RU2145109C1 - Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method - Google Patents
Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2145109C1 RU2145109C1 RU99104013A RU99104013A RU2145109C1 RU 2145109 C1 RU2145109 C1 RU 2145109C1 RU 99104013 A RU99104013 A RU 99104013A RU 99104013 A RU99104013 A RU 99104013A RU 2145109 C1 RU2145109 C1 RU 2145109C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- micro
- light source
- image
- lens
- dimensional
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к микроскопии, а более точно касается способа оптической томографии трехмерных микрообъектов и микроскопа для его осуществления. Изобретение может быть использовано в биологии, медицине, материаловедении. The present invention relates to microscopy, and more specifically relates to a method of optical tomography of three-dimensional micro-objects and a microscope for its implementation. The invention can be used in biology, medicine, materials science.
Большинство биологических объектов является достаточно прозрачными для излучения оптического диапазона. С точки зрения физической оптики такой объект является амплитудно-фазовым объектом и его внутренняя структура описывается трехмерными пространственными распределениями показателя преломления и коэффициента поглощения. Измерение этих оптических неоднородностей играет важную роль в исследовании таких распространенных микрообъектов, как живые биологические клетки. Эти измерения не требуют окрашивания клеток, введения флуоресцентных меток и т.п. С показателем преломления и коэффициентом поглощения связаны различные физические параметры клеток, например их плотность и концентрация различных веществ внутри клетки. По распределению показателя преломления можно определить вес сухих веществ в клетке и в ее органеллах, места локализации инородных веществ в клетке, например лекарств. Можно наблюдать динамические процессы в клетке, так как она остается живой, в частности, процессы синтеза и распада белков. Можно также определять традиционные морфологические параметры клеток. Most biological objects are transparent enough to emit in the optical range. From the point of view of physical optics, such an object is an amplitude-phase object and its internal structure is described by three-dimensional spatial distributions of the refractive index and absorption coefficient. The measurement of these optical inhomogeneities plays an important role in the study of such common microobjects as living biological cells. These measurements do not require staining of cells, the introduction of fluorescent labels, etc. Various physical parameters of the cells are associated with the refractive index and absorption coefficient, for example, their density and concentration of various substances inside the cell. By the distribution of the refractive index, it is possible to determine the weight of dry substances in the cell and in its organelles, the location of foreign substances in the cell, for example, drugs. You can observe the dynamic processes in the cell, since it remains alive, in particular, the processes of synthesis and breakdown of proteins. You can also determine the traditional morphological parameters of the cells.
Микроскопия амплитудно-фазовых объектов распадается на две задачи. Первая - это задача количественной визуализации изображений, т.е. использование таких методов формирования изображений прозрачных или полупрозрачных объектов, которые несут количественную информацию об их структуре. Вторая - формирование или реконструкция двумерных изображений внутренних сечений трехмерных объектов. Для чисто фазовых микрообъектов такие изображения должны нести количественную информацию о пространственном распределении показателя преломления, а для амплитудно-фазовых - еще и о коэффициенте поглощения. Microscopy of amplitude-phase objects is divided into two tasks. The first is the task of quantitative visualization of images, i.e. the use of such methods of imaging transparent or translucent objects that carry quantitative information about their structure. The second is the formation or reconstruction of two-dimensional images of the internal sections of three-dimensional objects. For purely phase microobjects, such images should carry quantitative information about the spatial distribution of the refractive index, and for amplitude-phase ones, also about the absorption coefficient.
Для фазовых и амплитудных объектов изображение, формируемое микроскопом с помощью какого-либо контраста, не совпадает с томографической проекцией, а связано с ней нелинейным образом. Только для флуоресцентного объекта его изображение совпадает (линейно связано) с проекцией, так как искомой характеристикой является пространственное распределение интенсивности излучения флуорофора. For phase and amplitude objects, the image formed by the microscope using any contrast does not coincide with the tomographic projection, but is associated with it in a non-linear manner. Only for a fluorescent object does its image coincide (linearly connected) with the projection, since the desired characteristic is the spatial distribution of the radiation intensity of the fluorophore.
В микроскопии для получения изображений внутренних сечений трехмерных объектов разработано несколько различных способов:
1. Микроскопия широкого поля зрения с последующей цифровой обработкой (деконволюцией).In microscopy, several different methods have been developed to obtain images of internal sections of three-dimensional objects:
1. Microscopy of a wide field of view with subsequent digital processing (deconvolution).
2. Конфокальная сканирующая микроскопия. 2. Confocal scanning microscopy.
3. Томографическая микроскопия. 3. Tomographic microscopy.
При этом под двумерным изображением внутреннего сечения трехмерного фазового или амплитудно-фазового объекта понимают двумерную карту локальных значений показателя преломления и коэффициента поглощения. Moreover, a two-dimensional image of the internal section of a three-dimensional phase or amplitude-phase object is understood to mean a two-dimensional map of local values of the refractive index and absorption coefficient.
Известен способ (A. Erhardt, G. Zinser, D. Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt. , 1985, vol. 24, n 2, pp. 194-200), основанный на цифровом восстановлении изображений внутренних сечений микрообъекта путем решения трехмерного уравнения. Способ заключается в том, что формируют трехмерное изображение трехмерного микрообъекта с помощью обычного микроскопа с широким полем зрения. Производят сканирование плоскости регистрации в области формирования изображения вдоль оптической оси микроскопа и последовательно регистрируют набор различных двумерных сечений трехмерных изображений. Далее полученные изображения совместно обрабатывают, используя дополнительную информацию о трехмерной функции рассеяния точки микроскопа. Этот подход предполагает, что трехмерный объект можно представить в виде суммы независимых двумерных сечений. Такая модель применима только для самосветящихся флуоресцентных объектов, так как только для них интенсивность света в любой точке его изображения складывается из интенсивностей света от соответствующих точек внутри объекта. Для фазовых и амплитудных объектов данный подход не применим. The known method (A. Erhardt, G. Zinser, D. Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt., 1985, vol. 24,
Способ конфокальной сканирующей микроскопии (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B.Pawley, Plenum Press, New-York and London, 1990) был специально разработан для повышения селективных свойств микроскопов по глубине трехмерных объектов. Способ заключается в том, что формируют изображение точечного источника света внутри микрообъекта, сканируют полученное изображение по всем трем направлениям, переотображают его в плоскость точечной диафрагмы, выполняют пространственную фильтрацию рассеянного света с помощью указанной точечной диафрагмы и производят регистрацию прошедшего света с помощью точечного фотодетектора. Полученные данные последовательно отображают на трехмерной сетке, соответствующей фиксированным положениям изображения точечного источника света внутри объекта при сканировании. Как и в первом случае, этот способ применим в основном для флуоресцентных объектов. Основной эффект заключается в устранении (уменьшении) вклада от рассеянного объектом света. Но даже для флуоресцентных объектов конфокальная микроскопия формирует изображения внутренних сечений лишь в некотором приближении. Это связано с тем, что в конфокальном микроскопе объект зондируется коническим пучком, вершина которого находится внутри объекта. Интегрирование информации выполняется по лучам, проходящим через эту вершину и равномерно заполняющим конус. В конфокальном микроскопе регистрируется суммарная интенсивность света от лучей, прошедших через эту вершину. The method of confocal scanning microscopy (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. By J.B. Pawley, Plenum Press, New York and London, 1990) was specially developed to increase the selective properties of microscopes over the depth of three-dimensional objects. The method consists in forming an image of a point light source inside a microobject, scanning the resulting image in all three directions, re-mapping it to the plane of the point diaphragm, performing spatial filtering of the scattered light using the specified point diaphragm, and recording the transmitted light using a point photodetector. The obtained data is sequentially displayed on a three-dimensional grid corresponding to the fixed positions of the image of a point light source inside the object during scanning. As in the first case, this method is mainly applicable for fluorescent objects. The main effect is to eliminate (reduce) the contribution from the light scattered by the object. But even for fluorescent objects, confocal microscopy forms images of internal sections only to a certain approximation. This is due to the fact that in a confocal microscope the object is probed with a conical beam, the apex of which is inside the object. Integration of information is carried out along the rays passing through this vertex and uniformly filling the cone. In a confocal microscope, the total light intensity from the rays passing through this peak is recorded.
Известны попытки комбинации конфокальной микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) при исследовании фазовых объектов (Т. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, Vol. 2083, pp. 132-138). Однако такой способ позволяет получать лишь качественные, а не количественные данные. Это связано, в первую очередь, с нелинейностью ДИК - изображений относительно градиента фазы. Во-вторых, такие изображения, как и в предыдущем случае, дают суммарную картину, а не искомое распределение показателя преломления. Known attempts to combine confocal microscopy with differential interference contrast (DIC) in the study of phase objects (T. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, Vol. 2083, pp. 132-138). However, this method allows you to get only qualitative, not quantitative data. This is primarily due to the nonlinearity of the DIC images relative to the phase gradient. Secondly, such images, as in the previous case, give the overall picture, and not the desired distribution of the refractive index.
В патенте США N 5162648 предложено соединить конфокальный сканирующий микроскоп с интерференционным контрастом путем введения опорного пучка света. Однако этот микроскоп предназначен для исследования профиля поверхности непрозрачных отражающих объектов и он не может быть применен для исследования трехмерных прозрачных или полупрозрачных объектов. US Pat. No. 5,162,648 proposes combining a confocal scanning microscope with interference contrast by introducing a reference light beam. However, this microscope is designed to study the surface profile of opaque reflecting objects and it cannot be used to study three-dimensional transparent or translucent objects.
Для исследования трехмерных фазовых и/или амплитудных микрообъектов необходимо применять методы восстановления изображений по проекциям, т.е. методы компьютерной томографии. В этом случае микроскоп выступает в роли устройства для визуализации и регистрации количественной информации о проекционных данных под различными углами зондирования объекта. To study three-dimensional phase and / or amplitude microobjects, it is necessary to apply projection image reconstruction methods, i.e. computed tomography methods. In this case, the microscope acts as a device for visualizing and recording quantitative information about projection data at various sensing angles of the object.
Наиболее близким к заявляемому является способ оптической томографии трехмерных объектов (Т. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, Vol. 31, N5, pp. 670-674). Closest to the claimed is a method of optical tomography of three-dimensional objects (T. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, Vol. 31, N5 , pp. 670-674).
Способ заключается в том, что формируют изображение точечного источника света в передней фокальной плоскости освещающего микрообъектива (конденсора), сканируют полученное изображение в указанной плоскости по круговой траектории с последующим формированием пучка света, зондирующего микрообъект, размещенный на прозрачном предметном стекле, под различными углами относительно оптической оси микрообъектива. Затем последовательно при всех угловых положениях пучка света выполняют в задней фокальной плоскости отображающего микрообъектива пространственную фильтрацию прошедшего через объект пучка света, формируют изображения микрообъекта, регистрируют полученные изображения и производят их совместную томографическую обработку. The method consists in forming an image of a point light source in the front focal plane of the illuminating micro-lens (condenser), scanning the resulting image in a specified plane along a circular path with the subsequent formation of a beam of light probing the micro-object placed on a transparent glass slide at different angles relative to the optical axis of the micro lens. Then, sequentially at all angular positions of the light beam, spatial filtering of the light beam transmitted through the object is performed in the rear focal plane of the imaging micro-lens, images of the micro-object are formed, the obtained images are recorded and their combined tomographic processing is performed.
Основной недостаток данного способа заключается в том, что по нему нельзя получить количественные данные о трехмерном распределении показателя преломления для произвольных фазовых объектов. Он применим только для фазовых объектов с малыми изменениями показателя преломления. Это вызвано тем, что в данном способе для формирования изображения микрообъекта может использоваться только метод фазового контраста, причем может применяться только одна из разновидностей метода фазового контраста, в которой используется непрозрачный край круглой диафрагмы в качестве визуализирующего (режекторного) ножа и наклонное освещение объекта. Поэтому по такому способу можно реализовать только одну круговую траекторию сканирования изображения точечного источника света в передней фокальной плоскости освещающего микрообъектива. Этот факт также накладывает ограничения на качество получаемых томограмм, так как ограничивает набор возможных траекторий. The main disadvantage of this method is that it cannot be used to obtain quantitative data on the three-dimensional distribution of the refractive index for arbitrary phase objects. It is applicable only for phase objects with small changes in the refractive index. This is because in this method only the phase contrast method can be used to form the image of a microobject, and only one of the varieties of the phase contrast method can be used, in which the opaque edge of the circular diaphragm is used as a visualizing (notch) knife and oblique illumination of the object. Therefore, in this way it is possible to realize only one circular path of scanning the image of a point light source in the front focal plane of the illuminating micro-lens. This fact also imposes restrictions on the quality of the obtained tomograms, since it limits the set of possible trajectories.
Наиболее подходящим для исследования фазовых объектов является интерференционный контраст. Поэтому для исследования пространственного распределения показателя преломления фазовых микрообъектов предлагается использовать метод компьютерной томографии в сочетании с оптической микроскопией и интерференционным методом визуализации проекций в реальном времени. The most suitable for the study of phase objects is interference contrast. Therefore, to study the spatial distribution of the refractive index of phase microobjects, it is proposed to use the computed tomography method in combination with optical microscopy and the interference method for visualizing projections in real time.
Известен микроскоп (A. Erhardt, G.Zinser, D.Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt., 1985, vol.24, N2, pp.194-200), содержащий расположенные последовательно вдоль оптической оси исследуемый микрообъект, микрообъектив, окуляр и регистрирующее устройство. Центр микрообъекта расположен в передней фокальной плоскости микрообъектива, задняя фокальная плоскость которого совмещена с передней фокальной плоскостью окуляра. Регистрирующее устройство располагают вблизи задней фокальной плоскости окуляра так, что оно может перемещаться вдоль оптической оси устройства. При таком конфокальном расположении оптических элементов в пространстве изображений (в области около задней фокальной плоскости окуляра) формируется трехмерное изображение микрообъекта с одинаковым увеличением изображений различных продольных сечений, отличающихся глубиной расположения внутри микрообъекта. При сканировании регистрирующего устройства вдоль оптической оси регистрируются двумерные изображения различных сечений трехмерного объекта. Далее полученные изображения совместно обрабатывают, используя дополнительную информацию о трехмерной функции рассеяния точки микроскопа. Этот подход предполагает, что трехмерный объект можно представить в виде суммы независимых двумерных сечений. Такая модель применима только для самосветящихся флуоресцентных объектов, так как для них интенсивность света в любой точке его изображения складывается из интенсивностей света от соответствующих точек внутри объекта. Для фазовых и амплитудных объектов данный подход не применим. A well-known microscope (A. Erhardt, G. Zinser, D. Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt., 1985, vol. 24, N2, pp. 194-200), containing the studied microobject, microobjective, eyepiece, and recording device arranged sequentially along the optical axis. The center of the micro-object is located in the front focal plane of the micro-lens, the rear focal plane of which is aligned with the front focal plane of the eyepiece. The recording device is located near the rear focal plane of the eyepiece so that it can move along the optical axis of the device. With such a confocal arrangement of optical elements in the image space (in the region near the posterior focal plane of the eyepiece), a three-dimensional image of the micro-object is formed with the same magnification of images of different longitudinal sections, which differ in the depth of location inside the micro-object. When scanning a recording device along the optical axis, two-dimensional images of various sections of a three-dimensional object are recorded. Further, the obtained images are jointly processed using additional information about the three-dimensional scattering function of the microscope point. This approach assumes that a three-dimensional object can be represented as the sum of independent two-dimensional sections. Such a model is applicable only for self-luminous fluorescent objects, since for them the light intensity at any point in its image is the sum of the light intensities from the corresponding points inside the object. For phase and amplitude objects, this approach is not applicable.
Известен конфокальный сканирующий микроскоп (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B.Pawley, Plenum Press, New-York and London, 1990), содержащий расположенные последовательно вдоль оптической оси микроскопа точечный источник света, линзу-конденсор, микрообъект, микрообъектив, точечную диафрагму и регистрирующее устройство. Причем линза-конденсор расположена на таком расстоянии от источника света, что она формирует изображение этого источника внутри микрообъекта, а микрообъектив переносит это изображение в плоскость точечной диафрагмы. Поэтому данная диафрагма полностью пропускает свет от тех точек внутри микрообъекта, которые находятся в оптически сопряженной плоскости. Регистрирующее устройство, расположенное сразу за диафрагмой, детектирует интенсивность прошедшего света. Свет от других точек внутри микрообъекта, которые находятся вне данной плоскости, будет фокусироваться вне плоскости диафрагмы. Следовательно, через диафрагму будет проходить лишь малая часть света от этих точек и их вклад в результирующий сигнал регистрирующего устройства будет мал. Поэтому конфокальный сканирующий микроскоп обладает лучшей избирательной способностью по глубине микрообъекта, чем обычный микроскоп. Для получения информации от других точек необходимо сканирование микрообъекта относительно изображения точечного источника света в трех направлениях. Как и в первом случае, этот микроскоп применим в основном для флуоресцентных объектов. Основной недостаток данного микроскопа заключается в том, что получаемые на нем изображения несут суммарную информацию об оптических характеристиках микрообъекта вдоль набора лучей, лежащих внутри конуса, вершина которого совпадает с положением изображения точечного источника света внутри микрообъекта. Known confocal scanning microscope (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. By JBPawley, Plenum Press, New York and London, 1990), containing a point source of light, a condenser lens, a micro lens, a micro lens, a pinhole diaphragm located in series along the optical axis of the microscope and a recording device. Moreover, the condenser lens is located at such a distance from the light source that it forms an image of this source inside the micro-object, and the micro-lens transfers this image to the plane of the point diaphragm. Therefore, this diaphragm completely transmits light from those points inside the microobject that are in the optically conjugated plane. A recording device located immediately after the diaphragm detects the intensity of transmitted light. Light from other points inside the microobject that are outside the given plane will be focused outside the plane of the diaphragm. Therefore, only a small part of the light from these points will pass through the diaphragm and their contribution to the resulting signal of the recording device will be small. Therefore, a confocal scanning microscope has a better selectivity in depth of a micro-object than a conventional microscope. To obtain information from other points, it is necessary to scan a micro-object relative to the image of a point light source in three directions. As in the first case, this microscope is mainly used for fluorescent objects. The main disadvantage of this microscope is that the images obtained on it carry summary information about the optical characteristics of the micro-object along a set of rays lying inside the cone, the vertex of which coincides with the position of the image of a point light source inside the micro-object.
По этой же причине комбинация конфокального сканирующего микроскопа с дифференциальным интерференционным контрастом (Т. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, vol. 2083, pp. 132-138) и даже введение опорного пучка, как в патенте США 5162648, не дает локальных количественных данных о фазовом объекте, а формирует некоторую суммарную (по конусу лучей) картину о показателе преломления. For the same reason, a combination of a confocal scanning microscope with differential interference contrast (T. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, vol. 2083, pp. 132-138) and even the introduction of a reference beam, as in US patent 5162648, does not provide local quantitative data on the phase object, and forms a total (by cone of rays) picture of the refractive index.
Наиболее близким по технической сущности, принятым за прототип, является микроскоп для оптической томографии трехмерных микрообъектов (Т. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, vol. 31, N 5, pp. 670-674), который содержит расположенные последовательно источник света, устройство сканирования изображения источника света, линзу-конденсор, предметное стекло для размещения исследуемого трехмерного микрообъекта, микрообъектив, визуализирующую диафрагму, окуляр, регистрирующее устройство и блок томографической обработки. Устройство сканирования изображения источника света формирует в передней фокальной плоскости линзы-конденсора движущееся по круговой траектории изображение точечного источника света. Поэтому микрообъект зондируется параллельным пучком света, распространяющимся под некоторым углом к оптической оси микроскопа. Микрообъект размещен в передней фокальной плоскости микрообъектива, в задней фокальной плоскости которого располагается круглая визуализирующая диафрагма. Микрообъектив и окуляр составляют конфокальную пару, т.е. задняя фокальная плоскость микрообъектива и передняя фокальная плоскость окуляра совпадают. В задней фокальной плоскости окуляра размещено регистрирующее устройство. Радиус траектории сканирования изображения источника света и радиус визуализирующей диафрагмы должны быть согласованы. Они подбираются так, что параллельный пучок света после зондирования микрообъекта фокусируется микрообъективом на край визуализирующей диафрагмы. Поэтому при зондировании фазового микрообъекта, данная диафрагма действует как непрозрачный нож Фуко, применяемый для визуализации фазовых микрообъектов. Наклонное зондирование микрообъекта позволяет получить информацию о различных проекциях микрообъекта, которые далее поступают в блок томографической обработки. The closest in technical essence, adopted for the prototype, is a microscope for optical tomography of three-dimensional microobjects (T. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, vol. 31, No. 5, pp. 670-674), which contains a sequentially located light source, a light source image scanning device, a condenser lens, a glass slide for receiving a three-dimensional microobject under study, a micro-lens visualizing aperture, an eyepiece, a recording device and tomographic processing unit and. The light source image scanning device generates an image of a point light source moving in a circular path in the front focal plane of the condenser lens. Therefore, the micro-object is probed by a parallel beam of light propagating at a certain angle to the optical axis of the microscope. The microobject is placed in the front focal plane of the microobject, in the rear focal plane of which is located a circular imaging aperture. A micro lens and an eyepiece make up a confocal pair, i.e. the rear focal plane of the micro-lens and the front focal plane of the eyepiece coincide. A recording device is placed in the rear focal plane of the eyepiece. The radius of the scanning path of the image of the light source and the radius of the imaging diaphragm must be consistent. They are selected so that the parallel beam of light after sensing the microobject is focused by the microobject onto the edge of the imaging diaphragm. Therefore, when sensing a phase microobject, this diaphragm acts as an opaque Foucault knife used to visualize phase microobjects. Inclined sounding of a microobject allows you to obtain information about the various projections of the microobject, which then enter the tomographic processing unit.
Устройство сканирования изображения источника света выполнено в виде двух неподвижных переотображающих линз и вращающейся призмы Пехана, которая смещает изображение источника света в поперечном (по отношению к оптической оси микроскопа) направлении на некоторую величину. The scanning device for the image of the light source is made in the form of two fixed reimaging lenses and a rotating Pehan prism, which shifts the image of the light source in the transverse (relative to the optical axis of the microscope) direction by a certain amount.
Основной недостаток данного микроскопа заключается в том, что в нем реализуется только фазоконтрастный метод визуализации изображений фазовых микрообъектов. Этот метод не дает количественных данных о проекциях произвольных фазовых микрообъектов. Еще один недостаток состоит в том, что в данном микроскопе может быть использована только одна траектория сканирования в виде окружности, а для повышения качества томографической обработки требуются другие типы траекторий. The main disadvantage of this microscope is that it implements only a phase-contrast method for imaging phase microobjects. This method does not provide quantitative data on the projections of arbitrary phase microobjects. Another drawback is that only one scanning path in the form of a circle can be used in this microscope, and other types of paths are required to improve the quality of tomographic processing.
В основу настоящего изобретения положена задача разработать способ оптической томографии трехмерных микрообъектов и микроскоп, обеспечивающие восстановление количественных данных о трехмерном пространственном распределении показателя преломления и/или коэффициента поглощения исследуемого трехмерного микрообъекта при одновременном повышении чувствительности измерений и качестве восстановленных изображений. The present invention is based on the task of developing a method of optical tomography of three-dimensional microobjects and a microscope, providing recovery of quantitative data on the three-dimensional spatial distribution of the refractive index and / or absorption coefficient of the investigated three-dimensional microobject while increasing the sensitivity of measurements and the quality of the reconstructed images.
Поставленная задача решается тем, что в способе оптической томографии трехмерных микрообъектов, заключающемся в том, что формируют изображение источника света в передней фокальной плоскости микрообъектива, сканируют полученное изображение в указанной плоскости с последующим формированием пучка света, зондирующего исследуемый трехмерный микрообъект под различными углами относительно оптической оси микрообъектива, последовательно формируют при всех угловых положениях пучка света изображения исследуемого микрообъекта, регистрируют полученные изображения и производят их совместную томографическую обработку, согласно изобретению, дополнительно формируют изображение источника света в передней фокальной плоскости второго микрообъектива с последующим формированием опорного пучка света, а при формировании изображений исследуемого трехмерного микрообъекта пучок света, отраженный от микрообъекта или прошедший микрообъект и затем отраженный обратно, вновь направляют на указанный выше микрообъектив, совмещают полученные изображения исследуемого трехмерного микрообъекта с опорным пучком света, в результате чего получают интерференционные картины, по которым измеряют амплитудно-фазовые характеристики изображений исследуемого трехмерного микрообъекта, на основании которых определяют трехмерное пространственное распределение показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта. The problem is solved in that in the method of optical tomography of three-dimensional microobjects, which consists in forming an image of a light source in the front focal plane of a microobjective, scanning the resulting image in this plane, followed by the formation of a beam of light probing the three-dimensional microobject under study at different angles relative to the optical axis microobjective, sequentially form at all angular positions of the light beam images of the investigated microobject, register received images and carry out their joint tomographic processing, according to the invention, additionally form an image of the light source in the front focal plane of the second micro-lens with the subsequent formation of a reference light beam, and when forming images of the investigated three-dimensional micro-object, the light beam reflected from the micro-object or transmitted micro-object and then reflected back, again sent to the above micro lens, combine the obtained image of the investigated three-dimensional micro an object with a reference light beam, as a result of which interference patterns are obtained, which measure the amplitude-phase characteristics of the images of the investigated three-dimensional micro-object, based on which the three-dimensional spatial distribution of the refractive index and / or absorption coefficient of the micro-object is determined.
Выделение опорного пучка света необходимо для реализации метода интерференционного контраста, то есть для получения интерференционных картин микрообъекта. Только этот метод визуализации позволяет измерять количественные характеристики (амплитуду и фазу) пучка света, зондирующего объект. Метод фазового контраста, который используется в прототипе, не позволяет измерять указанные характеристики и не может использоваться для микрообъектов, вызывающих большие изменения фазы светового пучка. The selection of the reference light beam is necessary to implement the interference contrast method, that is, to obtain interference patterns of a micro-object. Only this visualization method allows you to measure the quantitative characteristics (amplitude and phase) of the light beam probing the object. The phase contrast method, which is used in the prototype, does not allow to measure these characteristics and cannot be used for microobjects that cause large changes in the phase of the light beam.
Использование отраженного пучка света при формировании изображения микрообъекта позволяет расширить класс исследуемых микрообъектов и повысить чувствительность измерений. Например, можно исследовать микрообъекты, отражающие или рассеивающие зондирующий пучок света в обратном направлении. А в способе, взятом за прототип, при формировании изображений микрообъекта можно использовать только пучок света, прошедший через микрообъект в прямом направлении. The use of the reflected light beam in the formation of the image of a microobject allows you to expand the class of studied microobjects and increase the sensitivity of measurements. For example, you can investigate microobjects that reflect or scatter a probe beam of light in the opposite direction. And in the method taken as a prototype, when forming images of a microobject, you can use only a beam of light that has passed through the microobject in the forward direction.
В предлагаемом способе можно также исследовать микрообъекты, размещенные на предметном стекле с зеркальным покрытием. В этом случае зондирующий пучок света отражается от указанного покрытия и повторно зондирует микрообъект. Поэтому суммарный фазовый набег и/или поглощение увеличивается, что ведет к повышению чувствительности измерений. In the proposed method, it is also possible to investigate micro-objects placed on a glass slide with a mirror coating. In this case, the probe light beam is reflected from the specified coating and re-probes the micro-object. Therefore, the total phase incursion and / or absorption increases, which leads to an increase in the measurement sensitivity.
В предлагаемом способе используется один и тот же объектив для формирования пучка света, зондирующего объект, и для формирования изображений микрообъекта, в отличие от способа, взятого за прототип, в котором используются два микрообъектива. Уменьшение количества микрообъективов ведет также к упрощению процедуры юстировки оптической схемы и уменьшению фазовых и амплитудных шумов. In the proposed method, the same lens is used to form a beam of light probing the object, and to form images of a micro-object, in contrast to the method taken as a prototype, in which two micro-lenses are used. A decrease in the number of micro-lenses also leads to a simplification of the alignment procedure of the optical circuit and a decrease in phase and amplitude noise.
Совмещение полученных изображений с опорным пучком света с образованием интерференционных картин микрообъекта, по которым измеряют амплитудно-фазовые характеристики изображений микрообъекта, позволяет измерить количественные значения фазы и амплитуды изображений микрообъекта по его интерференционным картинам, а именно фазовые и амплитудные проекции микрообъекта. The combination of the obtained images with the reference light beam with the formation of interference patterns of a microobject, which measure the amplitude-phase characteristics of images of a microobject, allows you to measure the quantitative values of the phase and amplitude of the images of a microobject by its interference patterns, namely the phase and amplitude projections of a microobject.
Полученные в результате всех перечисленных операций фазовые и амплитудные проекции микрообъекта используются для томографической обработки и восстановления количественных значений трехмерного пространственного распределения, соответственно, показателя преломления и коэффициента поглощения микрообъекта. The phase and amplitude projections of the microobject obtained as a result of all the above operations are used for tomographic processing and restoration of quantitative values of the three-dimensional spatial distribution, respectively, of the refractive index and absorption coefficient of the microobject.
Для формирования отраженного пучка света микрообъект размещают на предметном стекле с зеркальным покрытием, что позволяет повысить чувствительность измерений и уменьшить количество угловых положений пучка света при сканировании, что, в конечном счете, ведет к сокращению времени сканирования. To form a reflected light beam, a micro-object is placed on a glass slide with a mirror coating, which allows to increase the measurement sensitivity and reduce the number of angular positions of the light beam during scanning, which ultimately leads to a reduction in scanning time.
В способе, взятом за прототип, можно использовать только пучок света, прошедший один раз через микрообъект в прямом направлении. Поэтому его чувствительность по меньшей мере в два раза меньше, а количество требуемых угловых положений пучка света в два раза больше, что ведет к увеличению времени сканирования. In the method taken as a prototype, you can use only a beam of light that has passed once through a microobject in the forward direction. Therefore, its sensitivity is at least two times less, and the number of required angular positions of the light beam is two times more, which leads to an increase in scan time.
Целесообразно между зеркальным покрытием предметного стекла и микрообъектом размещать слой оптически прозрачного вещества. It is advisable to place a layer of optically transparent substance between the mirror coating of the glass slide and the micro-object.
Это позволяет пространственно разделить изображения объекта и его зеркального отражения, что ведет к улучшению качества томографической обработки. This allows you to spatially separate the image of the object and its specular reflection, which leads to an improvement in the quality of tomographic processing.
Сканирование изображения источника света в предлагаемом способе осуществляют по произвольной двумерной траектории. Scanning the image of the light source in the proposed method is carried out along an arbitrary two-dimensional path.
В известном способе возможна только одна траектория сканирования изображения источника света - в виде окружности, радиус которой определяется числовой апертурой микрообъектива. Это вызвано особенностью фазоконтрастного метода визуализации изображений прозрачных объектов, используемого в способе-прототипе. В этом способе применяется одна из разновидностей метода фазового контраста, в которой используются непрозрачный край круглой диафрагмы поля зрения микрообъектива в качестве визуализирующего (режекторного) ножа и наклонное освещение объекта. В предлагаемом способе сканирование изображения источника света может осуществляться по произвольной двумерной траектории, так как в нем применяется интерференционный метод регистрации изображений прозрачных объектов, который не накладывает никаких ограничений на вид траектории сканирования. Могут быть реализованы траектории в виде прямой, креста, квадрата, спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Как показывают результаты численного моделирования, наиболее оптимальными для томографии с ограниченным углом обзора являются траектории в виде спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Качество восстановленных изображений при таких траекториях выше, чем для траектории в виде окружности. In the known method, only one scanning path of the image of the light source is possible — in the form of a circle whose radius is determined by the numerical aperture of the micro-lens. This is due to the peculiarity of the phase-contrast method for visualizing images of transparent objects used in the prototype method. This method uses one of the varieties of the phase contrast method, which uses the opaque edge of the circular diaphragm of the field of view of the micro-lens as a visualizing (notch) knife and oblique illumination of the object. In the proposed method, scanning the image of the light source can be carried out along an arbitrary two-dimensional path, since it uses the interference method for recording images of transparent objects, which does not impose any restrictions on the type of scan path. Trajectories in the form of a straight line, a cross, a square, a spiral, a set of concentric circles or squares can be implemented. As the results of numerical modeling show, the most optimal for tomography with a limited viewing angle are trajectories in the form of a spiral, a set of concentric circles or squares. The quality of the reconstructed images with such trajectories is higher than for the trajectory in the form of a circle.
Для измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта предпочтительно регистрировать по меньшей мере три интерференционные картины при соответственно трех различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света. To measure the amplitude-phase characteristics of images of a micro-object, it is preferable to register at least three interference patterns at respectively three different optical path lengths passing by a reference light beam.
В предлагаемом способе для измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта по его интерференционным картинам предлагается использовать метод фазовых шагов. Этот метод предполагает регистрацию по меньшей мере трех интерференционных картин при соответственно трех различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света, что позволяет автоматизировать процесс измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта. In the proposed method for measuring the amplitude-phase characteristics of images of a micro-object according to its interference patterns, it is proposed to use the method of phase steps. This method involves the registration of at least three interference patterns at respectively three different optical path lengths passing by the reference light beam, which makes it possible to automate the process of measuring the amplitude-phase characteristics of images of a micro-object.
При использовании иммерсионного микрообъектива микрообъект размещают в среде, показатель преломления которой по существу равен показателю преломления иммерсионной жидкости для микрообъектива. When using an immersion micro-lens, the micro-object is placed in a medium whose refractive index is substantially equal to the refractive index of the immersion liquid for the micro-lens.
Для повышения пространственного разрешения изображений и увеличения угла обзора микрообъекта необходимо использовать микрообъективы с большой числовой апертурой. Такими характеристиками обладают так называемые иммерсионные микрообъективы. Для уменьшения влияния рефракции света на границе микрообъекта его также обычно помещают в некоторую инертную среду, как правило жидкую, показатель преломления которой близок к показателю преломления микрообъекта. Если показатель преломления этой среды не будет равен показателю преломления иммерсионной жидкости для микрообъектива, то на границе этих двух сред будет происходить преломление света и уменьшение эффективного угла обзора микрообъекта. При равенстве показателей преломления среды и иммерсионной жидкости преломления не будет и достигается максимальный угол обзора. To increase the spatial resolution of images and increase the viewing angle of a micro-object, it is necessary to use micro-lenses with a large numerical aperture. The so-called immersion micro-lenses possess such characteristics. To reduce the influence of light refraction at the boundary of a microobject, it is also usually placed in a certain inert medium, usually a liquid, whose refractive index is close to the refractive index of a microobject. If the refractive index of this medium is not equal to the refractive index of the immersion liquid for the micro lens, then refraction of light and a decrease in the effective viewing angle of the micro object will occur at the boundary of these two media. If the refractive indices of the medium and the immersion liquid are equal, there will be no refraction and the maximum viewing angle is achieved.
В качестве источника света предпочтительно использовать протяженный источник пространственно-когерентного квазимонохроматического света. As the light source, it is preferable to use an extended source of spatially coherent quasi-monochromatic light.
При использовании такого источника света улучшается качество формируемых изображений по сравнению с точечным источником света, который используется в способе, взятом за прототип. Это вызвано тем, что при формировании суммарной интерференционной картины от протяженного источника происходит усреднение случайных шумов в изображениях отдельных элементарных интерферограмм. Это связано с тем, что они образованы с помощью пучков света, прошедших через различные участки оптических элементов микроскопа. В результате это приводит к уменьшению шумовой составляющей в проекциях. When using such a light source, the quality of the generated images is improved in comparison with a point light source, which is used in the method taken as a prototype. This is because during the formation of the total interference pattern from an extended source, random noise is averaged in the images of individual elementary interferograms. This is due to the fact that they are formed using beams of light that have passed through various sections of the optical elements of the microscope. As a result, this leads to a decrease in the noise component in the projections.
Поставленная задача решается также тем, что микроскоп для оптической томографии трехмерных микрообъектов, содержащий источник света, устройство сканирования изображения источника света, предметное стекло для размещения на нем исследуемого трехмерного микрообъекта, отображающий канал, содержащий окуляр и регистрирующее устройство, и блок томографической обработки, согласно изобретению, дополнительно содержит светоделитель, предназначенный для формирования двух идентичных предметного и опорного каналов, каждый из которых образован микрообъективом и зеркалом, расположенным в его задней фокальной плоскости, и для формирования отображающего канала, расположенного по направлению распространения пучков света, отраженных от зеркала предметного канала и от зеркала опорного канала и светоделителя, при этом зеркало предметного канала является предметным стеклом, а окуляр установлен в отображающем канале так, что его передняя фокальная плоскость совпадает с передними фокальными плоскостями микрообъективов предметного и опорного каналов, а в задней фокальной плоскости окуляра расположено регистрирующее устройство. The problem is also solved by the fact that the microscope for optical tomography of three-dimensional microobjects containing a light source, a scanning device for the image of the light source, a glass slide for placement of the studied three-dimensional microobject on it, displaying a channel containing an eyepiece and a recording device, and a tomographic processing unit, according to the invention , further comprises a beam splitter designed to form two identical subject and reference channels, each of which is formed a micro lens and a mirror located in its rear focal plane, and for forming a display channel located in the direction of propagation of light beams reflected from the mirror of the subject channel and from the mirror of the reference channel and the beam splitter, the mirror of the subject channel is a glass slide and the eyepiece is mounted in the imaging channel so that its front focal plane coincides with the front focal planes of the micro-lenses of the subject and reference channels, and in the rear focal plane eyepiece is a recording device.
Предметный канал, сформированный благодаря использованию в предлагаемом микроскопе светоделителя, предназначен для зондирования исследуемого микрообъекта и формирования его изображения, а опорный канал необходим для создания опорного пучка и образования интерференционной картины, по которой можно измерить количественные данные об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта. Отсутствие светоделителя и двух идентичных предметного и опорного каналов в микроскопе-прототипе не позволяет на нем реализовать интерференционный контраст и, соответственно, получать количественные данные об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта. The subject channel, formed due to the use of a beam splitter in the proposed microscope, is designed to probe the studied microobject and to form its image, and the reference channel is necessary to create a reference beam and the formation of an interference pattern by which quantitative data on the amplitude-phase characteristics of the microobject image can be measured. The absence of a beam splitter and two identical subject and reference channels in the prototype microscope does not allow it to realize interference contrast and, accordingly, to obtain quantitative data on the amplitude-phase characteristics of the microobject image.
Каждый из каналов образован микрообъективом и зеркалом, расположенным в его задней фокальной плоскости. Такое расположение зеркал необходимо для достижения максимального угла обзора исследуемого микрообъекта и формирования контрастной интерференционной картины при использовании протяженного пространственно-некогерентного источника света. Микрообъект должен быть расположен в непосредственной близости от зеркала предметного канала. Только в этом случае в плоскости регистрирующего устройства формируется контрастное интерференционное изображение микрообъекта. Each of the channels is formed by a micro lens and a mirror located in its rear focal plane. This arrangement of mirrors is necessary to achieve the maximum viewing angle of the investigated microobject and the formation of a contrast interference pattern when using an extended spatially incoherent light source. The microobject should be located in the immediate vicinity of the object channel mirror. Only in this case, a contrast interference image of the micro-object is formed in the plane of the recording device.
Отображающий канал микроскопа расположен по направлению распространения пучков света, отраженных от зеркал обоих каналов и светоделителя. При этом окуляр установлен в отображающем канале так, что его передняя фокальная плоскость совпадает с задними фокальными плоскостями микрообъективов обоих каналов, а в задней фокальной плоскости окуляра расположено регистрирующее устройство. Только такое расположение окуляра относительно микрообъективов, которое называется конфокальным, обеспечивает одинаковый размер изображений сечений микрообъекта, отличающихся различной глубиной расположения. The imaging channel of the microscope is located in the direction of propagation of light beams reflected from the mirrors of both channels and the beam splitter. In this case, the eyepiece is mounted in the imaging channel so that its front focal plane coincides with the rear focal planes of the micro-lenses of both channels, and a recording device is located in the rear focal plane of the eyepiece. Only such an arrangement of the eyepiece with respect to micro-lenses, which is called confocal, provides the same size of images of cross-sections of a micro-object, differing in different depths.
Если в микроскопе зеркало опорного канала установлено с возможностью возвратно-поступательного перемещения вдоль оптической оси опорного канала, то таким образом достигается возможность автоматической расшифровки интерферограмм методом фазовых шагов и измерения количественных данных об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта. If in the microscope the mirror of the reference channel is installed with the possibility of reciprocating movement along the optical axis of the reference channel, then the possibility of automatic decoding of interferograms by the method of phase steps and measurement of quantitative data on the amplitude-phase characteristics of the image of the micro-object is achieved.
Если зеркало опорного канала закрепить на пьезоэлементе, то его (зеркала) перемещение вдоль оптической оси опорного канала может выполняться по команде от компьютера за короткий промежуток времени. В результате повышается скорость расшифровки интерферограмм. Она может проводиться в телевизионном темпе. If the mirror of the reference channel is fixed on the piezoelectric element, then its (mirror) movement along the optical axis of the reference channel can be performed by command from a computer in a short period of time. As a result, the speed of decoding interferograms increases. It can be held at a television pace.
Устройство сканирования изображения источника света в микроскопе целесообразно выполнить в виде двухкоординатного механизма перемещения, на котором закреплен источник света, и неподвижного объектива, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оптической оси указанного объектива. Благодаря двухкоординатному перемещению может реализовываться любая траектория сканирования, а не только круговая, как это предусмотрено в микроскопе, взятом за прототип. В качестве источника света может использоваться компактный светодиод или полупроводниковый лазер. The scanning device for the image of the light source in the microscope is expediently performed in the form of a two-coordinate movement mechanism on which the light source is fixed, and a fixed lens, and the movement is performed in a plane perpendicular to the optical axis of the specified lens. Due to the two-coordinate movement, any scanning path can be realized, and not just circular, as provided for in the microscope taken as a prototype. As a light source, a compact LED or a semiconductor laser can be used.
Если в микроскопе используется стационарный источник света, то устройство сканирования изображения источника света можно выполнить в виде гибкого световода, светофильтра, линзы-конденсора, формирующей изображение источника света в плоскости входного торца световода, двухкоординатного механизма перемещения, на котором закреплен выходной торец световода, и неподвижного объектива, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оптической оси указанного объектива. Применение гибкого световода позволяет использовать различные типы источников света, в том числе лазеры. При перемещении световода будет нарушаться также пространственная когерентность пучка света, что положительно скажется на качестве формируемых микроскопом интерференционных картин. С помощью смены светофильтров легко выбрать требуемую длину волны света. If a stationary light source is used in the microscope, the scanning device for the image of the light source can be made in the form of a flexible fiber, a light filter, a condenser lens, forming an image of a light source in the plane of the input end of the fiber, a two-coordinate movement mechanism on which the output end of the fiber is fixed, and a fixed the lens, and the movement is performed in a plane perpendicular to the optical axis of the specified lens. The use of a flexible fiber allows the use of various types of light sources, including lasers. When the fiber is moved, the spatial coherence of the light beam will also be violated, which will positively affect the quality of the interference patterns formed by the microscope. By changing the filters it is easy to select the required wavelength of light.
Устройство сканирования изображения источника света в микроскопе может состоять из зеркала и линзы, закрепленных на однокоординатном механизме перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины, закрепленной на механизме вращения, и неподвижного объектива, причем зеркало расположено так, что оптические оси падающего и отраженного от него пучков света перпендикулярны, а направление перемещения зеркала и линзы и ось вращения пластины параллельны оптической оси падающего пучка света. Такое устройство сканирования позволяет уменьшить энергетические потери светового пучка и плавно менять размер источника света. The scanning device for the image of the light source in a microscope may consist of a mirror and a lens mounted on a single-coordinate movement mechanism, a plane-parallel transparent plate mounted on a rotation mechanism, and a fixed lens, the mirror being located so that the optical axes of the incident and reflected light beams are perpendicular, and the direction of movement of the mirror and lens and the axis of rotation of the plate are parallel to the optical axis of the incident light beam. Such a scanning device can reduce the energy loss of the light beam and smoothly change the size of the light source.
В микроскопе, в котором источником света служит светящаяся область экрана электронно-лучевой трубки, устройство сканирования изображения источника света может представлять собой устройство развертки электронного луча указанной трубки. В таком устройстве отсутствуют движущиеся механические узлы. Оно обеспечивает большую скорость сканирования и возможность управления от компьютера. In a microscope, in which the luminous region of the screen of the cathode ray tube serves as the light source, the scanning device for the image of the light source may be a scanning device for the electron beam of the tube. In such a device there are no moving mechanical units. It provides greater scanning speed and the ability to control from a computer.
В дальнейшем предлагаемое изобретение поясняется конкретными примерами его выполнения и прилагаемыми чертежами, на которых:
фиг.1 изображает принципиальную схему микроскопа для оптической томографии трехмерных микрообъектов;
фиг. 2 - ход лучей при размещении исследуемого трехмерного микрообъекта на предметном стекле с зеркальным покрытием;
фиг.3 - эквивалентную схему зондирования исследуемого трехмерного микрообъекта, размещенного на предметном стекле с зеркальным покрытием.In the future, the invention is illustrated by specific examples of its implementation and the accompanying drawings, in which:
figure 1 depicts a schematic diagram of a microscope for optical tomography of three-dimensional micro-objects;
FIG. 2 - the course of the rays when placing the investigated three-dimensional micro-object on a glass slide with a mirror coating;
figure 3 is an equivalent sensing circuit of the investigated three-dimensional microobject placed on a glass slide with a mirror coating.
фиг. 4 - вариант выполнения устройства сканирования в виде двухкоординатного механизма перемещения и неподвижного объектива;
фиг. 5 - вариант выполнения устройства сканирования, содержащего гибкий световод, светофильтр, линзу-конденсор, двухкоординатный механизм перемещения и неподвижный объектив;
фиг. 6 - вариант выполнения устройства сканирования в виде зеркала и линзы с однокоординатным механизмом их перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины и неподвижного объектива.FIG. 4 is an embodiment of a scanning device in the form of a two-coordinate movement mechanism and a fixed lens;
FIG. 5 is an embodiment of a scanning device comprising a flexible light guide, a light filter, a condenser lens, a two-coordinate movement mechanism, and a fixed lens;
FIG. 6 is an embodiment of a scanning device in the form of a mirror and a lens with a single-coordinate mechanism for their movement, a plane-parallel transparent plate and a fixed lens.
Микроскоп, реализующий предлагаемый способ томографии трехмерных объектов, содержит источник 1 (фиг. 1) света с устройством 2 сканирования изображения источника света, светоделитель 3, который делит оптическую схему микроскопа на два идентичных канала 4 и 5. Предметный канал 4 образован микрообъективом 6 и расположенным в его задней фокальной плоскости зеркалом 7, служащим предметным стеклом, на котором размещают исследуемый трехмерный микрообъект 8. На зеркало 7 может быть нанесен слой 9 оптически прозрачного вещества, например окиси кремния. A microscope that implements the proposed method for tomography of three-dimensional objects contains a light source 1 (Fig. 1) with a light source
Опорный канал 5 образован микрообъективом 10 и расположенным в его задней фокальной плоскости зеркалом 11, которое может быть закреплено на пьезоэлементе 12 с возможностью возвратно-поступательного перемещения в продольном направлении. The reference channel 5 is formed by a micro lens 10 and a mirror 11 located in its rear focal plane, which can be mounted on the piezoelectric element 12 with the possibility of reciprocating movement in the longitudinal direction.
По направлению распространения пучков света, отраженных от зеркал 7 и 11 и светоделителя 3, сформирован отображающий канал 13, в котором установлен окуляр 14, передняя фокальная плоскость которого совпадает с передними фокальными плоскостями 15 и 16 соответственно микрообъективов 6 и 10, то есть окуляр 14 образует с ними конфокальные пары. В задней фокальной плоскости окуляра 14, служащей выходной плоскостью микроскопа, размещено регистрирующее устройство 17, соединенное с блоком 18 томографической обработки. In the direction of propagation of the light beams reflected from the mirrors 7 and 11 and the beam splitter 3, a display channel 13 is formed in which the eyepiece 14 is mounted, the front focal plane of which coincides with the front
На фиг. 2 более детально изображена часть схемы освещения исследуемого трехмерного микрообъекта 8, размещенного на предметном стекле с зеркальным покрытием, а на фиг. 3 - эквивалентная схема зондирования такого микрообъекта. In FIG. 2 depicts in more detail a part of the lighting scheme of the investigated three-
Устройство 2 (фиг.4) сканирования изображения источника света состоит из двухкоординатного механизма 19 перемещения источника 1 света и неподвижного объектива 20, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оси 21 указанного объектива 20. В качестве источника 1 света могут использоваться малогабаритные светодиоды или полупроводниковые лазеры. В качестве двухкоординатного механизма 19 перемещения может применяться известный двухкоординатный электромеханический столик, управляемый от компьютера, на котором можно запрограммировать любую двумерную траекторию сканирования изображения источника 1 света. The light source image scanning device 2 (FIG. 4) consists of a two-coordinate
На фиг. 5 изображено устройство 2 сканирования изображения источника света, которое состоит из расположенных последовательно линзы-конденсора 22, светофильтра 23, гибкого световода 24, двухкоординатного механизма 25 перемещения, на котором закреплен выходной участок световода 24, и неподвижного объектива 27. В этом устройстве может использоваться стационарный (неподвижный) источник 1 света большого размера, например, ртутная лампа. Линза-конденсор 22 формирует изображение источника 1 света в плоскости неподвижно закрепленного входного торца световода 24. Таким образом вводится оптическое излучение в световод 24. Выходной участок 26 световода 24, из которого выходит оптическое излучение, закреплен на двухкоординатном механизме 25 перемещения. При перемещении этого выходного участка 26 световода 24 в плоскости, перпендикулярной оптической оси неподвижного объектива 27, происходит сканирование изображения источника света. In FIG. 5 shows a light source
Применение гибкого световода 24 позволяет использовать различные типы источников 1 света, в том числе лазеры. При перемещении световода 24 будет нарушаться также пространственная когерентность пучка света, что положительно скажется на качестве формируемых микроскопом интерференционных картин. С помощью смены светофильтров 23 легко выбрать требуемую длину волны света. The use of flexible
На фиг.6 изображено устройство 2 сканирования изображения источника света, которое состоит из расположенных последовательно зеркала 28, линзы 29, закрепленных на однокоординатном механизме 30 перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины 31, закрепленной на механизме 32 вращения, и неподвижного объектива 33. Зеркало 28 расположено так, что оптические оси падающего и отраженного от него пучков света перпендикулярны. Направление перемещения зеркала 28 и линзы 29 совпадает с направлением оптической оси падающего пучка света. Ось 34 вращения пластины 31 также параллельна оптической оси падающего пучка света. Пусть в начальном положении оптическая ось отраженного пучка света совпадает с оптической осью неподвижного объектива 33. При одновременном перемещении зеркала 28 и линзы 29 вдоль оптической оси падающего пучка света происходит смещение оптической оси отраженного пучка света в одном (на фиг.6 - горизонтальном) направлении относительно оптической оси неподвижного объектива 33. Это эквивалентно поперечному смещению источника 1 света относительно оптической оси этого объектива, поэтому его изображение также будет смещаться. Вращение плоскопараллельной прозрачной пластины 31 вокруг оси 34 приводит к дополнительному смещению оптической оси отраженного пучка света в другом (на фиг.6 - вертикальном) направлении. Регулируя величину смещения по обоим направлениям, можно реализовать любую двумерную траекторию сканирования изображения источника 1 света. Такое устройство 2 сканирования может применяться с любым источником 1 света и позволяет плавно менять его размер. Figure 6 shows a
В микроскопе в качестве источника 1 света может использоваться светящаяся область экрана электронно-лучевой трубки. Тогда устройство 2 сканирования изображения источника света совпадает с устройством развертки электронного луча указанной трубки. В таком устройстве отсутствуют движущиеся механические узлы. Оно обеспечивает большую скорость сканирования и возможность управления от компьютера. Для повышения длины когерентности излучения такого источника света необходимо использовать электронно-лучевую трубку с экранами, покрытыми люминофорами из редкоземельных металлов (Коржов Е.И. и др. "Многоканальный голографический коррелятор интенсивности квазимонохроматической ЭЛТ", журнал "Автометрия", 1987 г., N 2, стр. 8-17). In a microscope, a luminous region of the screen of a cathode ray tube can be used as a light source 1. Then, the light source
Предлагаемый способ оптической томографии трехмерных микрообъектов осуществляют следующим образом. The proposed method of optical tomography of three-dimensional microobjects is as follows.
Излучение от источника 1 света, пройдя устройство 2 сканирования изображения источника света, направляют на светоделитель 3 и осуществляют выделение в канале 5 опорного пучка света. С помощью указанного устройства 2 формируют изображение источника 1 света в передней фокальной плоскости 15 микрообъектива 6. После микрообъектива 6 формируется пучок света, который зондирует исследуемый микрообъект 8 под некоторым углом к его оптической оси. Отраженный от зеркала 7 или от самого микрообъекта 8 пучок
света вновь направляется в микрообъектив 6 и далее на светоделитель 3 и окуляр 14. С помощью светоделителя 3 сюда же направляют опорный пучок света и в плоскости регистрирующего устройства 17 совмещают его с изображением микрообъекта 8. В результате интерференции возникает картина, по которой измеряют амплитудно-фазовые характеристики полученного изображения микрообъекта 8. Далее все эти операции повторяют при другой позиции сканирования изображения источника 1 света в передней фокальной плоскости 15 микрообъектива 6. Производят совместную томографическую обработку всех полученных амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта 8 и определяют трехмерное пространственное распределение показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта 8.The radiation from the light source 1, having passed the
the light is again directed to the
Рассмотрим более подробно, как формируются изображения микрообъекта 8 при различных позициях сканирования изображения источника 1 света, например, в точках A', B', C' (фиг. 1). При каждом новом положении изображения источника 1 света создается своя интерференционная картина микрообъекта 8. Пусть в точке B' изображение источника 1 света находится на оптической оси, а источники A' и C' на некотором расстоянии от нее. Предположим, что источник 1 света - точечный. Let us consider in more detail how images of a micro-object 8 are formed at various scanning positions of the image of the light source 1, for example, at points A ', B', C '(Fig. 1). With each new position of the image of the light source 1, its own interference pattern of the
Проследим вначале за ходом лучей (сплошные линии на фиг. 1), которые участвуют в формировании интерференционной картины только от точки B'. Так как изображение источника 1 света формируется в передних фокальных плоскостях 15, 16 микрообъективов 6 и 10, то микрообъект 8 и зеркала 7, 11 освещаются параллельными пучками. Отраженное от зеркал 7, 11 излучение распространяется в обратном направлении и после светоделителя 3 создает элементарную интерференционную картину во всей области перекрытия пучков опорного и предметного каналов 4 и 5. Таким образом, эта картина интерференции для точечного источника света не локализована в какой-либо определенной плоскости. First, we will follow the course of the rays (solid lines in Fig. 1), which participate in the formation of the interference pattern only from point B '. Since the image of the light source 1 is formed in the front
Окуляр 14 должен быть расположен на фокусном расстоянии от плоскостей 15, 16 для того, чтобы микрообъективы 6, 10 образовывали с ним конфокальную пару. Это условие необходимо для достижения одинакового масштаба изображений различных продольных плоскостей микрообъекта 8. Только при таком расположении окуляра 14 отображающий канал 13 микроскопа будет инвариантен к сдвигу вдоль оптической оси. The eyepiece 14 should be located at the focal length from the
Ход лучей при формировании интерференционных картин от других позиций сканирования изображения точечного источника 1 света, смещенных относительно оптической оси в поперечном направлении, например, в точку A', аналогичен только что рассмотренному. Поэтому на фиг. 1 приведены пунктирными линиями лишь оси пучков света от этих источников, а на фиг. 2 изображена более детально часть схемы освещения микрообъекта 8. Из фиг. 1, 2 следует, что для положения изображения источника 1 света в точке A' после микрообъективов 6 и 10 распространяются уже наклонные к оптической оси параллельные пучки света. Угол θ наклона зависит от расстояния A'B'. Максимальный угол наклона определяется числовой апертурой микрообъективов 6, 10 и размером микрообъекта 8. Причем микрообъект 8 должен весь находиться в области пересечения этих пучков. Из фиг.2 видно, что размер этой области зависит от расположения зеркала 7 и достигает своего наибольшего значения при размещении его точно в задней фокальной плоскости микрообъектива 6. Соответственно, зеркало 11 опорного канала 5 также должно находиться в задней фокальной плоскости микрообъектива 10. Отраженное от зеркал 7, 11 и светоделителя 3 излучение преобразуется окуляром 14 в параллельные пучки и направляется под некоторым углом друг к другу в плоскость регистрирующего устройства 17. Так как эти пары пучков образованы из одного и того же изображения источника 1 света в точке A', то такие пучки когерентны и при регистрации в любой плоскости в пространстве изображений микроскопа создают свою нелокализованную интерференционную картину. Точно так же образуется интерференционная картина для любого другого точечного источника 1 света вокруг данной точки A'. Получим уравнение данной интерференционной картины. The path of the rays during the formation of interference patterns from other scanning positions of the image of a point light source 1, offset from the optical axis in the transverse direction, for example, to point A ', is similar to that just considered. Therefore, in FIG. 1 are shown by dashed lines only to the axes of light beams from these sources, and in FIG. 2 depicts in more detail a part of the lighting circuit of a
Пусть функция f(x,y,z) описывает трехмерный микрообъект, который можно заключить в шар радиуса po. Эта функция связана с трехмерным пространственным распределением показателя преломления n(x,y,z) следующим соотношением:
f(x,y,z) = [n(x,y,z)-n0]p0/λ, (1)
где no - показатель преломления окружающей объект среды, λ - средняя длина волны квазимонохроматического излучения. Предполагаем, что начало координат помещено в центр объекта (шара радиуса po). Так как у нас микрообъект расположен на или вблизи зеркальной поверхности (пусть плоской), то его можно записать в виде следующей суммы (см. фиг.3):
g(x,y,z) = f(x,y,z-po) + f(x,y,po-z). (2)
Отсюда следует, что томография исходного объекта (1), расположенного у зеркальной поверхности, сводится к томографии составного объекта (2).Let the function f (x, y, z) describe a three-dimensional micro-object that can be enclosed in a ball of radius p o . This function is associated with the three-dimensional spatial distribution of the refractive index n (x, y, z) by the following relation:
f (x, y, z) = [n (x, y, z) -n 0 ] p 0 / λ, (1)
where n o is the refractive index of the surrounding medium, λ is the average wavelength of quasi-monochromatic radiation. We assume that the origin is placed at the center of the object (a ball of radius p o ). Since we have a micro-object located on or near a mirror surface (albeit flat), it can be written in the form of the following sum (see figure 3):
g (x, y, z) = f (x, y, zp o ) + f (x, y, p o -z). (2)
It follows that the tomography of the original object (1), located near the mirror surface, is reduced to the tomography of the composite object (2).
Особенности заключаются в том, что функция (2) - четная по координате z и область ее задания представляет собой два соприкасающихся шара. The peculiarities lie in the fact that function (2) is even in z coordinate and the area of its task is two touching balls.
Для того, чтобы повысить качество томографической реконструкции такого составного объекта, мы предлагаем пространственно разделить микрообъект 8 и его зеркальное изображение с помощью слоя 9 оптически прозрачного вещества, нанесенного на зеркало 7, служащее предметным стеклом. In order to improve the quality of the tomographic reconstruction of such a composite object, we propose to spatially separate the
Так как плоскость регистрирующего устройства 17 (фиг. 1) параллельна плоскости (x, y), то мы регистрируем следующие двумерные параллельные проекции:
где (θ,φ) - угловые координаты оптической оси зондирующего пучка.Since the plane of the recording device 17 (Fig. 1) is parallel to the plane (x, y), we register the following two-dimensional parallel projections:
where (θ, φ) are the angular coordinates of the optical axis of the probe beam.
Отсюда следует отличительная особенность "зеркальной" томографии, которая заключается в том, что проекции для углов (θ,φ) и (θ,φ+π) идентичны. Этот факт следует из свойства взаимной обратимости лучей в оптике. Действительно, из фиг. 2 видно, что при перестановке местами падающего и отраженного от зеркала 7 пучков вид проекции не изменится. Отсюда следует, что диапазон углов зондирования по φ можно ограничить интервалом (0 π ). Диапазон углов по θ ограничен числовой апертурой микрообъектива: для 100-кратного микрообъектива он может достигать 90 градусов. From here follows the distinguishing feature of “mirror” tomography, which consists in the fact that the projections for the angles (θ, φ) and (θ, φ + π) are identical. This fact follows from the property of mutual reversibility of rays in optics. Indeed, from FIG. Figure 2 shows that when rearranging the beams incident and reflected from the mirror 7, the type of projection will not change. It follows that the range of probing angles with respect to φ can be limited by the interval (0 π). The θ angle range is limited by the numerical aperture of a micro lens: for a 100x micro lens, it can reach 90 degrees.
Для повышения пространственного разрешения изображений и увеличения угла обзора микрообъекта 8 необходимо использовать микрообъективы 6 с большой числовой апертурой. При использовании такого микрообъектива 6 между ним и покровным стеклом (на фиг. не показано), под которым находится микрообъект 8, размещена прозрачная жидкость, например вода или масло. Микрообъект 8 также размещают в некоторой прозрачной среде, жидкой, вязкой или иногда даже твердой, например в канадском бальзаме. Обычно показатель преломления этой среды меньше показателя преломления иммерсионной жидкости. Поэтому на границе этих двух сред будет происходить преломление света и уменьшение эффективного угла обзора микрообъекта 8. При равенстве по существу показателей преломления среды и иммерсионной жидкости преломления пучка света на границе не будет и тогда достигается максимальный угол обзора. To increase the spatial resolution of images and increase the viewing angle of a
При настройке микроскопа, например, на полосы конечной ширины, параллельные оси x, уравнение элементарной интерферограммы можно записать в виде
где α - угол между осями предметного и опорного пучков для данного положения точечного источника. Таким образом, элементарная интерферограмма представляет собой интерферограмму проекции (3).When setting up the microscope, for example, onto strips of finite width parallel to the x axis, the equation of the elementary interferogram can be written as
where α is the angle between the axes of the subject and reference beams for a given position of a point source. Thus, an elementary interferogram is a projection interferogram (3).
В случае использования протяженного источника 1 света его можно представить в виде набора точечных источников, некогерентных между собой. Каждый такой точечный источник создает свою интерференционную картину, которая описывается уравнением (4). Для такого источника 1 в пространстве изображений формируется непрерывный набор из пар плоских когерентных пучков (предметного и опорного), несущих информацию о своей элементарной интерферограмме. Однако между собой эти пары волн некогерентны. Следовательно, при регистрации элементарные интерферограммы будут суммироваться по интенсивности. Так как плоскость регистрирующего устройства 17 и плоскости размещения зеркал 7, 11 оптически сопряжены, то оси пучков из всего набора точечных источников будут пересекаться в одной точке, лежащей в плоскости фокусировки изображения зеркал 7, 11. Таким образом, только в этой плоскости элементарные интерференционные картины от каждого точечного источника будут складываться без смещения. Поэтому в данной плоскости будет наблюдаться наиболее контрастная интерференционная картина. В любой другой плоскости такие элементарные картины будут смещены друг относительно друга, и видность полос суммарной интерферограммы уменьшится. Это говорит о том, что область локализации интерференционных полос в схеме с протяженным источником 1 пространственно-некогерентного света совпадает с плоскостью изображения зеркал 7, 11 предметного и опорного каналов 4 и 5. In the case of using an extended light source 1, it can be represented as a set of point sources that are incoherent with each other. Each such point source creates its own interference pattern, which is described by equation (4). For such a source 1, a continuous set of pairs of plane coherent beams (subject and reference) carrying information about their elementary interferogram is formed in the image space. However, these pairs of waves are incoherent among themselves. Therefore, upon registration, elementary interferograms will be summed in intensity. Since the plane of the recording device 17 and the plane of placement of the mirrors 7, 11 are optically conjugated, the axis of the beams from the entire set of point sources will intersect at one point lying in the focus plane of the image of the mirrors 7, 11. Thus, only in this plane are elementary interference patterns from each point source will add up without bias. Therefore, the most contrasting interference pattern will be observed in this plane. In any other plane, such elementary patterns will be shifted relative to each other, and the visibility of the bands of the total interferogram will decrease. This suggests that the region of localization of interference fringes in the scheme with an extended source 1 of spatially incoherent light coincides with the image plane of mirrors 7, 11 of the subject and reference channels 4 and 5.
Так как точечные источники некогерентны между собой, то интерферограмма I(x, y) для протяженного источника 1 света будет формироваться как сумма из элементарных интерферограмм (4). Для непрерывного набора источников можно записать
I(x,y) = ∫∫(x,y;θ,φ)sinθdθdφ. (5)
Область интегрирования в (5) определяется угловыми размерами источника.Since point sources are incoherent with each other, the interferogram I (x, y) for an extended light source 1 will be formed as a sum of elementary interferograms (4). For a continuous set of sources, you can write
I (x, y) = ∫∫ (x, y; θ, φ) sinθdθdφ. (5)
The integration region in (5) is determined by the angular dimensions of the source.
Из (5), (4) следует, что даже в области локализации интерференционных полос (плоскость 12) они имеют не единичный контраст, так как в (5) суммируются интерферограммы разных проекций, поэтому для увеличения контраста желательно уменьшать угловой размер источника света, но при этом могут появиться когерентные шумы в изображении интерферограммы. From (5), (4) it follows that even in the region of localization of interference fringes (plane 12) they have not a single contrast, since interferograms of different projections are summed up in (5), therefore, to increase the contrast, it is desirable to reduce the angular size of the light source, but in this case, coherent noise may appear in the image of the interferogram.
При формировании суммарной интерферограммы (5) от протяженного источника 1 происходит усреднение случайных шумов в изображениях отдельных элементарных интерферограмм. Это связано с тем, что они образованы с помощью пучков света, прошедших через различные участки оптических элементов микроскопа. В результате это приводит к уменьшению шумовой составляющей в проекциях. При дальнейшем увеличении размера источника будет, во-первых, уменьшаться контраст интерференционных полос и, во-вторых, изменится характер проекционных данных. Для источника малых, но конечных размеров проекционные данные представляют собой сумму интерферограмм проекций из небольшого диапазона углов зондирования и лишь в некотором приближении их можно принять за проекцию. Аналогичная ситуация возникает в любой оптической системе регистрации проекционных данных, имеющей конечную числовую апертуру. When forming the total interferogram (5) from the extended source 1, averaging of random noise in the images of individual elementary interferograms occurs. This is due to the fact that they are formed using beams of light that have passed through various sections of the optical elements of the microscope. As a result, this leads to a decrease in the noise component in the projections. With a further increase in the size of the source, firstly, the contrast of the interference fringes will decrease and, secondly, the nature of the projection data will change. For a source of small but finite sizes, the projection data is the sum of the interferograms of the projections from a small range of sensing angles and can only be taken as a projection to a certain approximation. A similar situation arises in any optical system for recording projection data having a finite numerical aperture.
Таким образом, при выборе размера источника 1 необходимо поддерживать разумный компромисс между качеством изображения интерферограммы и достоверностью описания проекционных данных с помощью уравнения проекции (3). Thus, when choosing the size of source 1, it is necessary to maintain a reasonable compromise between the image quality of the interferogram and the reliability of the description of projection data using the projection equation (3).
Измерение амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта 8 производится по полученным интерференционным картинам. Для автоматической расшифровки интерферограмм мы используем метод фазовых шагов (P. Hariharan, B. F. Oreb., N. Brown, Opt. Commun., 1982, vol. 41, N 6, pp. 393-396). Суть этого метода заключается в том, что регистрируют по меньшей мере три, в нашем случае четыре, интерференционные картины при различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света. В более общем виде уравнение интерферограммы (5) можно записать в следующем виде:
где A - интенсивность фона; B - видность полос; k = 0, 1, 2, 3; d - фазовый сдвиг между опорным и предметным пучками,
Ψ(x,y;θ,φ) = Ф(x,y;θ,φ)+xsinα.
При различных значениях k и, соответственно, фазового сдвига, определяемого величиной kd, регистрируется несколько интерферограмм Ik. Физически данный фазовый сдвиг между опорным и объектным пучками вносится с помощью возвратно-поступательного перемещения зеркала 11 вдоль оптической оси опорного канала 5. В частности, это зеркало 11 может быть закреплено на пьезоэлементе 12, управляемом от компьютера. Мы используем самокалибрующийся алгоритм, при котором наряду с A, B, Ψ и величина d также является неизвестной (P. Hariharan, B.F. Oreb., N. Brown, Opt. Commun., 1982, vol. 41, N 6, pp. 393-396). При регистрации 4-х интерференционных картин мы получаем следующие системы уравнений:
Решение этой системы уравнений относительно Ψ для каждой точки (x,y) можно записать в виде:
На первом этапе вычисляется фазовая характеристика изображения микрообъекта 8 по формуле (7) в интервале значений от 0 до 2 π, в результате чего получают так называемую "несшитую" фазу. Второй этап состоит в устранении разрывов в распределении фазы, т.е. "сшивка" фазы. Третий этап заключается в устранении наклона в распределении фазы, связанного с регистрацией интерферограмм в полосах конечной ширины, т.е. в переходе от Ψ(x,y)kΦ(x,y). Таким образом, метод расшифровки не зависит от угла α, т.е. от количества и ориентации опорных интерференционных полос. Для устранения наклона, связанного с наблюдением в полосах конечной ширины, из распределения сшитой фазы вычитается линейная функция от переменных x,y, коэффициенты в которой подбираются по методу наименьших квадратов. При решении системы уравнений (6) одновременно вычисляются и амплитудные характеристики A, B изображения микрообъекта 8.The measurement of the amplitude-phase characteristics of the images of the
where A is the background intensity; B - band visibility; k = 0, 1, 2, 3; d is the phase shift between the reference and subject beams,
Ψ (x, y; θ, φ) = Ф (x, y; θ, φ) + xsinα.
For various values of k and, accordingly, the phase shift determined by the value of kd, several interferograms I k are recorded. Physically, this phase shift between the reference and object beams is introduced by the reciprocating movement of the mirror 11 along the optical axis of the reference channel 5. In particular, this mirror 11 can be mounted on a piezoelectric element 12, controlled from a computer. We use a self-calibrating algorithm in which, along with A, B, Ψ, the value of d is also unknown (P. Hariharan, BF Oreb., N. Brown, Opt. Commun., 1982, vol. 41, No. 6, pp. 393 -396). When registering 4 interference patterns, we get the following system of equations:
The solution of this system of equations with respect to Ψ for each point (x, y) can be written in the form:
At the first stage, the phase characteristic of the image of the
Для устранения влияния фазовых искажений, вызванных несовершенством оптических элементов микроскопа, после записи изображений микрообъекта можно зарегистрировать интерференционные картины без микрообъекта для тех же углов зондирования. Вычитая полученные "фазовые" изображения фона из аналогичных изображений микрообъекта, мы достигаем повышения их качества. To eliminate the effect of phase distortion caused by imperfection of the optical elements of the microscope, after recording images of a microobject, interference patterns without a microobject can be recorded for the same sensing angles. Subtracting the obtained "phase" background images from similar images of a micro-object, we achieve an increase in their quality.
Полученные амплитудно-фазовые характеристики изображений микрообъекта 8 под различными углами используются для определения трехмерного пространственного распределения показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта 8 с использованием методов томографии. Например, могут использоваться итерационные методы реконструкции трехмерных томограмм по двумерным проекциям или метод свертки и обратного проецирования. При реконструкции томограмм в ограниченном диапазоне углов важно правильно выбрать угловую траекторию зондирования микрообъекта 8 (зависимость (θ,φ) ) и общее количество проекций. Как показано выше, угловая траектория зондирования определяется траекторией сканирования изображения источника 1 света. В предлагаемом способе сканирование изображения источника света может осуществляться по произвольной двумерной траектории, так как в нем применяется интерференционный метод регистрации изображений прозрачных объектов, который не накладывает никаких ограничений на вид траектории сканирования. Могут быть реализованы траектории в виде прямой, креста, квадрата, спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Как показывают результаты численного моделирования, наиболее оптимальной для томографии с ограниченным углом обзора являются траектории в виде спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Качество восстановленных изображений при таких траекториях выше, чем для траектории в виде окружности. The obtained amplitude-phase characteristics of the images of the micro-object 8 at various angles are used to determine the three-dimensional spatial distribution of the refractive index and / or absorption coefficient of the micro-object 8 using tomography methods. For example, iterative methods for reconstructing three-dimensional tomograms from two-dimensional projections or the convolution and reverse projection methods can be used. When reconstructing tomograms in a limited range of angles, it is important to choose the right angular trajectory of sounding of microobject 8 (dependence (θ, φ)) and the total number of projections. As shown above, the angular sensing path is determined by the scanning path of the image of the light source 1. In the proposed method, scanning the image of the light source can be carried out along an arbitrary two-dimensional path, since it uses the interference method for recording images of transparent objects, which does not impose any restrictions on the type of scan path. Trajectories in the form of a straight line, a cross, a square, a spiral, a set of concentric circles or squares can be implemented. As the results of numerical modeling show, the most optimal for tomography with a limited viewing angle are trajectories in the form of a spiral, a set of concentric circles or squares. The quality of the reconstructed images with such trajectories is higher than for the trajectory in the form of a circle.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99104013A RU2145109C1 (en) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99104013A RU2145109C1 (en) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2145109C1 true RU2145109C1 (en) | 2000-01-27 |
Family
ID=20216516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99104013A RU2145109C1 (en) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2145109C1 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003019163A1 (en) * | 2001-08-28 | 2003-03-06 | Vadim Israilovich Rakhovski | Method for determining the structure of a polyatomic molecule. |
| RU2448339C1 (en) * | 2008-05-08 | 2012-04-20 | Кэнон Кабусики Кайся | Optical coherence tomographic imaging apparatus and optical coherence tomographic imaging method |
| RU2469637C2 (en) * | 2006-12-21 | 2012-12-20 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. | Method for optical imaging interior of turbid medium, method for reconstruction of image of interior of turbid medium, apparatus for imaging interior of turbid medium, medical imaging device and computer program product for use in said methods and devices |
| RU2489091C2 (en) * | 2009-01-23 | 2013-08-10 | Кэнон Кабусики Кайся | Method of visualisation by means of optic tomography and device for visualisation by means of optic tomography |
| RU2524742C2 (en) * | 2011-10-08 | 2014-08-10 | Йенлаб Гмбх | Flexible non-linear laser scanning microscope for non-invasive 3d detection |
| RU2544294C2 (en) * | 2012-01-26 | 2015-03-20 | Кэнон Кабусики Кайся | Optical coherence tomography scanner |
| RU2574791C2 (en) * | 2014-02-25 | 2016-02-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-технологический центр уникального приборостроения (НТЦ УП РАН) | Method of obtaining optical three-dimensional and spectral images of microlenses and device therefor |
| RU2626310C2 (en) * | 2015-09-22 | 2017-07-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НижГМА Минздрава России) | Method of visualizing object areas containing micromotions |
-
1999
- 1999-03-09 RU RU99104013A patent/RU2145109C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| APPLIED OPTICS, 1992, V.31, N 5, P.670 - 674. * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003019163A1 (en) * | 2001-08-28 | 2003-03-06 | Vadim Israilovich Rakhovski | Method for determining the structure of a polyatomic molecule. |
| RU2469637C2 (en) * | 2006-12-21 | 2012-12-20 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. | Method for optical imaging interior of turbid medium, method for reconstruction of image of interior of turbid medium, apparatus for imaging interior of turbid medium, medical imaging device and computer program product for use in said methods and devices |
| RU2448339C1 (en) * | 2008-05-08 | 2012-04-20 | Кэнон Кабусики Кайся | Optical coherence tomographic imaging apparatus and optical coherence tomographic imaging method |
| RU2489091C2 (en) * | 2009-01-23 | 2013-08-10 | Кэнон Кабусики Кайся | Method of visualisation by means of optic tomography and device for visualisation by means of optic tomography |
| US9044165B2 (en) | 2009-01-23 | 2015-06-02 | Canon Kabushiki Kaisha | Optical tomographic imaging method and optical tomographic imaging apparatus |
| RU2524742C2 (en) * | 2011-10-08 | 2014-08-10 | Йенлаб Гмбх | Flexible non-linear laser scanning microscope for non-invasive 3d detection |
| RU2544294C2 (en) * | 2012-01-26 | 2015-03-20 | Кэнон Кабусики Кайся | Optical coherence tomography scanner |
| RU2574791C2 (en) * | 2014-02-25 | 2016-02-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-технологический центр уникального приборостроения (НТЦ УП РАН) | Method of obtaining optical three-dimensional and spectral images of microlenses and device therefor |
| RU2626310C2 (en) * | 2015-09-22 | 2017-07-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НижГМА Минздрава России) | Method of visualizing object areas containing micromotions |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7738945B2 (en) | Method and apparatus for pseudo-projection formation for optical tomography | |
| US7009700B2 (en) | Method and device for obtaining a sample with three-dimensional microscopy | |
| CN106415354B (en) | Microscopie unit and image acquiring method | |
| USRE38307E1 (en) | Method and apparatus for three-dimensional microscopy with enhanced resolution | |
| US7235047B2 (en) | Methods and apparatus for imaging using a light guide bundle and spatial light modulator | |
| US3517980A (en) | Method and arrangement for improving the resolving power and contrast | |
| CN105980810A (en) | Optical tomography apparatus and method | |
| JP2013545997A (en) | Techniques for recording tomographic images | |
| JP2012508366A (en) | Image mapping spectrometer | |
| WO2015178420A1 (en) | Photostimulation device and photostimulation method | |
| Maiden et al. | A new method of high resolution, quantitative phase scanning microscopy | |
| US10012495B2 (en) | Optical telemetry device | |
| Boyde | Confocal optical microscopy | |
| US10018818B2 (en) | Structured standing wave microscope | |
| RU2145109C1 (en) | Method for optical tomography of three- dimensional microscopic objects and microscope which implements said method | |
| Wilson | Trends in confocal microscopy | |
| US8693091B2 (en) | Optical microscope system and method carried out therewith for reconstructing an image of an object | |
| US5835265A (en) | Large numerical aperture imaging device | |
| CA2210801C (en) | Method and apparatus for three-dimensional microscopy with enhanced depth resolution | |
| Vishnyakov et al. | Interferometric-computed microtomography of 3D phase objects | |
| Sung | Introduction to biomedical engineering | |
| JP2022544292A (en) | Sample imaging via two-step brightfield reconstruction | |
| Sheppard | Scanning confocal microscopy | |
| EP0845112B1 (en) | Reflecting microscope device | |
| Conchello et al. | Novel reflected light confocal profilometer |