RU2158303C2

RU2158303C2 - Method of producing recombinant strains of bacterium escherichia coli biomass enriched with polypeptides with human cytokine properties

Info

Publication number: RU2158303C2
Application number: RU98118945A
Authority: RU
Inventors: Л.Р. Лебедев; А.В. Каньшина; Л.Л. Литовченко; Г.Н. Кривопалова; В.И. Масычева; Н.М. Пустошилова
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2000-10-27

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology. SUBSTANCE: invention relates to biosynthesis of human cytokines (tumor necrosis alpha- and beta-factor, granulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors) by recombinant strains of E. coli SG20050/pTNF311Δ, E. coli SG20050pLT21, E. coli SG20050/pGGG8 and E. coli SG20050/p280GM. For preparing inoculum with high content of plasmid-containing cells inoculate is treated with ampicillin in concentration 400-500 mcg/ml for 2-3 h. Ampicillin in concentration 100 mcg/ml is added to medium in the process of fermentation. Ampicillin is added in each 1-2 h of culture growth. EFFECT: decreased segregation nonstability of recombinant strains, increased content of end proteins in biomasses. 6 cl, 1 dwg, 6 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения биомасс рекомбинантных штаммов E.coli, содержащих плазмидные ДНК, кодирующие биосинтез цитокинов со свойствами факторов некроза опухолей α и β (ФНО-альфа и ФНО-бета), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и несущие в качестве селективного маркера ген bla (устойчивость к ампициллину). Полученные биомассы могут быть использованы для выделения и очистки из них рекомбинантных цитокинов: ФHO-α, ФHO-β, Г-КСФ и ГМ-КСФ, с целью их детального исследования и применения в медицинской практике. The invention relates to biotechnology and microbiology and is a method for producing biomass of recombinant E. coli strains containing plasmid DNA encoding the cytokine biosynthesis with the properties of tumor necrosis factors α and β (TNF-alpha and TNF-beta), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF ) and granulocyte macrophage of human colony-stimulating factor (GM-CSF) and carrying the bla gene (ampicillin resistance) as a selective marker. The obtained biomass can be used to isolate and purify recombinant cytokines from them: FHO-α, FHO-β, G-CSF and GM-CSF, for the purpose of their detailed study and application in medical practice.

Цитокины - это белки, вырабатываемые преимущественно активированными клетками иммунной системы и являющиеся медиаторами межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных взаимодействиях. Традиционно цитокины разделяют на несколько групп: интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухолей (ФНО), колониестимулирующие факторы (КСФ) и др. В организме они действуют взаимосвязанно, образуя единую цельную цитокиновую сеть [1,2]. Все это делает перспективным детальное исследование этих белков и применение в медицине [3-7] и, как следствие, актуальна разработка способов их получения. Cytokines are proteins produced primarily by activated cells of the immune system and are mediators of intercellular interactions in the immune response, hematopoiesis, inflammation, as well as intersystem interactions. Traditionally, cytokines are divided into several groups: interleukins, interferons, tumor necrosis factors (TNF), colony stimulating factors (CSF), and others. In the body, they act interconnectedly, forming a single whole cytokine network [1,2]. All this makes promising a detailed study of these proteins and their use in medicine [3-7] and, as a result, the development of methods for their preparation is relevant.

Известны способы получения цитокинов, основанные на использовании культуральной жидкости продуцирующих их клеточных линий [8-13]. Однако эти способы трудоемки, трудно масштабируемы, не позволяют получать белки в больших количествах; и только техника рекомбинантных ДНК позволила нарабатывать цитокины в количествах, доступных для широкомасштабного исследования и применения в медицинской практике. Способы получения рекомбинантных цитокинов микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных плазмид известны [14-24] и бурно развиваются [25-32]. Known methods for producing cytokines based on the use of culture fluid producing their cell lines [8-13]. However, these methods are laborious, difficult to scale, do not allow to obtain proteins in large quantities; and only the recombinant DNA technique allowed the production of cytokines in quantities available for large-scale research and use in medical practice. Methods for producing recombinant cytokines by microbiological synthesis using recombinant plasmids are known [14-24] and are rapidly developing [25-32].

Одной из первых основополагающих стадий технологии получения белков является стадия получения биомассы клеток рекомбинантного штамма-продуцента. Обычно, компетентные клетки штамма-реципиента (чаще всего клетки Escherichia coli) трансформируют плазмидой, несущей ген целевого белка и селективный генетический маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику). Трансформанты выращивают на среде с антибиотиком и далее размножают трансформированные клетки в ферментере с целью получения биомассы. При этом часто при выращивании клеток необходимо проводить индукцию промотора для экспрессии гена целевого белка с помощью специальных индукторов или повышением температуры [15,19-22] , что приводит к усложнению и удорожанию технологии производства. Наиболее технологично, когда целевой белок экспрессируется в ходе выращивания клеток постоянно, без индукции [16,17, 24-32]. Тем не менее практика показывает, что процесс получения качественной биомассы рекомбинантных штаммов-продуцентов крайне нестабилен, содержание целевых белков в ней невелико (от 3% до 10% от суммы клеточных белков), а также сильно варьирует от опыта к опыту [10,22,24,30,32] . Основной причиной нестабильности биомассы по продуктивности является сегрегация плазмид и селективное преимущество в скорости размножения клеток, не содержащих плазмиду [33-37]. Для повышения качества биомассы рекомбинантных штаммов авторы работ [33-36] рекомендуют тестировать отдельные клоны трансформантов на содержание целевого белка и использовать для получения инокулята наиболее продуктивные из них, в качестве посевного материала использовать культуру в первой трети - середине логарифмической фазы роста, усилить селективное давление на клетки в ходе ферментации путем повышения в среде концентрации антибиотика, подбором в ходе роста культуры оптимальной температуры для синтеза нужного метаболита. Первые две рекомендации авторов являются бесспорными и применимы для всех исследованных рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих ФHO-α, ФHO-β, α2- интерферон. Однако увеличение в среде концентрации антибиотика для усиления селективного давления, используемого успешно в работе [35] для культивирования штамма E. coli SG20050/pIFN16 - продуцента лейкоцитарного интерферона α2, не всегда резонно, т. к. может привести к резкому снижению скорости роста культуры и снижению выхода биомассы [34] . Изменение температуры при выращивании рекомбинантного штамма может привести не только к изменению уровня синтеза целевого белка, но и изменить его конформационное состояние [37,38]. Этот параметр в каждом случае требует специального исследования. One of the first fundamental stages of the technology for producing proteins is the stage of obtaining the biomass of cells of the recombinant producer strain. Typically, the competent cells of the recipient strain (most often Escherichia coli cells) are transformed with a plasmid carrying the target protein gene and a selective genetic marker (usually an antibiotic resistance gene). Transformants are grown on a medium with an antibiotic and then transformed cells are propagated in a fermenter in order to obtain biomass. Moreover, often when growing cells, it is necessary to induce a promoter for the expression of the target protein gene using special inducers or by raising the temperature [15, 19-22], which leads to the complication and cost of production technology. Most technologically, when the target protein is expressed during cell growth continuously, without induction [16.17, 24-32]. Nevertheless, practice shows that the process of obtaining high-quality biomass of recombinant producer strains is extremely unstable, the content of target proteins in it is small (from 3% to 10% of the sum of cellular proteins), and also varies greatly from experience to experience [10,22, 24,30,32]. The main reason for biomass instability in productivity is plasmid segregation and a selective advantage in the rate of reproduction of cells that do not contain a plasmid [33–37]. To improve the quality of the biomass of recombinant strains, the authors of [33-36] recommend testing individual transformant clones for the content of the target protein and use the most productive ones to obtain the inoculum, use the culture in the first third to the middle of the logarithmic growth phase as seed, increase selective pressure on cells during fermentation by increasing the concentration of the antibiotic in the medium, by selecting the optimum temperature for the synthesis of the desired metabolite during the growth of the culture. The first two recommendations of the authors are indisputable and applicable to all studied recombinant E. coli strains producing FHO-α, FHO-β, and α2-interferon. However, an increase in the concentration of the antibiotic in the medium to enhance the selective pressure, which was successfully used in [35] for the cultivation of E. coli strain SG20050 / pIFN16, a producer of leukocyte interferon α2, is not always reasonable, because it can lead to a sharp decrease in the growth rate of the culture and decrease in biomass yield [34]. A change in temperature during the cultivation of a recombinant strain can lead not only to a change in the level of synthesis of the target protein, but also to a change in its conformational state [37.38]. This parameter in each case requires special research.

Наиболее близким (прототипом) к заявляемому способу является способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека [39, прототип]. Стабилизация процесса биосинтеза лимфотоксина и повышение его процентного содержания в биомассе в 2,0-2,5 раза достигается путем отбора высокопродуктивных клонов клеток-трансформантов для получения посевного материала, получения посевного материала на плотной среде с добавлением в среду второго антибиотика - хлорамфеникола с целью увеличения амплификации плазмиды и сбором биомассы клеток в конце логарифмической фазы роста культуры. Совокупность указанных приемов позволяет получать биомассу с содержанием целевого белка 10-16% от суммы клеточных белков. К недостаткам способа следует отнести низкую технологичность на стадии получения посевного материала (инокулята), т.к. получение его на твердой питательной среде трудно масштабируется, и узкий специализированный прием увеличения плазмидной ДНК в штамме-продуценте, подходящий только для улучшения рекомбинантных штаммов, содержащих в плазмиде ген устойчивости к хлорамфениколу. The closest (prototype) to the claimed method is a method for producing biomass of a recombinant strain of bacteria E. coli enriched in a polypeptide with the properties of human lymphotoxin [39, prototype]. Stabilization of the process of biosynthesis of lymphotoxin and an increase in its percentage in biomass by a factor of 2.0-2.5 is achieved by selecting highly productive clones of transforming cells to obtain seed, to obtain seed in a solid medium with the addition of a second antibiotic, chloramphenicol, to increase amplification of the plasmid and collection of cell biomass at the end of the logarithmic phase of culture growth. The combination of these techniques allows you to get biomass with the content of the target protein 10-16% of the total cellular proteins. The disadvantages of the method include low adaptability at the stage of obtaining seed (inoculum), because obtaining it on a solid nutrient medium is difficult to scale, and a narrow specialized technique for increasing plasmid DNA in a producer strain is only suitable for improving recombinant strains containing the chloramphenicol resistance gene in the plasmid.

Технической задачей предлагаемого изобретения является стабилизация процессов биосинтеза группы человеческих цитокинов (ФHO-α, ФHO-β, Г-КСФ и ГМ-КСФ) и повышение их процентного содержания в биомассе рекомбинантных штаммов, содержащих в качестве селективного маркера ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину, Ap^r).The technical task of the invention is to stabilize the biosynthesis of a group of human cytokines (FHO-α, FHO-β, G-CSF and GM-CSF) and increase their percentage in the biomass of recombinant strains containing β-lactamase gene as a selective marker (resistance to ampicillin, Ap ^r ).

Задача решается путем обработки посевного материала ампициллином в повышенной концентрации (400-500 мкг/мл) с целью разрушения накопившихся бесплазмидных клеток и последующим дробным добавлением антибиотика в процессе ферментации. The problem is solved by treating the inoculum with ampicillin in an increased concentration (400-500 μg / ml) in order to destroy the accumulated plasmid-free cells and the subsequent fractional addition of the antibiotic in the fermentation process.

Сущность предлагаемого способа получения биомассы рекомбинантных штаммов E.coli заключается в следующем:
Плазмидой, содержащей целевой ген цитокина (pTNF311 Δ либо pLT21, либо pGG8, либо 280GM), трансформируют компетентные клетки Escherichia coli SG20050, трансформанты подращивают на плотной селективной среде (Ap, 50-150 мкг/мл) в течение 16-18 ч при температуре 30-32^oC. Колонии трансформантов анализируют на содержание целевого белка. Наиболее продуктивные засевают в жидкую селективную питательную среду (Ap, 50-150 мкг/мл) и выращивают до одной трети - середины логарифмической фазы роста. Затем в культуру добавляют ампициллин до концентрации 400-500 мкг/мл и инкубируют в течение 2-3 ч. Полученной культурой засевают ферментер с селективной питательной средой (Ap, 100 мкг/мл), и клетки выращивают до конца логарифмической фазы роста. При этом в ходе ферментации периодически через 1-2 ч добавляют ампициллин в концентрации 100 мкг/мл среды. В конце логарифмической фазы роста клетки собирают центрифугированием и используют для выделения цитокина сразу или после хранения при температуре -70^oC.The essence of the proposed method for producing biomass of recombinant E. coli strains is as follows:
A plasmid containing the target cytokine gene (pTNF311 Δ or pLT21, or pGG8, or 280GM) transforms Escherichia coli competent cells SG20050, transformants are grown in a dense selective medium (Ap, 50-150 μg / ml) for 16-18 hours at a temperature 30-32 ^o C. Colonies of transformants are analyzed for the content of the target protein. The most productive ones are seeded in a liquid selective nutrient medium (Ap, 50-150 μg / ml) and grown to one third - the middle of the logarithmic growth phase. Then, ampicillin is added to the culture to a concentration of 400-500 μg / ml and incubated for 2-3 hours. The resulting culture is seeded with a fermenter with selective nutrient medium (Ap, 100 μg / ml), and the cells are grown until the end of the logarithmic growth phase. Moreover, in the course of fermentation, ampicillin is added periodically after 1-2 hours at a concentration of 100 μg / ml of medium. At the end of the logarithmic growth phase, cells are harvested by centrifugation and used to isolate the cytokine immediately or after storage at a temperature of -70 ^o C.

Анализ посевного материала (инокулята) на содержание плазмидсодержащих клеток (Ap^r) показал, что их количество колеблется от опыта к опыту от 60 до 80% (табл. 1), т.е. около 20- 40% популяции клеток уже на стадии получения посевного материала даже из высокопродуктивных колоний трансформантов могут потерять плазмиду и далее, быстро размножаясь в процессе ферментации, вытеснят плазмидсодержащие клетки, что приведет к низкому качеству биомассы.Analysis of the inoculum (inoculum) for the content of plasmid-containing cells (Ap ^r ) showed that their number varies from experiment to experiment from 60 to 80% (Table 1), i.e. about 20–40% of the cell population already at the stage of inoculum production even from highly productive transformant colonies can lose the plasmid and then, rapidly multiplying during fermentation, displace plasmid-containing cells, which will lead to poor biomass quality.

Для удаления бесплазмидных клеток из инокулята используют обработку его ампициллином в повышенной концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч. При этом показано (табл.2), что после такой обработки бесплазмидные клетки E.coli SG20050 (Ap^s) практически полностью теряют жизнеспособность. Анализ культуральной жидкости на белок методом электрофореза показывает, что клетки лизируются (белки выходят в культуральную жидкость) (фиг. 1). Способность к росту трансформированных клеток E. coli после такой обработки полностью сохраняется (табл.2).To remove plasmid-free cells from the inoculum, treatment with ampicillin at an increased concentration of 400-500 μg / ml for 2-3 hours is used. It is shown (Table 2) that after such treatment, plasmid-free E. coli SG20050 (Ap ^s ) cells are practically completely lose their vitality. Analysis of the culture fluid for protein by electrophoresis shows that the cells are lysed (proteins enter the culture fluid) (Fig. 1). The ability to grow transformed E. coli cells after such treatment is fully preserved (Table 2).

Анализ популяции клеток посевного материала (инокулята) на содержание плазмидсодержащих клеток после обработки его высокими концентрациями (400-500 мкг/мл) ампициллина показал, что их количество увеличивается и составляет не менее 90% (данные табл. 1). Analysis of the cell population of inoculum (inoculum) for the content of plasmid-containing cells after processing it with high concentrations (400-500 μg / ml) of ampicillin showed that their number increases and is at least 90% (data in Table 1).

В связи с тем, что селекция по ампициллин резистентности не является эффективной, поскольку плазмидные клетки синтезируют β- лактамазу, которая, являясь секретируемым белком, разрушает ампициллин в среде, то с целью усиления селективного давления в ходе ферментации и подавления роста Ap^s клеток, появляющихся в ходе роста культуры в результате сегрегации плазмиды, необходимо периодически добавлять в среду ампициллин. Экспериментально показано, что целесообразно это делать при вступлении культуры в логарифмическую фазу роста, через каждые 1-2 ч.Due to the fact that selection for ampicillin resistance is not effective, since plasmid cells synthesize β-lactamase, which, as a secreted protein, destroys ampicillin in the medium, in order to increase selective pressure during fermentation and suppress the growth of Ap ^s cells that appear during culture growth as a result of plasmid segregation, ampicillin must be periodically added to the medium. It has been experimentally shown that it is advisable to do this when the culture enters the logarithmic phase of growth, every 1-2 hours.

Новыми по сравнению со способом-прототипом признаками являются: обработка посевного материала рекомбинантных штаммов ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч для удаления бесплазмидных клеток и дробное добавление в среду ампициллина в концентрации 100 мкг/мл при ферментации культуры в экспериментально подобранное время для снижения сегрегации плазмиды и накопления бесплазмидных клеток. New features in comparison with the prototype method are: treatment of inoculum of recombinant strains with ampicillin at a concentration of 400-500 μg / ml for 2-3 hours to remove plasmid-free cells and fractional addition of ampicillin at a concentration of 100 μg / ml to the medium during culture fermentation experimentally selected time to reduce plasmid segregation and accumulation of non-plasmid cells.

Совокупность указанных признаков позволяет повысить выход целевых белков в биомассе, стабилизировать процесс их биосинтеза и постоянно получать качественную биомассу рекомбинантных штаммов: E. coli SG200-50/pTNF311 Δ (продуцент ФHO-α), E.coli SG20050/pLT21 (продуцент ФHO-β), E.coli SG20050/pGGF8 (продуцент Г-КСФ) и E.coli SG20050/p280GM (продуцент ГМ-КСФ), содержащую целевые белки в количестве не менее 10% от суммы клеточных белков. Содержание ФHO-α в биомассе в среднем повысилось в 1,5 раза, ФHO-β - в 4 раза, Г-КСФ - в 2-3 раза и ГМ-КСФ - в 8 раз. The combination of these characteristics allows to increase the yield of target proteins in the biomass, to stabilize the process of their biosynthesis and to constantly obtain high-quality biomass of recombinant strains: E. coli SG200-50 / pTNF311 Δ (producer of FHO-α), E.coli SG20050 / pLT21 (producer of FHO-β ), E.coli SG20050 / pGGF8 (producer of G-CSF) and E.coli SG20050 / p280GM (producer of GM-CSF) containing the target proteins in an amount of at least 10% of the sum of cellular proteins. The content of PHO-α in biomass increased on average 1.5 times, PHO-β - 4 times, G-CSF - 2-3 times and GM-CSF - 8 times.

Графические материалы:
Фиг. 1. Анализ культуральной жидкости (без клеток) на наличие клеточных белков после инкубации клеток E.coli SG20050 с различными концентрациями ампициллина (мкг/мл): 1-0; 2-50; 3-100; 4-200; 5-400; 6-600; 7-800; 8-1000.Graphic materials:
FIG. 1. Analysis of the culture fluid (without cells) for the presence of cellular proteins after incubation of E. coli SG20050 cells with various concentrations of ampicillin (μg / ml): 1-0; 2-50; 3-100; 4-200; 5-400; 6-600; 7-800; 8-1000.

Ниже следуют примеры конкретного получения обогащенных цитокинами (ФHO-α, ФHO-β Г-КСФ и ГМ-КСФ) биомасс рекомбинантных штаммов E.coli SG20050, содержащих плазмиды с генами вышеперечисленных цитокинов и геном β-лактамазы (ген bla) в качестве селективного маркера. The following are examples of the specific preparation of cytokine-enriched (FHO-α, FHO-β G-CSF and GM-CSF) biomass recombinant E. coli strains SG20050 containing plasmids with the genes of the above cytokines and the β-lactamase gene (bla gene) as a selective marker .

Пример 1. Получение трансформированных клеток, отбор высокопродуктивных клонов и выращивание их в жидкой селективной среде
Трансформацию компетентных клеток E.coli SG20050 плазмидной ДНК pTNF311 Δ [40], или pLT21 [24], или pGGF8 [30], или p280GM [32] проводят кальциевым методом, как описано ранее [41]. Отбор высокопродуктивных клонов проводят, как описано в способе-прототипе [39]. Клоны с наибольшим содержанием целевого белка используют для получения инокулята. Их подращивают в L-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина при 32^oC до середины логарифмической фазы роста (Д₅₅₀ = 0,5-0,6).Example 1. Obtaining transformed cells, the selection of highly productive clones and growing them in a selective liquid medium
Transformation of competent E. coli SG20050 cells with plasmid DNA pTNF311 Δ [40], or pLT21 [24], or pGGF8 [30], or p280GM [32] is carried out by the calcium method, as described previously [41]. The selection of highly productive clones is carried out as described in the prototype method [39]. Clones with the highest content of the target protein are used to produce the inoculum. They are grown in L-broth containing 100 μg / ml ampicillin at 32 ^° C until the middle of the logarithmic growth phase (D ₅₅₀ = 0.5-0.6).

Анализ полученных клеток на содержание плазмидсодержащих клеток проводят методом, описанным в [42]. Полученные данные представлены в табл. 1 (графа 2). Analysis of the obtained cells for the content of plasmid-containing cells is carried out by the method described in [42]. The data obtained are presented in table. 1 (column 2).

Как видно из таблицы, процентное содержание Ap^r клеток в посевном материале колеблется от 60 до 85%.As can be seen from the table, the percentage of Ap ^r cells in the seed varies from 60 to 85%.

Пример 2. Влияние ампициллина на жизнеспособность реципиента E.coli SG20050 и рекомбинантного штамма E.coli SG20050/pGGF8. Example 2. The effect of ampicillin on the viability of the recipient E. coli SG20050 and the recombinant E. coli strain SG20050 / pGGF8.

Исследован процесс влияния различных концентраций ампициллина на жизнеспособность штамма-реципиента E. coli SG20050 и рекомбинантного штамма-продуцента Г-КСФ, данные представлены в табл.2 и фиг. 1. The process of the influence of various concentrations of ampicillin on the viability of the recipient strain of E. coli SG20050 and the recombinant producer strain G-CSF was studied, the data are presented in Table 2 and FIG. 1.

Как видно из табл.2, после инкубации реципиента клеток (Ap^s) в среде с антибиотиком (до 400 мкг/мл) в течение 1 ч, отдельные колонии сохраняют способность к росту при высеве на среду без селективного давления, тогда как после 3-часовой инкубации их роста не наблюдается. В то же время после инкубации трансформированных клеток (Ap^r) в тех же условиях их способность к росту практически не изменяется.As can be seen from table 2, after incubation of the cell recipient (Ap ^s ) in an environment with an antibiotic (up to 400 μg / ml) for 1 h, individual colonies retain the ability to grow when plated on the medium without selective pressure, whereas after 3- hourly incubation of their growth is not observed. At the same time, after incubation of transformed cells (Ap ^r ) under the same conditions, their ability to grow remains practically unchanged.

Из фиг. 1 видно, что при обработке реципиентных клеток антибиотиком в культуральной жидкости начинают обнаруживаться в значительных количествах клеточные белки E. coli при концентрациях ампициллина выше 400 мкг/мл, что указывает на лизис клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что до этих концентраций антибиотика происходит подавление роста бесплазмидных клеток, но они могут сохраняться в нативном состоянии, и при инактивации ампициллина β-лактамазой способны к интенсивному росту. После обработки клеточной популяции ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч можно ожидать гибель бесплазмидных клеток. From FIG. Figure 1 shows that when the recipient cells are treated with an antibiotic, significant amounts of E. coli cell proteins begin to be detected in the culture fluid at ampicillin concentrations above 400 μg / ml, which indicates cell lysis. The data obtained indicate that up to these antibiotic concentrations there is a suppression of the growth of non-plasmid cells, but they can remain in their native state, and upon inactivation of ampicillin with β-lactamase are capable of intensive growth. After treatment of the cell population with ampicillin at a concentration of 400-500 μg / ml for 2-3 hours, the death of non-plasmid cells can be expected.

Пример 3. Получение посевного материала с повышенным содержанием Ap^r клеток.Example 3. Obtaining seed with a high content of Ap ^r cells.

Отобранный высокопродуктивный клон, выращенный на чашке отдельно растущими колониями, смывают в жидкую среду в качалочные колбы с объемом L-бульона 200 мл и дозой ампициллина 100 мкг/мл. Подращивают культуру при температуре 32^oC и скорости вращения качалки 150-160 об/мин до первой трети - середины логарифмической фазы роста (Д₅₅₀=0,5-0,6). Далее проводят инкубацию с ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч.The selected highly productive clone grown on a plate by separately growing colonies is washed into a liquid medium in rocking flasks with a volume of 200 ml L-broth and a dose of ampicillin 100 μg / ml. Cultivate the culture at a temperature of 32 ^o C and a rotation speed of the rocking chair 150-160 rpm to the first third - the middle of the logarithmic growth phase (D ₅₅₀ = 0.5-0.6). Then, incubation with ampicillin is carried out at a concentration of 400-500 μg / ml for 2-3 hours.

В табл. 1 (графа 4) представлены результаты анализа полученной популяции клеток. Как видно из табл. 1, обработка инокулята антибиотиком в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 3 ч способствует повышению уровня Ap^r клеток, и их содержание достигает 90%.In the table. 1 (column 4) presents the results of the analysis of the obtained cell population. As can be seen from the table. 1, treatment of the inoculum with an antibiotic at a concentration of 400-500 μg / ml for 3 hours increases the level of Ap ^r cells, and their content reaches 90%.

Пример 4. Ферментация без дробного добавления ампициллина. Example 4. Fermentation without fractional addition of ampicillin.

Ферментацию проводят в качалочных колбах с объемом среды 250 мл или в ферментере "Ультраферм" с рабочим объемом 4 л при температуре 31-32^oC. Питательная среда - L-бульон, содержащий Ap в концентрации 100 мкг/мл. Скорость вращения качалки 150-160 об/мин. Скорость вращения мешалки в ферментере от 100 до 200 об/мин, подача воздуха 0,5-1,0 л/мин на 1 л среды. Для засева используют посевной материал, полученный, как описано в примере 3. Объем посевного материала 1% (об/об) от объема среды для ферментации. Время ферментации 9-10 ч. Заканчивают ферментацию в конце логарифмической фазы роста. Культуральную жидкость охлаждают до 5-10^oC, клетки собирают центрифугированием и хранят при температуре минус 70^oC. Данные по содержанию плазмидсодержащих клеток в ходе ферментации представлены в табл. 3-6 (графы 1-3).Fermentation is carried out in rocking flasks with a medium volume of 250 ml or in an Ultraferm fermenter with a working volume of 4 l at a temperature of 31-32 ^o C. Nutrient medium - L-broth containing Ap at a concentration of 100 μg / ml. The rotation speed of the rocking chair is 150-160 rpm. The speed of rotation of the mixer in the fermenter is from 100 to 200 rpm, the air supply is 0.5-1.0 l / min per 1 liter of medium. For sowing, seed is used that is obtained as described in Example 3. The seed volume is 1% (v / v) of the volume of the fermentation medium. The fermentation time is 9-10 hours. Fermentation is completed at the end of the logarithmic growth phase. The culture fluid is cooled to 5-10 ^o C, the cells are collected by centrifugation and stored at a temperature of minus 70 ^o C. Data on the content of plasmid-containing cells during fermentation are presented in table. 3-6 (columns 1-3).

Содержание целевого белка в биомассах колеблется от опыта к опыту и составляет от суммы клеточных белков в %: ФHO-α - 10-15%, ФHO-β - 1-3%, Г-КСФ - 1,0-4,0%, ГМ-КСФ - 1-4%. The content of the target protein in biomass varies from experiment to experiment and amounts to the sum of cellular proteins in%: FHO-α - 10-15%, FHO-β - 1-3%, G-CSF - 1.0-4.0%, GM-CSF - 1-4%.

Пример 5. Ферментация с дробным добавлением ампициллина. Example 5. Fermentation with fractional addition of ampicillin.

Ферментацию проводят, как описано в примере 4, за исключением того, что в процессе ферментации через каждые 1-2 ч роста добавляют в среду ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. Данные по содержанию плазмидсодержащих клеток в процессе ферментации представлены в табл. 3-6 (графы 4-7). Целевые белки в биомассах всегда присутствуют в количестве не ниже 10% от суммы клеточных белков: ФHO-α - 15 -25%, ФHO-β - 10-16%, Г-КСФ - 10-12%, ГМ-КСФ - 10%. Fermentation is carried out as described in example 4, except that in the fermentation process, ampicillin is added to the medium every 100 hours to a concentration of 100 μg / ml. Data on the content of plasmid-containing cells during the fermentation process are presented in table. 3-6 (columns 4-7). Target proteins in biomass are always present in an amount of not less than 10% of the sum of cellular proteins: FHO-α - 15-25%, FHO-β - 10-16%, G-CSF - 10-12%, GM-CSF - 10% .

Таким образом, предлагаемый способ получения биомасс рекомбинантных штаммов E.coli SG20050, содержащих ген bla в качестве селективного маркера, позволяет стабилизировать процесс биосинтеза 4-х целевых белков-цитокинов, исключить "холостые" производственные ферментации и повысить их содержание в биомассе: ФHO-α в 1,5 раза, Г-КСФ и ГМ-КСФ в 2-3 раза. Содержание ФHO-β в биомассе не ниже, чем в способе-прототипе, но процесс получения инокулята универсален и легко масштабируется. Thus, the proposed method for producing biomass of recombinant strains of E. coli SG20050 containing the bla gene as a selective marker allows to stabilize the biosynthesis of 4 target cytokine proteins, to exclude “idle” production fermentations and increase their content in biomass: ФHO-α 1.5 times, G-CSF and GM-CSF 2-3 times. The content of FHO-β in the biomass is not lower than in the prototype method, but the inoculum production process is universal and easily scalable.

ЛИТЕРАТУРА
1. Кетлинский С.А., Симбирцев А. С., Воробьев А.А. // Эндогенные иммуно-модуляторы.- СПб: Гиппократ.- 1992.- С.256.LITERATURE
1. Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S., Vorobyov A.A. // Endogenous immuno-modulators. - St. Petersburg: Hippocrates. - 1992. - P.256.

2. ЯрилинА.А.//Иммунология.- 1997.-N 5.-С.7-14. 2. Yarilin A.A. // Immunology.- 1997.-N 5.-C.7-14.

3. Варпаховская И. //Remedium. 1998.- N 2.- Р.45-49. 3. Varpakhovskaya I. // Remedium. 1998.- N 2.- P. 45-49.

4. Моисеенко В.М. //Вопросы онкологии.- 1998.- Т.44.- N1.-С. 120-125. 4. Moiseenko V.M. // Questions of oncology.- 1998.- T.44.- N1.-S. 120-125.

5. Нейпоген. Информационные материалы фирмы Ф.Хоффманн-Ля Рощ АГ, Базель, Швейцария.- 1993. 5. Neupogen. Information materials of the company F. Hoffmann-La Grove AG, Basel, Switzerland. - 1993.

6. Смирнова Н.Б. // Клиническая фармакология и терапия.- 1995.-N 4.-С. 49-51. 6. Smirnova N.B. // Clinical pharmacology and therapy.- 1995.-N 4.- С. 49-51.

7. Лейкомакс. Информационные материалы фирмы "Sandoz".- Базель.- Швейцария.- 1993-1994. 7. Leukomax. Information materials of the company "Sandoz" .- Basel.- Switzerland.- 1993-1994.

8. Патент США N 48333127, кл. A 61 K 37/02, 1989. 8. US patent N 48333127, CL. A 61 K 37/02, 1989.

9. Nomura Н., Imazeki I., Oheda M., Kubota N et al.// EMBO J.-1986.- N 5.-P.871-876. 9. Nomura N., Imazeki I., Oheda M., Kubota N et al. // EMBO J.-1986.- N 5.-P.871-876.

10. Европ. патент N 215126, кл. C 12 N 15/00. - 1987. 10. Europe. Patent N 215126, class C 12 N 15/00. - 1987.

11. Патент США N 4604284, кл. A 61 K 37/02; C 07 K 13/00; C 12 P 21/00, опубл. 05.08.1986. 11. US patent N 4604284, CL. A 61 K 37/02; C 07 K 13/00; C 12 P 21/00, publ. 08/05/1986.

12. Aggarwal B.B., Moffat В. and Harkins R.N. //J. Biol. Chem.- 1984.- V.259.- N 1.- P.686-691. 12. Aggarwal B.B., Moffat B. and Harkins R.N. // J. Biol. Chem .- 1984.- V.259.- N 1.- P.686-691.

13. Lee F., Yokota Т., Otsuka T. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- V.82.- P.4360-4364. 13. Lee F., Yokota T., Otsuka T. et al. // Proc. Natl. Acad Sci. USA.- 1985.- V.82.- P.4360-4364.

14. Заявка WO 86/03751, кл. A 61 K 37/02, 45/02, опубл. 03.10.1986. 14. Application WO 86/03751, cl. A 61 K 37/02, 45/02, publ. 10/03/1986.

15. А.С. СССР 1614765, кл. C 12 N 15/28, опубл. 15.12.1990. 15. A.S. USSR 1614765, class C 12 N 15/28, publ. 12/15/1990.

16. Shirai Т. , Yamaguch H., ltoH. et al. //Nature, 1985.- V.313.- P. 803-806. 16. Shirai, T., Yamaguch H., ltoH. et al. // Nature, 1985.- V.313.- P. 803-806.

17. Тихонов Р. В., Якимов С.А., Коробко В.Г., Вульфсон А.Н. // Биоорг. Химия.- 1996.- Т.22.- N3.- C.163- 167. 17. Tikhonov R.V., Yakimov S.A., Korobko V.G., Wulfson A.N. // Bioorg. Chemistry.- 1996.- T.22.- N3.- C.163- 167.

18. Патент США 4617378, кл. C 07 K 15/26, опубл. 14.10.1986. 18. US Patent 4,617,378, cl. C 07 K 15/26, publ. 10/14/1986.

19. Heng-Fong Seow, Cynthia R.Coh, Kristman L., Porter A. // Biotechnology.-1989.- V.7.-N 4.- P.363-368. 19. Heng-Fong Seow, Cynthia R. Coh, Kristman L., Porter A. // Biotechnology.-1989.- V.7.-N 4.- P.363-368.

20. Schoenfeld H. J. , Poesche D., Frey J.R. et al. // J. Biol. Chem.- 1991.- V.266.-N 6.- P.3863-3869. 20. Schoenfeld H. J., Poesche D., Frey J.R. et al. // J. Biol. Chem .- 1991.- V.266.-N 6.- P.3863-3869.

21. Европ. патент N215126, кл. C 12 N 15/00, 1987. 21. Europe. Patent N215126, CL C 12 N 15/00, 1987.

22. Патент США N 4810643, кл. C 12 N 15/00, 1989. 22. U.S. Patent No. 4,810,643, cl. C 12 N 15/00, 1989.

23. Европ. патент N 0299782, кл. C 07 K 13/00, опубл. 18.01.1989. Б. 89/03. 23. Europe. patent N 0299782, class C 07 K 13/00, publ. 01/18/1989. B. 89/03.

24. Патент РФ N2048521, кл. C 12 P 21/00, 1992. 24. RF patent N2048521, cl. C 12 P 21/00, 1992.

25. Патент РФ 2101292, кл. C 07 K 1/36, C 12 P 21/00, опубл. 10.01.1989, Б N1. 25. RF patent 2101292, cl. C 07 K 1/36, C 12 P 21/00, publ. 01/10/1989, B N1.

26. Патент РФ 2102988, кл. A 61 K 35/00, 35/26, 35/76, 39/00, опубл. 27.01.1998, Б N3. 26. RF patent 2102988, cl. A 61 K 35/00, 35/26, 35/76, 39/00, publ. 01/27/1998, B N3.

27. Патент РФ N2082430, кл. A 61 K 38/21, опубл. БМ N 8, 1997. 27. RF patent N2082430, cl. A 61 K 38/21, publ. BM N 8, 1997.

28. Заявка на патент РФ N 97110634 от 20.06.97. 28. Application for patent of the Russian Federation N 97110634 from 06/20/97.

29. Заявка на патент РФ N97105785 от 10.04.1997. 29. Application for a patent of the Russian Federation N97105785 dated 04/10/1997.

30. Заявка на патент РФ N96113021. От 21.06. 1996. Положительное решение от 26.09.1997. 30. Application for patent of the Russian Federation N96113021. From 06.21. 1996. Positive decision of September 26, 1997.

31. Заявка на патент РФ N 97106895 от 23.04.1997. 31. Application for patent of the Russian Federation N 97106895 from 04/23/1997.

32. Патент РФ N2091488, кл. C 12 N 1/21, опубл. БИ N27, 1997. 32. RF patent N2091488, cl. C 12 N 1/21, publ. BI N27, 1997.

33. Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Пустошилова Н.М. и др. // Биотехнология.- 1995.- N 12.- С. 19-24. 33. Lebedev L.R., Zernov Yu.P., Pustoshilova N.M. and others // Biotechnology.- 1995.- N 12.- S. 19-24.

34. Андреева И. С., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. // Биотехнология.-1996.- N1.- С.9-12. 34. Andreeva I.S., Lebedev L.R., Pustoshilova N.M. // Biotechnology.-1996.- N1.- P.9-12.

35. Андреева И.С., Закабунин А.И., Пучкова Л.И. и др. // Биотехнология.- 1996.- N10.- С.18-23. 35. Andreeva I.S., Zakabunin A.I., Puchkova L.I. and others // Biotechnology.- 1996.- N10.- P.18-23.

36. Лебедев Л. Р. , Пустошилова Н.М., Синичкина С.А., Андрева И.С. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т.34.- N1.- С.120-126. 36. Lebedev L.R., Pustoshilova N.M., Sinichkina S.A., Andreva I.S. // Applied biochemistry and microbiology.- 1998.- T.34.- N1.- P.120-126.

37. Шмелев В.А., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.Ю. и др. // Мол. генет. микробиол. и вирусол.- 1995.- N1.- С.9-14. 37. Shmelev V.A., Bunina Z.F., Kudryavtseva T.Yu. and others // Mol. a gene. microbiol. and viralol .- 1995.- N1.- P.9-14.

38. A.C. 1712416, кл. C 12 N 15/00. 38. A.C. 1712416, class C 12 N 15/00.

39. Способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека.//Заявка N 97103807, положительное решение от 23.04.1998. 39. A method of obtaining a biomass of a recombinant strain of bacteria E. coli enriched in a polypeptide with the properties of human lymphotoxin. // Application N 97103807, positive decision from 04/23/1998.

40. Патент РФ N 1445193, кл. 6 C 12 N 15/28. Опубл. 20.03.96, Б. N8. 40. RF patent N 1445193, class. 6 C 12 N 15/28. Publ. 03/20/96, B. N8.

41. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование.- М.: Мир.- 1984. С. 41. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. // Molecular Cloning. - M.: Mir. - 1984. S.

42. Луста К.А., Фихте Б.А. // Методы определения жизнеспособности микроорганизмов.- Пущино.: ОНТИ НЦБИ СССР. 1990.- С. 186. 42. Lusta K.A., Fichte B.A. // Methods for determining the viability of microorganisms. - Pushchino .: ONTI NTsBI USSR. 1990.- S. 186.

Claims

1. A method for producing biomass of recombinant strains of Escherichia coli bacteria enriched in polypeptides with human cytokine properties, comprising transforming competent Escherichia coli cells with plasmids containing human cytokine genes, plating on selective medium containing ampicillin, obtaining an inoculum from preselected highly productive clones, fermentation and collection biomass, characterized in that the transformation of competent cells is carried out by plasmids containing the bla gene as a selective marker, and to obtain kulyata high plazmidosoderzhaschih cells spend processing inoculum ampicillin at a concentration of 400 - 500 micrograms / ml for 2 - 3 hours and the addition of this fraction same antibiotic in the fermentation process every 1 - 2 hours the culture growth.

2. The method according to p. 1, characterized in that the strain of bacteria Escherichia coli SG 20050 is used as the recipient strain.

3. The method according to claim 1, characterized in that the competent cells are transformed with the plasmid pTNF311Δ containing the human tumor necrosis factor-α gene (TNF-α).

4. The method according to claim 1, characterized in that the transformation of competent cells is carried out by plasmid pLT21 containing the gene for human tumor necrosis factor-β (TNF-β).

5. The method according to claim 1, characterized in that the cell transformation is carried out by the plasmid pGGF8 containing the gene of granulocyte colony-stimulating human factor.

6. The method according to claim 1, characterized in that the transformation of competent cells is carried out by the plasmid p28GM containing the granulocyte macrophage gene of human colony stimulating factor.