-20

Abstract

FIELD: biology; gene engineering. SUBSTANCE: method involves applying synthetic medium of MSOF oviducts as base for microinjection buffer. EFFECT: improved physiological properties; low influence on embryo viability. 3 tbl

Description

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению трансгенных животных. The invention relates to genetic engineering, in particular to the production of transgenic animals.

Известен стандартный буфер ТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,0), который используется для приготовления микроинъекционных растворов генных конструкций с целью получения трансгенных животных (Hammer R.Е., Pursel V.G., Rexroad С.Е. Jr. е.a. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature, 1985, 315, 680-683). Буфер ТЕ характеризуется очень низким осмотическим давлением (~25 мосм) по сравнению с большинством сред для культивирования эмбрионов, что является одной из причин относительно низкой жизнеспособности инъецированных эмбрионов. Known standard buffer TE (10 mm Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mm EDTA, pH 8.0), which is used for the preparation of microinjection solutions of gene constructs in order to obtain transgenic animals (Hammer R.E., Pursel VG , Rexroad S.E. Jr. E.A. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature, 1985, 315, 680-683). The TE buffer is characterized by a very low osmotic pressure (~ 25 mosm) compared with most embryo culture media, which is one of the reasons for the relatively low viability of the injected embryos.

Известна синтетическая среда яйцеводов на буферной основе МОПС (MSOF) для микроинъекции эмбрионов крупного рогатого скота и исследования их выживаемости in vitro (Hagemann L.J. Pronuclear injection of MOPS-buffered medium does not affect bovine embryo development. Theriogenology, 1995, 43 (1): 229), взятая в качестве прототипа. Инъекция физиологического буфера MSOF не влияла на развитие бластоцист in vitro. Доля эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты при инъекции MSOF, была в два раза выше по сравнению с инъекцией буфера ТЕ (соответственно 27,5% и 13,9%) и не отличалась от контрольных неинъецированных эмбрионов (27,6%). Возможность использования среды MSOF для получения трансгенных животных не была установлена. Known is the synthetic environment of oviducts on the basis of MOPS buffer (MSOF) for microinjection of cattle embryos and in vitro studies of their survival (Hagemann LJ Pronuclear injection of MOPS-buffered medium does not affect bovine embryo development. Theriogenology, 1995, 43 (1): 229 ) taken as a prototype. Injection of the physiological MSOF buffer did not affect in vitro blastocyst development. The proportion of embryos that developed to the blastocyst stage during MSOF injection was two times higher compared to TE buffer injection (27.5% and 13.9%, respectively) and did not differ from control uninjected embryos (27.6%). The possibility of using MSOF medium to obtain transgenic animals has not been established.

Целью настоящего изобретения является применение синтетической среды яйцеводов MSOF в качестве основы микроинъекционного буфера для получения трансгенных животных. The aim of the present invention is the use of a synthetic environment of oviducts MSOF as the basis of microinjection buffer for producing transgenic animals.

Для приготовления микроинъекционных растворов MSOF и ТЕ использовали профильтрованную (0,22 мкм) бидистиллированную воду. Буфер ТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 7,4; 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,0) готовили и хранили в виде 2-кратного раствора (2х). При приготовлении инъекционного раствора генных конструкций концентрацию буфера доводили до 1х. For the preparation of microinjection solutions MSOF and TE, filtered (0.22 μm) bidistilled water was used. The TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 mM EDTA, pH 8.0) was prepared and stored as a 2-fold solution (2x). When preparing an injection solution of gene constructs, the buffer concentration was adjusted to 1x.

Состав MSOF с указанием молярности исходных растворов и их конечных концентраций в 1х буфере приводится в таблице 1. Концентрированные растворы отдельных компонентов этого буфера готовили заранее и хранили при +4^oC или при -20^oC (L-глютамин, стрептомицин, пенициллин) в течение трех месяцев. За день до эксперимента готовили 2х MSOF, выполняли контроль и установку pH на уровне 7,4. Затем добавляли концентрированный раствор генных конструкций и доводили концентрацию MSOF до 1х. Концентрацию ДНК в инъекционных растворах MSOF и ТЕ устанавливали на уровне 1000 копий/пкл. Микроинъекционные растворы хранили при +4^oC и использовали в течение суток.The composition of MSOF with the molarity of the initial solutions and their final concentrations in 1x buffer is shown in Table 1. Concentrated solutions of the individual components of this buffer were prepared in advance and stored at + 4 ^° C or at -20 ^° C (L-glutamine, streptomycin, penicillin) in for three months. The day before the experiment, 2x MSOF was prepared, and pH was monitored and set at 7.4. Then a concentrated solution of gene constructs was added and the concentration of MSOF was adjusted to 1x. The DNA concentration in the injection solutions of MSOF and TE was set at 1000 copies / pl. Microinjection solutions were stored at + 4 ^o C and used for a day.

Пример. Опыт проводили на кроликах. На этих животных хорошо отработаны методы суперовуляции, извлечения, микроинъекции и пересадки эмбрионов. Кролики имеют короткий период беременности, поэтому результаты могут быть получены в течение небольшого периода времени (месяца). Закономерности, выявленные на кроликах, могут быть перенесены на другие виды сельскохозяйственных животных. Example. The experiment was carried out on rabbits. Methods of superovulation, extraction, microinjection, and embryo transfer have been well developed on these animals. Rabbits have a short gestation period, so results can be obtained within a short period of time (month). Patterns found in rabbits can be transferred to other types of farm animals.

Зиготы кроликов получали от суперовулированных самок кроликов породы Zika. Подготовку доноров и реципиентов, извлечение и пересадку эмбрионов проводили известным способом (Зиновьева Н.А., Безенфельдер У., Брем Г. Получение яйцеклеток и пересадка микроинъецированных зигот у кроликов. Онтогенез, 1996, 27(3): 214-217). Микроинъекцию осуществляли в мужской пронуклеус под микроскопом при увеличении х400. В каждый эмбрион инъецировали 1-2 пкл раствора ДНК. До момента пересадки микроинъецированные эмбрионы культивировали в капле питательной среды (PBS+20% сыворотки) при +37^oC в течение 1-2 часов. В качестве контроля части реципиентов пересаживали неманипулированные эмбрионы.Rabbit zygotes were obtained from superovulated female rabbits of the Zika breed. The preparation of donors and recipients, the extraction and transplantation of embryos was carried out in a known manner (Zinovieva NA, Bezenfelder U., Brem G. Obtaining eggs and transplanting microinjected zygotes in rabbits. Ontogenesis, 1996, 27 (3): 214-217). Microinjection was carried out into the male pronucleus under a microscope at a magnification of x400. 1-2 pl of DNA solution was injected into each embryo. Prior to transplantation, microinjected embryos were cultured in a drop of culture medium (PBS + 20% serum) at +37 ^o C for 1-2 hours. As a control, part of the recipients were transplanted non-manipulated embryos.

На 14-й день выполняли пальпацию реципиентов с целью предварительной диагностики беременности. Окролы ожидали на 31-й день после пересадки эмбрионов. В случае задержки реципиентам вводили 0,3 ME окситоцина внутримышечно. Пробы тканей (ухо) отбирали на 4-5-й день после окрола, при этом метя крольчат с помощью маркера. Такая маркировка сохранялась в течение 1-2-х недель, что было достаточно для выполнения анализа и диагностики трансгенности. Выявленных трансгенных животных повторно метили маркером в возрасте 2-3-х недель и затем окончательно (ушной маркер) в возрасте 1-1,5 месяцев. On the 14th day, recipients were palpated for the preliminary diagnosis of pregnancy. Okroli was expected on the 31st day after the embryo transfer. In case of delay, 0.3 ME of oxytocin was administered intramuscularly to the recipients. Tissue samples (ear) were taken on the 4th-5th day after the okrol, while labeling rabbits using a marker. This labeling was maintained for 1-2 weeks, which was enough to perform analysis and diagnosis of transgenicity. Identified transgenic animals were re-labeled with a marker at the age of 2-3 weeks and then finally (an ear marker) at the age of 1-1.5 months.

ДНК из проб тканей выделяли с использованием модифицированного метода фенольно-хлороформовой экстракции (Ausubel F.М., Brent R., Kingston R.E. e. a. Current protocols in molecular biology. New York, 1987). Диагностику трансгенности выполняли методом капиллярной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., Брем Г. Метод капиллярной полимеразной цепной реакции как быстрая и более дешевая альтернатива доказательства различных вариантов ДНК. В сб.: Генноинженерные сельскохозяйственные животные. М., 1995: 244-248). Продукты ПЦР разделяли в 1,6% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М Трис-HCl, pH 7,5; 0,1 М борная кислота; 2 мМ ЭДТА, pH 8,0) с добавлением бромида димидия до конечной концентрации 30 нг/мкл, просматривали в ультрафиолетовом свете и фотографировали. DNA was isolated from tissue samples using a modified phenol-chloroform extraction method (Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. e. A. Current protocols in molecular biology. New York, 1987). Diagnostics of transgenicity was carried out by the method of capillary polymerase chain reaction (PCR) (Zinovieva N. A., Ernst L. K., Brem G. The method of capillary polymerase chain reaction as a quick and cheaper alternative to prove various DNA variants. In collection: Genetically engineered farm animals M., 1995: 244-248). PCR products were separated on a 1.6% agarose gel in TBE buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 M boric acid; 2 mM EDTA, pH 8.0) with dimidium bromide added to a final concentration 30 ng / μl, viewed in ultraviolet light and photographed.

Результаты анализа влияния микроинъекционных буферов на физиологические показатели реципиентов представлены в таблице 2. Из полученных данных (табл. 2) следует, что применение буфера MSOF повышало долю нормальных окролов на 12,8% по сравнению с буфером ТЕ (p < 0,95). В среднем от каждого окролившегося реципиента в группе MSOF было получено на 1,2 крольчонка больше по сравнению с группой ТЕ (p > 0,99), в то время как число эмбрионов, в среднем пересаживаемых реципиентам в опытных группах, не различалось (20,1 и 20,3). Таким образом, MSOF был менее вреден для эмбрионов по сравнению с ТЕ. В группе MSOF было лишь 20% реципиентов, принесших по 1-2 крольчонка, в то время как в группе ТЕ их было 50%. Доля мертворожденных в группе MSOF была на 16,2% ниже по сравнению с группой ТЕ (p > 0,999). Основным физиологическим показателем, который напрямую позволяет выявить влияние инъекционного буфера на жизнеспособность эмбрионов, является показатель выживаемости эмбрионов. В группе MSOF отмечалась в 1,7 раза более высокая общая выживаемость эмбрионов по сравнению с группой ТЕ (p > 0,999). Расчет этого показателя у окролившихся реципиентов показал, что выживаемость эмбрионов, инъецированных MSOF, была выше по сравнению с ТЕ в 1,4 раза (p > 0,999). Следовательно, инъекционный буфер на основе MSOF отличается от стандартного инъекционного буфера ТЕ лучшей физиологической пригодностью. Показатели эффективности трансгенеза в исследовательских группах приводятся в таблице 3. Из данных таблицы следует, что между исследовательскими группами не наблюдалось различий в степени интеграции (9,0 и 9,8%), поскольку интеграция зависит прежде всего от метода, используемого для введения ДНК в эмбриональные линии млекопитающих, и от вида животных. Физиологические показатели со степенью интеграции трансгена характеризует показатель общей эффективности. Известно, что у кроликов он составляет величину порядка 1%. При пересадке одинакового числа эмбрионов за счет их лучшей выживаемости рождается большее количество животных, среди которых при равной степени интеграции присутствует большее число трансгенных животных. В настоящих исследованиях за счет использования физиологически более пригодного буфера MSOF общая эффективность переноса генов увеличилась в 1,6 раза (p < 0,95) и составила 1,4% по сравнению с 0,9% при использовании ТЕ. The results of the analysis of the effect of microinjection buffers on the physiological parameters of the recipients are presented in Table 2. From the data obtained (Table 2), it follows that the use of the MSOF buffer increased the proportion of normal okrols by 12.8% compared to the TE buffer (p <0.95). On average, 1.2 rabbits were obtained more from each recipient in the MSOF group compared to the TE group (p> 0.99), while the number of embryos transplanted on average to recipients in the experimental groups did not differ (20, 1 and 20.3). Thus, MSOF was less harmful to embryos compared to TE. In the MSOF group, there were only 20% of the recipients who brought 1-2 rabbits each, while in the TE group there were 50% of them. The proportion of stillbirths in the MSOF group was 16.2% lower compared to the TE group (p> 0.999). The main physiological indicator that directly reveals the effect of the injection buffer on embryo viability is the embryo survival rate. The MSOF group showed 1.7 times higher overall embryo survival compared to the TE group (p> 0.999). Calculation of this indicator in enrolled recipients showed that the survival rate of embryos injected with MSOF was 1.4 times higher compared to TE (p> 0.999). Therefore, the MSOF-based injection buffer differs from the standard TE injection buffer by better physiological suitability. The transgenesis efficacy indicators in the research groups are given in Table 3. From the table it follows that between the research groups there were no differences in the degree of integration (9.0 and 9.8%), since integration depends primarily on the method used to introduce DNA into embryonic lines of mammals, and from animal species. Physiological indicators with the degree of transgene integration characterize the indicator of overall effectiveness. In rabbits, it is known to be about 1%. When transplanting the same number of embryos due to their better survival, more animals are born, among which, with an equal degree of integration, a greater number of transgenic animals are present. In the present studies, through the use of a physiologically more suitable MSOF buffer, the overall gene transfer efficiency increased by 1.6 times (p <0.95) and amounted to 1.4% compared with 0.9% when using TE.

Показатель эффективности переноса генов у окролившихся реципиентов исключает влияние тех реципиентов, которые на момент проведения опытов были не способны к имплантации эмбрионов и их дальнейшему развитию. Расчет этого показателя выявил различия в 1,3 раза (p < 0,95) в пользу MSOF. Кроме того, что в группе MSOF было получено больше трансгенных животных, лишь 14,3% из них были нежизнеспособны. В группе ТЕ из общего числа полученных трансгенных животных нежизнеспособными оказались в 2 раза больше особей (28,6%). The efficiency index of gene transfer in enrolled recipients excludes the influence of those recipients who at the time of the experiments were not capable of implantation of embryos and their further development. The calculation of this indicator revealed 1.3 times differences (p <0.95) in favor of MSOF. In addition to the fact that more transgenic animals were obtained in the MSOF group, only 14.3% of them were non-viable. In the TE group, out of the total number of transgenic animals obtained, 2 times more individuals were nonviable (28.6%).

На основе полученных данных можно заключить, что среда MSOF как основа микроинъекционного буфера является более пригодной для использования в получении трансгенных кроликов по сравнению со стандартным буфером ТЕ. MSOF оказывает меньшее влияние на жизнеспособность эмбрионов и в результате способствует более высокой эффективности трансгенеза у кроликов. Известно, что аналогичные закономерности изменения физиологических показателей выявлены при культивировании in vitro эмбрионов крупного рогатого скота. В этой связи можно предположить лучшую пригодность раствора MSOF для получения трансгенного крупного рогатого скота и других видов животных. Based on the data obtained, it can be concluded that the MSOF medium as the basis of the microinjection buffer is more suitable for use in obtaining transgenic rabbits compared to the standard TE buffer. MSOF has a lesser effect on the viability of embryos and, as a result, contributes to a higher efficiency of transgenesis in rabbits. It is known that similar patterns of changes in physiological parameters were revealed during in vitro cultivation of cattle embryos. In this regard, the best suitability of the MSOF solution for producing transgenic cattle and other animal species can be assumed.

Изобретение применимо в биотехнологии. The invention is applicable in biotechnology.

Claims

The use of the synthetic medium of oviducts MSOF as the basis of microinjection buffer for producing transgenic animals.