RU2158759C2

RU2158759C2 - Method for storing cellular cultures in suspension

Info

Publication number: RU2158759C2
Application number: RU98116715/13A
Authority: RU
Inventors: И.В. Тимофеев; Н.Г. Перминова; дин Ю.А. Д; Ю.А. Дядин; Ф.В. Журко
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1998-09-07
Filing date: 1998-09-07
Publication date: 2000-11-10

Abstract

FIELD: microbiological methods. SUBSTANCE: cellular suspension is supplemented by fresh preserving nutrient medium RPMI-1640 and then 20% of fetal serum, preferably bovine embryo serum, is added. Sample under hydrostatic pressure 450-550 atm is cooled to temperature from (-3)-(-5)^oC. EFFECT: ensured integrity of spatial structural organization of cell association and high level of their vitality. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении пространственно организованных клеточных структур и клеточных ассоциаций (суспензий). The invention relates to biology and medicine and can be used for storing spatially organized cell structures and cell associations (suspensions).

Известен способ хранения культуры клеток в замороженном с криопротектором (глицерин или ДМСО) состоянии при -196^oC (жидкий азот) [1,2], а также способы хранения клеток крови в жидком состоянии при +4^oC с консервантом ЦОЛИПК-7Б [3].A known method of storing a cell culture in a frozen state with a cryoprotectant (glycerin or DMSO) at -196 ^o C (liquid nitrogen) [1,2], as well as methods of storing blood cells in a liquid state at + 4 ^o C with the preservative TSOLIP-7B [ 3].

Недостатком сохранения клеточной культуры в случае ее хранения в жидком азоте при температуре -196^oC является сохранение низкого процента жизнеспособных клеток (55-60%). Препарат ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии клеток после размораживания. Кроме того, при этом идет потеря до 30% клеток. Использование глицерина также приводит к разрушению клеток после размораживания.The disadvantage of preserving the cell culture when stored in liquid nitrogen at a temperature of -196 ^o C is the preservation of a low percentage of viable cells (55-60%). DMSO is toxic, which requires its complete removal from the cell suspension after thawing. In addition, there is a loss of up to 30% of the cells. The use of glycerol also leads to cell destruction after thawing.

Известен способ хранения культур клеток в жидком состоянии под давлением 400-500 атм с охлаждением до (-5) - (-6)^oC [прототип].A known method of storing cell cultures in a liquid state under a pressure of 400-500 atm with cooling to (-5) - (-6) ^o C [prototype].

Однако этот способ не обеспечивает сохранности пространственной структурной организации клеточных ассоциаций и высокого уровня их жизнеспособности. However, this method does not ensure the preservation of the spatial structural organization of cell associations and the high level of their viability.

Задачей изобретения является обеспечение хранения клеточных культур в жидком состоянии с сохранением их пространственной 3-мерной структурной организации, возникшей в результате межклеточной адгезии и межклеточной кооперации. The objective of the invention is to ensure the storage of cell cultures in a liquid state while maintaining their spatial 3-dimensional structural organization that arose as a result of intercellular adhesion and intercellular cooperation.

Поставленная задача решается тем, что в способе хранения клеточных культур в суспензии путем охлаждения до (-3) - (-5)^oC при повышенном гидростатическом давлении согласно изобретению добавляют защитную питательную среду RPMI-1640 с добавлением 20%-ной фетальной сыворотки при поддерживании гидростатического давления в интервале от 450 до 550 атм.The problem is solved in that in the method of storing cell cultures in suspension by cooling to (-3) - (-5) ^o C under increased hydrostatic pressure according to the invention add a protective nutrient medium RPMI-1640 with the addition of 20% fetal serum while maintaining hydrostatic pressure in the range from 450 to 550 atm.

Существенными признаками изобретения являются:
- смешивание клеточной суспензии со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки;
- применение повышенного гидростатического давления 450 - 550 атм.The essential features of the invention are:
- mixing the cell suspension with fresh nutrient medium RPMI-1640 with the addition of 20% fetal serum;
- application of high hydrostatic pressure 450 - 550 atm.

Данный способ сохранения пространственной организации клеточных культур неизвестен из доступных литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень". This method of maintaining the spatial organization of cell cultures is unknown from available literature, which indicates the compliance of the claimed invention with the criterion of "novelty" and "inventive step".

Далее следует пример конкретного выполнения способа: культуры клеток человека, образующие 3-мерные структуры в суспензионном состоянии (лимфоцитарные и макрофагальные клеточные суспензии) смешивают со свежей питательной средой RPMI-1640 с добавлением в нее 20%-ной фетальной сыворотки и заполняют в стерильный пластиковый контейнер объемом 5 мл без воздушного зазора. Пластиковый контейнер помещают в камеру высокого давления, которая представляет собой цилиндр с завинчивающимися пробками и с электровводами для измерения давления, контроля температуры и термоэлементом для ее поддержания в заданном режиме. Полость камеры высокого давления заполнена селиконовым маслом, которое бесконтактно передает создаваемое в камере ручным способом давление (450-550 атм) образцу. Охлаждение образцов в камере достигается либо подачей через проточную систему камеры жидкого азота, либо в криостате до заданной температуры. Образец с клеточной культурой необходимый период времени (например, 6 мес или 1 год) хранится при заданных условиях. По окончании сроков хранения камеру либо вынимают из криостата, либо подогревают до комнатной температуры включением термоэлемента, после чего плавно в режиме 10-20 атм/мин сбрасывается гидростатическое давление до атмосферного. Указанная последовательность операций и плавный сброс давления необходимы для предотвращения повреждающего действия высокого давления на клеточные ассоциации и предотвращения их замерзания. В случае сброса давления до уровня атмосферного без предварительного повышения температуры образцов до комнатной температуры культура клеток может подвергнуться замерзанию при отрицательной (ниже 0^oC) температуре. Учет результатов производят до и после воздействия по жизнеспособности клеток окрашиванием 0,4%-ным раствором трипанового синего и последующим подсчетом живых и мертвых клеток в камере Горяева по обычной методике, а также по сохранности организации тестируемых клеточных субпопуляций в 3-мерных клеточных структурах (кластерах), - процент которых определяют в сравнении с контрольными клеточными культурами.The following is an example of a specific implementation of the method: human cell cultures forming 3-dimensional structures in suspension (lymphocytic and macrophage cell suspensions) are mixed with fresh RPMI-1640 nutrient medium with the addition of 20% fetal serum and filled into a sterile plastic container 5 ml without air gap. A plastic container is placed in a high-pressure chamber, which is a cylinder with screw caps and with electrical inputs for measuring pressure, temperature control and a thermocouple to maintain it in a given mode. The cavity of the high-pressure chamber is filled with selicon oil, which contactlessly transmits the pressure (450-550 atm) created in the chamber manually to the sample. The cooling of the samples in the chamber is achieved either by supplying liquid nitrogen through the flow system of the chamber or in a cryostat to a predetermined temperature. A sample with a cell culture for the required period of time (for example, 6 months or 1 year) is stored under specified conditions. At the end of the storage period, the chamber is either taken out of the cryostat or warmed up to room temperature by switching on the thermocouple, after which the hydrostatic pressure is gradually released to atmospheric pressure in the mode of 10-20 atm / min. The indicated sequence of operations and smooth depressurization are necessary to prevent the damaging effect of high pressure on cell associations and to prevent their freezing. In the case of pressure relief to atmospheric level without first raising the temperature of the samples to room temperature, the cell culture may undergo freezing at a negative (below 0 ^o C) temperature. The results are taken into account before and after exposure to cell viability by staining with a 0.4% solution of trypan blue and subsequent counting of living and dead cells in the Goryaev chamber according to the usual method, as well as by the safety of the organization of the tested cell subpopulations in 3-dimensional cell structures (clusters ), - the percentage of which is determined in comparison with control cell cultures.

В таблице приведены экспериментальные данные по конкретному выполнению заявленного изобретения. The table shows the experimental data on the specific implementation of the claimed invention.

Анализ таблицы показывает, что при известном способе (прототип) не сохраняется полная жизнеспособность клеток и 3-мерная структурная организация клеточной культуры нарушается уже через 24 ч их хранения в указанных условиях, а применение предлагаемого способа позволяет сохранять нативную структуру клеток долгое время. Analysis of the table shows that with the known method (prototype), the full viability of the cells is not preserved and the 3-dimensional structural organization of the cell culture is violated after 24 hours of storage under the indicated conditions, and the application of the proposed method allows you to maintain the native cell structure for a long time.

Литература
1. Авторское свидетельство СССР N 1822782 "Способ консервирования тромбоцитов", опубликовано БИ 23, 93.Literature
1. USSR author's certificate N 1822782 "Method for the preservation of platelets", published BI 23, 93.

2. Кривохарченко А.С., Серобян Г.А., Садовников В.Б. Криоэмбриобанки - перспективная технология консервации генетических ресурсов лабораторных, домашних и диких животных для практического использования. Труды IV Международной конференции и дискуссионный научный клуб. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф: "IT+ME'98", 1998, т.1, с.380-383. 2. Krivokharchenko A.S., Serobyan G.A., Sadovnikov V.B. Cryoembryobanks - a promising technology for the conservation of laboratory, domestic and wild animals' genetic resources for practical use. Proceedings of the IV International Conference and Discussion Scientific Club. Ukraine, Crimea, Yalta-Gurzuf: "IT + ME'98", 1998, v. 1, p. 380-383.

3. Гаврилов O.K., Кулешов Ю.Я. Массовая заготовка крови и ее компонентов. М.: Медицина, 1982. 3. Gavrilov O.K., Kuleshov Yu.Ya. Mass preparation of blood and its components. M .: Medicine, 1982.

4. Авторское свидетельство СССР N 1124974 "Способ хранения крови", опубликовано БИ 43, 84. 4. USSR author's certificate N 1124974 "Method for the storage of blood", published BI 43, 84.

Claims

A method of storing cell cultures in suspension by cooling to (-3) - (-5) ^o C under increased hydrostatic pressure, characterized in that a protective nutrient medium RPMI-1640 is added to the suspension of cell cultures with the addition of 20% fetal serum, and hydrostatic pressure is maintained in the range of 450 - 550 atm.