RU2160111C1

RU2160111C1 - Method for obtaining high activity raw materials for producing complete soluble thromboplastin

Info

Publication number: RU2160111C1
Application number: RU99121264/14A
Authority: RU
Inventors: Л.Н. Тарасова; кова Е.М. Репн; Е.М. Репнякова; Е.Ю. Савиных; Н.Р. Решетникова; Л.Н. Гонин
Original assignee: Кировский НИИ гематологии и переливания крови
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2000-12-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves twice freezing cadaver brain gray substance at -40 C and melting at +36 C. Extraction is carried out with the same volume of cleaned water. The mass is centrifuged at 600 G at +5 C during 30 min. The supernatant is separated, the same volume of cleaned water is added to the precipitate and centrifuged under the same conditions. The obtained supernatant liquids are mixed to produce high thromboplastin activity supernatant. EFFECT: improved quality and high activity of raw materials. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине и касается получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина растворимого, используемого при определении активности протромбинового комплекса в одностадийном тесте Квика. The invention relates to medicine and relates to the production of highly active raw materials for the manufacture of soluble thromboplastin used in determining the activity of the prothrombin complex in a one-step Quick test.

В настоящее время существуют многочисленные модификации метода, затрудняющие получение сравнимых результатов. Одной из основных причин этого является использование тромбопластинов разного качества. Зарубежные фирмы выпускают лиофилизированные полные тромбопластины (Международные, Национальные), однако технология их изготовления в большинстве своем запатентована (реагенты фирм Boehringer Mannheim, Dade, Sigma, Organon teknika, George king bio-medical, Hospitex diagnostics. Human, Grifols, Biomerieux). Currently, there are numerous modifications to the method that make it difficult to obtain comparable results. One of the main reasons for this is the use of thromboplastins of different quality. Foreign companies produce lyophilized complete thromboplastins (International, National), however, their manufacturing technology is mostly patented (reagents from Boehringer Mannheim, Dade, Sigma, Organon teknika, George king bio-medical, Hospitex diagnostics. Human, Grifols, Biomerieux).

В качестве прототипа нами использован патент 1775897 Кулене В.В, Стрейкувене И.К, Синкувене Д.С, Герасимене Г.Б. и соавторов на "Способ получения диагностического агента для определения протромбинового времени". Существенным недостатком прототипа является то, что в качестве сырья берут все ткани кадаверного головного мозга, многие из которых (белое вещество, кровеносные сосуды) отличаются низкой тромбопластиновой активностью. Обработка ацетоном, включенная в технологический процесс, может существенно влиять на специфичность конечного продукта, а дезинтегрирование и фильтрация сырья, проводимые с целью получения тромбопластиновых везикул оптимальной величины, являются длительными и трудоемкими, требующими специального оборудования. As a prototype, we used patent 1775897 Kulene V.V., Streikuven I.K., Sinkuven D.S., Gerasimene G.B. and co-authors on "A method of obtaining a diagnostic agent for determining prothrombin time." A significant disadvantage of the prototype is that all cadaveric brain tissues are taken as raw materials, many of which (white matter, blood vessels) are characterized by low thromboplastin activity. Processing with acetone, which is included in the technological process, can significantly affect the specificity of the final product, and the disintegration and filtration of raw materials carried out in order to obtain thromboplastin vesicles of optimal size are long and time-consuming, requiring special equipment.

Целью настоящего изобретения является получение высокоактивного сырья из серого вещества кадаверного головного мозга как ткани, обладающей наибольшей активностью, которое необходимо для изготовления тромбопластина полного растворимого, также обладающего высокой активностью. The aim of the present invention is to obtain highly active raw materials from the gray matter of the cadaveric brain as the tissue with the highest activity, which is necessary for the manufacture of thromboplastin completely soluble, also with high activity.

Поставленная цель достигается тем, что используют смесь серого вещества головного мозга от 5-6 трупов и сокращают время хранения сырья. Температура хранения сырья до обработки не должна превышать минус 40^oC. Проводят двукратную заморозку при минус 40^oC и последующую оттайку при +36^oC. Серое вещество измельчают в миксере, получают грубую смесь и проводят экстракцию ее очищенной водой при +36 и центрифугирование при 600 g и температуре +5^oC в течение 30 мин. При этом удаляются нерастворимые частицы и получается сырье для растворимой формы тромбопластина, которая более удобна и проста в применении. Отделившийся супернатант, содержащий активные тромбопластиновые везикулы, переносят в стеклянный стакан, а оставшийся осадок разводят таким же объемом очищенной воды и повторно центрифугируют при том же режиме; супернатант также отделяют. Полученные надосадочные жидкости смешивают и тестируют, проводя контроль pH и активности (в секундах) в тесте Квика с контрольной плазмой (смеси свежей донорской плазмы не менее 10 человек). Если значения pH находятся в пределах 6,5-8,0, а активность не превышает 15 с, то супернатант подготавливают к сублимации.This goal is achieved by using a mixture of gray matter of the brain from 5-6 corpses and reduce the storage time of raw materials. The storage temperature of the raw materials before processing should not exceed minus 40 ^o C. Double-freezing is carried out at minus 40 ^o C and subsequent defrosting at +36 ^o C. The gray matter is ground in a mixer, a coarse mixture is obtained and it is extracted with purified water at +36 and centrifuged at 600 g and a temperature of +5 ^o C for 30 minutes In this case, insoluble particles are removed and the raw material for the soluble form of thromboplastin is obtained, which is more convenient and easy to use. The separated supernatant containing the active thromboplastin vesicles is transferred to a glass beaker, and the remaining precipitate is diluted with the same volume of purified water and centrifuged again under the same conditions; the supernatant is also separated. The resulting supernatants are mixed and tested by monitoring the pH and activity (in seconds) in the Quick test with a control plasma (mixture of fresh donor plasma of at least 10 people). If the pH values are in the range of 6.5-8.0, and the activity does not exceed 15 s, then the supernatant is prepared for sublimation.

Оптимальное время хранения сырья до сублимации, в течение которого сохраняется высокая активность, не должно превышать 3 недель. The optimal storage time of raw materials until sublimation, during which high activity is maintained, should not exceed 3 weeks.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА
Высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого получают следующим образом: отделяют серое вещество кадаверного головного мозга и измельчают в миксере в течение 10 мин до получения грубой гомогенной смеси. Ее разливают во флаконы вместимостью 250 мл по 50 мл в каждый, затем замораживают до минус 40^oC. После заморозки тотчас проводят оттайку при +36^oC и снова замораживают при той же температуре. Повторно размороженную смесь разводят равным объемом очищенной воды, тщательно перемешивают и центрифугируют при 600 g и температуре +5^oC в течение 30 мин. Супернатант отделяют, а к оставшемуся осадку снова добавляют такой же объем очищенной воды и повторно центрифугируют в том же режиме. Супернатант снимают, перемешивают с ранее полученным и проверяют pH и активность протромбинового комплекса с контрольной плазмой. Если полученные значения удовлетворяют требованиям, то смесь готовят к сублимации.METHOD DESCRIPTION EXAMPLE
Highly active raw materials for the manufacture of soluble thromboplastin are prepared as follows: the gray matter of the cadaveric brain is separated and ground in a mixer for 10 minutes to obtain a coarse homogeneous mixture. It is poured into bottles with a capacity of 250 ml of 50 ml each, then frozen to minus 40 ^o C. After freezing, a defrost is carried out immediately at +36 ^o C and again frozen at the same temperature. The re-thawed mixture is diluted with an equal volume of purified water, thoroughly mixed and centrifuged at 600 g and a temperature of +5 ^o C for 30 minutes. The supernatant is separated and the same volume of purified water is again added to the remaining precipitate and centrifuged again in the same mode. The supernatant is removed, mixed with previously obtained and check the pH and activity of the prothrombin complex with a control plasma. If the obtained values satisfy the requirements, then the mixture is prepared for sublimation.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
(проведены на базе лаборатории биохимии крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови.)
Разработанный способ использован при изготовлении сырья для 7 серий реактива. Результаты приведены в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что полученное сырье имеет высокую активность, равную 14,7-15,2 с.EXPERIMENTAL RESEARCH
(conducted on the basis of the blood biochemistry laboratory of the Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion.)
The developed method was used in the manufacture of raw materials for 7 series of reagent. The results are shown in table 1. They indicate that the obtained raw material has a high activity equal to 14.7-15.2 s.

Таким образом, разработанный способ позволяет получить высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого, необходимого для включения в наборы реактивов, используемых при определении протромбинового комплекса в методе Квика. Разработанный способ найдет применение при создании производственной технологии изготовления тромбопластина растворимого, который наиболее удобен и прост при использовании в клинико-диагностических и специализированных лабораториях. Thus, the developed method allows to obtain highly active raw materials for the manufacture of soluble thromboplastin, which is necessary for inclusion in the reagent kits used to determine the prothrombin complex in the Quick method. The developed method will find application in creating a manufacturing technology for the production of soluble thromboplastin, which is most convenient and simple when used in clinical diagnostic and specialized laboratories.

Claims

The method of obtaining highly active raw materials from the cadaveric brain for the manufacture of soluble thromboplastin, comprising aqueous extraction of the target product, characterized in that the homogenate of the gray matter is frozen twice at minus 40 ^o C and thawed at +36 ^o C, the extraction is carried out with an equal volume of purified water, centrifuged at 600 g and a temperature of +5 ^o C for 30 minutes, the supernatant is separated, the same volume of purified water is added to the precipitate and centrifuged in the same mode, the resulting supernatants are mixed to obtain a soup ernatant with high thromboplastin activity.