RU2142638C1

RU2142638C1 - Method for carrying out group analysis of biological fluid samples

Info

Publication number: RU2142638C1
Application number: RU98110240A
Authority: RU
Inventors: В.Т. Ларин; Е.А. Пермяков; А.А. Фрейдин
Original assignee: Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 1999-12-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves setting fluid samples, their programmed heating and cooling in reaction chamber with following samples being electrophoretically separated in gel plates and identified. The fluid samples are spaced over hygroscopic areas of strips having hygroscopic and non-hygroscopic areas following each other in alternating series. After being treated in reaction chamber, the strips are placed on gel plates with their shorter side having the same direction with electric field. Hygroscopic areas are arranged in the gel plate cross-section plane. EFFECT: uniform polymerase chain reaction conditions in all samples. 3 dwg

Description

Предлагаемое техническое решение относится к медицине, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано при проведении, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), т.е. реакции амплификации. The proposed technical solution relates to medicine, biotechnology and genetic engineering and can be used when, for example, polymerase chain reaction (PCR), i.e. amplification reactions.

Известен способ групповых анализов биологических образцов в жидкой форме, патент РФ N 2081700, кл. В 01 L 7/00, бюл. N 17 от 20.06.97 г., включающий локализацию жидких образцов в пробирках, программируемый нагрев и охлаждение образцов в реакционной камере с целью осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР). The known method of group analysis of biological samples in liquid form, RF patent N 2081700, class. B 01 L 7/00, bull. N 17 from 06/20/97, including the localization of liquid samples in test tubes, programmed heating and cooling of samples in the reaction chamber in order to carry out polymerase chain reaction (PCR).

Недостатком известного способа является низкая эффективность теплопередачи через стенки пробирок, что снижает управляемость процессами нагрева и охлаждения биологических образцов, влияющую на стабильность поддержания температуры в каждом цикле проведения процедур нагрева и охлаждения образцов. При этом снижается качество, например, реакции амплификации (ПЦР). Известно, что при амплификации ДНК необходимо стремиться к минимальному времени перехода температуры биообразца от 93-96^oC к температуре 35-37^oC, которая в идеале должна составлять 2-3 сек, но не более 20 сек. При увеличении этого времени цепи ДНК могут ренатурировать, вследствие чего неэффективно пройдет "отжиг" и полимеризация. Существенна стабильность температуры в каждом цикле амплификации. От этого зависит воспроизводимость и специфичность ПЦР (+/- 0,2^oC). Кроме того, низкая управляемость процессами нагрева и охлаждения образцов отрицательно влияет на стабильность времени циклов, которая должна составлять +/- 1сек. От этого зависит гомогенность новосинтезируемой ДНК по длине.The disadvantage of this method is the low efficiency of heat transfer through the walls of the tubes, which reduces the controllability of the processes of heating and cooling of biological samples, affecting the stability of maintaining temperature in each cycle of heating and cooling of samples. This reduces the quality of, for example, amplification reaction (PCR). It is known that during DNA amplification, it is necessary to strive for a minimum transition time of the temperature of the biosample from 93-96 ^o C to a temperature of 35-37 ^o C, which ideally should be 2-3 seconds, but not more than 20 seconds. With an increase in this time, DNA chains can be renatured, as a result of which annealing and polymerization are ineffective. Significant temperature stability in each amplification cycle. The reproducibility and specificity of PCR (+/- 0.2 ^o C) depends on this. In addition, the low controllability of the heating and cooling of the samples negatively affects the stability of the cycle time, which should be +/- 1 sec. The homogeneity of the newly synthesized DNA in length depends on this.

Наиболее близким способом (прототипом) является способ проведения групповых анализов биологических образцов в жидкой форме, включающий локализацию жидких образцов, программируемый нагрев и охлаждение образцов в реакционной камере, последующее электрофоретическое разделение и идентификацию (S.Hummel et all "Improves Short Tandem Repeat Amplifications of Higly Degraded DNA" в журн. "Amplifications, The PCR Newsletter from PE Applied Byosistems Issue 14, 1996, vol. 1, p. 5-6) при проведении полимеразной цепной реакции. The closest method (prototype) is a method for conducting group analyzes of biological samples in liquid form, including localization of liquid samples, programmed heating and cooling of samples in the reaction chamber, subsequent electrophoretic separation and identification (S. Hummel et all "Improves Short Tandem Repeat Amplifications of Higly Degraded DNA "in Journal" Amplifications, The PCR Newsletter from PE Applied Byosistems Issue 14, 1996, vol. 1, p. 5-6) during the polymerase chain reaction.

Недостатком способа проведения групповых анализов биологических образцов в жидкой форме (прототипа) является низкая эффективность и неравномерность теплопередачи через стенки пробирок, установленных в гнездах термоциклера, что приводит к неодинаковому температурному воздействию на биообразцы. В этой связи снижается управляемость процессами нагрева и охлаждения образцов, что в свою очередь отрицательно влияет на стабильность поддержания температуры в каждом цикле амплификации и увеличивает время перехода (особенно при охлаждении) образца от одной температуры к другой. От этого снижается воспроизводимость и специфичность ПЦР. Недостатком способа-прототипа является также сложность переноса образцов из пробирок на пластину геля, для чего требуется применение специальных устройств. The disadvantage of the method of conducting group analyzes of biological samples in liquid form (prototype) is the low efficiency and uneven heat transfer through the walls of the tubes installed in the sockets of the thermal cycler, which leads to unequal temperature effects on the biological samples. In this regard, the controllability of the heating and cooling of the samples decreases, which in turn adversely affects the stability of maintaining the temperature in each amplification cycle and increases the transition time (especially when cooling) of the sample from one temperature to another. This reduces the reproducibility and specificity of PCR. The disadvantage of the prototype method is the difficulty of transferring samples from test tubes to the gel plate, which requires the use of special devices.

В основу предлагаемого изобретения поставлена задача создания такого способа проведения групповых анализов биологических образцов в жидкой форме, который обеспечил бы повышение однородности условий прохождения реакции во всех образцах, уменьшил время перехода образцов от одной температуры к другой с одновременным упрощением процедуры переноса образцов из реакционной камеры на пластину геля. The basis of the present invention is the task of creating such a method of group analysis of biological samples in liquid form, which would provide an increase in the uniformity of the reaction conditions in all samples, reduce the transition time of samples from one temperature to another while simplifying the procedure for transferring samples from the reaction chamber to the plate gel.

Поставленная задача решается тем, что в способе проведения групповых анализов биологических образцов в жидкой форме, включающем локализацию жидких образцов, программируемый нагрев и охлаждение образцов в реакционной камере, последующее электрофоретическое разделение в пластинах геля и идентификацию, согласно изобретению, локализацию жидких образцов проводят на гигроскопичных участках полосок с чередующимися гигроскопичными и негигроскопичными участками, полоски после обработки в реакционной камере помещают на пластины геля короткой стороной вдоль направления электрического поля, причем гигроскопичные участки располагают в плоскости сечения пластины геля. The problem is solved in that in the method of conducting group analyzes of biological samples in liquid form, including localization of liquid samples, programmed heating and cooling of samples in the reaction chamber, subsequent electrophoretic separation in gel plates and identification, according to the invention, the localization of liquid samples is carried out in hygroscopic areas strips with alternating hygroscopic and non-hygroscopic sections, the strips after processing in the reaction chamber are placed on the gel plates side along the direction of the electric field, and the hygroscopic sections are located in the plane of the cross section of the gel plate.

На фиг. 1 изображена полоска с чередующимися гигроскопичными и негигроскопичными участками. In FIG. 1 shows a strip with alternating hygroscopic and non-hygroscopic sections.

На фиг. 2 изображена реакционная камера термоциклера. In FIG. 2 shows the reaction chamber of a thermal cycler.

На фиг. 3 изображена электрофоретическая камера с вертикальной пластиной геля. In FIG. 3 shows an electrophoretic chamber with a vertical gel plate.

Полоска, изображенная на фиг. 1, выполнена из тонкого негигроскопичного 1 пластика, к которому приклеены кусочки крупнопористой гигроскопичной 2 фильтровальной бумаги. Она может быть заранее пропитана реагентами и высушена с целью длительного хранения. Для проведения реакции могут быть одновременно использованы несколько таких полосок. Перед проведением реакции сухие фильтры с реагентами смачиваются растворителем, содержащим исследуемый образец. В случае "незаряженных" полосок все компоненты наносятся на фильтры непосредственно перед реакцией. The strip depicted in FIG. 1 is made of thin non-hygroscopic 1 plastic, to which pieces of coarse-absorbent hygroscopic 2 filter paper are glued. It can be pre-saturated with reagents and dried for long-term storage. For carrying out the reaction, several such strips can be used simultaneously. Before carrying out the reaction, dry filters with reagents are wetted with a solvent containing the test sample. In the case of "uncharged" strips, all components are applied to the filters immediately before the reaction.

Реакционная камера термоциклера, изображенная на фиг. 2, снабжена держателем 3, металлическими пластинами с термоэлементами 4, осуществляющими нагревание и охлаждение полосок, при этом полоски со стороны, противоположной подложке, закрепляются тонкой пленкой 5. The thermal cycler reaction chamber shown in FIG. 2, is equipped with a holder 3, metal plates with thermocouples 4, which carry out heating and cooling of the strips, while the strips from the side opposite to the substrate are fixed with a thin film 5.

В электрофоретической камере 6 с горизонтальной пластиной 7 геля, имеющей прямоугольные углубления, размещается полоска 1 у края пластины 7, короткой стороной вдоль направления электрического поля, пластиковой подложкой вверх, при этом фильтры с образцами размещаются в прямоугольных углублениях, выполненных в пластине геля. In the electrophoretic chamber 6 with a horizontal gel plate 7 having rectangular recesses, a strip 1 is placed at the edge of the plate 7, with the short side along the direction of the electric field, with the plastic substrate facing upward, while filters with samples are placed in rectangular recesses made in the gel plate.

Благодаря тому, что реакция амплификации (ПЦР) проходит в тонком слое, теплообмен между жидкими образцами и тепловыми элементами происходит с высокой эффективностью, при этом благодаря тому, что все образцы размещаются в одной плоскости между тепловыми элементами, во всех образцах обеспечивается одинаковый температурный режим. После завершения реакции полоска с образцами легко переносится на пластину геля с целью электрофоретического разделения образца и последующей идентификации. Due to the fact that the amplification reaction (PCR) takes place in a thin layer, heat transfer between liquid samples and thermal elements occurs with high efficiency, while due to the fact that all samples are placed in the same plane between the thermal elements, the same temperature regime is ensured in all samples. After completion of the reaction, the strip with the samples is easily transferred to the gel plate for the purpose of electrophoretic separation of the sample and subsequent identification.

Таким образом, предлагаемый способ проведения групповых анализов биологических образцов в жидкой форме обеспечивает повышение однородности условий прохождения реакции во всех образцах, уменьшает время перехода образцов от одной температуры к другой и упрощает процедуру переноса образцов из реакционной камеры на пластину геля. Thus, the proposed method for conducting group analyzes of biological samples in liquid form provides an increase in the uniformity of the reaction conditions in all samples, reduces the transition time of samples from one temperature to another and simplifies the procedure for transferring samples from the reaction chamber to the gel plate.

Claims

A method for conducting group analyzes of biological samples in liquid form, including localization of liquid samples, programmed heating and cooling of samples in the reaction chamber, subsequent electrophoretic separation in gel plates and identification, characterized in that the localization of liquid samples is carried out on hygroscopic sections of strips with alternating hygroscopic and non-hygroscopic sections, the strips after processing in the reaction chamber are placed on the gel plates with the short side along the direction of the electric field, and hygroscopic areas are located in the plane of the cross section of the gel plate.