RU2160112C1

RU2160112C1 - Method for producing cellular transplant from fetus tissues

Info

Publication number: RU2160112C1
Application number: RU2000108669/14A
Authority: RU
Inventors: Г.Т. Сухих
Original assignee: Сухих Геннадий Тихонович
Priority date: 2000-04-10
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2000-12-10
Also published as: WO2001076611A1; AU1316001A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves separating cells of various organ tissues from abortion fetus of 17- 21 weeks intrauterine development. Suspensions are produced. The suspensions, having increased contents of regional trunk cells, are selected. Separate identified regional trunk cell cultures, regional blast cells possessing high migration activity, differentiated cells, special cells like pancreas beta-cells and biologically active substances containing in the fetal tissues are collected. The number of transplant cells varies from 25•10⁴ to 10•10⁷. Viability of cells composing the transplant is not less than 80-90%, II class histological compatibility antigen expression is not greater than 8-15%, spontaneous activity of Ca²⁺/Mg²⁺-dependent endonuclease is not less than 0.1 conditional units, induced activity of Ca²⁺/Mg²⁺-dependent endonuclease is from 0.3 to 9 conditional units, CD95 marker representation rate is not greater than 5%. The cellular transplant optionally has additions like growth factors and/or migration factors, and/or specific proteins, and/or antioxidation agents and so on. EFFECT: enhanced effectiveness of treatment; high safety level of cellular transplants produced from fetal tissues. 10 cl

Description

Изобретение относится к области медицины и касается приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей для лечения широкого круга заболеваний. The invention relates to medicine and relates to the preparation of a cell transplant from fetal tissues for the treatment of a wide range of diseases.

В современной медицине отчетливо сформировалось отдельное направление, использующее тканевые и клеточные трансплантаты в терапевтических целях. Одним из научно-практических результатов этого направления является признание того, что фетальные ткани и клетки и их ассоциаты, а также биологически активные вещества из них обладают большей терапевтической эффективностью, чем зрелые ткани и дифференцированные клетки взрослого человека. Это обусловлено особыми свойствами клеток в период эмбриогенеза. In modern medicine, a separate area has clearly formed, using tissue and cell transplants for therapeutic purposes. One of the scientific and practical results of this direction is the recognition that fetal tissues and cells and their associates, as well as biologically active substances from them, have greater therapeutic efficacy than mature tissues and differentiated adult cells. This is due to the special properties of cells during embryogenesis.

Прежде всего, в клетках II триместра гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II класса и поэтому при трансплантации они не вызывают иммунной реакции отторжения. First of all, histocompatibility proteins of class I and II are not yet expressed in the cells of the second trimester of gestation and therefore, during transplantation, they do not cause an immune rejection reaction.

Во-вторых, эти клетки в значительно большей степени способны использовать эволюционно более древний энергетический путь - гликолиз и в связи с этим обладают большей устойчивостью к гипоксии, чем дифференцированные клетки взрослого человека. С терапевтической точки зрения это свойство важно в случаях, связанных с лечением ишемии органов и тканей реципиента, с технологической - для создания банков клеток и их ассоциатов с глубоким замораживанием, которое влечет за собой резкое снижение концентрации кислорода. Secondly, these cells are much more able to use the evolutionarily more ancient energy path - glycolysis, and therefore have greater resistance to hypoxia than differentiated adult cells. From a therapeutic point of view, this property is important in cases associated with the treatment of ischemia of organs and tissues of a recipient, and from a technological point of view, to create cell banks and their associates with deep freezing, which entails a sharp decrease in oxygen concentration.

В-третьих, фетальные клетки очень пластичны и способны направленно изменять свои функции и свойства в зависимости от сигналов из окружающей среды, в том числе и от сигналов клеток реципиента. Последнее заставляет клетки мигрировать из области трансплантации в область конечной локализации и дифференцироваться в клетки соответствующей ткани. Именно это свойство высокой морфно-функциональной пластичности лежит в основе так называемой терапевтической полипатентности фетальных клеток и тканей. Thirdly, fetal cells are very plastic and capable of directionally changing their functions and properties depending on signals from the environment, including the signals of the recipient's cells. The latter causes the cells to migrate from the transplantation region to the region of final localization and differentiate into cells of the corresponding tissue. It is this property of high morphological and functional plasticity that underlies the so-called therapeutic polypatence of fetal cells and tissues.

Наконец, фетальные клетки в большей степени, чем клетки взрослого человека, содержат ростовые факторы, факторы миграции, стадиоспецифические белки, антиоксиданты и перехватчики активных форм кислорода, адаптогены, противовоспалительные бактериостатические соединения. Finally, fetal cells to a greater extent than adult cells contain growth factors, migration factors, stage-specific proteins, antioxidants and interceptors of active oxygen species, adaptogens, anti-inflammatory bacteriostatic compounds.

Таким образом, терапевтический эффект фетальных трансплантатов зависит не только от количества имплантированных фетальных тканей, клеток и их ассоциатов, но и от строгого соблюдения условий, обеспечивающих содержание в трансплантате клеток, обладающих всеми перечисленными выше уникальными свойствами. Thus, the therapeutic effect of fetal transplants depends not only on the number of implanted fetal tissues, cells and their associates, but also on strict adherence to conditions ensuring the content of cells in the transplant that possess all of the unique properties listed above.

Сегодня трудно перечислить все области применения фетальных тканей, клеток или препаратов на их основе. Достаточно сказать, что уже в настоящее время ряд клиник США и Европы успешно применяют фетальные клетки и ткани дефектов метаболизма печени, системных врожденных иммунодефицитов, нарушение гемопоэза, а также для лечения пациентов с мышечной дистрофией, дегенеративными заболеваниями нервной ткани, нарушениями репродуктивной системы, костной и хрящевой тканей, кожных покровов и т.д. Применение фетальных клеток в терапевтических целях стало возможным в связи с прогрессом в молекулярной и клеточной биологии, иммунологии, генной инженерии и других, смежных с перечисленными областях науки. В настоящее время не остается сомнений в эффективности фетальных клеток человека и вопрос их широкого применения в клинической практике больше связан с по меньшей мере двумя проблемами: во-первых, с разработкой технологий обеспечения безопасности трансплантата и технологий управления его эффективностью или терапевтической полипатентностью, во-вторых, с разработкой технологий получения нозологически специфических форм трансплантата. Today it is difficult to list all the areas of application of fetal tissues, cells or drugs based on them. Suffice it to say that already a number of clinics in the USA and Europe are successfully using fetal cells and tissues of liver metabolic defects, systemic congenital immunodeficiencies, hematopoiesis disorders, as well as for the treatment of patients with muscular dystrophy, degenerative diseases of the nervous tissue, reproductive system disorders, bone and cartilage, skin, etc. The use of fetal cells for therapeutic purposes has become possible in connection with the progress in molecular and cellular biology, immunology, genetic engineering and others related to these fields of science. At present, there is no doubt about the effectiveness of human fetal cells and the question of their widespread use in clinical practice is more related to at least two problems: firstly, the development of transplant safety technologies and technologies for managing its effectiveness or therapeutic polypatency, and secondly , with the development of technologies for producing nosologically specific graft forms.

Технической задачей настоящего изобретения является способ приготовления клеточного трансплантата с использованием биоматериалов из абортивного плода, позволяющий сохранить терапевтическую полипатентность этих биоматериалов и обеспечить безопасность метода, управляя качеством трансплантата на всех стадиях и этапах. Этот способ включает в себя подготовку трансплантата из фетальных тканей, получение суспензий для последующего получения компонентов клеточных трансплантатов и составление композиций трансплантата. Обеспечение безопасности трансплантата реализуется на основе комплексного подхода с исследованием на контаминацию донора плода, окончательной инъекционной формы трансплантата, а также с учетом условий сохранения антиканцерогенных свойств и гистосовместимости клеток трансплантата с клетками реципиента. An object of the present invention is a method for preparing a cell transplant using biomaterials from an abortive fetus, which allows to maintain the therapeutic polypatency of these biomaterials and to ensure the safety of the method by controlling the quality of the graft at all stages and stages. This method includes the preparation of a transplant from fetal tissues, the preparation of suspensions for the subsequent preparation of the components of cell transplants, and the preparation of transplant compositions. Ensuring the safety of the transplant is implemented on the basis of an integrated approach with research on the contamination of the fetal donor, the final injection form of the transplant, as well as taking into account the conditions for maintaining the anticarcinogenic properties and histocompatibility of transplant cells with recipient cells.

Установлены объективные количественные критерии качества трансплантата с учетом количества клеток в трансплантате, оценки жизнеспособности всех клеток, составляющих трансплантат, экспрессии антигенов гистосовместимости II класса, спонтанной активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы, индуцированной активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы, а также представленности маркера CD 95.Objective quantitative quantitative criteria for the quality of the graft have been established taking into account the number of cells in the graft, assessing the viability of all cells making up the graft, expression of histocompatibility class II antigens, spontaneous activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease, induced activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease, as well as the representation of the marker CD 95.

Для решения поставленной задачи предлагается способ приготовления клеточного трансплантата, согласно которому из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 грамм выделяют клетки различных органов, их суспендируют, затем отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры региональных стволовых клеток, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически-активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате от 25•10⁴ до 10•10⁷, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат, не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8-15%; спонтанная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы от 0,3 до 9 условных ед.; представленность маркера CD 95 - не более 5%. Клеточный трансплантат может дополнительно включать ростовые факторы и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты, и/или переносчики активных форм кислорода, и/или адаптогены, а также вещества, обладающие противовоспалительным, бактериостатическим действием. Клеточный трансплантат может быть использован при исследовании на контаминацию донора абортивного плода, исследований на контаминацию абортивного плода, контроле стерильности тканевых суспензий.To solve this problem, a method of preparing a cell transplant is proposed, according to which cells of various organs are isolated from fetal tissues of an abortive fetus of 17-21 weeks of intrauterine development weighing 150-450 grams, they are suspended, then suspensions with a high content of regional stem cells are selected, some identified regional cultures stem cells, regional blast cells with enhanced migration properties, differentiated cells, specialized cells ki (such as pancreatic beta cells) and biologically active substances from fetal tissues, with the number of cells in the graft from 25 • 10 ⁴ to 10 • 10 ⁷ , the viability of all cells making up the graft, at least 80-90%, expression histocompatibility class II antigens no more than 8-15%; spontaneous activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease at least 0.1 conventional units; the induced activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease from 0.3 to 9 conventional units; the representation of the CD 95 marker is not more than 5%. A cell transplant may additionally include growth factors and / or migration factors, and / or specific proteins, and / or antioxidants, and / or carriers of reactive oxygen species, and / or adaptogens, as well as substances that have anti-inflammatory, bacteriostatic effects. A cell transplant can be used in studies on the contamination of an abortive fetus donor, studies on the contamination of an abortive fetus, and monitoring the sterility of tissue suspensions.

При составлении трансплантатов подбирают ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию. When making transplants, tissues and cells are selected that have lost their function to the greatest extent.

При лечении молодых пациентов трансплантаты содержат больше дифференцированных клеток и/или композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных региональных стволовых клеток. Для старых и пожилых пациентов в трансплантате преобладают региональные стволовые клетки. In the treatment of young patients, transplants contain more differentiated cells and / or compositions of biologically active substances to stimulate their own regional stem cells. For old and elderly patients, regional stem cells predominate in the transplant.

При лечении рассеянного склероза трансплантат должен содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции. In the treatment of multiple sclerosis, the transplant should contain mainly cells of the intermediate region of the brain, which are most capable of migration.

Трансплантаты для лечения больных ишемической болезнью сердца должны содержать миоциты, бластные клетки печени, легкого, селезенки, сосудистого эндотелия. При лечении анемий - региональные гемопоэтические клетки. Transplants for the treatment of patients with coronary heart disease should contain myocytes, blast cells of the liver, lung, spleen, and vascular endothelium. In the treatment of anemia - regional hematopoietic cells.

Клеточные трансплантаты могут быть использованы при лечении заболеваний нервной, эндокринной систем, нарушениях обмена веществ, болезнях крови, кроветворных органов и отдельных нарушениях, вовлекающих иммунные механизмы, для лечения новообразований, болезней глаз и его придаточного аппарата, уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, болезней кожи и подкожной клетчатки, костно- мышечной системы и соединительной ткани, отдельных состояний, возникающих в перинатальном периоде, травм, отравлений. Cell transplants can be used in the treatment of diseases of the nervous and endocrine systems, metabolic disorders, blood diseases, blood-forming organs and certain disorders involving the immune mechanisms, for the treatment of neoplasms, diseases of the eye and its adnexa, ear and mastoid process, circulatory system, organs respiration, digestive organs, diseases of the skin and subcutaneous tissue, musculoskeletal system and connective tissue, certain conditions that occur in the perinatal period, injuries, tions.

Для приготовления трансплантата необходимы абортивные плоды 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 г. Допускается хранить в холодильнике при 4^oC не более 4 ч. Это обеспечивает выход клеток с жизнеспособностью не ниже 85% (в тесте с трипановым синим). Абортивные плоды содержащие менее 70% жизнеспособных клеток, не могут быть использованы для подготовки трансплантата.To prepare the transplant, abortive fetuses of 17-21 weeks of fetal development weighing 150-450 g are required. It is allowed to store in the refrigerator at 4 ^o C for no more than 4 hours. This ensures the yield of cells with a viability of at least 85% (in the test with trypan blue). Abortive fruits containing less than 70% of viable cells cannot be used to prepare a transplant.

Ограничивающие условия определены нами опытным путем в результате анализа жизнеспособности клеток от 112 плодов (p<0,05). В работу принимаются плоды без генетических аномалий и без нарушений целостности кожных покровов. The limiting conditions were determined by us empirically as a result of analysis of cell viability from 112 fruits (p <0.05). The work takes fruits without genetic abnormalities and without compromising the integrity of the skin.

Плод тщательно обрабатывают раствором детергента и отмывают дистиллированной водой. Пуповину отделяют. Затем забирают следующие органы: тимус, сердце, легкие, печень, селезенка, поджелудочную железу, надпочечники, почки, гонады, желудок, тонкий кишечник, брыжейка, спинной мозг, щитовидную железу, глаза. Кроме того, выделяют хрящи из всех суставов плода и снимается кожа с живота и спины. Перед разделением тканей мозга мозговые оболочки обязательно отделяются и в дальнейшем используются для получения клеточных культур. Из головного мозга забирают: мозжечок, мозговой ствол, эпифиз, гипоталамус, таламус, базальные ядра, затылочные доли, теменные доли, височные доли, лобные доли. Гипофиз не изолируется вместе со всем мозгом и может быть отделен в последнюю очередь. The fruit is carefully treated with a detergent solution and washed with distilled water. The umbilical cord is separated. Then the following organs are taken: thymus, heart, lungs, liver, spleen, pancreas, adrenal glands, kidneys, gonads, stomach, small intestine, mesentery, spinal cord, thyroid gland, eyes. In addition, cartilage is secreted from all joints of the fetus and skin is removed from the abdomen and back. Before the separation of brain tissue, the meninges are necessarily separated and subsequently used to obtain cell cultures. From the brain are taken: cerebellum, brain stem, pineal gland, hypothalamus, thalamus, basal nuclei, occipital lobes, parietal lobes, temporal lobes, frontal lobes. The pituitary gland is not isolated with the entire brain and can be separated last.

Органы измельчают в стерильной чашке Петри стерильными, острыми ножницами до визуально гомогенного состояния, затем в гомогенат, добавляют 10 - 15 мл охлажденного (+4^oC) стерильного физраствора и суспендируют стерильной пипеткой. После этого одноразовым шприцом через иглу 0,8х38 производят дополнительную гомогенизацию. Полученный гомогенат переносят в стерильные центрифужные пробирки, содержащие 5-кратный объем охлажденного (+4^oC) стерильного физраствора. Пробирку оставляют на 3-5 мин для осаждения недезагрегированных кусочков ткани, затем надосадочную жидкость, содержащую отдельные клетки, отбирают и переносят в другую стерильную центрифужную пробирку. Осадок, содержащий кусочки ткани, подвергают дополнительной механической или энзиматической дезагрегации. Суспензию клеток центрифугируют в течение 10 мин при 1000 оборотах в мин, после чего надосадочную жидкость сливают.The organs are ground in a sterile Petri dish with sterile, sharp scissors until they are visually homogeneous, then into the homogenate, add 10 - 15 ml of chilled (+ 4 ^o C) sterile saline and suspended with a sterile pipette. After this, a disposable syringe through a 0.8x38 needle produces additional homogenization. The resulting homogenate is transferred into sterile centrifuge tubes containing a 5-fold volume of chilled (+ 4 ^o C) sterile saline. The tube is left for 3-5 minutes to precipitate non-disaggregated pieces of tissue, then the supernatant containing individual cells is removed and transferred to another sterile centrifuge tube. Sludge containing tissue pieces is subjected to additional mechanical or enzymatic disaggregation. The cell suspension is centrifuged for 10 min at 1000 rpm, after which the supernatant is drained.

Суспензии, прошедшие контроль стерильности, могут использоваться сразу в виде трансплантата из отдельных тканей, композиций тканей, передаваться на хранение в банк либо служить исходным биоматериалом для получения клеточных трансплантатов. Suspensions that have passed sterility control can be used immediately in the form of a graft from individual tissues, tissue compositions, transferred to a bank for storage, or serve as the initial biomaterial for cell transplants.

Проверенный на стерильность материал суспендируют в среде для замораживания - 10% DMSO (в качестве криопротектора) и 90% эмбриональной сыворотки теленка, затем помещают в криопробирки (Costar), по 1,5 мл (2-50•10⁶ клеток/пробирку) и замораживают в парах жидкого азота со скоростью 1^oC/мин до -40^oC и 5^oC/мин - 70^oC. После этого охлажденные криопробирки с суспензией помещают в жидкий азот в сосуды Дьюара (35 литров, Sigma), либо в хранилища для биопродуктов (ХБ-0.5, Свердловский завод кислородного машиностроения).The sterility-tested material is suspended in a freezing medium - 10% DMSO (as a cryoprotectant) and 90% fetal calf serum, then placed in cryovials (Costar), 1.5 ml each (2-50 x 10 ⁶ cells / tube) and frozen in pairs of liquid nitrogen at a rate of 1 ^o C / min to -40 ^o C and 5 ^o C / min - 70 ^o C. After that, the cooled cryovials with suspension are placed in liquid nitrogen in Dewar vessels (35 liters, Sigma), or storage facilities for organic products (HB-0.5, Sverdlovsk oxygen engineering plant).

Хранящиеся в банке суспензии находятся в криопробирке емкостью 2 мл или 4 мл, содержащую стерильную гомогенную жидкость от светло-желтого до розово-оранжевого цвета с концентрацией клеток от 1 млн. в мл до 50 млн. в мл. Suspensions stored in the bank are in a 2 ml or 4 ml cryovial containing a sterile homogeneous liquid from light yellow to pink-orange in color with a cell concentration of 1 million in ml to 50 million in ml.

Срок хранения суспензии в жидком азоте - 3 года. The shelf life of the suspension in liquid nitrogen is 3 years.

Ограничивающее условие определено нами опытным путем на основе анализа жизнеспособности 167 образцов суспензий (p<0,05). The limiting condition was determined by us empirically based on the analysis of the viability of 167 samples of suspensions (p <0.05).

После размораживания осуществляют контроль жизнеспособности клеток суспензии. After thawing, the viability of the suspension cells is monitored.

Замороженную суспензию (по 1 ампуле из каждой партии) быстро размораживают при 60^oC, отмывают физраствором для удаления среды для замораживания (центрифугирование в течение 1-2 минут при 1000 об/мин) и окрашивают витальным красителем трипановым синим по стандартной методике. Жизнеспособность клеток должна составлять не ниже 80%. Если этот показатель ниже, то такие образцы отбраковывают. При строгом соблюдении режима замораживания и последующем быстром размораживании жизнеспособность, как правило, составляет 80-95% (общая статистика 70, уровень значимости p<0,05).The frozen suspension (1 ampoule from each batch) is quickly thawed at 60 ^o C, washed with saline to remove the freezing medium (centrifugation for 1-2 minutes at 1000 rpm) and stained with trypan blue vital dye according to the standard method. Cell viability should be at least 80%. If this indicator is lower, then such samples are rejected. With strict adherence to the freezing regime and subsequent rapid defrosting, viability is usually 80-95% (general statistics 70, significance level p <0.05).

Изучение эмбриогенеза, особенно органогенеза, показало, что в первый триместр беременности в зародыше закладываются и формируются "в миниатюре" все органы. На стадии после 15-ой недели развития органы зародыша представлены в 35-60% региональными стволовыми клетками (РСК), которые затем в течение 6 последующих месяцев развития интенсивно делятся, превращаясь в часть органа. A study of embryogenesis, especially organogenesis, showed that in the first trimester of pregnancy all organs are laid and formed "in miniature" in the embryo. At the stage after the 15th week of development, the embryo organs are represented in 35-60% by regional stem cells (CSCs), which then intensively divide over the next 6 months of development, turning into part of the organ.

Теоретически идеальным трансплантатом является тот, который содержит 100% РСК. Однако простой расчет показывает, что для получения достаточного только для одной трансплантации РСК необходимо в сотни раз увеличить количество исходного абортного материала. Поэтому практически, для подготовки трансплантата, используют абортный материал более поздних чем 15 недель сроков гестации, когда количество РСК резко возрастает, применяют культивирование РСК, добавляют частично дифференцированные клетки, а также стимулируют "спящие" камбиальные РСК реципиента ростовыми факторами, цитокинами или другими биологически активными веществами, содержащимися в фетальных тканях. A theoretically ideal graft is one that contains 100% CSC. However, a simple calculation shows that in order to obtain RSC sufficient for just one transplant, it is necessary to increase the amount of the initial abortion material hundreds of times. Therefore, in practice, for the preparation of the graft, abortion material is used later than 15 weeks of gestational age, when the number of CSCs increases sharply, CSC cultivation is used, partially differentiated cells are added, and they also stimulate “sleeping” cambial CSCs of the recipient by growth factors, cytokines or other biologically active substances contained in fetal tissues.

Таким образом, основными компонентами трансплантата являются РСК, частично дифференцированные, специализированные клетки и биологически активные вещества, стимулирующие регенерацию собственных РСК реципиента. Thus, the main components of the transplant are CSCs, partially differentiated, specialized cells and biologically active substances that stimulate the regeneration of the recipient's own CSCs.

В настоящее время уже установлено место первичной локализации РСК для разных органов и тканей. Это было сделано с применением тонких дорогостоящих методов, что затрудняет использование их в технологическом процессе при широкой практике подготовки и применения трансплантата. Currently, the place of primary localization of CSCs for various organs and tissues has already been established. This was done using thin, expensive methods, which makes it difficult to use them in the process with widespread practice of preparation and application of the transplant.

Предлагается к патентованию технологически более подходящий способ определения наибольшей плотности: региональных стволовых клеток. Способ заключается в том, что в образцах суспензий, полученных из областей первичной локализации РСК, определяют уровень аноптотической активности по CD 95 и наличие на поверхности этих клеток антигенов гистосовместимости II-класса HLA-DR. Опыт применения этих двух методов одновременно для определения образца суспензий с наибольшей плотностью РСК позволяет получить от 75 до 85% жизнеспособных РСК, что достаточно для дальнейшего их культивирования
Общая статистика - 87 измерений. Вариабельность по тканям от 6 до 8 измерении. Уровень значимости - p<0,05 - 0,001.It is proposed to patent a technologically more suitable method for determining the highest density: regional stem cells. The method consists in the fact that in the samples of suspensions obtained from the regions of primary localization of CSC, the level of anoptotic activity is determined from CD 95 and the presence of histocompatibility antigens of the II class HLA-DR on the surface of these cells. The experience of using these two methods at the same time to determine a sample of suspensions with the highest density of CSCs allows to obtain from 75 to 85% of viable CSCs, which is sufficient for their further cultivation
General statistics - 87 measurements. Tissue variability from 6 to 8 measurement. Significance level - p <0.05 - 0.001.

Культивирование РСК проводят в специальных условиях, не позволяющих, им дифференцироваться. The cultivation of CSCs is carried out in special conditions that do not allow them to differentiate.

При выращивании клеток в недифференцирующих условиях, культура РСК может поддерживаться не более одного года. When cells are grown under non-differentiating conditions, the CSC culture can be maintained for no more than one year.

Ограничивающее условие получено нами опытным путем на основании анализа жизнеспособности 8 образцов РСК (p<0,05)
Получение частично дифференцированных и специализированных клеток
Если РСК поместить в условия, позволяющие ей дифференцироваться, то через примерно 3 недели можно получить специализированные клетки, практически не отличающиеся от клеток из области окончательной их локализации. При этом все они будут нести антигены гистосовместимости II-класса (HLA-DR). Такого рода клетки добавляют в трансплантат в качестве источника композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных репаративных механизмов реципиента, поскольку они распознаются и уничтожаются иммунной системой больного, в результате чего высвобождаются эти биологически активные вещества.The limiting condition was obtained by us empirically based on the analysis of the viability of 8 samples of CSCs (p <0.05)
Obtaining partially differentiated and specialized cells
If CSCs are placed in conditions that allow it to differentiate, then after about 3 weeks it is possible to obtain specialized cells that practically do not differ from cells from their final location. Moreover, all of them will carry histocompatibility antigens of class II (HLA-DR). Such cells are added to the graft as a source of a composition of biologically active substances to stimulate the recipient's own reparative mechanisms, since they are recognized and destroyed by the patient’s immune system, as a result of which these biologically active substances are released.

Опытным путем нами получено, что терапевтическая эффективность такого рода клеток резко падает после 3-5 пассажей. Empirically, we have found that the therapeutic effectiveness of such cells drops sharply after 3-5 passages.

Ограничивающее условие получено при N =12 (p<0,05)
При трансплантации с целью замещения дефектного клона клеток должны использовать частично дифференцированные клетки. Опытным путем нами получено, что терапевтическая эффективность оптимальна при экспрессии антигенов гистосовместимости II-класса не более 8-15%.The limiting condition is obtained at N = 12 (p <0.05)
When transplanted to replace a defective cell clone, partially differentiated cells must be used. We have experimentally found that therapeutic efficacy is optimal when expressing histocompatibility antigens of class II no more than 8-15%.

Ограничивающее условие получено при N = 47 (p<0,05)
Получение композиции пептидов, стимулирующих РСК реципиента
Все процедуры производятся при 0^oC. В максимально "мягких" условиях из ткани готовится гомогенат на дистиллированной воде и (или) изотоническом растворе хлорного калия (11,5 г на 1 литр дистиллированной воды - 15% раствор). В последнем случае гомогенат центрифугируют при 600g 10 мин и осадок из неразрушенных клеток и обрывков разрушенных клеток используют для тестирования. Далее следует этап центрифугирования при 12000g в течение 15 мин - оседают митохондрии - осадок используется так же, как и первый, т.е. как осадок 600g. Следующий этап центрифугирование постмигохондриальной надосадочной жидкости при 105000g в течение часа - получение осадка мембран эндоплазматического ретикулума. Фракции осадка, кроме осадка 600g, ресуспендируют в дистиллированной воде и (или) дополнительно могут быть "озвучены" на 3 ДН с целью солюбилизации периферического белка мембран и разрушения компонентов субклеточных структур, содержащих растворимые белки и биоактивные пептиды.The limiting condition is obtained at N = 47 (p <0.05)
Obtaining a composition of peptides stimulating recipient CSCs
All procedures are performed at 0 ^o C. In the most “mild” conditions, a homogenate is prepared from the tissue in distilled water and (or) isotonic solution of potassium chloride (11.5 g per 1 liter of distilled water - 15% solution). In the latter case, the homogenate is centrifuged at 600 g for 10 minutes and the pellet from undetected cells and fragments of destroyed cells is used for testing. This is followed by a centrifugation step at 12000g for 15 min - mitochondria settle - the sediment is used in the same way as the first, i.e. as a precipitate of 600g. The next step is the centrifugation of postmigochondrial supernatant at 105000g for an hour - obtaining a precipitate of membranes of the endoplasmic reticulum. The sediment fractions, in addition to sediment 600g, are resuspended in distilled water and (or) can be additionally “voiced” for 3 days in order to solubilize the peripheral protein of the membranes and destroy the components of subcellular structures containing soluble proteins and bioactive peptides.

Испытания фракции проводятся или в виде самой фракции как таковой или после экстракции пептидов по известным (общепринятым) методикам. Экстракты для характеристики пептидного состава подвергаются ВЭЖ хроматографии. Tests of the fraction are carried out either in the form of the fraction itself or after extraction of the peptides according to known (generally accepted) methods. Extracts to characterize the peptide composition are subjected to HPLC.

В случае приготовления гомогената ткани на дистиллированной воде, последний готовится в максимально жестких условиях: допустимо повторное замораживание-оттаивание, дополнительное озвучивание на ультразвуковом дезинтеграторе (3 Д) при максимальной мощности и т.д. Гомогенат центрифугируется при 105000g в течение 1 часа. Во всех случаях допустим этап лиофильной сушки осадка или супернатанта с целью концентрации материала. In the case of preparation of tissue homogenate in distilled water, the latter is prepared under the most severe conditions: repeated freezing-thawing is acceptable, additional sounding on an ultrasonic disintegrator (3 D) at maximum power, etc. The homogenate is centrifuged at 105000g for 1 hour. In all cases, the step of freeze drying the precipitate or supernatant with the aim of concentration of the material is acceptable.

Инъекционная форма трансплантата готовится из суспензий, полученных сразу после препарирования абортного плода, из замороженных тканевых и клеточных суспензий различных органов, из отдельных идентифицированных культур РСК, региональных бластных клеток, дифференцированных клеток, а также из композиций биологически активных веществ из фетальных тканей. Она представляет собой стерильную пробирку с мутноватой жидкостью от светло-желтого до розово-оранжевого цвета. The injectable form of the graft is prepared from suspensions obtained immediately after preparation of the abortion fetus, from frozen tissue and cell suspensions of various organs, from individual identified cultures of CSCs, regional blast cells, differentiated cells, as well as from compositions of biologically active substances from fetal tissues. It is a sterile tube with a turbid liquid from light yellow to pink-orange.

Для получения отчетливого эффекта в тансплантате должно содержаться от 25•10⁴ до 10•10⁷ жизнеспособных клеток.To obtain a distinct effect, the graft should contain from 25 • 10 ⁴ to 10 • 10 ⁷ viable cells.

В настоящее время существует несколько методических подходов к паспортизации. Среди них можно выделить: иммуноцитохимические методы, методы оценки ферментативной активности, метод проточной цитофлуориметрии. Currently, there are several methodological approaches to certification. Among them are: immunocytochemical methods, methods for assessing enzymatic activity, flow cytofluorimetry method.

Иммуноцитохимические методы используются только для идентификации клеток, прикрепленных к субстрату (пластик, стекло) и готовых к дифференцировке. Идентификацию проводят по реакции на специфические мембранные маркеры или по наличию специфического биологического продукта этих клеток. Immunocytochemical methods are used only to identify cells attached to a substrate (plastic, glass) and ready for differentiation. Identification is carried out by reaction to specific membrane markers or by the presence of a specific biological product of these cells.

Методы изучения ферментативной активности клеток, входящих в состав трансплантата, дают возможность оценить норму реакции наиболее важных для жизнеспособности и ферментов (в том числе и ядерных ферментов) в ответ на различные индукторы. Примером использования ферментативных методов является оценка индуцированой активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы.Methods of studying the enzymatic activity of the cells that make up the graft make it possible to evaluate the rate of reaction of the most important for viability and enzymes (including nuclear enzymes) in response to various inducers. An example of the use of enzymatic methods is the assessment of the induced activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease.

На основании накопленного нами опыта впервые для паспортизации предлагается использовать метод проточной цитофлуориметрии, позволяющий одновременно в одном и том же образце трансплантата оценить основные показатели сохранности терапевтической полипатентности водящих в состав трансплантата компонентов. В результате применения этого метода впервые установлено, что трансплантат с оптимальной терапевтической полипатентностью должен отвечать следующим требованиям: количество клеток в трансплантате от 25•10⁴ до 10•10⁷, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат - не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8- 15%, спонтанная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы не менее - 0,1 условной ед. , индуцированная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы - от 0,3 до 9 условных ед., представленность маркера CD 95 не более 5%.Based on our experience, for the first time it is proposed to use the method of flow cytofluorimetry for certification, which allows us to simultaneously evaluate the main indicators of the preservation of therapeutic polypatency of the components that make up the graft in the same transplant sample. As a result of using this method, it was first established that a transplant with optimal therapeutic polypatency should meet the following requirements: the number of cells in the transplant from 25 • 10 ⁴ to 10 • 10 ⁷ , the viability of all cells that make up the transplant is at least 80-90%, antigen expression histocompatibility of class II no more than 8-15%, spontaneous activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease no less than - 0.1 conditional unit. , the induced activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease is from 0.3 to 9 conventional units, the presence of the CD 95 marker is not more than 5%.

Общая статистика - 375. Вариабельность по показателям от 30 до 85. Уровень значимости p<0,05 - p<0,001. General statistics - 375. Variability in indicators from 30 to 85. The significance level is p <0.05 - p <0.001.

Предлагаемый способ приготовления трансплантата позволяет формировать банк биоматериалов, который включает: набор тканевых и клеточных суспензий различных органов, отдельные идентифицированные культуры РСК, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные региональные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы), "эталоны" паспортизированных трансплантатов, а также композиции биологически активных веществ из фетальных тканей. Манипулирование перечисленными биоматериалами при составлении композиции трансплантата открывает перед терапевтами практически неограниченные возможности вплоть до индивидуального подбора каждому больному при составлении трансплантата подбирают те ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию. The proposed method for the preparation of the transplant allows you to create a biomaterial bank, which includes: a set of tissue and cell suspensions of various organs, individual identified cultures of CSCs, regional blast cells with enhanced migration properties, differentiated regional cells, specialized cells (such as pancreatic beta cells), " standards "certified transplants, as well as compositions of biologically active substances from fetal tissues. The manipulation of the listed biomaterials during the preparation of the graft composition opens up practically unlimited possibilities for therapists right up to the individual selection for each patient in the preparation of the graft those tissues and cells that have lost their function to the greatest extent are selected.

Немаловажное значение при составлении трансплантата имеет учет возраста больного. При всех прочих равных условиях трансплантат для лечения более молодых пациентов должен содержать больше дифференцированных клеток и/или композицию биологически активных веществ для стимуляции собственных РСК реципиента, в то время как в трансплантате для пожилых и старых пациентов в подавляющем большинстве должны преобладать РСК. Equally important in the preparation of the transplant is taking into account the age of the patient. Ceteris paribus, the transplant for treating younger patients should contain more differentiated cells and / or a composition of biologically active substances to stimulate the recipient's own RCC, while in the overwhelming majority of the transplant for elderly and old patients, RSC should prevail.

При составлении клеточного трансплантата следует ориентироваться, как на основное заболевание, так и на породившие его причины. Так, например, при ишемической болезни сердца эффективность лечения выше, если в трансплантате присутствуют не только миоциты, но и бластные клетки печени, легкого, селезенки и сосудистого эндотелия. Трансплантат, составленный для лечения рассеянного склероза, должен состоять преимущественно из клеток промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции, а трансплантат для лечения анемий должен состоять из региональных гемопоэтических клеток. When compiling a cell transplant, one should focus on both the underlying disease and the causes that generated it. So, for example, with coronary heart disease, the effectiveness of treatment is higher if not only myocytes are present in the transplant, but also blast cells of the liver, lung, spleen and vascular endothelium. A transplant designed to treat multiple sclerosis should consist mainly of cells in the intermediate region of the brain that are most capable of migration, and a transplant for the treatment of anemia should consist of regional hematopoietic cells.

Клеточные трансплантаты могут быть составлены для лечения болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ, болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм, новообразования, болезни глаз и его придаточного аппарата, болезни уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, кожи и подкожной клетчатки, костно-мышечной системы и соединительной ткани, отдельные состояния, возникающие в перинтальном периоде, травмы, отравления. Cell transplants can be made up for the treatment of endocrine system diseases, eating disorders and metabolic disorders, blood diseases, blood-forming organs and individual disorders involving the immune mechanism, neoplasms, diseases of the eye and its adnexa, diseases of the ear and mastoid process, circulatory system, organs respiration, digestive organs, skin and subcutaneous tissue, musculoskeletal system and connective tissue, individual conditions that occur in the perintal period, trauma, poisoning.

Claims

1. A method of preparing a cell transplant from fetal tissues, characterized in that cells of various organs are isolated from suspension fetal tissues of 17-21 weeks of fetal development weighing 150-450 g, they are suspended, suspensions with a high content of regional stem cells are selected, individual identified cultures regional stem cells, regional blast cells with enhanced migration properties, differentiated cells, specialized cells (such as beta cells under eludochnoy gland) and biologically active substances from fetal tissues, the number of cells in the graft from 25 x 10 ⁴ to 10 x 10 ^7, vitality of all cells constituting the graft, at least 80 - 90%, the expression of MHC II antigen class not more than 8 - fifteen%; spontaneous activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease at least 0.1 conventional units; the induced activity of Ca ²⁺ / Mg ²⁺ - dependent endonuclease from 0.3 to 9 conventional units; the presence of the marker SD 95 - not more than 5%.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cell transplant further includes growth factors and / or migration factors and / or specific proteins and / or antioxidants and / or carriers of reactive oxygen species and / or adaptogens, and also substances with anti-inflammatory, bacteriostatic effect.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell transplant obtained by the proposed method can be used in the study for contamination of the donor of the abortive fetus, a study on the contamination of the abortive fetus, monitoring the sterility of tissue suspensions.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in the preparation of the grafts selected tissues and cells that have lost their function to the greatest extent.

5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the transplants for the treatment of young patients should contain more differentiated cells and / or compositions of biologically active substances to stimulate their own regional stem cells.

6. The method according to claim 1 or 2, characterized in that regional stem cells should prevail in the transplant for old and elderly patients.

7. The method according to claim 1, characterized in that the grafts for the treatment of patients with coronary heart disease should contain myocytes, blast cells of the liver, lung, spleen, vascular endothelium.

8. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the transplants for the treatment of multiple sclerosis should contain mainly cells of the intermediate region of the brain, which are most capable of migration.

9. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the transplant for the treatment of anemia should consist mainly of regional hematopoietic cells.

10. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell transplants can be used in the treatment of diseases of the nervous system, diseases of the endocrine system, metabolic disorders, blood diseases, blood-forming organs and certain disorders involving immune mechanisms for the treatment of neoplasms, diseases of the eye and its adnexa, diseases of the ear and mastoid process, diseases of the circulatory system, diseases of the respiratory system, diseases of the digestive system, diseases of the skin and subcutaneous tissue, diseases of the bone-mouse Neu system and connective tissue conditions arising in the perinatal period, injuries, poisonings and other consequences of external causes.