RU2154494C2

RU2154494C2 - Complex of insulin analog and protamine, method of preparing, pharmaceutical composition and method of diabetic treatment

Info

Publication number: RU2154494C2
Application number: RU95109842A
Authority: RU
Inventors: Розарио Де ФЕЛИППИС Майкл
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2000-08-20

Abstract

FIELD: medicine, endocrinology, hormones, pharmacy. SUBSTANCE: invention relates to different parenteral pharmaceutical compositions that have monomeric insulin analog, zinc, protamine and phenolic derivative. Compositions of analog provide prolonged effect. Invention describes also method of preparing the composition insulin analog-protamine. Invention involves also description of method of treatment of diabetics using the complex of insulin and protamine and pharmaceutical composition containing said. EFFECT: development of agents used for treatment of diabetics, prolonged effect of agent. 31 cl, 1 tbl, 13 ex, 3 dwg

Description

Изобретение относится к мономерным аналогам человеческого инсулина. В частности, настоящее изобретение относится к различным парентеральным композициям, которые включают аналог мономерного инсулина, цинк, протамин и фенольное производное. Композиции обеспечивают пролонгирующее действие. Также описывается способ получения композиций инсулиновый аналог-протамин. The invention relates to monomeric analogues of human insulin. In particular, the present invention relates to various parenteral compositions, which include an analogue of monomeric insulin, zinc, protamine and a phenolic derivative. Compositions provide a prolonged effect. Also described is a method for producing insulin analog-protamine compositions.

Со времени введения инсулина в 20-х годах XX в. непрерывно предпринимаются шаги для улучшения лечения сахарного диабета. Основные успехи достигнуты в чистоте инсулина и его доступности в связи с разработкой технологии с использованием рекомбинантной ДНК. Разработаны различные композиции с различными временами действия. В настоящее время, вообще говоря, существуют семь коммерчески доступных инсулиновых композиций: регулярный инсулин, инсулин семиленте, глобин инсулин, изофан инсулин, суспензия цинк инсулина, протамин-цинк-инсулин, инсулин ультраленте. Since the introduction of insulin in the 20s of the XX century. continuous steps are being taken to improve the treatment of diabetes. The main successes were achieved in the purity of insulin and its availability in connection with the development of technology using recombinant DNA. Various compositions with different times of action have been developed. Currently, generally speaking, there are seven commercially available insulin compositions: regular insulin, insulin semilent, insulin globin, insulin isofan, insulin zinc suspension, protamine-zinc-insulin, insulin ultralente.

Несмотря на множество пригодных композиций, при лечении с помощью подкожных инъекций пациент все еще нуждается в удобном регулировании и нормализованном гликемическом контроле. Частые переходы от нормальных гликемических уровней на протяжения жизни пациентов ведут к гипер- или гипогликемии и отдаленным осложнениям, включая ретинопатию, нейропатию, нефропатию, и микро- и макроангиопатию. Despite the many suitable compositions, in the treatment with subcutaneous injections the patient still needs convenient regulation and normalized glycemic control. Frequent transitions from normal glycemic levels over the course of a patient’s life lead to hyper- or hypoglycemia and long-term complications, including retinopathy, neuropathy, nephropathy, and micro- and macroangiopathy.

Чтобы помочь избежать экстремальных гликемических уровней, диабетики часто практикуют терапию с помощью многократных инъекций посредством введения инсулина перед каждым приемом пищи. Однако эта терапия все же неоптимальна. Коммерчески доступный самый быстродействующий инсулин дает пик слишком поздно после инъекции, и его действие продолжается слишком долго до оптимальных уровней глюкозы. Поэтому значительные усилия направлены на создание инсулиновых композиций и композиций инсулинового аналога, которые изменяют кинетику процесса подкожной абсорбции. To help avoid extreme glycemic levels, diabetics often practice multiple injection therapy by administering insulin before each meal. However, this therapy is still not optimal. The commercially available fastest-acting insulin peaks too late after injection and lasts too long for optimal glucose levels. Therefore, considerable efforts are directed to the creation of insulin compositions and insulin analog compositions that alter the kinetics of the subcutaneous absorption process.

Поскольку все коммерческие фармацевтические композиции инсулина содержат инсулин в самоассоциированном состоянии и преимущественно в гексамерной форме, полагают, что стадия, лимитирующая скорость абсорбции инсулина из депо при подкожной инъекции в кровоток, представляет собой диссоциацию самоагрегированного гексамера инсулина. Недавно разработаны мономерные инсулиновые аналоги, которые менее склонны к ассоциации с образованием форм с более высокой молекулярной массой, чем человеческий инсулин. Эта потеря самоассоциации обусловлена модификациями аминокислотной последовательности человеческого инсулина, которые уменьшают ассоциацию с помощью главным образом, разрушения образования димеров (cм., например, Brems et al., Protein Engineering 5: 6, 527-533 (1992) и Brange et al., Nature, 333:679-682 (1988)). В соответствии с этим мономерные инсулиновые аналоги обладают относительно более быстрым началом активности при сохранении биологической активности природного человеческого инсулина. Эти инсулиновые аналоги обеспечивают быструю абсорбцию, устанавливая время инъекции и пик действия инсулина в большей близости к возникающему после приема пищи изменению уровня глюкозы, связанному с ответом на прием пищи. Since all commercial insulin pharmaceutical compositions contain insulin in a self-associated state and predominantly in hexameric form, it is believed that the stage that limits the rate of absorption of insulin from the depot upon subcutaneous injection into the bloodstream is the dissociation of the self-aggregated insulin hexamer. Recently monomeric insulin analogues have been developed that are less likely to associate with the formation of forms with a higher molecular weight than human insulin. This loss of self-association is due to modifications in the amino acid sequence of human insulin, which reduce association by mainly destroying the formation of dimers (see, for example, Brems et al., Protein Engineering 5: 6, 527-533 (1992) and Brange et al., Nature, 333: 679-682 (1988)). Accordingly, monomeric insulin analogues have a relatively faster onset of activity while maintaining the biological activity of natural human insulin. These insulin analogs provide rapid absorption by setting the time of injection and peak action of insulin in closer proximity to the post-food change in glucose level associated with the response to food intake.

Физические свойства и характеристики мономерных аналогов не аналогичны инсулину. Например, Brems et al. раскрывает, что различные мономерные аналоги имеют небольшую или не имеют вообще склонность к ассоциации, вызываемую Zn. Любая ассоциация, которая наблюдается, представляет собой множество образований с более высокой молекулярной массой. Это сильно отличается от инсулина, который находится почти в исключительно упорядоченной гексамерной конформации в присутствии цинка. Brange et al., Diabetes 13:923-954 (1990) быстродействующие характеристики аналогов приписывают отсутствию ассоциации. Поскольку аналоги имеют меньшую тенденцию ассоциировать, то совсем удивительно, что мономерный инсулиновый аналог может быть приготовлен таким образом, чтобы обеспечить среднюю продолжительность действия. The physical properties and characteristics of monomeric analogues are not similar to insulin. For example, Brems et al. discloses that various monomeric analogs have little or no association tendency caused by Zn. Any association that is observed is a multitude of higher molecular weight formations. This is very different from insulin, which is almost exclusively ordered hexamer conformation in the presence of zinc. Brange et al., Diabetes 13: 923-954 (1990) attribute the high-speed characteristics of analogues to the lack of association. Since analogues have a lesser tendency to associate, it is very surprising that a monomeric insulin analog can be prepared in such a way as to provide an average duration of action.

Настоящее изобретение предлагает композицию, содержащую мономерный инсулиновый аналог, которая обладает при использовании средней продолжительностью действия. Кроме того, изобретение обеспечивает новый протаминовый кристалл, называемый инсулиновым NPD-аналогом. Настоящее изобретение также обеспечивает смесь инсулинового NPD-аналога и растворимого мономерного инсулинового аналога. Эта смесь обеспечивает быстрое начало действия и промежуточную продолжительность действия. В соответствии с этим смесь обладает преимуществами как перед инсулином, так и перед мономерным аналогом. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения однородных кристаллов инсулинового аналога-NPD. The present invention provides a composition comprising a monomeric insulin analogue which has an average duration of use when used. In addition, the invention provides a new protamine crystal called an insulin NPD analogue. The present invention also provides a mixture of an insulin NPD analog and a soluble monomeric insulin analog. This mixture provides a fast onset of action and an intermediate duration of action. Accordingly, the mixture has advantages over both insulin and the monomeric analogue. In addition, the present invention provides a method for producing uniform crystals of the insulin analog NPD.

Это изобретение предлагает композицию, содержащую систему инсулиновый аналог-протамин, которая включает мономерный инсулиновый аналог, протамин, цинк и фенольное производное. This invention provides a composition comprising an insulin analog-protamine system, which comprises a monomeric insulin analog, protamine, zinc and a phenolic derivative.

Кроме того, изобретение обеспечивает комплекс из кристаллического инсулинового аналога и протамина. Этот комплекс определяют как инсулиновый аналог-NRD. Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин-NRD включает Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин, 0,27-0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога, 0,35-0,9% цинка по весу и фенольное производное.In addition, the invention provides a complex of crystalline insulin analogue and protamine. This complex is defined as the insulin analog NRD. Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin-NRD includes Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin, 0.27-0.32 mg protamine / 100 Units of insulin analogue, 0.35-0.9% zinc by weight and phenolic derivative.

Это изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения комплекса Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин-NRD, который включает:
смешение водного раствора Lys^B28Pro^B29-человеческого инсулина в гексамерном ассоциированном состоянии и раствора протамина при температуре от около 8 до около 22^oC;
указанный водный раствор включает от 0,35 до 0,9% цинка по весу, Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин и фенольное производное при pH от около 7,1 до около 7,6;
указанный раствор протамина включает протамин при pH от 7,1 до 7,6, такой что финальная концентрация протамина составляет около 0,27 до около 0,32 мг протамина/100 E инсулинового аналога.This invention, in addition, provides a method for producing a complex of Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin-NRD, which includes:
mixing an aqueous solution of Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin in the hexameric associated state and a protamine solution at a temperature of from about 8 to about 22 ^o C;
said aqueous solution comprises from 0.35 to 0.9% zinc by weight, Lys ^B28 Pro ^{B29 is a} human insulin and phenolic derivative at a pH of from about 7.1 to about 7.6;
said protamine solution comprises protamine at a pH of from 7.1 to 7.6, such that the final concentration of protamine is about 0.27 to about 0.32 mg of protamine / 100 E insulin analogue.

Изобретение также обеспечивает композиции, обладающие как быстрым, так и средним действием. Композиции представляют собой смеси мономерного инсулинового аналога и кристаллического инсулинового аналога-NRD, в которых весовое отношение двух компонентов составляет около 1-99:99-1. The invention also provides compositions having both quick and medium action. The compositions are mixtures of a monomeric insulin analog and a crystalline insulin analog-NRD, in which the weight ratio of the two components is about 1-99: 99-1.

Наконец, изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего сахарным диабетом, который включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей кристаллы комплекса инсулиновый аналог-протамин. Finally, the invention provides a method of treating a patient suffering from diabetes mellitus, which comprises administering to said patient a pharmaceutical composition comprising crystals of an insulin analog-protamine complex.

Фиг. 1 представляет собой графическое изображение профиля действия Lys^B28Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина-NPH. График представляет собой зависимость мкEд/мл от времени вливания. Фиг. 1 демонстрирует преимущества настоящего изобретения.FIG. 1 is a graphical representation of the action profile of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD and human insulin-NPH. The graph is a plot of μEd / ml versus the time of infusion. FIG. 1 shows the advantages of the present invention.

Фиг. 2 представляет собой изображение кристаллов Asp^B28-человеческий инсулин-протамин настоящего изобретения. Изображение приводится при 1000х увеличении c дифференциальным фазовым контрастом.FIG. 2 is an image of crystals of Asp ^B28 -human insulin-protamine of the present invention. The image is shown at 1000x magnification with differential phase contrast.

Фиг. 3 представляет собой изображение кристаллов Lys^B28Pro^B29-hI-протамин настоящего изобретения. Изображение приводится при 1000х увеличении с дифференциальным фазовым контрастом.FIG. 3 is an image of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-protamine crystals of the present invention. Image is shown at 1000x magnification with differential phase contrast.

Как отмечалось выше, изобретение обеспечивает различные композиции мономерного инсулинового аналога. Используемый здесь термин "мономерный инсулиновый аналог" или "инсулиновый аналог" означает быстродействующий инсулиновый аналог, который менее склонен к димеризации или самоассоциации. Мономерный инсулиновый аналог представляет собой человеческий инсулин, в котором Pro в положении B28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala и Lys в положении B29 есть лизин или пролин; des (B28-B30); или des (B27). Мономерные инсулиновые аналоги описаны Chance et al., EPO рublication 383472 и Brange et al., EPO publication 214826, на которые здесь ссылаются. As noted above, the invention provides various compositions of a monomeric insulin analogue. As used herein, the term “monomeric insulin analogue” or “insulin analogue” means a fast-acting insulin analogue that is less prone to dimerization or self-association. The monomeric insulin analogue is human insulin in which Pro at position B28 is replaced by Asp, Lys, Leu, Val or Ala, and Lys at position B29 is lysine or proline; des (B28-B30); or des (B27). Monomeric insulin analogs are described by Chance et al., EPO publication 383472 and Brange et al., EPO publication 214826, which are referred to here.

Специалисту в данной области должно быть известно, что возможны другие модификации для мономерного инсулинового аналога. Эти модификации широко известны в данной области и включают замещение гистидинового остатка в положении B10 на аспарагиновую кислоту; замещение остатка фенилаланина в положении B1 на аспарагиновую кислоту; замещение остатка треонина в положении B30 на аланин; замещение остатка серина в положении B9 на аспарагиновую кислоту; утрату аминокислот только в положении B1 или в комбинации с потерей в положении B2; и потерю треонина в положении B30. One of skill in the art would recognize that other modifications are possible for the monomeric insulin analogue. These modifications are widely known in the art and include the substitution of the histidine residue at position B10 for aspartic acid; substitution of the phenylalanine residue at position B1 with aspartic acid; substitution of the threonine residue at position B30 with alanine; substitution of the serine residue at position B9 with aspartic acid; loss of amino acids only at position B1 or in combination with loss at position B2; and loss of threonine at position B30.

Используемые в этом описании аббревиатуры всех аминокислот являются аббревиатурами, принятыми United States Patent & Trademark Office как указано в 37 CFR, параграф 1.822(b) (2). Особенно предпочтительными мономерными инсулиновыми аналогами являются Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин (B28 есть Lys; B29 есть Pro) и Asp^B28-человеческий инсулин (B28 есть Asp).The abbreviations of all amino acids used in this description are abbreviations adopted by the United States Patent & Trademark Office as indicated in 37 CFR, paragraph 1.822 (b) (2). Particularly preferred monomeric insulin analogs are Lys ^B28 Pro ^B29 human insulin (B28 is Lys; B29 is Pro) and Asp ^{B28 is} human insulin (B28 is Asp).

Термин "мономерный инсулиновый аналог-NPD" или "инсулиновый аналог-NРD" означает суспензию кристаллического инсулинового аналога и протамина в композиции. NPD представляет собой композицию протамина согласно De Felippis. Композицию получают в соответствии с заявляемым способом, описанным здесь. Родственный термин "кристаллы инсулинового аналога-NPD", "кристаллический инсулиновый аналог-NPD" или кристаллы Lys^B28Pro²⁹-человеческий инсулин-протамин относится к кристаллам инсулиновый аналог-протамин в NPD композиции.The term "monomeric insulin analog-NPD" or "insulin analog-NPD" means a suspension of crystalline insulin analog and protamine in the composition. NPD is a protamine composition according to De Felippis. The composition is prepared in accordance with the inventive method described herein. The related term “insulin analog-NPD crystals”, “crystalline insulin analog-NPD” or Lys ^B28 Pro ²⁹ crystals — human insulin-protamine refers to insulin analog-protamine crystals in an NPD composition.

Используемый здесь термин "лечение" описывает оказание помощи и уход за пациентом с целью борьбы с болезнью, состоянием или расстройством и включает введение соединения настоящего изобретения с целью предотвратить начало наступления заболевания или осложнений, облегчения симптомов или осложнений, или ликвидации заболевания, состояния или нарушения. As used herein, the term “treating” describes the care and care of a patient to combat a disease, condition or disorder, and includes the administration of a compound of the present invention to prevent the onset of a disease or complications, alleviate symptoms or complications, or eradicate a disease, condition or disorder.

Термин "изотонический агент" относится к агенту, который является физиологически толерантным и который придает подходящий тонус композиции, чтобы предотвратить сеточный поток воды через клеточную мембрану. Соединения, такие как глицерин, обычно используют для таких целей в известных концентрациях. Концентрация изотонического агента лежит в диапазоне, известном в области применения для композиций инсулина. The term "isotonic agent" refers to an agent that is physiologically tolerant and which imparts a suitable tone to the composition to prevent a net flow of water through the cell membrane. Compounds, such as glycerin, are usually used for such purposes in known concentrations. The concentration of the isotonic agent lies in the range known in the field of application for insulin compositions.

Термин "фенольное производное" обозначает м-крезол, фенол или предпочтительно смесь м-крезола и фенола. The term “phenolic derivative” means m-cresol, phenol, or preferably a mixture of m-cresol and phenol.

Термин "в расчете на свободное основание" указывает на количество протамина в композиции. Расчет на свободное основание корректирует содержание воды и содержание солей протамина, коммерчески приемлемых и обычно используемых в парентеральных композициях. Предпочтительный протамин, сульфат протамина, составляет приблизительно 80% протамина. The term “calculated on the free base” indicates the amount of protamine in the composition. The free base calculation adjusts the water content and the content of protamine salts commercially acceptable and commonly used in parenteral formulations. A preferred protamine, protamine sulfate, is about 80% protamine.

Термин "IU" или "U" означает международную единицу. The term “IU” or “U” means an international unit.

Термин "изофановое отношение" означает равновесное количество протамина, необходимое для комплексования с аналогом инсулина, установленное Krayenbuhl и Rosenberg, Stent Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946). Изофановое отношение определяют путем титрования по способу, хорошо известному в данной области техники и описанному Krayenbbuhl, et el. The term "isophane ratio" means the equilibrium amount of protamine necessary for complexing with an insulin analogue as established by Krayenbuhl and Rosenberg, Stent Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946). The isophane ratio is determined by titration according to a method well known in the art and described by Krayenbbuhl, et el.

Настоящее изобретение обеспечивает композицию инсулиновый аналог-протамин, которая включает мономерный инсулиновый аналог, протамин, цинк, и фенольное производное. Концентрация протамина составляет предпочтительно от 0,2 до 1,5 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога в расчете на свободное основание. Наиболее предпочтительно, чтобы диапазон протамина составлял от 0,27 до 0,35 мг/100 Единиц. Концентрация цинка составляет от 0,35 до 0,9% по весу. Предпочтительно концентрация цинка составляет около 0,7%. The present invention provides an insulin analogue-protamine composition, which comprises a monomeric insulin analogue, protamine, zinc, and a phenolic derivative. The concentration of protamine is preferably from 0.2 to 1.5 mg of protamine per 100 Units of insulin analog, based on the free base. Most preferably, the protamine range is from 0.27 to 0.35 mg / 100 Units. The concentration of zinc is from 0.35 to 0.9% by weight. Preferably, the zinc concentration is about 0.7%.

Фенольное производное представляет собой м-крезол, фенол или смесь м-крезола и фенола. Предпочтительными фенольными производными является м-крезол и фенол. Концентрация фенольного производного известна специалисту в данной области. Концентрации должны быть достаточными для того, чтобы сохранять эффективность консервации, т.е. затормозить микробный рост. Вообще концентрация фенольного производного, например, находится в диапазоне от 1,0 до 6,0 мг/мл; предпочтительно выше, чем около 2,5 мг/мл. Наиболее предпочтительна концентрация около 3 мг/мл. Присутствие фенольного производного является существенным, поскольку оно воздействует на комплексообразование аналога, протамина и цинка помимо функционирования в качестве консерванта. Однако полагают, что в кристаллической структуре на молекулу инсулинового аналога приходится только одна молекула фенола. The phenolic derivative is m-cresol, phenol or a mixture of m-cresol and phenol. Preferred phenolic derivatives are m-cresol and phenol. The concentration of the phenolic derivative is known to those skilled in the art. Concentrations should be sufficient to maintain conservation effectiveness, i.e. inhibit microbial growth. In general, the concentration of the phenolic derivative, for example, is in the range from 1.0 to 6.0 mg / ml; preferably higher than about 2.5 mg / ml. A concentration of about 3 mg / ml is most preferred. The presence of a phenolic derivative is significant because it affects the complexation of the analogue, protamine and zinc in addition to functioning as a preservative. However, it is believed that in the crystal structure there is only one phenol molecule per insulin analog molecule.

Предпочтительно изотонический агент добавляют к композиции. Предпочтительным изотоническим агентом является глицерин. Концентрация изотонического агента составляет, например, от 14 до 18 мг/мл, предпочтительно около 18 мг/мл. Preferably, the isotonic agent is added to the composition. A preferred isotonic agent is glycerol. The concentration of the isotonic agent is, for example, from 14 to 18 mg / ml, preferably about 18 mg / ml.

pH композиции может быть установлена с помощью физиологически толерантного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, такого как двуосновный фосфат натрия. К другим физиологически толерантным буферам относятся TRIS, ацетат натрия, или цитрат натрия. Выбор буфера и концентрация буфера известны в данной области. Обычно концентрация составляет, например, от около до около 5,0 мг/мл, предпочтительно 3,8 мг/мл. The pH of the composition may be adjusted using a physiologically tolerant buffer, preferably a phosphate buffer such as dibasic sodium phosphate. Other physiologically tolerant buffers include TRIS, sodium acetate, or sodium citrate. Buffer selection and buffer concentration are known in the art. Typically, the concentration is, for example, from about to about 5.0 mg / ml, preferably 3.8 mg / ml.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает специфические условия, при которых инсулиновый аналог-протамин существует в виде стабильного кристалла. Композиции этих кристаллов определяют как инсулиновый аналог-NPD. Инсулиновый аналог-NPD представляет собой сформулированную суспензию кристаллов инсулиновый аналог-NPD, и он при использовании проявляет промежуточное действие. Профиль активности инсулинового аналога-NPD достаточно неожидан с точки зрения отсутствия самоаcсоциации мономерного аналога. In addition, the present invention provides specific conditions under which the insulin protamine analog exists as a stable crystal. The compositions of these crystals are defined as the insulin analog NPD. The insulin analog NPD is a formulated suspension of crystals of the insulin analog NPD, and when used exhibits an intermediate effect. The activity profile of the insulin analogue-NPD is quite unexpected in terms of the lack of self-association of the monomeric analogue.

Способность композиции с мономерным аналогом проявлять промежуточное действие демонстрируется на фиг. 1. Фиг. 1 иллюстрирует профиль действия для Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина-NPH. NPD профиль подобен профилю инсулина-NPH. Продолжительность действия для NPD композиции и инсулин-NPH композиции приблизительно одинаковa. Однако наиболее важно, что настоящая композиция повышает более быстро и остается стабильной в течение более длительного периода, чем инсулин-NPH. Это различие достаточно неожиданно с точки зрения быстродействующего профиля мономерного аналога.The ability of a composition with a monomeric analog to exhibit an intermediate effect is demonstrated in FIG. 1. FIG. 1 illustrates an action profile for Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD and human insulin-NPH. The NPD profile is similar to the insulin-NPH profile. The duration of action for the NPD composition and insulin-NPH composition is approximately the same. However, most importantly, the present composition increases more rapidly and remains stable for a longer period than insulin-NPH. This difference is quite unexpected in terms of the high-speed profile of the monomeric analogue.

Особенно предпочтительная композиция инсулиновый аналог-протамин, Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин-NPD, включает Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин, от 0,27 до 0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога, от 0,35 до 0,9% цинка по весу и фенольное производное. Концентрация протамина предпочтительно составляет 0,3 мг/100 Единиц в расчете на свободное основание.A particularly preferred composition is the insulin analog protamine, Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin-NPD, includes Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin, from 0.27 to 0.32 mg of protamine / 100 Units of insulin analogue, from 0.35 to 0, 9% zinc by weight and phenolic derivative. The protamine concentration is preferably 0.3 mg / 100 Units based on the free base.

Изобретение также обеспечивает способ получения Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин-протамин кристаллов, который включает:
смешение водного раствора Lys^B28 Pro^B29-человеческого инсулина в состоянии гексамерного ассоциата и раствора протамина при температуре от около 8 до около 22^oC;
указанный водный раствор включает от 0,35 до 0,9% цинка по весу, Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин и фенольное производное при pH от 7,1 до 7,6;
указанный раствор протамина включает протамин при pH от 7,1 до 7,6 так, чтобы его финальная концентрация составляла от 0,27 до 0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога.The invention also provides a method for producing Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin-protamine crystals, which comprises:
mixing an aqueous solution of Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin in the state of hexamer associate and a solution of protamine at a temperature of from about 8 to about 22 ^o C;
the specified aqueous solution comprises from 0.35 to 0.9% zinc by weight, Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin and phenolic derivative at a pH of from 7.1 to 7.6;
said protamine solution comprises protamine at a pH of from 7.1 to 7.6 so that its final concentration is from 0.27 to 0.32 mg of protamine / 100 Units of insulin analogue.

До создания изобретения было известно, что мономерные инсулиновые аналоги менее склонны к ассоциации и образованию гексамеров. Условия, необходимые для того, чтобы вызвать ассоциацию мономерных инсулиновых аналогов с протамином с образованием кристаллов, ранее были не известны в данной области. Pанние исследования относились к инсулину. Указания относительно получения инсулина-NPH (нейтральная композиция протамина согласно Hagedorn) или изофан инсулиновых композиций согласно Krayenbuhl и Rosenberg, Sterd Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946) не уместны с точки зрения различия в свойствах мономерных инсулиновых аналогов. В действительности, коммерческий способ получения Hunilin-N^TM (инсулин-NPH), кислотно-нейтральный способ, не приводит к получению кристаллического инсулинового аналога-NPD.Prior to the invention, it was known that monomeric insulin analogues are less likely to associate and form hexamers. The conditions necessary to induce the association of monomeric insulin analogues with protamine to form crystals were not previously known in the art. Previous studies related to insulin. Guidelines for the production of insulin-NPH (neutral protamine composition according to Hagedorn) or isofan insulin compositions according to Krayenbuhl and Rosenberg, Sterd Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946) are not relevant in terms of differences in the properties of monomeric insulin analogues. In fact, the commercial method for producing Hunilin-N ^TM (insulin-NPH), an acid-neutral method, does not produce a crystalline insulin analogue-NPD.

Наиболее важно установление того, что параметры настоящего изобретения, а именно температура кристаллизации и образования гексамерного комплекса инсулинового аналога, цинка и фенольного производного, являются существенными признаками для образования стабильных Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD кристаллов.It is most important to establish that the parameters of the present invention, namely, the crystallization temperature and the formation of the hexamer complex of the insulin analog, zinc and phenolic derivative, are essential features for the formation of stable Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD crystals.

Температура кристаллизации должна находиться в пределах от около 8 до около 22^oC, предпочтительно от 13 до 17^oC. Если температура находится за пределами этого диапазона, то получается главным образом аморфная композиция инсулиновый аналог-протамин.The crystallization temperature should be in the range of from about 8 to about 22 ^° C., preferably from 13 to 17 ^° C. If the temperature is outside this range, then the insulin analog-protamine composition is mainly amorphous.

Также существенно, что инсулиновый аналог трансформируется в гексамерное состояние до кристаллизации. Кристаллизация приводит к аморфному продукту в случае, когда способ осуществляют в состоянии мономерного ассoциирования. Кристаллы образуются без перемешивания в течение от 5 до 30-60 ч. Кристаллы высокого качества образуются обычно в течение 24 ч. It is also essential that the insulin analog transforms into the hexamer state before crystallization. Crystallization leads to an amorphous product when the process is carried out in a state of monomer association. The crystals form without stirring for 5 to 30-60 hours. High-quality crystals usually form within 24 hours.

Растворимый мономерный инсулиновый аналог комплексуется в гексамерный ассоциат при суспендировании твердого мономерного аналога в растворителе, содержащем фенольное производное, и при добавлении цинка до тех пор, пока концентрация цинка не составит от 0,35 до 0,9% по весу. Цинк предпочтительно добавляют в виде соли. К иллюстрирующим примерам солей цинка относятся ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, фторид цинка, иодид цинка и сульфат цинка. Специалисту в данной области должно быть известно, что существуют и другие соли цинка, которые также могут быть использованы в способе настоящего изобретения. Предпочтительно использование ацетата цинка и хлорида цинка. The soluble monomeric insulin analog is complexed into a hexamer associate by suspending the solid monomer analog in a solvent containing a phenolic derivative and adding zinc until the zinc concentration is from 0.35 to 0.9% by weight. Zinc is preferably added as a salt. Illustrative examples of zinc salts include zinc acetate, zinc bromide, zinc chloride, zinc fluoride, zinc iodide and zinc sulfate. One of skill in the art should know that there are other zinc salts that can also be used in the process of the present invention. The use of zinc acetate and zinc chloride is preferred.

Растворению инсулинового аналога в растворителе, как это известно, может способствовать подкисление. При кислом растворении для повышения растворимости аналога pH понижают до около 3-3,5 с помощью физиологически толерантной кислоты, предпочтительно HCl. К другим физиологически толерантным кислотам относятся уксусная кислота, лимонная кислота и фосфорная кислота. pH затем подводят физиологически толерантным основанием, предпочтительно NaOH, до около 7,1-7,6 для кристаллизации. Другими физиологически толерантными основаниями являются KOH и гидрохлорид аммония. The dissolution of the insulin analog in a solvent, as is known, can be facilitated by acidification. Upon acid dissolution, to increase the solubility of the analogue, the pH is lowered to about 3-3.5 with a physiologically tolerant acid, preferably HCl. Other physiologically tolerant acids include acetic acid, citric acid and phosphoric acid. The pH is then adjusted with a physiologically tolerant base, preferably NaOH, to about 7.1-7.6 for crystallization. Other physiologically tolerant bases are KOH and ammonium hydrochloride.

Наиболее важно то, что способ получения Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD комплекса чувствителен к концентрации NaCl. Если концентрация превосходит приблизительно 4 мг/мл, кристаллы инсулиновый аналог-NPD оказываются смешанными с аморфным продуктом. Таким образом, предпочтительно, для того чтобы избежать образования ионов соли, мономерный аналог растворить при нейтральном pH. Наконец, аналог можно растворить в растворителе при кислом pH до добавления буфера. Это уменьшает концентрацию солей, генерируемых вследствие подведения pH. Однако порядок, при котором добавляются компоненты, не является существенным для образования гексамера или для аморфного образования.Most importantly, the method for producing Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD complex is sensitive to NaCl concentration. If the concentration exceeds approximately 4 mg / ml, crystals of the insulin analog NPD are mixed with the amorphous product. Thus, preferably, in order to avoid the formation of salt ions, the monomeric analogue is dissolved at a neutral pH. Finally, the analog can be dissolved in a solvent at an acidic pH before adding buffer. This reduces the concentration of salts generated by adjusting the pH. However, the order in which the components are added is not essential for hexamer formation or for amorphous formation.

Как указывалось выше, к композициям настоящего изобретения может быть добавлен изотонический агент. Изотонический агент можно добавлять к раствору аналога, к раствору протамина или к финальной инсулиновый аналог-NPD композиции. Аналогично добавление физиологически толерантного буфера можно проводить к раствору аналога, к раствору протамина, или к финальной инсулиновый аналог-NPD композиции. Однако предпочтительно, чтобы как раствор аналога, так и раствор протамина содержали изотонический агент и буфер до смешения водного раствора и протамина. Из-за влияния NaCl на способ получения кристаллического инсулинового аналога-NPD глицерин является предпочтительным изотоническим агентом. As indicated above, an isotonic agent may be added to the compositions of the present invention. The isotonic agent can be added to the analog solution, to the protamine solution, or to the final insulin analog-NPD composition. Similarly, the addition of a physiologically tolerant buffer can be carried out to a solution of the analogue, to a solution of protamine, or to the final insulin analogue-NPD composition. However, it is preferable that both the analog solution and the protamine solution contain an isotonic agent and a buffer before mixing the aqueous solution and protamine. Due to the effect of NaCl on the process for the preparation of crystalline insulin analog-NPD, glycerin is the preferred isotonic agent.

Изобретение также обеспечивает композиции инсулиновых аналогов, которые включают смеси инcулинового аналога в виде кристаллического твердого вещества и растворимого инсулинового аналога. Эти смеси получают в диапазоне от около 1: 99 до 99:1 по объему суспендированного инсулинового аналога-NPD к растворимому инсулиновому аналогу. Растворимый инсулиновый аналог представляет собой мономерный инсулиновый аналог, растворимый в водном растворителе, содержащий цинк, фенольное производное, изотонический агент и буфер. Концентрации в растворителе такие же, как здесь ранее указанные. Предпочтительно, чтобы отношение инсулиновый аналог-NPD к растворимому инсулиновому аналогу составляло 25:75 - 75:25 и более предпочтительно 50:50. Смеси легко получают смешением индивидуальных компонентов. The invention also provides compositions of insulin analogs, which include mixtures of the insulin analog in the form of a crystalline solid and a soluble insulin analog. These mixtures are prepared in the range of about 1: 99 to 99: 1 by volume of the suspended insulin analog-NPD to the soluble insulin analog. A soluble insulin analog is a monomeric insulin analog soluble in an aqueous solvent containing zinc, a phenolic derivative, an isotonic agent, and a buffer. The concentrations in the solvent are the same as previously indicated. Preferably, the ratio of the insulin analogue-NPD to the soluble insulin analogue is 25:75 - 75:25, and more preferably 50:50. Mixtures are readily prepared by mixing individual components.

Смешанные композиции настоящего изобретения особенно пригодны для лечения сахарного диабета благодаря сочетанию быстрого начала действия и пролонгированного действия. Эти смеси позволяют осуществлять "прекрасный контроль" путем варьирования количества каждого индивидуального компонента исходя из потребностей, диеты и физической нагрузки пациента. Преимущество смесей суспендированного инсулинового аналога-NPD и растворимого инcулинового аналога заключается также в том, что они гомогенны, т.е. при любом равновесном обмене между суспендированными кристаллами и растворимым инсулиновым аналогом они прозрачны. The mixed compositions of the present invention are particularly suitable for the treatment of diabetes mellitus due to the combination of fast onset and sustained action. These mixtures allow for "excellent control" by varying the amount of each individual component based on the needs, diet and physical activity of the patient. The advantage of the mixtures of the suspended insulin analog-NPD and the soluble insulin analog is also that they are homogeneous, i.e. at any equilibrium exchange between suspended crystals and a soluble insulin analogue, they are transparent.

Инсулиновые аналоги настоящего изобретения могут быть получены при помощи любой из ряда признанных технологий синтеза пептидов, включая классические (растворные) способы, твердофазные способы, полусинтетические способы и более современные способы при помощи рекомбинантной ДНК. Например, Chance et al., EPO 214826, раскрывают получение различных мономерных аналогов. The insulin analogs of the present invention can be obtained using any of a number of recognized peptide synthesis technologies, including classical (solution) methods, solid phase methods, semi-synthetic methods, and more modern methods using recombinant DNA. For example, Chance et al., EPO 214826, disclose the preparation of various monomeric analogs.

Следующие примеры приведены для более подробной иллюстрации получения инсулиновых аналогов и настоящего изобретения. Объем изобретения не ограничивается только нижеследующими примерами. The following examples are provided to illustrate in more detail the preparation of insulin analogues and the present invention. The scope of the invention is not limited to the following examples.

Пример 1
Получение Lys^B28 Pro^B29 - hI-NPD
Раствор Lys^B28 Pro^B29-человеческого инсулина (Lys^B28 Pro^B29-hI) с концентрацией 200 МЕ/мл (Е200) получают путем растворения цинксодержащих кристаллов Lys^B28 Pro^B29-hI в системе консервант/буфер, содержащий 1,6 мг/мл м-крезола, 0,73 мг/мл фенола (эквивалентное 0,65 мг/мл фенола, рассчитанное как 89%), 16 мг/мл глицерина и 3,78 мг/мл двухосновного фосфатного натриевого буфера. Эндогенный (возникший внутри организма) уровень цинка в кристаллах дополняют путем добавления соответствующего объема кислого раствора ZnO (10 мг/мл) до достижения конечной концентрации 0,025 мг/100 ME (0,7%). Растворение Lys^B28 Pro^B29 осуществляют при температуре окружающей среды путем понижения pH до около 3-мкл объемами 5М HCl. После того как раствор просветлеет, pH вновь доводят до 7,5 при помощи микролитровых объемов 5М NaOH.Example 1
Obtaining Lys ^B28 Pro ^B29 - hI-NPD
A solution of Lys ^B28 Pro ^B29 -human insulin (Lys ^B28 Pro ^B29 -hI) with a concentration of 200 IU / ml (E200) is prepared by dissolving zinc-containing crystals of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI in a preservative / buffer system containing 1.6 mg / ml m α-cresol, 0.73 mg / ml phenol (equivalent to 0.65 mg / ml phenol, calculated as 89%), 16 mg / ml glycerol and 3.78 mg / ml dibasic sodium phosphate buffer. The endogenous (arising inside the body) level of zinc in the crystals is supplemented by adding the appropriate volume of an acidic ZnO solution (10 mg / ml) to achieve a final concentration of 0.025 mg / 100 ME (0.7%). Dissolution of Lys ^B28 Pro ^{B29 is} carried out at ambient temperature by lowering the pH to about 3 μl with volumes of 5 M HCl. After the solution brightens, the pH is again adjusted to 7.5 using microliter volumes of 5M NaOH.

Раствор протамина получают растворением достаточно твердого сульфата протамина в растворе консервант/буфер до достижения конечной концентрации 0,6 мг/100 ME в расчете на свободное основание. pH этого раствора доводят до 7,5 и стабилизируют при 15^oC.A protamine solution is prepared by dissolving enough solid protamine sulfate in a preservative / buffer solution until a final concentration of 0.6 mg / 100 ME is reached, based on the free base. The pH of this solution was adjusted to 7.5 and stabilized at 15 ^o C.

Оба раствора разбавляют до конечной концентрации водой для инъекции и фильтруют. 5 мл аликвоты Lys^B28 Pro^B29-hI составляющей заполняют в отдельные чистые стеклянные ампулы, и образцы инкубируют в водяной бане при 15^oC. После соответствующего времени стабилизации (15 мин), вызывают осаждение путем быстрого добавления 5 мл раствора протамина к Lys^B28 Pro^B29-hI образцам. Кристаллизацию проводят в течение около 24 ч при 15^oC.Both solutions are diluted to a final concentration with water for injection and filtered. A 5 ml aliquot of the Lys ^B28 Pro ^B29 -hI component is filled in separate clean glass ampoules, and the samples are incubated in a water bath at 15 ^o C. After the appropriate stabilization time (15 min), precipitation is caused by the rapid addition of 5 ml of protamine solution to Lys ^B28 Pro ^B29 -hI Samples. Crystallization is carried out for about 24 hours at 15 ^o C.

Пример 2
Получение Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD
Способ идентичен примеру 1, за исключением того, что растворение Lys^B28 Pro^B29-hI происходит при нейтральном pH. Способ осуществляют так, чтобы конечное pH составляло 7,4.Example 2
Obtaining Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD
The method is identical to Example 1, except that the dissolution of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI occurs at a neutral pH. The method is carried out so that the final pH is 7.4.

Пример 3
Получение Lys^B28 Pro^B29-hI NPD
Инсулиновый аналог-NPD получают по способу, аналогичному примеру 1, но растворение в кислой среде Lys^B28 Pro^B29-hI выполняют в присутствии всех наполнителей, за исключением двухосновного натриевого фосфатного буфера. Твердый двухосновной натрий фосфат добавляют, после того как раствор инсулинового аналога возвращают к pH 7,4. Добавление двуxосновного натрий фосфата приводит к осветвлению раствора.Example 3
Obtaining Lys ^B28 Pro ^B29 -hI NPD
The insulin analog NPD was prepared by a method analogous to Example 1, but dissolving in an acidic medium Lys ^B28 Pro ^B29 -hI was performed in the presence of all excipients except dibasic sodium phosphate buffer. Solid dibasic sodium phosphate is added after the insulin analog solution is returned to a pH of 7.4. Adding dibasic sodium phosphate leads to clarification of the solution.

Пример 4
Получение смешанных композиций инсулинового аналога
Смеси Lys^B28 Pro^B29-hI композиций промежуточного и быстрого действия получают следующим образом. Суспензионную композицию промежуточного действия получают при помощи способов, описанных в примере 3, и эта композиция служит в качестве составляющей промежуточного действия для смеси. Отдельный раствор Lys^B28 Pro^B29-hI (100 ME) получают путем растворения цинксодержащих Lys^B28 Pro^B29 - hI кристаллов при температуре окружающей среды в растворителе, описанном в примере 1. Эндогенный уровень цинка Lys^B28 Pro^B29-hI в этом растворе дополняют путем добавления кислого раствора ZnO до соответствия уровню в суспензионной составляющей (т.е. 0,025 мг/100 ME (0,7%)). После того как pH доводят до 7,4, используя 10%-ные растворы HCl и/или NaOH, для разбавления раствора до конечной концентрации используют воду для инъекции. Этот раствор представляет собой быстродействующую составляющую смесей. Конечную смесь получают смешением соответствующих объемов составляющих промежуточного и быстрого действия, получая требуемое отношение. 50/50 смесь получают путем смешения 1 части составляющей промежуточного действия с 1 частью составляющей быстрого действия по объему.Example 4
Obtaining mixed compositions of the insulin analogue
Mixtures of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI compositions of intermediate and rapid action are obtained as follows. An intermediate suspension composition is prepared using the methods described in Example 3, and this composition serves as an intermediate component of the mixture. A separate Lys ^B28 Pro ^B29- hI (100 ME) solution is prepared by dissolving zinc-containing Lys ^B28 Pro ^B29 -hI crystals at ambient temperature in the solvent described in Example 1. The endogenous zinc level of Lys ^B28 Pro ^B29- hI in this solution is supplemented by adding acid solution of ZnO to match the level in the suspension component (i.e., 0.025 mg / 100 ME (0.7%)). After the pH was adjusted to 7.4 using 10% solutions of HCl and / or NaOH, water for injection was used to dilute the solution to a final concentration. This solution is a quick-acting component of the mixtures. The final mixture is obtained by mixing the appropriate volumes of the components of the intermediate and quick action, obtaining the desired ratio. A 50/50 mixture is obtained by mixing 1 part of an intermediate component with 1 part of a fast acting component by volume.

Пример 5
Влияние ионной силы на кристаллизацию Lys^B28 Pro^B29-hI протамин
Влияние ионной силы на кристаллизацию оценивают путем добавления NaCl к Lys^B28 Pro^B29-hI составляющей до смешения с протамином. NaCl добавляют так, чтобы общая концентрация составляла 20, 30 и 40 мM (1,2; 1.8; 2,3 мг/мл). Распределение частиц по объему демонстрирует полимодальное поведение (дополнительные пики для частиц малого размера) по мере повышения концентрации NaCl. Средний объемный размер частиц уменьшается по мере увеличения концентрации NaCl, указывая на увеличение аморфного вещества. Результаты размера частиц в зависимости от концентрации NaCl выглядят следующим образом:
[NaCl] - Средний размер частиц по объему (мкм)
13 мM - 3,9
20 мM - 3.5
30 мМ - 3,3
40 мМ - 3,2
Анализ с помощью микроскопии показал, что все образцы содержали смесь аморфного и кристаллического вещества. Образец, содержащий 40 мМ NaCl, представлял собой в основном аморфное вещество и содержал очень мало кристаллов.Example 5
The effect of ionic strength on the crystallization of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI protamine
The effect of ionic strength on crystallization is evaluated by adding NaCl to the Lys ^B28 Pro ^B29 -hI moiety prior to mixing with protamine. NaCl is added so that the total concentration is 20, 30 and 40 mM (1.2; 1.8; 2.3 mg / ml). The volume distribution of particles shows a polymodal behavior (additional peaks for small particles) with increasing NaCl concentration. The average volumetric particle size decreases with increasing NaCl concentration, indicating an increase in amorphous substance. Particle size results as a function of NaCl concentration are as follows:
[NaCl] - The average particle size by volume (microns)
13 mM - 3.9
20 mM - 3.5
30 mm - 3.3
40 mm - 3.2
Microscopic analysis showed that all samples contained a mixture of amorphous and crystalline material. A sample containing 40 mM NaCl was essentially an amorphous substance and contained very few crystals.

Пример 6
Сравнительные динамики Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина
Это исследование проводят на модели conscious собаки. Перед началом исследования делают вливание соматостатина (0,3 мкг/кг-мин). После 10-минутного перерыва вводят подкожную инъекцию либо NPD, либо NPH. Проводят частый мониторинг глюкозы в плазме и вливают переменное количество глюкозы (20%), для того чтобы поддержать гликемию вблизи нормы. Пробы берут все время и анализируют на иммунореактивный инсулин (Linco антитело) и глюкозу. Результаты иллюстрируются фиг. 1.Example 6
Comparative Dynamics of Lys ^B28 Pro ^B29 -hI-NPD and Human Insulin
This study is conducted on a conscious dog model. Before the start of the study, somatostatin is infused (0.3 μg / kg-min). After a 10-minute break, subcutaneous injection of either NPD or NPH is administered. Frequent plasma glucose monitoring is carried out and a variable amount of glucose (20%) is infused in order to maintain glycemia near normal. Samples are taken all the time and analyzed for immunoreactive insulin (Linco antibody) and glucose. The results are illustrated in FIG. 1.

Пример 7
Получение кристаллов Asp (B28) аналог-протамин
Составляющую Asp (B28)-hI при концентрации 200 МЕ/мл (Е 200) получают путем растворения лиофилизированного блока (95%-ная чистота) в системе консервант/буфер, содержащей: 1,6 мг/мл м-крезола, 0,73 мг/мл фенола (эквивалент для 0,65 мг/мл фенола, рассчитанного как 89%), 16 мг/мл глицерина и 3,78 мг/мл двухосновного фосфата натрия. К системе добавляют цинк, используя соответствующий объем кислого ZnO раствора (10 мг/мл), получая финальную концентрацию 0,025 мг/100 ME. Растворение Asp (B28) проводят при температуре окружающей среды при нейтральной pH. Конечная pH составляющей равна 7,4.Example 7
Obtaining crystals of Asp (B28) protamine analog
Component Asp (B28) -hI at a concentration of 200 IU / ml (E 200) is obtained by dissolving the lyophilized block (95% purity) in a preservative / buffer system containing: 1.6 mg / ml m-cresol, 0.73 mg / ml phenol (equivalent to 0.65 mg / ml phenol, calculated as 89%), 16 mg / ml glycerol and 3.78 mg / ml dibasic sodium phosphate. Zinc is added to the system using an appropriate volume of acidic ZnO solution (10 mg / ml) to obtain a final concentration of 0.025 mg / 100 ME. Dissolution of Asp (B28) is carried out at ambient temperature at neutral pH. The final pH of the component is 7.4.

Кристаллизацию проводят, как описано в примере 2. Получают конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100Е. Эти концентрации протамина соответствуют 2,9, 9,3 и 10,5% соответственно в расчете вес/вес. Инкубационные температуры составляют 5^oC (0,3 мг/100Е только), 15 и 22^oC. После выдержки в течение 24 ч при этих температурах, образцы анализируют на образование кристаллов. Результаты, определенные с помощью микроскопии, дают смесь небольшого количества кристаллов и аморфного продукта.Crystallization is carried out as described in Example 2. Final protamine concentrations of 0.3, 0.35 and 0.4 mg / 100E are obtained. These protamine concentrations correspond to 2.9, 9.3 and 10.5%, respectively, in terms of weight / weight. The incubation temperatures are 5 ^o C (0.3 mg / 100E only), 15 and 22 ^o C. After exposure for 24 hours at these temperatures, the samples are analyzed for crystal formation. Microscopic results give a mixture of a small amount of crystals and an amorphous product.

Пример 8
Получение кристаллов Asp (B28) аналог-протамин
Кристаллизацию Asp (B28) протамин проводят, как описано в примере 7, за исключением того, что белок растворяют первым в растворителе, свободном от буфера. Добавление кислой ZnO смеси было достаточно, чтобы подкислить образец до pH 2,0-2,5. После того как раствор осветлится, pH доводят до приблизительно 7 с помощью микролитровых объемов 5N NaOH. Фосфат натрия двухосновный добавляют, используя концентрированный раствор смеси при 47,25 мг/мл, получая финальную концентрацию 3,78 мг/мл. Эту составляющую доводят до pH 7,4. используя микролитровые количества HCl.Example 8
Obtaining crystals of Asp (B28) protamine analog
Crystallization of Asp (B28) protamine is carried out as described in Example 7, except that the protein is dissolved first in a buffer-free solvent. The addition of an acidic ZnO mixture was sufficient to acidify the sample to a pH of 2.0-2.5. After the solution has clarified, the pH is adjusted to approximately 7 using microliter volumes of 5N NaOH. Dibasic sodium phosphate is added using a concentrated solution of the mixture at 47.25 mg / ml to obtain a final concentration of 3.78 mg / ml. This component is adjusted to a pH of 7.4. using microliter amounts of HCl.

Кристаллизацию инициируют путем комбинации составляющих Asp (B28) и протамина, как описано в предыдущих примерах. Получают финальные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100Е. Температуры инкубации составляют 15 и 22^oC. После выдержки в течение 24 ч при этих температурах образцы анализируют на образование кристаллов. Результаты, определенные с помощью микроскопии, дают смесь кристаллов и аморфного продукта.Crystallization is initiated by a combination of Asp (B28) and protamine as described in the previous examples. Get the final concentration of protamine 0.3, 0.35 and 0.4 mg / 100E. The incubation temperatures are 15 and 22 ^o C. After exposure for 24 hours at these temperatures, the samples are analyzed for crystal formation. Microscopic results give a mixture of crystals and an amorphous product.

Пример 9
Получение кристаллов Leu (B28) Pro(В29) аналог-протамин
Составляющую Leu (B28) Pro (В29) (93%-ная чистота) при концентрации 200 МЕ/мл (Е 200) получают, как описано в примере 8, используя растворение блока в кислоте с последующим доведении pH с помощью 5N NaOH до pH 7,4. Кристаллизацию проводят как описано выше. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 5, 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах все образцы содержат некоторое количество кристаллов, но в основном они были аморфными, как это определено с помощью микроскопии.Example 9
Obtaining crystals of Leu (B28) Pro (B29) protamine analog
The Leu (B28) Pro (B29) component (93% purity) at a concentration of 200 IU / ml (E 200) was prepared as described in Example 8 using dissolution of the block in acid followed by adjusting the pH with 5N NaOH to pH 7 ,4. Crystallization is carried out as described above. Final protamine concentrations of 0.3, 0.35, and 0.4 mg / 100E are examined. Incubation temperatures include 5, 15 and 22 ^o C. After 24 hours at these temperatures, all samples contain a certain amount of crystals, but they were mostly amorphous, as determined by microscopy.

Пример 10
Des (В27) hI-протамин кристаллы
Составляющую Des Thr (B27) (97,37%-ная чистота) при концентрации 200 ME/мл (Е200) получают, как описано в примере 8, используя кислое растворение блока с последующим доведением pH с помощью 5N NaOH до 7,4. Кристаллизацию проводят, как описано в примере 8. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах, все образцы в основном были аморфными, как определено с помощью микроскопии. Качественно наблюдаются кристаллы.Example 10
Des (B27) hI-protamine crystals
Component Des Thr (B27) (97.37% purity) at a concentration of 200 ME / ml (E200) was prepared as described in Example 8 using acidic dissolution of the block followed by adjusting the pH with 5N NaOH to 7.4. Crystallization is carried out as described in Example 8. Final protamine concentrations of 0.3, 0.35 and 0.4 mg / 100E are examined. Incubation temperatures include 15 and 22 ^o C. After 24 hours at these temperatures, all samples were mainly amorphous, as determined by microscopy. Qualitatively observed crystals.

Пример 11
Des (B28-B30) hI-протамин
Составляющую Des (28-30) (96,3%-ная чистота) при концентрации 200 МЕ/мл (Е200) получают, как описано в примере 8, используя кислое растворение блока с последующим доведением pH с помощью 5N NaOH до 7,4. Кристаллизацию проводят, используя способ нейтральное/нейтральное смешение белковой и протаминовой составляющих, как описано выше. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах все образцы в основном были аморфными, как определено с помощью микроскопии. Качественно наблюдаются кристаллы. Эти кристаллы хорошо определяются.Example 11
Des (B28-B30) hI-protamine
Component Des (28-30) (96.3% purity) at a concentration of 200 IU / ml (E200) was prepared as described in Example 8 using acidic dissolution of the block, followed by adjusting the pH with 5N NaOH to 7.4. Crystallization is carried out using the neutral / neutral method of mixing the protein and protamine moieties, as described above. Final protamine concentrations of 0.3, 0.35, and 0.4 mg / 100E are examined. Incubation temperatures include 15 and 22 ^o C. After 24 hours at these temperatures, all samples were mostly amorphous, as determined by microscopy. Qualitatively observed crystals. These crystals are well defined.

Пример 12
Asp (B28) аналог-протамин
Раствор инсулин Asp (В28)-человеческого инсулинового аналога получают путем растворения 16,6 мг белка в 1 мл раствора, содержащего 3,2 мг/мл м-крезола, 1,3 мг/мл фенола и 32 мг/мл глицерина. Добавляют 14,4-мкл аликвоту раствора смеси подкисленного цинка (10 мг/мл в Zn²⁺, полученный растворением 0,311 г оксида цинка в 5 мл 10%-ной HCl и разбавлением до 25 мл водой). pH раствора составлял 2,3, что обеспечивало полное растворение белка. Добавляют 10-мкл аликвоту 10 NaOH, чтобы довести pH до 7,06. К раствору добавляют 100 мкл 0,28 М двухосновного фосфата натрия, pH 7,0, который повышает pH раствора до 7,27. К раствору добавляют 870-мкл аликвоту воды для инъекции. Дополнительно добавляют 10%-ную HCl (1 мкл) и NaOH (0,7 мкл), и конечный объем раствора доводят до 2 мл водой для инъекции, получая конечную pH 7,26. Раствор фильтруют через 0,2-мкм Supor^R Acrodisc^R 13, Gelman Sciences) фильтр перед использованием.Example 12
Asp (B28) protamine analog
A solution of the insulin Asp (B28) -human insulin analogue is prepared by dissolving 16.6 mg of protein in 1 ml of a solution containing 3.2 mg / ml of m-cresol, 1.3 mg / ml of phenol and 32 mg / ml of glycerol. A 14.4 μl aliquot of the acidified zinc mixture solution (10 mg / ml in Zn ²⁺ , obtained by dissolving 0.311 g of zinc oxide in 5 ml of 10% HCl and diluting to 25 ml with water) was added. The pH of the solution was 2.3, which ensured complete dissolution of the protein. A 10 μl aliquot of 10 NaOH was added to adjust the pH to 7.06. To the solution was added 100 μl of 0.28 M dibasic sodium phosphate, pH 7.0, which increases the pH of the solution to 7.27. An 870 μl aliquot of water for injection was added to the solution. Additionally, 10% HCl (1 μl) and NaOH (0.7 μl) were added, and the final solution volume was adjusted to 2 ml with water for injection, resulting in a final pH of 7.26. The solution was filtered through a 0.2 μm Supor ^R Acrodisc ^R 13 Gelman Sciences filter before use.

Протаминовые смесевые растворы получают путем растворения сульфата протамина в растворе, содержащем 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и 14 мМ двухосновного фосфата натрия. Конечное значение pH раствора доводят до 7,3. Конечная концентрация протамина составляла 0,60 мг/100E в расчете на свободное основание. Оба раствора фильтруют через 0,22-мкм (Millipore Sterivex^TM-GV) фильтрующий элемент перед использованием.Protamine mixed solutions are prepared by dissolving protamine sulfate in a solution containing 1.6 mg / ml m-cresol, 0.65 mg / ml phenol, 16 mg / ml glycerol and 14 mM dibasic sodium phosphate. The final pH of the solution was adjusted to 7.3. The final concentration of protamine was 0.60 mg / 100E based on the free base. Both solutions are filtered through a 0.22 μm (Millipore Sterivex ^™ -GV) filter element before use.

Кристаллизация достигается путем смешения раствора Asp (В28)-человеческого инсулина в отношении 1:1 при контролируемой температуре, указанной в таблице. Конечные условия смеси были 3,94 мг/мл Asp (B28)-человеческого инсулина, 0,0359 мг/мл (0,9%) ионов цинка, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина, 14 мM двуxосновного фосфата натрия и 0,30 мг/100Е протамина при pH 7,3. В частности, 50-200-мкл порции раствора Asp^B28-человеческого инсулина переносят в стеклянные ампулы, и температуру образцов доводят до 4, 8, 15 или 23^oC (температура окружающей среды). Части обоих протаминовых растворов также доводят до этих температур. Через 15-20 мин эквивалентный объем любого протаминового раствора переносят с помощью пипетки в образцы Asp (В28)-человеческого инсулина. Смесь мягко взбалтывают при вращении, накрывают и затем оставляют неподвижной при контролируемой температуре в течение периода кристаллизации. Все образцы исследуют с помощью микроскопии через 24 ч, и, как обнаружено, они являются в основном аморфными. Через 48 ч образцы, содержащие 0,30 мг/100Е протамина и инкубированные при 15^oC, показывают значительное количество иглоподобных кристаллов и некоторое количество аморфного вещества.Crystallization is achieved by mixing a solution of Asp (B28) -human insulin in a ratio of 1: 1 at a controlled temperature indicated in the table. The final conditions of the mixture were 3.94 mg / ml Asp (B28) -human insulin, 0.0359 mg / ml (0.9%) zinc ions, 1.6 mg / ml m-cresol, 0.65 mg / ml phenol , 16 mg / ml glycerol, 14 mM dibasic sodium phosphate and 0.30 mg / 100E protamine at a pH of 7.3. In particular, 50-200 μl portions of a solution of Asp ^B28 -human insulin are transferred into glass ampoules, and the temperature of the samples is adjusted to 4, 8, 15 or 23 ^° C (ambient temperature). Parts of both protamine solutions are also brought to these temperatures. After 15-20 minutes, the equivalent volume of any protamine solution is pipetted into samples of Asp (B28) -human insulin. The mixture is gently agitated upon rotation, covered and then left stationary at a controlled temperature for a period of crystallization. All samples were examined by microscopy after 24 hours, and were found to be mostly amorphous. After 48 hours, samples containing 0.30 mg / 100 U of protamine and incubated at 15 ^° C. show a significant amount of needle-like crystals and some amorphous substance.

Пример 13
Раствор инсулин Asp (В28)-человеческий инсулиновый аналог получают путем растворения 10,62 мг белка в 0,71 мл раствора, содержащего 3,2 мг/мл м-крезола, 1,3 мг/мл фенола и 32 мг/мл глицерина. Добавляют 10,2-мкл аликвоту смесевого раствора кислого цинка (10 мг/мл в Zn²⁺, полученном растворением 0,311 г оксида цинка в 5 мл 10%-ной HCl и разбавлением до 25 мл водой). pH раствора составлял 2,3, что обеспечивало полное растворение белка. Добавляют 6,5-мкл аликвоту 10%-ной NaOH, чтобы довести pH до 7,00. К раствору добавляют 71 мкл 0,28 М двухосновного фосфата натрия, pH 7,0, который повышает pH раствора до 7,26. К раствору добавляют 620-мкл аликвоту воды для инъекции. Дополнительно добавляют 10%-ную HCl (0,2 мкл) и NaOH (0,6 мкл), и конечный объем раствора доводят до 1,42 мл водой для инъекции, получая конечную pH 7,42. Раствор фильтруют через 0,2-мкм (Supor^R Acrodisc^R 13, Gelman Scinces) фильтр перед использованием.Example 13
Solution insulin Asp (B28) -human insulin analogue is obtained by dissolving 10.62 mg of protein in 0.71 ml of a solution containing 3.2 mg / ml m-cresol, 1.3 mg / ml phenol and 32 mg / ml glycerol. A 10.2 μl aliquot of a mixed solution of zinc acid (10 mg / ml in Zn ²⁺ obtained by dissolving 0.311 g of zinc oxide in 5 ml of 10% HCl and diluting to 25 ml with water) is added. The pH of the solution was 2.3, which ensured complete dissolution of the protein. A 6.5 μl aliquot of 10% NaOH was added to adjust pH to 7.00. 71 μl of 0.28 M dibasic sodium phosphate, pH 7.0, which increases the pH of the solution to 7.26, is added to the solution. A 620 μl aliquot of water for injection was added to the solution. Additionally, 10% HCl (0.2 μl) and NaOH (0.6 μl) were added, and the final solution volume was adjusted to 1.42 ml with water for injection to obtain a final pH of 7.42. The solution was filtered through a 0.2 μm (Supor ^R Acrodisc ^R 13, Gelman Scinces) filter before use.

Протаминовый смесевой раствор получают путем растворения сульфата протамина в растворе, содержащем 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и 14 мМ двухосновного фосфата натрия. Конечное значение pH раствора доводят до 7,4, и конечная концентрация протамина составляет 0,60 мг/100E в расчете на свободное основание. Раствор фильтруют через 0,22-мкм (Millipore Sterivex^TM-GV) фильтрующий элемент перед использованием.A protamine mixed solution is prepared by dissolving protamine sulfate in a solution containing 1.6 mg / ml m-cresol, 0.65 mg / ml phenol, 16 mg / ml glycerol and 14 mM dibasic sodium phosphate. The final pH of the solution was adjusted to 7.4, and the final concentration of protamine was 0.60 mg / 100E based on the free base. The solution is filtered through a 0.22 μm (Millipore Sterivex ^™ -GV) filter element before use.

Кристаллизация достигается путем смешения раствора Aps (В28)-человеческого инсулина в отношении 1:1 с раствором протамина, как описано в примере 12, при контролируемых температурах 13, 15, 17 и 23^oC. Результаты представлены в таблице. Конечные условия смеси - 3,74 мг/мл Aps (В28)-человеческого инсулина, 0,0359 мг/мл (0,9%) ионов цинка, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина, 14 мМ двуxосновного фосфата натрия и 0,30 мг/100E протамина при pH 7,4. Оценивают четыре различные температуры кристаллизации. 1-мл аликвоту Aps^B28-человеческого инсулина, стабилизированную при 15^oC, смешивают с 1 мл протаминового раствора, доведенного до той же самой температуры. После мягкого взбалтывания при вращении, композицию оставляют неподвижной при 15^oC. Другой образец получают путем стабилизации раствора 100-мкл Asp(В28)-человеческого инсулина при 13^oC и затем смешения со 100 мкл протаминового раствора, доведенного до той же самой температуры, финальную смесь инкубируют при 13^oC. Третий образец получают аналогичным путем, за исключением того, что две 100- мкл аликвоты стабилизируют, смешивают и затем инкубируют при 17^oC. Финальный раствор получают путeм смешения стабилизированных при температуре окружающей среды растворов 80-мкл аликвот Asp (В28)-человеческого инсулина и протамина и инкубирования при температуре окружающей среды (23^oC). Все образцы оценивают с помощью микроскопии через 24 ч и другие более поздние временные интервалы, перечисленные в таблице.Crystallization is achieved by mixing a solution of Aps (B28) -human insulin in a ratio of 1: 1 with a solution of protamine, as described in example 12, at controlled temperatures of 13, 15, 17 and 23 ^o C. The results are presented in the table. The final conditions of the mixture are 3.74 mg / ml Aps (B28) -human insulin, 0.0359 mg / ml (0.9%) zinc ions, 1.6 mg / ml m-cresol, 0.65 mg / ml phenol , 16 mg / ml glycerol, 14 mM dibasic sodium phosphate and 0.30 mg / 100E protamine at a pH of 7.4. Four different crystallization temperatures are evaluated. A 1 ml aliquot of Aps ^B28 human insulin stabilized at 15 ^° C. is mixed with 1 ml of a protamine solution brought to the same temperature. After gentle agitation by rotation, the composition is left stationary at 15 ^° C. Another sample is obtained by stabilizing a solution of 100 μl Asp (B28) -human insulin at 13 ^° C and then mixing with 100 μl of a protamine solution brought to the same temperature. final mixture was incubated at 13 ^o C. The third sample was prepared in an analogous manner, except that two 100-.mu.l aliquots of stabilized, mixed and then incubated at 17 ^o C. The final solution is obtained by mixing stabilized putem at ambient temperature p alignments 80 .mu.l aliquots of Asp (B28) -human insulin and protamine and incubation at ambient temperature (23 ^o C). All samples are evaluated by microscopy after 24 hours and other later time intervals listed in the table.

Кристаллы, полученные в соответствии с вышеуказанными примерами, иллюстрируются фиг. 2 и 3. The crystals obtained in accordance with the above examples are illustrated in FIG. 2 and 3.

Claims

1. The complex of an insulin analog and protamine, which includes human insulin, in which Pro at position B28 is replaced by Asp, Lys, Leu, Val or Ala, and Lys at position B29 is Lys or Pro; human insulin in which amino acids B28-B30 are deleted; or human insulin, in which amino acid B27 is deleted, as well as protamine, zinc, and a phenolic derivative, provided that when the insulin is Asp ^B28 - human insulin, the concentration of protamine is less than 10% by weight.

2. The complex of the insulin analog and protamine according to claim 1, which contains Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin, protamine, zinc, and a phenolic derivative.

3. The complex according to claim 2, which contains 0.2 - 0.32 mg of protamine per 100 Units of insulin analogue, 0.35 - 0.9% zinc by weight, and a phenolic derivative.

4. The complex according to claim 1, which contains Asp ^B28 — human insulin, ^0.2-0.35 mg protamine / 100 units of the insulin analogue, 0.35-0.9% zinc by weight, and a phenolic derivative.

5. The complex according to any one of claims 1, 2, 3 or 4, in which the complex has the shape of crystals.

6. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin analogue and protamine, which includes a complex according to claims 1, 2, 3, 4 or 5.

7. The composition according to claim 6, which includes 0.2 - 1.5 mg of protamine per 100 Units of insulin analogue, 0.35 - 0.9% zinc by weight and phenolic derivative.

8. A pharmaceutical composition for parenteral administration, which includes Lys ^B28 Pro ^B29 human insulin, ^0.27-0.32 mg protamine per 100 units of insulin analogue, and 0.35-0.9% zinc by weight and phenolic derivative.

9. The pharmaceutical composition for parenteral administration, which includes Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin, 0.3 mg of protamine per 100 Units of insulin analogue, 0.7% zinc by weight, 1.7 mg / ml m-cresol, 0.7 mg / ml phenol, 16 mg / ml glycerol and 3.78 mg / ml dibasic sodium phosphate.

10. A pharmaceutical composition for parenteral administration, which includes Asp ^B28 human insulin, ^0.27-0.35 mg protamine per 100 units of insulin analogue, 0.35-0.9% zinc by weight and phenolic derivative.

11. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to any one of claims 6 to 10, which further comprises a soluble insulin analogue.

12. A pharmaceutical composition for parenteral administration, comprising a mixture of a solution of a soluble insulin analogue containing a human insulin analogue, zinc and a phenolic derivative, as well as crystals of an insulin-protamine analogue, in which the weight ratio of the two components is from 1: 99 to 99: 1 insulin analogue to crystals of an insulin-protamine analogue, wherein said insulin analogue is human insulin in which Pro at position B28 is replaced by Asp, Lys, Leu, Val or Ala, and Lys at position B29 is Lys or Pro human sky insulin wherein the amino acids B28 - B30 are deleted; or human insulin in which amino acid B27 has been deleted, provided that when the insulin is Asp ^B28 human insulin, the concentration of protamine is less than 10% by weight.

13. A pharmaceutical composition for parenteral administration, comprising a mixture of a solution of a soluble insulin analogue containing a human insulin analogue, zinc and a phenolic derivative, as well as crystals of an insulin-protamine analogue, in which the weight ratio of the two components is from 1: 99 to 99: 1 of the insulin analogue to crystals of an insulin-protamine analogue, and wherein said insulin analogue is Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin.

14. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to item 12 or 13, in which the weight ratio of the two components is from 75: 25 to 25: 75.

15. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to 14, in which the weight ratio of the two components is 50: 50.

15. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to 14, which includes Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin and crystals of Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin-protamine.

17. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to clause 16, in which the weight ratio of the two components is 50: 50, 75: 25 or 25: 75.

18. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin-protamine analogue, which comprises a mixture of a solution of a soluble human insulin analogue, including a human insulin analogue, zinc and a phenolic derivative, characterized in that essentially all of the soluble analogue is in the hexamer complex and the insulin analogue complex -protamine, in which the weight ratio of the two components is from 1: 99 to 99: 1 of the soluble insulin analogue to the insulin-protamine analogue complex, wherein said the insulin log is human insulin in which Pro at position B28 is replaced by Asp, Lys, Leu, Val or Ala, and Lys at position B29 is Lys or Pro, human insulin in which amino acids B28 to B30 are deleted, or human insulin, in which amino acid B27 is deleted,
19. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin-protamine analogue according to claim 18, wherein the weight ratio of the two components is from 75: 25 to 25: 75.

20. A pharmaceutical composition for parenteral administration comprising an insulin-protamine analogue according to claim 18 or 19, which comprises soluble Asp ^B28 hexamer complexes and Asp ^B28 -protamine complexes.

21. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin-protamine analogue according to claim 18 or 19, which comprises soluble Lys ^B28 Pro ^B29 hexamer complexes and Lys ^B28 Pro ^B29 -protamine complexes.

22. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin-protamine analogue according to any one of claims 18, 19, 20 or 21, which contains crystals of an insulin-protamine analog complex.

23. A pharmaceutical composition for parenteral administration containing an insulin-protamine analogue according to any one of claims 18 to 22, wherein the solution of the soluble human insulin analogue comprises 0.35-0.09% Zn by weight.

24. The pharmaceutical composition for parenteral administration, containing the insulin analogue-protamine, according to item 23, in which the human insulin analogue is Asp ^B28 - human insulin.

25. The pharmaceutical composition for parenteral administration, containing the insulin analogue-protamine according to item 23, in which the human insulin analogue is Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin.

26. The method of obtaining the complex in any one of claims 1 to 5, comprising combining an analogue of the monomeric insulin, protamine, zinc and a phenolic derivative in an aqueous solvent and keeping the mixture to form a complex.

27. A method of obtaining crystals of Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin-protamine, which comprises combining an aqueous solution of Lys ^B28 Pro ^B29 - human insulin in a hexameric associative state and a solution of protamine at a temperature of ^8-22 ^° C., wherein said aqueous solution contains 0, 35 - 0.9% zinc by weight, Lys ^B28 Pro ^B29 is human insulin and a phenolic derivative at pH 7.1 - 7.6, and the protamine solution contains protamine at pH 7.1 - 7.6, so that the final concentration protamine ranged from 0.27 to 0.32 mg of protamine / 100 Units of insulin analogue.

28. The method according to item 27, in which the temperature is 15 ^o C, the concentration of zinc is 0.7 - 0.9%, and the concentration of protamine is 0.3 mg / 100 Units of insulin analogue.

29. A method of obtaining crystals of Asp ^B28 - human insulin-protamine, which comprises combining an aqueous solution of Asp ^B28 - human insulin in the hexameric associative state and a protamine solution at a temperature of ^13-17 ^° C, wherein said aqueous solution contains 0.35-0. 9% zinc by weight, Asp ^B28 - human insulin and phenolic derivative at pH 7.1 - 7.6, the protamine solution contains protamine at pH 7.1 - 7.6, so that the final concentration of protamine is 0.27 - 0.32 mg protamine / 100 Units of insulin analogue.

30. A method of obtaining a pharmaceutical composition for parenteral administration according to any one of claims 6 to 17, which comprises suspending crystals of the insulin-protamine analog in a pharmaceutically acceptable diluent.

31. The pharmaceutical composition for parenteral administration according to any one of claims 6 to 25 for use in the treatment of diabetes mellitus.