RU2147129C1

RU2147129C1 - Method for setting differential diagnosis of uveal melanoma and progressive choroidea nevus

Info

Publication number: RU2147129C1
Application number: RU98121042A
Authority: RU
Inventors: В.Г. Лихванцева; Н.Н. Юровская; Е.Е. Гришина
Original assignee: Московский НИИ глазных болезней им.Гельмгольца
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2000-03-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves determining C16 killer cells level in blood serum and their specific activity. Their simultaneous rise beyond the norm limits being observed, initial stage of uveal melanoma is to be diagnosed. No changes being found, progressive choroidea nevus is to be diagnosed. EFFECT: high accuracy of the method. 3 cl, 1 tbl

Description

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии и предназначено для повышения эффективности и качества диагностики с целью проведения своевременного и адекватного лечения. The invention relates to ophthalmology, namely to ophthalmology and is intended to improve the efficiency and quality of diagnosis in order to conduct timely and adequate treatment.

В настоящее время проведение дифференциальной диагностики между невусом хориоидеи значительных размеров и начальной увеальной меланомой остается чрезвычайно актуальной задачей. Для ее решения используются все существующие современные методы исследования, включающие клинико-анамнестические, функциональные (компьютерная периметрия, визометрия) и инструментальные методы исследования (прямая и обратная офтальмоскопия, ядерно-магнитный резонанс, ультразвуковые исследования в двух- и трехмерном изображении, флюоресцентная ангиография, компьютерная томография, интраоперационная биопсия с проведением срочного гистологического исследования биоптата или радиоизотопная диагностика с использованием P32-тестирования). Currently, the differential diagnosis between the nevus of choroid of considerable size and initial uveal melanoma remains an extremely urgent task. To solve it, all existing modern research methods are used, including clinical anamnestic, functional (computer perimetry, visometry) and instrumental research methods (direct and reverse ophthalmoscopy, nuclear magnetic resonance, ultrasound examinations in two and three-dimensional images, fluorescence angiography, computer tomography, intraoperative biopsy with an urgent histological examination of the biopsy or radioisotope diagnosis using P32-tested I).

Сложность проведения дифференциальной диагностики заключается в сходстве клинической картины глазного дна, обусловленной единством происхождения (единством клетки-родоначальника - меланоцита) при невусе хориоидеи и увеальной меланоме, накладывающимися на нее сходными клиническими симптомами и данными инструментального обследования. The difficulty of differential diagnosis lies in the similarity of the clinical picture of the fundus, due to the unity of origin (unity of the progenitor cell - melanocyte) with choroid nevus and uveal melanoma, overlapping it with similar clinical symptoms and instrumental examination data.

Невус хороидеи встречается по данным различных авторов от 5 до 10% при аутопсии глаз (Tumors of the Eye and Ocular Adnexa. - p. 242. - by Jan W. McLean, Miguel N. Burnier, Lorenz E. Zimmerman. AFIP, Washington 1993). Его часто принимают за начальную опухоль. И, наоборот, принимая начальную опухоль за невус хориоидеи, офтальмологи часто оставляют пациента на продолжительный срок без наблюдения и упускают сроки для проведения эффективного лечения. Вместе с тем, в случае увеальной меланомы, когда процесс метастазирования может произойти на любой стадии опухолевого роста, этот срок может оказаться решающим для начала органной инвазии. According to various authors, nevus of the choroid occurs from 5 to 10% with autopsy of the eyes (Tumors of the Eye and Ocular Adnexa. - p. 242. - by Jan W. McLean, Miguel N. Burnier, Lorenz E. Zimmerman. AFIP, Washington 1993 ) It is often mistaken for an initial tumor. And, on the contrary, taking the initial tumor for the nevus of the choroid, ophthalmologists often leave the patient for a long time without observation and miss the deadlines for effective treatment. However, in the case of uveal melanoma, when the process of metastasis can occur at any stage of tumor growth, this period may be crucial for the onset of organ invasion.

Дифференциальная диагностика настолько сложна, что некоторые офтальмологи в Европе и США предпочитают лечить маленькие опухоли ad priore фотокоагуляцией или брахитерапией без гистологического подтверждения диагноза, считая, что лучше гипердиагностировать, чем пропустить опухоль [там же, стр. 247]. Однако не следует забывать, что вышеупомянутые методы лечения достаточно часто сопровождаются осложнениями различного рода и характера. Например, фотокоагуляция может вызвать отслойку сетчатки (при передозировке мощности излучения в процессе коагуляции с образованием дырки в сетчатке) или обширные кровоизлияния в сетчатку при повреждении интраретинальных сосудов. А брахитерапия может вызвать склеромаляцию, постлучевую хориоретинопатию, нейроретинопатию или иридоциклит в зависимости от локализации опухоли и, следовательно, места и дозы облучения. В литературе также описаны случаи пострадиационного эндофтальмита [Зарубей Г.Д. Радиотерапия опухолей глаза. - стр. 13 - докт. дисс. - Москва. - 1982 г]. Проведение лечения любым из указанных методов сопровождается снижением зрительных функций, а следовательно, и качества жизни больных. Все вышеперечисленное заставляет глубже заглянуть в проблему дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы. Differential diagnosis is so complex that some ophthalmologists in Europe and the USA prefer to treat small ad priore tumors with photocoagulation or brachytherapy without histological confirmation of the diagnosis, believing that it is better to overdiagnose than to miss the tumor [ibid, p. 247]. However, we should not forget that the above treatment methods are often accompanied by complications of various kinds and nature. For example, photocoagulation can cause retinal detachment (with an overdose of radiation power during coagulation to form a hole in the retina) or extensive retinal hemorrhage due to damage to the intraretinal vessels. And brachytherapy can cause scleromalacia, post-radiation chorioretinopathy, neuroretinopathy or iridocyclitis, depending on the location of the tumor and, consequently, the place and dose of radiation. The literature also describes cases of post-radiation endophthalmitis [Zarubei GD Radiotherapy of eye tumors. - p. 13 - doct. diss. - Moscow. - 1982 g]. Conducting treatment with any of these methods is accompanied by a decrease in visual functions, and consequently, in the quality of life of patients. All of the above makes a deeper look into the problem of differential diagnosis of initial uveal melanoma.

Невус хориоидеи при проминенции до 1,5 мм и диаметром менее 10 мм², протекает бессимптомно. Его находят случайно на профилактических осмотрах при офтальмоскопии. Но тщательная периметрия, тем не менее, у многих из них обнаруживает дефекты в поле зрения, как и при начальной увеальной меланоме [Edward Jackson Memorial lection Problems in the differential diagnosis nevi and malignant melanomas. Am J. Ophthalmol 1977; 83 : 299-323].Nevus of the choroid, with a prominence of up to 1.5 mm and a diameter of less than 10 mm ² , is asymptomatic. He is found by chance at preventive examinations with ophthalmoscopy. But careful perimetry, however, in many of them reveals defects in the field of view, as in the case of initial uveal melanoma [Edward Jackson Memorial lection Problems in the differential diagnosis nevi and malignant melanomas. Am J. Ophthalmol 1977; 83: 299-323].

Гистологические данные выявляют дегенеративные изменения в тканях, прилежащих к невусу, которые и обуславливают дефекты в поле зрения. Самыми ранними проявлениями являются компрессия и облитерация хориокапилляров хориоидеи с последующим формированием друз в пигментном эпителии сетчатки и серозной отслойкой пигментного эпителия, а впоследствии отслойкой нейросенсорной сетчатки. Затем присоединяется дегенерация пигментного эпителия и фоторецепторных клеток [Naumann G. et al "Histogenesis of malignant melanomas of uvea. Histopathologic characteristics of nevi of the chotoid and ciliary body". Arch Ophthalmol 1966 vol. 76, p. 784-96; Naumann G. et al Pigmanted nevi of the choroid: clinical study of secondary changes in the overlying tissue. Trans Am Ophthalmol Otolaryngol 1971; vol. 75: p 110-123]. Histological data reveal degenerative changes in the tissues adjacent to the nevus, which cause defects in the field of view. The earliest manifestations are compression and obliteration of the choriocapillaries of the choroid, followed by the formation of drusen in the retinal pigment epithelium and serous detachment of the pigment epithelium, and subsequently detached neurosensory retina. Then, degeneration of the pigment epithelium and photoreceptor cells is added [Naumann G. et al "Histogenesis of malignant melanomas of uvea. Histopathologic characteristics of nevi of the chotoid and ciliary body". Arch Ophthalmol 1966 vol. 76, p. 784-96; Naumann G. et al Pigmanted nevi of the choroid: clinical study of secondary changes in the overlying tissue. Trans Am Ophthalmol Otolaryngol 1971; vol. 75: p 110-123].

В ряде случаев проминенция невуса достигает 3 мм. Такие невусы в 100% случаев сопровождаются дефектами в поле зрения. Их называют подозрительными и рекомендуют наблюдение за ними с частыми посещениями окулиста. Возможен рост невуса или его перерождение (в 10% случаев) [Shields and Shields C. Intraocular Tumors. A text and atlas. Philadelphia: p. 123 WB Saunders, 1992]. С возрастом вероятность перерождения увеличивается. In some cases, the nevus prominence reaches 3 mm. Such nevi in 100% of cases are accompanied by defects in the field of view. They are called suspicious and recommend monitoring them with frequent visits to the optometrist. Possible growth of nevus or its degeneration (in 10% of cases) [Shields and Shields C. Intraocular Tumors. A text and atlas. Philadelphia: p. 123 WB Saunders, 1992]. With age, the likelihood of rebirth increases.

Поля оранжевого пигмента на поверхности таких подозрительных невусов, представляющие глыбки отложенного липофусцина, также зачастую присутствуют, хотя гораздо чаще они ассоциируются с прогрессирующими опухолями [Zimmerman LE. , Armaly MF The nature of the orange pigment over a choroidal melanoma. Histochemical and electron microscopical observations. Arch Ophthalmol 1974 vol. 91, p. 359-61]. Fields of orange pigment on the surface of such suspicious nevi, representing lumps of delayed lipofuscin, are also often present, although they are much more often associated with progressive tumors [Zimmerman LE. , Armaly MF The nature of the orange pigment over a choroidal melanoma. Histochemical and electron microscopical observations. Arch Ophthalmol 1974 vol. 91, p. 359-61].

Сходство офтальмоскопической картины невуса хориоидеи и начальной увеальной меланомы дополняет сходные данные ультрасонографии или компьютерной томографии. The similarity of the ophthalmoscopic picture of the choroid nevus and the initial uveal melanoma complements the similar data of ultrasonography or computed tomography.

Из инструментальных методов исследования при проведении дифференциальной диагностики флюоресцентная ангиография является наиболее информативной. Основными ангиографическими признаками, характерными для начальной меланомы, является пятнистая гиперфлюоресценция, переходящая в венозной фазе в сливную; длительная остаточная флюоресценция опухоли. Как правило, начальную меланому хориоидеи окружает бордюр из флюоресцирующих друз, которые могут визуализироваться на поверхности всей опухоли, но в меньшем количестве, чем на периферии. Часто отмечаются изменения в регионарных сосудах, типа аневризм. Вокруг новообразования может быть реактивный гиперфлюоресцирующий ореол. Начальная меланома не имеет четких границ (фиг. 2). Вместе с тем, данные флюоресцентной ангиографии широко варьируют при невусах и маленьких опухолях. Они зависят от некоторых факторов, например степени васкуляризации меланомы или активности невуса. Обычно степень ранней гипофлюоресценции пропорциональная степени пигментации образования. Однако по мере заполнения сосудов флюоресцеином последний начинает пропотевать сквозь сосудистую стенку и гипофлюоресценция сменяется гиперфлюоресценцией различной степени выраженности в позднюю артериальную и венозную фазу. Таким образом, поздняя венозная фаза увеальной меланомы характеризуется сливной диффузной гиперфлюоресценцией. Однако аналогичная картина наблюдается и при прогрессирующем гигантском невусе или псевдотуморозных заболеваниях, метастатических опухолях хориоидеи, гемангиомах хориоидеи [Howard Schatz et al. "Interpretation of fundus fluorescein angiography". Sant Louis 1978]. Of the instrumental methods of research during differential diagnosis, fluorescence angiography is the most informative. The main angiographic signs characteristic of the initial melanoma are spotty hyperfluorescence, which passes into the confluent in the venous phase; prolonged residual fluorescence of the tumor. As a rule, the initial choroid melanoma is surrounded by a border of fluorescent druses that can be visualized on the surface of the entire tumor, but in less quantity than on the periphery. Often there are changes in regional vessels, such as aneurysms. Around the neoplasm there may be a reactive hyperfluorescent halo. Initial melanoma has no clear boundaries (Fig. 2). However, fluorescence angiography data vary widely in nevi and small tumors. They depend on certain factors, for example, the degree of vascularization of melanoma or nevus activity. Usually the degree of early hypofluorescence is proportional to the degree of pigmentation of the formation. However, as the vessels fill with fluorescein, the latter begins to sweat through the vascular wall and hypofluorescence is replaced by hyperfluorescence of varying severity in the late arterial and venous phase. Thus, the late venous phase of uveal melanoma is characterized by confluent diffuse hyperfluorescence. However, a similar pattern is observed with progressive giant nevus or pseudotumor diseases, metastatic choroid tumors, choroid hemangiomas [Howard Schatz et al. "Interpretation of fundus fluorescein angiography." Sant Louis 1978].

Прогрессирующий невус с классической клинической картиной характеризуется на ангиограмме появлением на фоне гипофлюоресценции зоны пятнистого окрашивания; выявляются множественные хаотично разбросанные друзы, которые гуще и чаще располагаются от центра к периферии. Прогрессирующий невус также не имеет четких границ; вокруг зоны невуса, как и при начальной меланоме, могут быть и флюоресцирующий ореол и бордюр (фиг. 1). Некоторые авторы отмечают наличие микроаневризм сосудов сетчатки на его периферии. Раннее уменьшение флюоресценции зоны поражения считается более характерным для прогрессирующего невуса в отличие от начальной меланомы. Таким образом, практически одни и те же ангиографические признаки (мелкопятнистая гиперфлюоресценция на фоне признаков дистрофии сетчатки, чередование участков атрофии пигментного эпителия и его гиперплазии, друзы, микроаневризмы сосудов сетчатки, нечеткость контуров) могут иметь место и при начальной меланоме и при прогрессирующем невусе. Различия заключаются лишь в степени выраженности и сочетании различных симптомов, которые оцениваются субъективно. То есть на сегодняшний день нет патогномоничного симптома ни для невуса хориоидеи, ни для увеальной меланомы, выявляемых на флюоресцентной ангиографии. Практика показывает, что кроме "классических" случаев начальной меланомы хориоидеи и прогрессирующего невуса, когда диагностика на основе клиникоангиографической картины не представляет больших трудностей, у большинства пациентов имеет место "пограничная" клиническая и ангиографическая клиническая симптоматика, которая сложна для интерпретации, вследствие чего диагностика чрезвычайно затруднена. Кроме того, этот метод не всегда полезен в дифференциальной диагностике, например, в случаях локализации процесса на крайней периферии и невозможности достичь максимального мидриаза. Далее, флюоресцентная ангиография возможна только при абсолютно прозрачных оптических средах. У пациента не должны быть тяжелые соматические (сердечно-сосудистые, почечные) и аллергические заболевания. Указанные ограничения связаны с необходимостью введения флюоресцеина больному и возможностью возникновения аллергической реакции на препарат или способностью его вызывать изменения в коагулирующих свойствах крови с риском возникновения тромбоза вен нижних конечностей. Таким образом, возможности проведения флюоресцентной ангиографии ограничены у ряда пациентов. A progressive nevus with a classic clinical picture is characterized on the angiogram by the appearance of a spotted staining zone against hypofluorescence; multiple chaotically scattered Druze are revealed, which are denser and more often located from the center to the periphery. Progressive nevus also has no clear boundaries; around the nevus zone, as with initial melanoma, there may be a fluorescent halo and a border (Fig. 1). Some authors note the presence of microaneurysms of the retinal vessels on its periphery. An early decrease in the fluorescence of the affected area is considered more characteristic of progressive nevus, in contrast to initial melanoma. Thus, almost the same angiographic signs (finely spotted hyperfluorescence against the background of signs of retinal dystrophy, alternation of sites of atrophy of the pigment epithelium and its hyperplasia, druse, retinal vascular microaneurysm, blurred contours) can occur with initial melanoma and progressive nevus. The differences are only in the severity and combination of various symptoms, which are evaluated subjectively. That is, today there is no pathognomonic symptom for either the choroid nevus or the uveal melanoma detected on fluorescence angiography. Practice shows that in addition to the “classic” cases of initial choroid melanoma and progressive nevus, when the diagnosis based on the clinical angiographic picture is not very difficult, most patients have “borderline” clinical and angiographic clinical symptoms, which are difficult to interpret, which makes diagnosis extremely difficult. In addition, this method is not always useful in differential diagnostics, for example, in cases of localization of the process at the extreme periphery and the inability to achieve maximum mydriasis. Further, fluorescence angiography is possible only with completely transparent optical media. The patient should not have severe somatic (cardiovascular, renal) and allergic diseases. These limitations are associated with the need to administer fluorescein to the patient and the possibility of an allergic reaction to the drug or its ability to cause changes in the coagulating properties of the blood with the risk of venous thrombosis of the lower extremities. Thus, the ability to conduct fluorescence angiography is limited in a number of patients.

В этом случае предпочтительна ультрасонография, поскольку проведение этого метода исследования не зависит от прозрачности оптических сред и возможно у всех пациентов, невзирая на тяжелый соматический статус. In this case, ultrasonography is preferable, since the implementation of this research method does not depend on the transparency of optical media and is possible in all patients, despite the difficult somatic status.

Однако и при этом методе исследования нет четких патогномоничных признаков, свойственных только увеальной меланоме или только прогрессирующему невусу. При обеих нозологических единицах имеет место проминирующая "+ ткань" с определенными, относительно точными, характеристиками (уровень проминенции и диаметр основания). Точность измерения определяется разрешающими способностями оборудования, используемого при ультразвуковом сканировании. Форма опухоли или невуса может быть различной от "грибовидной" на тонком основании до почти плоской (что более характерно для метастазирующей опухоли сосудистой оболочки). However, even with this research method, there are no clear pathognomonic signs characteristic only of uveal melanoma or only progressive nevus. With both nosological units, there is a propping “+ tissue” with certain, relatively accurate, characteristics (level of proination and diameter of the base). The measurement accuracy is determined by the resolution of the equipment used in ultrasound scanning. The shape of the tumor or nevus can vary from "mushroom" on a thin base to almost flat (which is more characteristic of a metastatic tumor of the choroid).

В подобных случаях решающим оказывается наблюдение в динамике (осмотр и повторение ФАГ и УЗИ через 3 месяца, сроки обусловлены скоростью роста подобных опухолей). Однако нельзя забывать о высоком риске метастазирования и значительной прогрессии опухоли за столь продолжительный срок наблюдения. Кроме того, в условиях тяжелой экономической инфляции повторные поездки для некоторых больных, проживающих в отдаленных регионах, связаны с значительными материальными затратами, порой неразрешимыми. В связи со всем вышеизложенным представляется чрезвычайно важным разработка новых методов дифференциальной диагностики, внедрение которых позволит не только поставить диагноз, но и своевременно и обоснованно начать органосохранное лечение, а следовательно, повысить эффективность проводимой терапии и увеличить продолжительность и качество жизни офтальмонкологических больных. In such cases, the follow-up in dynamics is decisive (examination and repetition of phage and ultrasound after 3 months, the timing is determined by the growth rate of such tumors). However, one should not forget about the high risk of metastasis and significant tumor progression over such a long observation period. In addition, in conditions of severe economic inflation, repeated trips for some patients living in remote regions are associated with significant material costs, sometimes insoluble. In connection with all of the above, it seems extremely important to develop new methods of differential diagnosis, the introduction of which will not only make a diagnosis, but also timely and reasonably begin organ-preserving treatment, and therefore, increase the effectiveness of the therapy and increase the duration and quality of life of ophthalmic patients.

Проведение интраоперационной биопсии с проведением срочной гистологической верификации или P32-тестирование сопряжены с психологической, физической нагрузкой и операционной травмой и необходимостью принимать решение об объеме оперативного вмешательства на операционном столе, когда больной находится в бессознательном состоянии (наркозе). Но более важным на наш взгляд является ассоциация с высоким риском метастазирования в процессе забора биоптата или повреждением глазного яблока. Лишь отдельные авторы признают этот метод верификации диагноза. An intraoperative biopsy with urgent histological verification or P32 testing is associated with psychological, physical exertion and surgical trauma and the need to decide on the amount of surgical intervention on the operating table when the patient is in an unconscious state (anesthesia). But more important in our opinion is the association with a high risk of metastasis in the process of biopsy sampling or damage to the eyeball. Only a few authors recognize this method of verification of the diagnosis.

За последнюю декаду в связи с появившимися публикациями о том, что в патогенезе увеальной меланомы огромное значение имеют иммунные механизмы, мы предположили, что какие-либо иммунологические показатели могут свидетельствовать о присутствии злокачественного неопластического процесса в организме уже на начальных стадиях. Over the past decade, due to publications that have shown that immune mechanisms are of great importance in the pathogenesis of uveal melanoma, we hypothesized that any immunological parameters may indicate the presence of a malignant neoplastic process in the body at the initial stages.

В своей гипотезе мы отталкивались от того, что увеальная меланома является иммунозависимой опухолью [Char D.H. et al. Immunology of malanoma. Jap. J. Ophthalmol. - 1978-22-3 - p. 396-400]. Подтверждением иммуногенности является не только поведенческий характер опухоли, в виде возможных отсроченных метастазов спустя 30 лет после энуклеации или спонтанной регрессии первичного опухолевого узла [Scott R. et al. Spontaneous Regression of a Choroidal melanoma. Arch. Ophthalm. Vol 104, 1986, p. 732-734]. Иммунный ответ был подтвержден серией опубликованных экспериментальных и клинических работ. Так еще в 70-е годы выявлены изменения иммунной системы по типу повышенной чувствительности замедленного типа (РГЗТ), т.е. зафиксирована несомненная заинтересованность иммунологической реактивности организма [Priluck I.A. et al. Immune responsivness in patients with choroidal malignant melanom. Am. S. Ophthalmol - 1979 - vol 87 - p. 215-220]. In our hypothesis, we were guided by the fact that uveal melanoma is an immunodependent tumor [Char D.H. et al. Immunology of malanoma. Jap. J. Ophthalmol. - 1978-22-3 - p. 396-400]. Confirmation of immunogenicity is not only the behavioral nature of the tumor, in the form of possible delayed metastases 30 years after enucleation or spontaneous regression of the primary tumor node [Scott R. et al. Spontaneous Regression of a Choroidal melanoma. Arch. Ophthalm. Vol 104, 1986, p. 732-734]. The immune response has been confirmed by a series of published experimental and clinical studies. So back in the 70s, changes in the immune system were revealed by the type of hypersensitivity of the delayed type (RGT), i.e. recorded undoubted interest in the immunological reactivity of the body [Priluck I.A. et al. Immune responsivness in patients with choroidal malignant melanom. Am. S. Ophthalmol - 1979 - vol 87 - p. 215-220].

Char с сотр., выявил у 5 из 7 больных с меланомой хориоидеи аномальное подавление миграции лейкоцитов методом РГЗТ [Char D.H. et al. Cutaneous delayed hypersensitivity reactions to soluble melanoma antigen in patients with ocular malignant melanoma. N. Eng. J. Med. - 1974 - 291 - p. 274-277]. Ранее ими же была описана положительная реакция кожи с растворенным меланомным антигеном у 18 из 19 пациентов с увеальной меланомой. Char et al., Revealed in 5 of 7 patients with choroid melanoma an abnormal suppression of leukocyte migration by the RGT method [Char D.H. et al. Cutaneous delayed hypersensitivity reactions to soluble melanoma antigen in patients with ocular malignant melanoma. N. Eng. J. Med. - 1974 - 291 - p. 274-277]. Previously, they also described a positive skin reaction with dissolved melanoma antigen in 18 of 19 patients with uveal melanoma.

Аналогичные исследования функциональной активности иммуноцитов in vivo с использованием различных методик и митогенов проводили отечественные авторы (в реакции спонтанной бласттрансформации лимфоцитов) при увеальной меланоме. [Зайцева Н. С. с соавт. "Иммунологические и аллергические процессы в патологии органа зрения". Тез. У Всесоюзного съезда офтальмологов. - М., 1979 - т. 4. - с. 3-11; Нифонтова Т.П. Кожная реакция замедленной гиперчувствительности на 2-4 динитрохлорбензол у больных меланобластомой сосудистого тракта глаза. Офтальм. ж. - 1981 - N 6 - с. 356-357; Котелянский Э.О. с соавт. "Иммунологические исследования при увеальных меланомах". Сб. научн. работ: Офтальмоонкология - М. , 1983, - с. 68-72]. Обнаружены достоверные различия между показателями пациентов с развитой увеальной меланомой и донорскими. Обнаружена корреляция в 75% случаев исходного уровня с прогнозом и стадией увеальной меланомы. Similar studies of the functional activity of immunocytes in vivo using various techniques and mitogens were performed by Russian authors (in the reaction of spontaneous blast transformation of lymphocytes) with uveal melanoma. [Zaitseva N. S. et al. "Immunological and allergic processes in the pathology of the organ of vision." Thes. At the All-Union Congress of Ophthalmologists. - M., 1979 - v. 4. - p. 3-11; Nifontova T.P. Skin reaction of delayed hypersensitivity to 2-4 dinitrochlorobenzene in patients with melanoblastoma of the vascular tract of the eye. Ophthalmus. g. - 1981 - N 6 - p. 356-357; Kotelyansky E.O. et al. "Immunological studies in uveal melanomas." Sat scientific works: Ophthalmooncology - M., 1983, - p. 68-72]. Significant differences were found between the parameters of patients with advanced uveal melanoma and donor. A correlation was found in 75% of cases of the initial level with the prognosis and stage of uveal melanoma.

Кожные тесты гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) остаются единственным способом оценки функций иммунокомпетентных клеток in vivo и при корректной интерпретации дают ценную информацию об иммунном статусе пациента с увеальной меланомой. Показатели ответа в кожных тестах РГЗТ коррелируют с результатами тестирования ГЗТ in vitro, включая оценку пролиферативного ответа лимфоцитов и определение продукции цитокинов. Кожные тесты ГЗТ являются наиболее простыми и эффективными методами оценки функций клеточного иммунитета у человека, однако их выполнение сопряжено с несколькими моментами. Slow-type skin hypersensitivity tests (HRGTs) remain the only way to evaluate the functions of immunocompetent cells in vivo and, if correctly interpreted, provide valuable information about the immune status of a patient with uveal melanoma. Response rates in RGTT skin tests correlate with in vitro HRT testing results, including assessment of the lymphocyte proliferative response and determination of cytokine production. Skin tests HRT are the simplest and most effective methods for assessing the functions of cellular immunity in humans, however, their implementation is associated with several points.

Во-первых, необходима достаточно высокая профессиональная компетентность врача-иммунолога, чтобы идентифицировать саму реакцию ГЗТ, так как внутрикожная инъекция антигена может индуцировать несколько типов реакций у человека. При оценке ГЗТ решающими являются сроки появления пика реакции (24-48 часов) и характер ее проявления (покраснение и уплотнение), которые обусловлены накоплением лимфоцитов и макрофагов в месте введения антигена. First, a sufficiently high professional competence of the immunologist is needed to identify the HRT reaction itself, since intradermal injection of antigen can induce several types of reactions in humans. When assessing HRT, the timing of the appearance of the peak of the reaction (24-48 hours) and the nature of its manifestation (redness and densification), which are caused by the accumulation of lymphocytes and macrophages at the site of antigen administration, are crucial.

Во-вторых, отсутствие стандартных реагентов (антигена) требует для правильной интерпретации результатов предварительного тестирования на здоровых добровольцах с известной кожной реактивностью к интересующему антигену. В связи с этим гипоэргия (низкая реакция ГЗТ на антиген) может быть констатирована у больных только с более слабой реакцией, чем в группе здоровых доноров. Secondly, the lack of standard reagents (antigen) requires for the correct interpretation of the results of preliminary testing in healthy volunteers with known skin reactivity to the antigen of interest. In this regard, hypoergy (low HRT response to an antigen) can only be detected in patients with a weaker reaction than in the group of healthy donors.

В-третьих, необходимо тестирование не на один, а хотя бы на два и более антигена, так как отсутствие или снижение реакции на какой-либо один антиген еще не является свидетельством анергии или гипоэргии у данного индивидуума, поскольку ему, возможно не приходилось ранее встречаться с этим антигеном, а ответ на другие антигены может быть сохранен. Thirdly, testing is necessary not for one, but for at least two or more antigens, since the absence or decrease in the reaction to any one antigen is not yet evidence of anergy or hypoergy in this individual, since he may not have previously met with this antigen, and the response to other antigens can be saved.

Наиболее принятыми являются два метода кожных тестов РГЗТ:
1) классический метод заключается во внутрикожном введении 0,1 мл антигена (меланомного) с помощью тонкой иглы и шприца;
2) мультитест подразумевает стандартную технику использования пластикового аппликатора, когда с помощью щипчиков вводится семь антигенов и контролируется давление на коже. Используются несколько антигенов (антиген вируса паротита, дифтерийный токсин, туберкулин, и т.д.). По данным литературы, встречаемость положительного ответа на различный антиген у здоровых доноров различна и колеблется от 75,5% (на антиген паротита) до 38,3% - к дифтерийному токсину.The most accepted are two methods of skin tests RGZT:
1) the classical method consists in the intradermal injection of 0.1 ml of antigen (melanoma) using a thin needle and syringe;
2) multitest involves the standard technique of using a plastic applicator, when seven antigens are introduced using tweezers and pressure on the skin is controlled. Several antigens are used (mumps antigen, diphtheria toxin, tuberculin, etc.). According to the literature, the incidence of a positive response to a different antigen in healthy donors is different and ranges from 75.5% (for mumps antigen) to 38.3% for diphtheria toxin.

Однако, если вышеописанные реакции можно использовать при составлении прогноза конкретного больного с увеальной меланомой или определении эффективности проводимого лечения, то ни в одной из приведенных выше работ нет ссылок на то, что иммунологические показатели, полученные в реакциях ГЗТ, могут быть использованы в качестве маркеров злокачественной опухоли на начальном этапе при проведении дифференциальной диагностики сложных клинических случаев невусов хориоидеи и начальной меланомы сосудистой оболочки (болезнь и др.). However, if the above reactions can be used to make a prognosis of a particular patient with uveal melanoma or to determine the effectiveness of the treatment, then none of the above works cites the fact that the immunological parameters obtained in HRT reactions can be used as markers of malignant tumors at the initial stage in the differential diagnosis of complex clinical cases of nevi of the choroid and initial choroid melanoma (disease, etc.).

В поисках стандартных иммунологических приемов, используемых в диагностике неопластических процессов maligna на самых ранних его этапах, мы обнаружили способ определения иммунологических параметров естественных или нормальных киллерных клеток (НК) в различных биологических объектах (плевральном выпоте или крови). In search of standard immunological techniques used in the diagnosis of maligna neoplastic processes at its earliest stages, we found a way to determine the immunological parameters of natural or normal killer cells (NK) in various biological objects (pleural effusion or blood).

НК присутствуют в периферической крови (до 15% от числа лимфоцитов) и в различных лимфоидных тканях человека. Выделенные из периферической крови человека они обладают in vitro спонтанной цитотоксической активностью против различных опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусами. Данная популяция лимфоцитов открыта в начале 70-х годов, и в результате ее интенсивного изучения общепринятым методом сформировалось мнение, что НК выполняют важнейшую функцию в организме, обеспечивая первый уровень защиты против опухолевых клеток и внутриклеточных инфекций до включения иммунных механизмов (Руководство по аллергологии и клинической иммунологии. - под ред. Хаитова Р.М., Львов, 1997, с. 23). NK are present in peripheral blood (up to 15% of the number of lymphocytes) and in various human lymphoid tissues. Isolated from human peripheral blood, they have in vitro spontaneous cytotoxic activity against various tumor cells, cells infected with viruses. This population of lymphocytes was discovered in the early 70s, and as a result of its intensive study by the generally accepted method, it was suggested that NKs perform an essential function in the body, providing the first level of protection against tumor cells and intracellular infections before the inclusion of immune mechanisms (Guidelines for Allergology and Clinical immunology. - under the editorship of Khaitov R.M., Lvov, 1997, p. 23).

В отличие от других цитотоксических клеток (например T-супрессоров) НК опосредуют цитотоксические реакции без предварительной сенсибилизации и без рестрикции по экспрессии антигенов класса I и II главного комплекса гистосовместимости на клетках мишени, последние моменты обуславливают более быстрое реагирование этого клона на появление опухолевой клетки-мутанта. Высокая цитотоксичность и способность продуцировать многие цитокины - основные свойства естественных клеток киллеров, которые могут быть нарушены при злокачественных опухолях. Unlike other cytotoxic cells (for example, T-suppressors), NKs mediate cytotoxic reactions without prior sensitization and without restriction on the expression of class I and II antigens of the main histocompatibility complex on target cells, the last moments determine a faster response of this clone to the appearance of a mutant tumor cell . High cytotoxicity and the ability to produce many cytokines are the main properties of natural killer cells that can be impaired in malignant tumors.

Kwong с соавт., проводя фенотипирование НК-клеток у больных с лимфомами установил, что выявление только CD56+ (метод фенотипирования) на нормальных киллерных клетках периферического русла у пациентов с множественной (полиорганной) лимфомой является неблагоприятным фактором при прогнозировании продолжительности жизни этих больных [Kwong-YL et al. "CD56+ NK lymphomas: clinicopathological features and prognosis". Br-J-Haematol. 1997 Jun; 97(4): 821-9]. Kwong et al., Performing phenotyping of NK cells in patients with lymphomas, found that the detection of only CD56 + (phenotyping method) on normal killer cells of the peripheral bed in patients with multiple (multiple) lymphoma is an unfavorable factor in predicting the life expectancy of these patients [Kwong- YL et al. "CD56 + NK lymphomas: clinicopathological features and prognosis." Br-J-Haematol. 1997 Jun; 97 (4): 821-9].

Green-LK с соавт., определяя наряду с фенотипом относительный показатель (% содержание в пуле лимфоцитов) НК-клеток, выделяемых из плеврального выпота, использовал эти показатели в диагностике карциномы легких. Ему также удавалось в 90% анализируемых случаев прогнозировать вероятность метастазирования у пациентов [Green-LK; Griffin-J "Increased natural killer cells in fluids. A new, sensitive means of detecting carcinoma". Acta-Cytol. 1996 Nov-Dec; 40(6): 1240-5]. Green-LK et al., Determining along with the phenotype the relative indicator (% content in the pool of lymphocytes) of NK cells isolated from pleural effusion, used these indicators in the diagnosis of lung carcinoma. He was also able to predict the probability of metastasis in patients in 90% of the analyzed cases [Green-LK; Griffin-J "Increased natural killer cells in fluids. A new, sensitive means of detecting carcinoma." Acta-Cytol. 1996 Nov-Dec; 40 (6): 1240-5].

Ohlsson-Wilhelm-BM; Wang-G провели широкие исследования по выявлению количества циркулирующих НК-клеток в крови с одновременным определением их способности к цитолизу клеток-мишеней in vitro. Количественный показатель НК-клеток у пациентов с начальным раком молочной железы оказался не пригодным для этих целей, поскольку он практически не отличался от донорского. Индекс цитолиза определяли с использованием различных клеток мишеней (тест-панель включала К562, резистентные к НК-киллингу клетки Daudi и две опухолевые линии рака молочной железы, гормоно-чувствительную линию MCF7 и метастазирующую линию MDA-MB-435). Причем показатели цитолиза первых двух мишеней НК-клетками у пациентов с раком молочной железы и здоровых доноров не отличались. Вместе с тем, обнаружена достоверная разница в цитолитической активности НК пациентов с начальной стадией рака молочной железы и здоровых женщин при использовании клеток-мишеней MCF7 и MDA-MB-435. Цитолитическая активность увеличивалась по мере прогрессирования ракового процесса. Согласно представленным данным, больные с первой стадией рака молочной железы среди всех женщин с подозрительными мамограммами могут быть распознаны по повышенной функциональной способности их НК-клеток к цитолизу мишени MCF7. [Ohlsson-Wilhelm-BM; et al. Circulating killer cells in women undergoing needle-directed excisional breast biopsy. Eur-J-Histochem. 1994; 38 Suppl 1: 77-82}. Ohlsson-Wilhelm-BM; Wang-G conducted extensive studies to identify the number of circulating NK cells in the blood while determining their ability to cytolize target cells in vitro. The quantitative indicator of NK cells in patients with initial breast cancer was not suitable for these purposes, since it practically did not differ from the donor one. The cytolysis index was determined using various target cells (the test panel included K562, NK-resistant cells from Daudi and two tumor lines of breast cancer, the hormone-sensitive line MCF7 and the metastatic line MDA-MB-435). Moreover, the cytolysis rates of the first two targets by NK cells in patients with breast cancer and healthy donors did not differ. At the same time, a significant difference was found in the cytolytic activity of NK patients with the initial stage of breast cancer and healthy women using the target cells MCF7 and MDA-MB-435. Cytolytic activity increased as the cancer process progressed. According to the data presented, patients with the first stage of breast cancer among all women with suspicious mammograms can be recognized by the increased functional ability of their NK cells to cytolize the MCF7 target. [Ohlsson-Wilhelm-BM; et al. Circulating killer cells in women undergoing needle-directed excisional breast biopsy. Eur-J-Histochem. 1994; 38 Suppl 1: 77-82}.

Напротив, у больных с метастазирующей формой аденокарциономы молочной железы или меланомой кожи функциональная активность киллеров ниже, чем у больных с начальными формами этих опухолей. Таким образом, установлена четкая корреляция между функциональной активностью естественных киллеров (как пула иммунокомпетентных клеток) и малигнизацией/метастазированием отдельных видов опухолей. On the contrary, in patients with a metastatic form of breast adenocarcinoma or skin melanoma, the functional activity of killers is lower than in patients with the initial forms of these tumors. Thus, a clear correlation was established between the functional activity of natural killers (as a pool of immunocompetent cells) and malignancy / metastasis of certain types of tumors.

Аналогичных данных по изучению НК-клеток in vivo и in vitro при увеальной меланоме в доступной литературе нами не найдено. Пытаясь применить описанный выше способ (количественный подсчет и определение функциональной активности НК-клеток) при проведении дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы мы обнаружили, что наши данные отличаются от приведенных выше. Более того, выявлены достоверные отличия в полученных показателях двух анализируемых групп: увеальной меланомы и невусе хориоидеи. We have not found similar data on the study of NK cells in vivo and in vitro with uveal melanoma in the available literature. Trying to apply the method described above (quantitative calculation and determination of the functional activity of NK cells) in the differential diagnosis of initial uveal melanoma, we found that our data differ from the above. Moreover, significant differences were found in the obtained indices of the two analyzed groups: uveal melanoma and choroid nevus.

Материалом для анализа послужили данные, полученные в процессе клинико-иммунологического обследования 12 пациентов с невусами хориоидеи и 57 человек с меланомой, в том числе 18 с начальной стадией увеальной меланомы различной локализации и размеров, не выходящих за пределы, обозначенные стадией T₁N₀M₀ по международной классификации. Исследовали абсолютный показатель нормальных киллерных киллеров (CD16+) в периферической крови и функциональный свойства НК-клеток in vitro. Проведенные исследования контролировались данными инструментальных методов с целью подтверждения диагноза и исключения ошибки.The analysis was based on data obtained during a clinical and immunological examination of 12 patients with choroid nevi and 57 people with melanoma, including 18 with the initial stage of uveal melanoma of various localization and sizes, not exceeding the limits indicated by stage T ₁ N ₀ M ₀ according to international classification. We studied the absolute value of normal killer killers (CD16 +) in peripheral blood and the functional properties of NK cells in vitro. The studies were controlled by instrumental methods in order to confirm the diagnosis and eliminate errors.

Полученные данные легли в основу излагаемого изобретения. The obtained data formed the basis of the claimed invention.

При анализе популяции CD16+ использовали абсолютный показатель, являющийся отражением количества клеток, циркулирующих в периферическом русле в единице объема, выражаемый в кл./мл³. Этот показатель в сочетании с удельной активностью достаточно полно отразил состояние НК популяции у пациентов с начальной меланомой.In the analysis of the CD16 + population, an absolute indicator was used, which is a reflection of the number of cells circulating in the peripheral bed in a unit volume, expressed in cells / ml ³ . This indicator, combined with specific activity, adequately reflected the state of the NK population in patients with initial melanoma.

Обнаружены достоверные отличия при оценке анализируемых показателей CD16+ в двух нозологических единицах. Так, если у пациентов с невусом хориоидеи абсолютный показатель не отличается от донорских, то при начальной увеальной меланоме отмечается достоверная гиперплазия пула CD16+ (ср. абсолютный показатель 600±100 кл./мкл при норме 300±100) с достоверным повышением удельной активности (при снижении, соответственно, цитолитической активности нормальных киллеров). Significant differences were found when assessing the analyzed indicators of CD16 + in two nosological units. So, if in patients with choroid nevus the absolute indicator does not differ from the donor one, then with initial uveal melanoma there is significant hyperplasia of the CD16 + pool (compare the absolute indicator of 600 ± 100 cells / μl at a rate of 300 ± 100) with a significant increase in specific activity (at a decrease, respectively, of the cytolytic activity of normal killers).

Таким образом, проведенные нами исследования позволили установить иммунологические параметры, характеризующие НК-клетки в условиях начальной увеальной меланомы. Thus, our studies made it possible to establish immunological parameters characterizing NK cells in the conditions of initial uveal melanoma.

Определяют субпопуляции НК-лимфоцитов с помощью особо чувствительного метода с применением моноклональных антител. Моноклональные антитела CD получают с помощью использования гибридомной технологии. Эти антитела способны с высокой точностью распознавать определенные клеточные компоненты иммунной системы. Антитела определенной специфичности связываются с флюоресцентной меткой /TC-флюоресцеин-изоцианат/. Обнаруживая на поверхности жизнеспособных клеток /лимфоцитов/ экспрессированные уникальные антигенные детерминанты, меченные флюоресцеином моноклональные антитела образуют соединения с этими детерминантами и делают клетки узнаваемыми и определяемыми количественно. Subpopulations of NK lymphocytes are determined using a particularly sensitive method using monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies CD obtained using hybridoma technology. These antibodies are able to accurately recognize certain cellular components of the immune system. Antibodies of a specific specificity bind to the fluorescent label / TC-fluorescein-isocyanate /. By detecting on the surface of viable cells / lymphocytes / expressed unique antigenic determinants, fluorescein-labeled monoclonal antibodies form compounds with these determinants and make the cells recognizable and quantifiable.

CD16+ являются природными эффекторными клетками и необходимы для эффективного иммунного ответа к опухоли. Они используют те же самые литические механизмы, что и цитотоксические T-лимфоциты (CD8+) для киллинга клеток, но при этом не экспрессируют T-клеточных антигенных рецепторов и осуществляют независимым от МНС способом киллинг клеток-мишеней. CD16+ могут лизировать как вирус-инфицированные, так и опухолевые клетки некоторых линий (К562), особенно гематопоэтических опухолей in vitro. Лизис таких линий очень показателен при оценке CD16+-активности. Он также зависит от степени специфичности киллинга, осуществляемого нормальными киллерами, поскольку многие вирус-инфицированные клетки и опухолевые клетки, как и большинство нормальных тканевых клеток in vitro, не чувствительны к нему. Основа этой специфичности не ясна. Мишенями CD16+ могут быть покрытые антителами опухолевые клетки. CD16 + are natural effector cells and are necessary for an effective immune response to the tumor. They use the same lytic mechanisms as cytotoxic T-lymphocytes (CD8 +) for cell killing, but do not express T-cell antigenic receptors and carry out target cell killing independent of MHC. CD16 + can lyse both virus-infected and tumor cells of certain lines (K562), especially hematopoietic tumors in vitro. The lysis of such lines is very indicative in assessing CD16 + activity. It also depends on the degree of specificity of killing carried out by normal killers, since many virus-infected cells and tumor cells, like most normal tissue cells in vitro, are not sensitive to it. The basis of this specificity is not clear. CD16 + targets can be antibody coated tumor cells.

Количественный подсчет CD16+ позволяет произвести оценку состояния иммунной системы конкретного больного. Учитывая роль иммунных эффекторных механизмов противораковой защиты вообще и киллерных клеток в частности, обнаружение реакций иммунного реагирования с участием CD16+клеток в организме у больного с подозрением на увеальную меланому позволяет предположить наличие процесса maligna. Quantitative counting of CD16 + allows you to assess the state of the immune system of a particular patient. Given the role of the immune effector mechanisms of anticancer protection in general and killer cells in particular, the detection of immune responses involving CD16 + cells in the patient’s body with suspected uveal melanoma suggests the presence of the maligna process.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего произвести дифференциальную диагностику начальной увеальной меланомы в клинически сложных, атипичных случаях. Техническим результатом является объективизация и повышение точности диагностики. Технический результат достигается за счет исследования CD16+ как фактора противоопухолевой защиты, принимающего участие от самых ранних этапов неопластического процесса до стадии метастазирования. The objective of the invention is to develop a method that allows for differential diagnosis of initial uveal melanoma in clinically complex, atypical cases. The technical result is the objectification and increase the accuracy of diagnosis. The technical result is achieved through the study of CD16 + as a factor of antitumor protection, taking part from the earliest stages of the neoplastic process to the stage of metastasis.

Способ осуществляли следующим образом. The method was carried out as follows.

Определение уровня субпопуляций CD16 проводили с помощью метода моноклональных антител [Frank C. Hay, Leslie Hudson "Practical Immunology. 1987 Blackwell Scientific Publications]. The level of CD16 subpopulations was determined using the monoclonal antibody method [Frank C. Hay, Leslie Hudson "Practical Immunology. 1987 Blackwell Scientific Publications].

1. Забирают периферическую кровь в объеме 5 мл из локтевой вены в пробирку, содержащую ЭДТА. 1. Take peripheral blood in a volume of 5 ml from the ulnar vein into a tube containing EDTA.

2. Производят маркировку пробирок (количество последних на одного больного равно числу определяемых типов субпопуляций плюс одна контрольная). 2. Labeling of tubes (the number of the latter per patient is equal to the number of determined types of subpopulations plus one control).

3. В пробирку, содержащую 100 мкл хорошо перемешанной цельной крови вносят 100 мкл PBS (фосфатный буферный раствор, приготовленный согласно официнальной прописи) и помещают пробирку в ледяную баню. 3. In a test tube containing 100 μl of well-mixed whole blood, add 100 μl of PBS (phosphate buffered saline prepared according to the official prescription) and place the tube in an ice bath.

4. В каждую пробирку вносят 7 мкл соответствующего типа моноклональных антител, растворенных в дистиллированной воде предварительно, в соответствии с инструкцией. 4. In each tube, 7 μl of the appropriate type of monoclonal antibody, dissolved in distilled water previously, in accordance with the instructions.

5. Затем, в течение 15-30 секунд осторожно встряхивая пробирки, смешивают компоненты. Манипуляцию повторяют пять раз с минутным интервалом. 5. Then, for 15-30 seconds, gently shaking the tubes, mix the components. The manipulation is repeated five times with a minute interval.

6. Пробирки изымают из ледяной бани, добавляют в каждую из них 2 мл лизирующего раствора, который представляет собой один из компонентов коммерческого набора. Его готовят накануне согласно инструкции, данной фирмой-поставщиком оборудования. Пробирки помещают в шейкер после каждого добавления. 6. The tubes are removed from the ice bath, add to each of them 2 ml of a lysing solution, which is one of the components of the commercial kit. It is prepared the day before according to the instructions given by the equipment supplier. Tubes are placed in a shaker after each addition.

7. Производят инкубацию исследуемых образцов при комнатной температуре в течение 5-10 минут до получения прозрачного "лакового" раствора. 7. The test samples are incubated at room temperature for 5-10 minutes until a clear "lacquer" solution is obtained.

8. Пробирки центрифугируют в течение 5 минут при 400 X оборотах в минуту и удаляют супернатант из каждой пробирки. При недостаточном эффекте клетки отмывают до 7-8 раз. 8. The tubes are centrifuged for 5 minutes at 400 X rpm and the supernatant is removed from each tube. With insufficient effect, cells are washed up to 7-8 times.

9. Пробирки помещают в ледяную баню. 9. Test tubes are placed in an ice bath.

10. Количественное измерение субпопуляций производят на лазерном цитофлуориметре "Спектрум-3" фирмы "Орто Диагностик Системс", США. 10. Quantitative measurement of subpopulations is carried out on a Spectrum-3 laser cytofluorimeter manufactured by Ortho Diagnostic Systems, USA.

11. Получают показатели CD16. 11. Receive indicators of CD16.

Активность НК-клеток определяют в цитотоксическом тесте по лизису меченных радиоизотопными изотопами клеток-мишеней (КМ), которыми служат опухолевые линии клеток К-562 (миелолейкоз человека). В качестве тестируемых клеток-эффектов используют мононуклеары периферической крови. The activity of NK cells is determined in a cytotoxic test for the lysis of radioactive isotopes labeled with target cells (KM), which are tumor lines of K-562 cells (human myelogenous leukemia). Peripheral blood mononuclear cells are used as test effects cells.

Реакцию осуществляют следующим способом:
1. Взвесь клеток периферических мононуклеаров разводят до концентрации 1•10⁷ в 1 мл.The reaction is carried out in the following way:
1. A suspension of peripheral mononuclear cells is diluted to a concentration of 1 • 10 ⁷ in 1 ml.

2. Клетки мишени К562 (3-дневного культивирования) метят ³H-уридином в дозе 3 мкКи на 1 мл клеточной культуры. Для этого клеточную взвесь в концентрации 5•10⁵ в 3 мл культуральной среды инкубируют с изотопом (удельная активность 24 Ки/мМ) 1 час при 37^oC, трижды отмывают средой Игла, содержащей 10% бычьей сыворотки и антибиотики, и центрифугируют при 400g при 20^oC 10 минут. Отмытые клетки-мишени выдерживают в культуральной среде 2 часа при 37^oC и еще раз отмывают с целью удаления дериватов ³H-уридина, не включавшегося в РНК-клеток-мишеней. После этого готовят рабочую взвесь меченых КМ, которая содержит в 1 мл 1•10⁶ КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы (Гедеон-Рихтер, Венгрия).2. K562 target cells (3-day culture) are labeled with ³ H-uridine at a dose of 3 μCi per 1 ml of cell culture. For this, the cell suspension in a concentration of 5 • 10 ⁵ in 3 ml of culture medium is incubated with an isotope (specific activity 24 Ci / mm) for 1 hour at 37 ^o C, washed three times with Needle medium containing 10% bovine serum and antibiotics, and centrifuged at 400g at 20 ^o C for 10 minutes. The washed target cells were incubated in the culture medium for 2 hours at 37 ^° C. and washed again to remove ³ H-uridine derivatives that were not included in the target RNA cells. After that, a working suspension of labeled KM is prepared, which contains 1 x 10 ⁶ KM and 5 μg of pancreatic RNAase in 1 ml (Gideon-Richter, Hungary).

3. Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей взвеси и меченых КМ (т. е. 1•10⁴ клеток) и 100 мкл суспензии мононуклеаров, которую разводят так, чтобы выдерживалось соотношение КЭ:КМ = 100:1, 50:1, 25:1, 12:1. Каждое разведение КЭ помещают в три ячейки. Контрольными пробами являются эти же меченые КМ, которые помещают в ячейки без добавления КЭ.3. The cytotoxic reaction is carried out in round bottom 96-well microplates. 100 μl of working suspension and labeled CM (i.e. 1 • 10 ⁴ cells) and 100 μl of a mononuclear suspension are diluted in each well, which is diluted so that the ratio of CE: KM = 100: 1, 50: 1, 25 is maintained: 1, 12: 1. Each KE dilution is placed in three cells. Control samples are the same labeled CMs, which are placed in cells without the addition of CE.

4. Заполненный планшет инкубируют 14-16 часов во влажной атмосфере при 37^oC в CO₂-инкубаторе. После инкубации содержимое ячеек переносят на мембранные фильтры с диаметром пор 2,5 мкм и отмывают как описано выше.4. The filled plate is incubated for 14-16 hours in a humid atmosphere at 37 ^o C in a CO ₂ incubator. After incubation, the contents of the cells are transferred to membrane filters with a pore diameter of 2.5 μm and washed as described above.

Анализируемый параметр выражен как удельная киллерная активность, отражающая количество эффекторных клеток, необходимых для лизиса одной клетки-мишени с учетом литического потенциала единичного киллера. В норме у здоровых доноров удельная активность нормальных киллеров колеблется в пределах 7-12 усл. единиц. The analyzed parameter is expressed as the specific killer activity, which reflects the number of effector cells necessary for lysis of one target cell, taking into account the lytic potential of a single killer. Normally, in healthy donors, the specific activity of normal killers ranges from 7-12 conv. units.

Оценка результатов
Функциональную активность НК оценивают по разнице радиоактивности, выделяемой на β -сцинтилляционном счетчике в ячейках, содержащих или не содержащих клеток-эффекторов. Индекс цитотоксически определяют по формуле:

При выявлении повышенного абсолютного показателя CD16+ с повышенной удельной активностью у пациента с подозрением на увеальную меланому диагностируют увеальную меланому в стадии T₁N₀M₀. Ему следует срочно назначить адекватную терапию в виде существующих современных методов фото- и лазеркоагуляции, брахитерапии или термотерапии. А при отсутствии отклонений в исследуемых показателях констатируют прогрессирующий невус и оставляют такого больного под наблюдением окулиста.Evaluation of the results
The functional activity of NK is evaluated by the difference in radioactivity released on a β-scintillation counter in cells containing or not containing effector cells. The cytotoxic index is determined by the formula:

If a higher absolute CD16 + indicator with increased specific activity is detected in a patient with suspected uveal melanoma, uveal melanoma is diagnosed in the stage T ₁ N ₀ M ₀ . He should urgently prescribe adequate therapy in the form of existing modern methods of photo and laser coagulation, brachytherapy or thermotherapy. And in the absence of deviations in the studied parameters, a progressive nevus is noted and such a patient is left under the supervision of an oculist.

Пример 1. Example 1

Больная К, 36 лет. На профилактическом осмотре у окулиста случайно обнаружили на правом глазу сероватое проминирующее образование в верхненаружном квандранте глазного дна в 4 ПД от Диска Зрительно Нерва с соответствующим дефектом в поле зрения. Острота зрения на правом глазу = 1,0. Ультразвуковое исследование подтвердило наличие "+ткани" с проминенцией 2,1 мм и диаметром основания 9 мм². Ангиографическая картина, динамика развития ангиографических признаков могла быть характерной и для начальной увеальной меланомы и для невуса хориоидеи, так как имело место раннее вымывание флюоресцеина. Проведено иммунологическое исследование. Выявлена гиперплазия пула CD16+ с абсолютным показателем 538 кл./мкл (при норме до 400 кл./мкл). Функциональные показатели клеток также отличались от донорских. Удельная активность CD16+ повышена до 16 усл. ед. (при норме от 7 до 12 усл.ед.). Основываясь на картине флюоресцентной ангиографии, клинико-анамнестических, инструментальных и иммунологических данных, пациентке был поставлен диагноз начальной меланомы. Была предложена брахитерапия с одномоментным 32P тестирование на операционном столе для подтверждения диагноза и обоснования тактики лечения. Радиоиндикаторный теста дал положительный результат. Счет РФИ выявил асимметрию накопления 32P в месте предполагаемой злокачественной опухоли и симметричном месте на 200%, что подтвердило диагноз увеальной меланомы и обосновывало необходимость проведения брахитерапии (как одного из возможных методов лечения). На осмотре через 2 года: сформировался плотный хориоретинальный рубец, соответствующий зоне облучения, определяемый на УЗИ.Patient K, 36 years old. During a routine examination by an ophthalmologist, a grayish streaming formation was discovered in the right eye in the upper external fundus of the fundus 4 PD from the Optic Nerve Disc with a corresponding defect in the field of vision. Visual acuity in the right eye = 1.0. An ultrasound scan confirmed the presence of “+ tissue” with a 2.1 mm prominence and a base diameter of 9 mm ² . The angiographic picture, the dynamics of the development of angiographic signs could be characteristic of both initial uveal melanoma and choroid nevus, since there was an early leaching of fluorescein. An immunological study was carried out. Hyperplasia of the CD16 + pool with an absolute value of 538 cells / μl was detected (with a norm of up to 400 cells / μl). Functional indicators of cells also differed from donor ones. The specific activity of CD16 + increased to 16 srvc. units (at a rate of 7 to 12 conventional units). Based on the picture of fluorescence angiography, clinical and medical history, instrumental and immunological data, the patient was diagnosed with initial melanoma. Brachytherapy with simultaneous 32P testing on the operating table was proposed to confirm the diagnosis and justify treatment tactics. The radio indicator test gave a positive result. The RFI count revealed an asymmetry of 32P accumulation at the site of the alleged malignant tumor and a symmetrical location of 200%, which confirmed the diagnosis of uveal melanoma and justified the need for brachytherapy (as one of the possible treatment methods). On examination after 2 years: a dense chorioretinal scar formed, corresponding to the irradiation zone, determined by ultrasound.

Пример 2. Больной В., 23 года. После контузионной травмы головы попал в стационар, где случайно отметил снижение зрения на левый глаз с дефектом в поле зрения. Был осмотрен окулистом. Выявлено проминирующее пигментированное образование в парамакулярной зоне. При проведении компьютерной периметрии относительные и абсолютные скотомы в соответствующей половине поля зрения. Острота зрения 0,7, не корригирует очковыми линзами. УЗИ выявило проминирующую "+ткань+ с высотой 3,0 мм и диаметром 10 мм². Характер накопления флюоресцеина в зоне предполагаемой опухоли не соответствовал увеальной меланоме. Иммунологическое обследование выявило увеличение абсолютного показателя CD16+ до 600 кл./мкл. Обнаружено повышение удельной активности до 17 (соответственно, литическая их активность снижена). Установлен диагноз меланомы хориоидеи левого глаза. Предложена брахитерапия. однако для подтверждения диагноза больной был "заряжен" ³²P. Радиофосфорная индикация подтвердила диагноз и необходимость брахитерапии, которая и была проведена. Спустя год, на осмотре: отмечена полная регрессия опухолевого узла с формированием плоского хориоретинального узла.Example 2. Patient C., 23 years old. After a concussive head injury, he ended up in a hospital, where he accidentally noted a decrease in vision in his left eye with a defect in the field of vision. Was examined by an optometrist. A promising pigmented formation in the paramacular zone was revealed. When conducting computer perimetry, relative and absolute scotomas in the corresponding half of the field of view. Visual acuity of 0.7, does not correct with spectacle lenses. Ultrasound revealed a prophylactic + tissue + with a height of 3.0 mm and a diameter of 10 mm ^{2. The} nature of the accumulation of fluorescein in the area of the proposed tumor did not correspond to uveal melanoma. An immunological examination revealed an increase in the absolute CD16 + to 600 cells / μl. An increase in specific activity to 17 (respectively, their lytic activity is reduced). The diagnosis of melanoma of the choroid of the left eye is established. Brachytherapy is proposed. However, to confirm the diagnosis, the patient was “charged” ³² P. Radiophosphoric indication confirmed the diagnosis and the need for brachytherapy, which was carried out.A year later, on examination: complete regression of the tumor node with the formation of a flat chorioretinal node was noted.

Пример 3. Больная 54 лет. Обратилась к окулисту с жалобами на появление пятна в поле зрения правого зрения. Заметила случайно, после того как рукой закрыла парный здоровый газ. Острота зрения на правом глазу = 0,4, не корригирует, на левом = 1,0. Ранее, на протяжении 10 лет к окулистам не обращалась. Ничего не может сказать о зрительных функциях обоих глаз при более ранних проверках. При офтальмоскопии выявлено аспидного цвета проминирующее образование с мелкими участками оранжевого пигмента и друзами на периферии образования. Расположено в макулярной зоне, УЗИ подтвердило наличие "+ткани" с высотой 1,9 мм и диаметром 8 мм². ФАГ провести не представлялось возможным в связи с имеющимися противопоказаниями у больной (тромбоз глубоких вен голени). Иммунологическое обследование не выявило никаких отклонений от нормы. Больная отпущена под наблюдение окулиста по месту жительства. Предложен контроль через 6 месяцев. На последующей явке. Данные периметрии, УЗ-исследования, офтальмоскопии оказались на прежнем уровне. Повторное иммунологическое исследование не выявило отклонений от нормы по-прежнему. Вновь отпущена на срок 6 месяцев. При третьей явке состояние стабильно. Все показатели на прежнем уровне. Диагноз установлен: прогрессирующий невус хориоидеи с дистрофическим компонентом.Example 3. Patient 54 years. I turned to the ophthalmologist with complaints of the appearance of a spot in the field of vision of the right vision. I noticed it by accident after I closed a pair of healthy gas with my hand. Visual acuity in the right eye = 0.4, does not correct, in the left = 1.0. Earlier, for 10 years, she did not contact ophthalmologists. Nothing can be said about the visual functions of both eyes in earlier tests. When ophthalmoscopy revealed an aspid color, a prominent formation with small areas of orange pigment and druses on the periphery of the formation. Located in the macular zone, ultrasound confirmed the presence of "+ tissue" with a height of 1.9 mm and a diameter of 8 mm ² . It was not possible to conduct a phage in connection with the existing contraindications in the patient (deep vein thrombosis of the leg). Immunological examination revealed no abnormalities. The patient was released under the supervision of an oculist at the place of residence. Proposed control after 6 months. At the subsequent appearance. Perimetric data, ultrasound studies, ophthalmoscopy were at the same level. Repeated immunological studies did not reveal abnormalities as before. Again released for a period of 6 months. At the third appearance, the condition is stable. All indicators are at the same level. The diagnosis was established: progressive nevus of the choroid with a dystrophic component.

Таким образом, полученные нами данные с анализом клиники заболевания на протяжении продолжительного периода (до 2-х лет) у больных с невусами хориоидеи и начальными увеальными меланомами позволяют утверждать, что с помощью предложенных иммунологических исследований возможно ранее выявление увеальной меланомы, проведение дифференциальной диагностики между указанными двумя нозологическими единицами. Thus, our data with an analysis of the disease clinic over a long period (up to 2 years) in patients with choroid nevi and initial uveal melanomas suggest that using the proposed immunological studies, it is possible to previously identify uveal melanoma and conduct differential diagnosis between the indicated two nosological units.

Практическая ценность предлагаемого нами способа заключается в том, что он позволяет осуществить дифференциальную диагностику в клинически сложных и атипичных случаях, что дает возможность своевременно и более эффективно провести адекватное лечение с целью удлинения продолжительности жизни офтальмоонкологических больных. Метод достаточно информативен, малотрудоемок при большой практической ценности. The practical value of our proposed method lies in the fact that it allows for differential diagnosis in clinically complex and atypical cases, which makes it possible to timely and more efficiently conduct adequate treatment in order to extend the life expectancy of ophthalmic oncological patients. The method is quite informative, laborious with great practical value.

Claims

A method for differential diagnosis of initial uveal melanoma from progressive nevus of the choroid, including the study of immunocompetent cells in the serum of peripheral blood, characterized in that the diagnosis is carried out by the absolute indicator of the population of normal killer cells SD16 ⁺ and their specific activity and when they increase beyond the norm, an initial uveal melanoma, and in the absence of changes in indicators - a progressive nevus of the choroid.