RU2141196C1 - Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability - Google Patents
Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability Download PDFInfo
- Publication number
- RU2141196C1 RU2141196C1 RU96113409A RU96113409A RU2141196C1 RU 2141196 C1 RU2141196 C1 RU 2141196C1 RU 96113409 A RU96113409 A RU 96113409A RU 96113409 A RU96113409 A RU 96113409A RU 2141196 C1 RU2141196 C1 RU 2141196C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plants
- phytosterol
- dependent
- resistant
- pests
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области сельского хозяйства и экологии, в частности, к растениеводству и охране окружающей среды и может быть использовано при производстве экологически чистых растений, подавляющих численность вредителей сельского хозяйства, зависящих в своем развитии от стеринов растений, например, фитофторы, насекомых и нематод. The invention relates to the field of agriculture and ecology, in particular, to crop production and environmental protection and can be used in the production of environmentally friendly plants that suppress the number of agricultural pests, which depend on plant sterols, for example, phytophthora, insects and nematodes.
Известен способ получения устойчивых к вредителям сельского хозяйства растений (1), основанный на методах генной инженерии, где в растения встраивают чужеродный ген, например ген Bt, который контролирует синтез белка-токсина, уничтожающего личинки насекомых или ген, контролирующий синтез защитных белков, что позволяет получать устойчивые трансгенные растения. К недостаткам этого метода относится то, что при встраивании в растения чужеродного гена изменяется экспрессия собственных генов растения, что приводит к нарушению свойств растения, в том числе и тех, которые связаны с урожайностью. Кроме того, введенный ген очень часто утрачивает свои свойства, перестает экспрессироваться, что сводит на нет физические и экономические затраты, связанные с получением трансгенных растений. A known method for producing pests resistant to agricultural plants (1), based on genetic engineering methods, where a foreign gene is inserted into plants, for example, the Bt gene, which controls the synthesis of a protein toxin that destroys insect larvae or a gene that controls the synthesis of protective proteins, which allows receive resistant transgenic plants. The disadvantages of this method include the fact that when a foreign gene is inserted into plants, the expression of the plant’s own genes changes, which leads to a violation of the plant’s properties, including those related to yield. In addition, the introduced gene very often loses its properties, ceases to be expressed, which negates the physical and economic costs associated with obtaining transgenic plants.
Известен также способ получения устойчивых к вредителям сельского хозяйства растений, основанный на явлении сомаклональной изменчивости (2), когда проводят скрининг на устойчивость среди множества растений-регенерантов, полученных из клеточных или тканевых культур. Такой подход позволяет значительно сократить время селекции. К недостаткам этого метода относится то, что отбор проводят не направленно, без специально подобранных селективных условий, и поэтому вероятность отбора растений, устойчивых к вредителям очень низкая и требует анализа большого числа растений-регенерантов. Кроме того, отбирают растения устойчивые только к определенному патогену, а не к целой группе вредителей сельского хозяйства. There is also a known method for producing pest resistant plants, based on the phenomenon of somaclonal variation (2), when resistance is screened among many regenerated plants obtained from cell or tissue cultures. This approach can significantly reduce the selection time. The disadvantages of this method include the fact that the selection is not directed, without specially selected selective conditions, and therefore the probability of selection of plants resistant to pests is very low and requires analysis of a large number of regenerated plants. In addition, plants that are resistant only to a specific pathogen, and not to a whole group of agricultural pests, are selected.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа (3), является способ, основанный на клеточной селекции, когда отбор устойчивых к насекомым растений осуществляется на фоне селективного агента, дающего возможность отбирать растения, у которых изменен спектр фитостеринов, необходимых насекомым для прохождения полного цикла развития. В качестве селективного агента используют полиеновый антибиотик нистатин, который является неспецифическим селективным агентом, на его фоне можно отбирать любые изменения, связанные с проницаемостью клеточной мембраны, в том числе возможен отбор клеток, а затем растений-регенерантов с измененным спектром фитостеринов, в силу чего такие растения не могут являться полноценным кормом для насекомых, что и приводит к снижению их численности. Недостатком этого способа является то, что применяемый селективный агент характеризуется широким спектром действия, что снижает, а иногда и сводит к нулю вероятность получения растений с направленно-измененным составом стеринов и нормальной морфологией. Кроме того, использование ультрафиолетового излучения, как мутагена, и отбор растений-регенерантов из устойчивых к селективному агенту клеточных культур на фоне нистатина, приводит к появлению очень большого числа аномальных растений, которые не пригодны для их использования в сельском хозяйстве. The closest analogue, selected as a prototype (3), is a method based on cell selection, when the selection of insect-resistant plants is carried out against the background of a selective agent, which makes it possible to select plants from which the spectrum of phytosterols necessary for insects to undergo a full development cycle is changed . The polyene antibiotic nystatin, which is a non-specific selective agent, is used as a selective agent; against its background, any changes related to the permeability of the cell membrane can be selected, including the selection of cells, and then regenerated plants with a modified spectrum of phytosterols, due to which such Plants cannot be a complete food for insects, which leads to a decrease in their numbers. The disadvantage of this method is that the selective agent used is characterized by a wide spectrum of action, which reduces and sometimes reduces to zero the probability of obtaining plants with a directionally changed composition of sterols and normal morphology. In addition, the use of ultraviolet radiation as a mutagen, and the selection of regenerated plants from selective agent-resistant cell cultures against the background of nystatin, leads to the appearance of a very large number of abnormal plants that are not suitable for their use in agriculture.
Задачей, решаемой данным изобретением является создание способа получения высших растений с комплексной устойчивостью ко всей группе фитостеринзависимых вредителей сельского хозяйства. Этот способ позволяет на основе специально подобранных селективных агентов и без использования мутагена, отбирать только те растения, у которых направленно изменен состав фитостеринов и не изменены признаки, влияющие на продуктивность растений. Такие растения характеризуются не только комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, но являются и экологически чистыми, так как при их выращивании не требуется использования ядохимикатов (пестицидов). К фитостеринзависимым вредителям относятся многие виды насекомых (например, колорадский жук), патогенные грибы (например, фитофтора) и нематоды, то есть большая разнородная группа вредителей, требующая для своего уничтожения разнообразных пестицидов, которые наносят огромный вред окружающей среде, являясь высокотоксичными для всех млекопитающих, в том числе и для человеке, а кроме того, их производство является трудоемким и дорогостоящим. Данное изобретение, основанное на клеточной селекции, позволяет не только получать растения с комплексной устойчивостью ко всем перечисленным вредителям и не требует внесения дорогих ядохимикатов, но также позволяет значительно сократить время селекции (до одного года), в отличие от общепринятой традиционной селекции, которая занимает от 5 до 8 лет, а также позволяет получать сразу необходимое число растений для воспроизводства посадочного материала. The problem solved by this invention is the creation of a method of obtaining higher plants with integrated resistance to the entire group of phytosterol-dependent pests of agriculture. This method allows, on the basis of specially selected selective agents and without the use of a mutagen, to select only those plants in which the composition of phytosterols is directionally changed and the characteristics affecting plant productivity are not changed. Such plants are characterized not only by complex resistance to phytosterol-dependent pests, but are also environmentally friendly, since their cultivation does not require the use of toxic chemicals (pesticides). Phytosterol-dependent pests include many types of insects (for example, Colorado potato beetle), pathogenic fungi (for example, late blight) and nematodes, that is, a large heterogeneous group of pests that require a variety of pesticides for their destruction, which cause great harm to the environment, being highly toxic to all mammals , including for man, and in addition, their production is time-consuming and expensive. This invention, based on cell selection, allows not only to obtain plants with complex resistance to all of the listed pests and does not require the introduction of expensive pesticides, but also can significantly reduce the selection time (up to one year), in contrast to the generally accepted traditional selection, which takes from 5 to 8 years, and also allows you to immediately get the required number of plants for the reproduction of planting material.
Этот результат достигается тем, что получение растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, основанное на клеточной селекции и отличающееся тем, что селекцию проводят на уровне микрокаллусов, получаемых из протопластов известным методом (4), которые выращивают на первичной питательной среде, содержащей агар, макро и микросоли, сахарозу, добавки фитогормонов ауксина и цитокинина при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток до формирования микрокаллуса, после чего микрокаллусы помещают в питательную среду с агентом, селектирующим клетки с измененным составом фитостеринов и подавляющим рост клеток дикого типа и культивируют устойчивые микрокаллусы до образования каллусов, затем каллусы помещают на вторичную питательную среду с составом, сходным с первичной средой с добавкой фитогормонов цитокинина, ауксина и гиббереллина при отсутствии селективного агента при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток и получают растения- регенеранты, определяя у них состав фитостеринов, затем из выращенных растений-регенерантов отбирают экземпляры, у которых по сравнению с диким типом изменен состав фитостеринов, после чего на отобранные растения-регенеранты наносят суспензию, содержащую смесь агрессивных штаммов фитостеринзависимых грибов и отбирают не пораженные грибом экземпляры растений, устойчивые к фитостеринзависимым грибам, после чего полученные растения, устойчивые к фитостеринзависимым грибам используют в качестве единственного источника стеринов в диете фитостеринзависимых насекомых и контролируют плодовитость и репродуктивную систему этих насекомых, затем окончательно отбирают экземпляры растений, которые одновременно устойчивы к грибам и подавляют плодовитость и репродуктивную систему насекомых, формируя из них экземпляры растения с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям. This result is achieved in that the production of plants with complex resistance to phytosterol-dependent pests, based on cell selection and characterized in that the selection is carried out at the level of microcalli obtained from protoplasts by the known method (4), which are grown on a primary nutrient medium containing agar, macro and microsols, sucrose, additives of phytohormones auxin and cytokinin at a temperature and daylight length corresponding to active cell division before the formation of microcallus, followed by microcalli placed in a nutrient medium with an agent that selects cells with a modified composition of phytosterols and inhibits the growth of wild-type cells and cultivates stable microcalli to form calluses, then calli are placed on a secondary nutrient medium with a composition similar to the primary medium with the addition of phytohormones cytokinin, auxin and gibberellin the absence of a selective agent at a temperature and length of daylight corresponding to active cell division and receive regenerant plants, determining their phytosterol composition, s from those grown regenerated plants, instances are selected for which the composition of phytosterols is changed in comparison with the wild type, after which a suspension containing a mixture of aggressive strains of phytosterol-dependent fungi is applied to selected regenerated plants and plant specimens that are resistant to phytosterol-dependent fungi are not affected by the fungus, after why the resulting plants resistant to phytosterol-dependent fungi are used as the only source of sterols in the diet of phytosterol-dependent insects and control the area Hovit and reproductive system of these insects, then a final selection of plant specimens that are both resistant to fungi and inhibit fertility and reproductive system of insects, creating copies of them plants with complex resistance to pests fitosterinzavisimym.
В частных конкретных случаях реализацию способа осуществляют получением растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, при котором протопласты выращивают при температуре окружающей среды в пределах от 20 до 28oC на свету, при длине светового дня не менее 10 часов в течение времени, необходимого для достижения размера микрокаллуса, содержащего не более 80-100 клеток, с последующим их культивированием на среде с селективным агентом в виде полиенового антибиотика филипина или ингибитора биосинтеза стеринов, например, байтана в течение времени, необходимого для селекции устойчивых к селективному агенту микрокаллусов при температуре окружающей среды в пределах от 20 до 28oC на свету, при длине светового дня не менее 10 часов, причем суспензию наносят на полученные из устойчивого каллуса растения-регенеранты в виде смеси, содержащей набор агрессивных штаммов фитофторы, а стеринсодержащая диета из этих растений используется для дрозофилы.In particular specific cases, the implementation of the method is carried out by obtaining plants with complex resistance to phytosterol-dependent pests, in which protoplasts are grown at ambient temperature in the range from 20 to 28 o C in the light, with a daylight length of at least 10 hours for the time required to achieve the size of a microcallus containing no more than 80-100 cells, followed by their cultivation on a medium with a selective agent in the form of a polyene antibiotic filipin or an sterol biosynthesis inhibitor, for example, b aitana for the time necessary for the selection of microcalli resistant to a selective agent at ambient temperatures ranging from 20 to 28 o C in the light, with a daylight duration of at least 10 hours, and the suspension is applied to regenerated plants obtained from stable callus in the form a mixture containing a set of aggressive phytophthora strains, and a sterol-containing diet from these plants is used for Drosophila.
Примеры конкретного выполнения
Растительный материал. Использовали сорта и различные формы картофеля Solanum tuberosum L.: сорта, растения-регенеранты сорта Невский (НСР), сорта Пушкинец (П-1, П-2), дигаплоид ДГ 30 (сорт Кози-ма) и дикий вид Solanum nigrum L., а также сорта томатов Утро, Таллалихин, Алпатьева, Бизон.Case Studies
Plant material. Varieties and various forms of potato Solanum tuberosum L. were used: varieties, regenerated plants of the Nevsky variety (NDS), Pushkinets (P-1, P-2), digaploid DG 30 (Kozi-ma variety) and wild species Solanum nigrum L. , as well as varieties of tomatoes Morning, Tallalikhin, Alpatieva, Bison.
Методы исследований. Получение микрокаллусов, каллусов и растений-регенерантов. Протопласты получали и культивировали до стадии формирования небольших агрегатов по стандартной методике (4). Видимые невооруженным взглядом агрегаты переносили на среду Мурасиге и Скуга (МС) с ауксином и цитокинином и культивировали при температуре 24-28oC на свету до размера микрокаллуса, содержащего 80-100 клеток. Для получения каллусных культур использовали микрокаллусы, размером не более 100 клеток, которые помещали на среду МС с ауксином и цитокинином и культивировали применительно к этим формам при температуре 24-28oC более 10 дней. Для индукции побегообразования и получения растений-регенерантов каллусы помещали на среду с ауксином, цитокинином, а для картофеля и с гиббереллином. Чашки помещали под светоустановку с лампами дневного света при фотопериоде 16 ч/сут и температуре 26oC.Research Methods. Obtaining microcalli, calli and regenerated plants. Protoplasts were obtained and cultured to the stage of formation of small aggregates according to the standard method (4). Aggregates visible to the naked eye were transferred onto Murashige and Skoog medium (MS) with auxin and cytokinin and cultured at a temperature of 24-28 o C in the light to the size of microcallus containing 80-100 cells. To obtain callus cultures, microcalli were used, with a size of not more than 100 cells, which were placed on MS medium with auxin and cytokinin and cultured for these forms at a temperature of 24-28 o C for more than 10 days. To induce shoot formation and obtain regenerated plants, calli were placed on medium with auxin, cytokinin, and for potatoes with gibberellin. The cups were placed under a light installation with fluorescent lamps at a photoperiod of 16 hours / day and a temperature of 26 o C.
Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану и филипину. В ходе осуществления способа необходим выбор сублетальной концентрации селективного агента, ингибирующей рост клеточных культур. Использовали такие селективные агенты, как филипин и ингибитор биосинтеза стеринов - байтан. Испытывали серию концентраций селективных агентов, которые значительно влияли на жизнеспособность растительных тканей. Для селекции на фоне селективного агента использовали формы с интенсивной регенерацией и сублетальные концентрации байтана и филипина. Устойчивые к селективным агентам клеточные культуры переносили на среду для регенерации без селективного агента для индукции побегообразования. Регенерирующие побеги были повторно перенесены на среду с байтаном. Подросшие устойчивые побеги укореняли и каждая форма поддерживалась индивидуально. Obtaining regenerated plants resistant to baytan and philipine. During the implementation of the method, it is necessary to select a sublethal concentration of a selective agent that inhibits the growth of cell cultures. Used selective agents such as philipine and a sterol biosynthesis inhibitor, Baytan. A series of concentrations of selective agents was tested, which significantly affected the viability of plant tissues. For selection against the background of a selective agent, forms with intensive regeneration and sublethal concentrations of baytan and philipine were used. Selective agent-resistant cell cultures were transferred to a regeneration medium without a selective shoot inducing agent. Regenerating shoots were re-transferred to the medium with baytan. Growing steady shoots were rooted and each form was maintained individually.
Анализ фитостеринов. Лиофилизированные ткани растений гомогенизировали с помощью ультрагомогенизатора в растворе метилен-хлорид-метанол. Тотальную фракцию липидов выделяли тремя последовательными экстракциями тем же растворителем. Все липидные производные сапонифицировали раствором щелочи в метаноле. Фракцию свободных стеринов экстрагировали гексаном и очищали фильтрованием через сульфат натрия. Производные стеринов анализировали методом ГЖХ на хроматографе. Различные формы стеринов идентифицировали методом масс-спектрометрического анализа. Analysis of phytosterols. Lyophilized plant tissues were homogenized using an ultrahomogenizer in a methylene chloride-methanol solution. The total lipid fraction was isolated by three successive extractions with the same solvent. All lipid derivatives were saponified with a solution of alkali in methanol. The free sterol fraction was extracted with hexane and purified by filtration through sodium sulfate. Derivatives of sterols were analyzed by GLC on a chromatograph. Various forms of sterols were identified by mass spectrometric analysis.
Оценка устойчивости растений картофеля к Phytophtora infestans. Для оценки устойчивости растений к фитофторозу in vitro использовалась раса Phytophtora infestans с 14 генами вирулентности - 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.X. Y. Z, выделенная из Сахалинской популяции гриба. Для повышения агрессивности культуру пассировали на пробирочных растениях восприимчивого сорта. Assessment of resistance of potato plants to Phytophtora infestans. To assess the resistance of plants to late blight in vitro, we used the Phytophtora infestans race with 14 virulence genes - 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.X. Y. Z isolated from the Sakhalin population of the fungus. To increase aggressiveness, the culture was passaged on test plants of a susceptible variety.
Пример 1. Получение растений-регенерантов картофеля, устойчивых к байтану
Получение растений-регенерантов с измененным составом стеринов из устойчивых к селективному агенту каллусов осуществляли следующим образом.Example 1. Obtaining potato regenerant plants resistant to baytan
Obtaining regenerated plants with a modified composition of sterols from resistant to selective agent calli was carried out as follows.
Предварительно подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов картофеля. Установлено, что помимо фитотоксического эффекта байтан обладает свойством подавлять процессы роста тканей и регенерации. В контроле регенерацию наблюдали уже через месяц (табл.1). На среде с байтаном выживало незначительное количество каллусов, у которых на этой среде регенерация была подавлена полностью. Поэтому для получения регенерантов переносили устойчивые каллусы на среду для регенерации с повышенной концентрацией гиббереллина и не содержащей байтана, что позволило получить растения-регенеранты. Их устойчивость была подтверждена при повторном переносе регенерирующего каллуса на среду с байтаном - образовавшиеся в неселективных условиях побеги продолжали расти. На стандартной среде МС для черенкования побеги укореняли. Морфологически большинство растений-регенерантов не отличалось от контрольных растений. The sublethal concentration of baytan for potato microcalli was preliminarily selected. It has been established that in addition to the phytotoxic effect, baytan has the property of inhibiting tissue growth and regeneration. In the control, regeneration was observed already after a month (Table 1). An insignificant number of calli survived on the medium with baytan, in which regeneration was completely suppressed on this medium. Therefore, to obtain regenerants, stable calli were transferred onto a regeneration medium with an increased concentration of gibberellin and not containing baytan, which allowed us to obtain regenerant plants. Their stability was confirmed by repeated transfer of the regenerating callus to the medium with baytan - the shoots formed under non-selective conditions continued to grow. On a standard MS medium for propagating cuttings, shoots were rooted. Morphologically, most regenerated plants did not differ from control plants.
Таким образом, на среде с сублетальной концентрацией байтана получено 50 растений, которые в дальнейшем были проанализированы на устойчивость к фитофторе и фитостеринзависимым насекомым. Thus, in a medium with sublethal concentration of baytan, 50 plants were obtained, which were further analyzed for resistance to late blight and phytosterol-dependent insects.
Пример 2. Получение растений-регенерантов, устойчивых к филипину
По той же схеме регенерации из устойчивых к филипину каллусов получали растения-регенеранты картофеля. Филипин является одним из самых цитотоксичных полиеновых антибиотиков и связывается с мембранными стеринами, что приводит к деформации и разрушению мембраны и гибели клетки. Поэтому ткани и клетки, устойчивые к нему, должны иметь в мембранах другие стерины, с которыми филипин не взаимодействует и обладать измененным биосинтезом стеринов.Example 2. Obtaining regenerated plants resistant to philipine
According to the same regeneration scheme, potato regenerant plants were obtained from philipine-resistant calli. Filipin is one of the most cytotoxic polyene antibiotics and binds to membrane sterols, which leads to deformation and destruction of the membrane and cell death. Therefore, tissues and cells resistant to it must have other sterols in the membranes with which the philipine does not interact and have an altered sterol biosynthesis.
На среде с филипином выживало только 36,2% каллусов при 100% и 80% в контролях KI и KI+ДМСО (табл. 2). Филипин также практически полностью подавляет процесс регенерации по сравнению с контролем. Поэтому для получения регенерантов, устойчивые экспланты переносили на среду без селективного агента. Сроки регенерации во всех вариантах остались неизменными - более одного месяца. Также не было отмечено морфологических отличий устойчивых регенерантов от контрольных растений-регенерантов. Only 36.2% of calli survived on the medium with philipine, with 100% and 80% in the controls KI and KI + DMSO (Table 2). Filipin also almost completely suppresses the regeneration process compared to control. Therefore, to obtain regenerants, stable explants were transferred onto a medium without a selective agent. Regeneration terms in all cases remained unchanged - more than one month. There were also no morphological differences between resistant regenerants and control regenerated plants.
Регенерировавшие побеги были высажены на стандартную среду для черенкования. Растения были проверены на устойчивость к фитофторе, а также в модельной системе "растение-дрозофила". Regenerated shoots were planted on a standard medium for cuttings. Plants were tested for resistance to late blight, as well as in the model plant-Drosophila system.
Пример 3. Оценка устойчивости к фитофторе in vitro растений-регенерантов картофеля
Известно, что Phytophtora infestans зависит в своем развитии от растительных стеринов, в частности, от β ситостерина. Поэтому один из возможных способов создания растений, устойчивых к фитофторе, - изменение состава стеринов в растении.Example 3. Assessment of resistance to late blight in vitro potato regenerant plants
It is known that Phytophtora infestans in its development depends on plant sterols, in particular, β sitosterol. Therefore, one of the possible ways to create plants resistant to late blight is to change the composition of sterols in the plant.
Устойчивость растения к фитофторе определяли по двум признакам - процент некротических зон, развившихся на растении при заражении и процент спороношения гриба. При полевой, оценке главным показателем восприимчивости является спороношение, в условиях in vitro оба показателя равны по значимости. Согласно разработанной балльной шкале максимально устойчивое растение имеет 0 баллов по обоим признакам, а максимально восприимчивое - 4 балла. Plant resistance to late blight was determined by two signs: the percentage of necrotic zones that developed on the plant during infection and the percentage of spore growth of the fungus. In field, assessment, the main indicator of susceptibility is sporulation, in vitro, both indicators are equal in importance. According to the developed point scale, the most stable plant has 0 points for both characteristics, and the most susceptible plant has 4 points.
Прежде всего, исходная форма картофеля П-1 оказалась максимально восприимчивой (балл 4). Спороношение отмечалось по всей поверхности растения, которое быстро гибло в результате системного некроза (табл. 3). Все контрольные растения-регенеранты оказались менее чувствительны к патогену по сравнению с исходной формой. First of all, the initial form of P-1 potatoes turned out to be maximally susceptible (score 4). Sporulation was observed over the entire surface of the plant, which quickly died as a result of systemic necrosis (Table 3). All control regenerated plants turned out to be less sensitive to the pathogen compared to the initial form.
Растения, устойчивые к байтану и филипину (опыт), закономерно характеризовались более высокой устойчивостью к фитофторозу, чем в обоих контролях. Колебания по признаку спороношения в этой группе составили 0-2 балла (в среднем 1 балл), по признаку развития некрозов 1-2 балла (в среднем 1,5 балла). Кроме того, были растения, например образец Rf18, полностью устойчивые к фитофторе. На этих растениях отмечались только редкие и мелкие некротические зоны (0-1 балл), а процент спороношения был подавлен полностью (0 баллов). Возникшая устойчивость связана с измененным составом стеринов (табл. 4). Plants resistant to baytan and philipine (experience) were naturally characterized by higher resistance to late blight, than in both controls. Fluctuations on the basis of sporulation in this group amounted to 0-2 points (on average 1 point), on the basis of the development of necrosis 1-2 points (on average 1.5 points). In addition, there were plants, for example, an Rf18 sample, completely resistant to late blight. On these plants, only rare and small necrotic zones were noted (0-1 point), and the percentage of sporulation was completely suppressed (0 points). The resulting resistance is associated with an altered sterol composition (Table 4).
Пример 4. Оценка растений-регенерантов, устойчивых к филипину или байтану, в модельной системе "растение-дрозофила"
Модельная система "растение-дрозофила" позволяет выявить различия между разными генетическими формами растений по устойчивости к насекомым. Оценивали показатель, который определяет процессы кладки яиц, линьки и метаморфоза личинок мух, зависящие от наличия в корме стеринов. Контрольные растения как единственный источник корма, в том числе и стеринов, способны в достаточной мере удовлетворять эту потребность (табл. 5).Example 4. Evaluation of regenerated plants resistant to philipine or baytan in the Drosophila plant model system
The model plant-Drosophila system makes it possible to identify differences between different genetic forms of plants in terms of insect resistance. An indicator was evaluated that determines the processes of egg laying, molting and metamorphosis of larvae of flies, depending on the presence of sterols in the feed. Control plants as the only source of food, including sterols, are able to sufficiently satisfy this need (Table 5).
Анализ плодовитости мух (линия Canton-C) на контрольных растениях, полученных в двух вариантах контроля (KI и KI+ДМСО), показал, что эти варианты достоверно не различаются между собой, и имеют практически одинаковый средний показатель плодовитости (46,8±6,9 и 43,3±5,5). Растения-регенеранты, устойчивые к филипину, а также устойчивые к фитофторе, достоверно снижали плодовитость мух (13,3±3,7 и 11,3±1,2) по сравнению с контрольными. An analysis of the fecundity of flies (Canton-C line) on control plants obtained in two control variants (KI and KI + DMSO) showed that these variants do not reliably differ from each other and have almost the same average fertility rate (46.8 ± 6 , 9 and 43.3 ± 5.5). Regenerant plants resistant to filipin, as well as resistant to late blight, significantly reduced the fecundity of flies (13.3 ± 3.7 and 11.3 ± 1.2) compared to the control.
Таким образом, хотя растения картофеля - непривычный корм для личинок дрозофилы, что видно из сравнения растительных и дрожжевых контролей (104±23,5), тем не менее система с дрозофилой применима для выявления форм растений с интересующим нас признаком. Итак, нами получены клеточные линии (например, ПIRf18), растения-регенеранты которой устойчивы к фитофторе и снижают плодовитость дрозофилы. Thus, although potato plants are an unusual food for Drosophila larvae, as can be seen from a comparison of plant and yeast controls (104 ± 23.5), nevertheless, the Drosophila system is applicable for identifying plant forms with the trait of interest to us. So, we obtained cell lines (for example, PIRf18), the regenerant plants of which are resistant to late blight and reduce the fertility of Drosophila.
Учитывая то, что эти формы устойчивы к фитофторе и к насекомым, их можно отнести к растениям, обладающим комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям сельского хозяйства. Given the fact that these forms are resistant to late blight and insects, they can be attributed to plants that have complex resistance to phytosterol-dependent pests of agriculture.
Предлагаемый способ позволяет в течение года получить целую серию растений, обладающих устойчивостью к патогенам, а не в течение 5-8 лет, необходимых в традиционной селекции. Предлагаемый способ может быть предназначен для использования для многих сельскохозяйственных культур, вредителями которых являются фитостеринзависимые патогены. The proposed method allows for a year to get a whole series of plants that are resistant to pathogens, and not within 5-8 years required in traditional breeding. The proposed method can be intended for use in many crops, the pests of which are phytosterol-dependent pathogens.
Пример 5. Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану (сорт Таллалихин)
Предварительно подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов томатов. Байтан растворяли в ДМСО, поэтому в качестве еще одного контроля использовали питательную среду, в которую добавляли 1 мг/л ДМСО. Клеточная культура томатов оказалась менее чувствительной к байтану, поэтому концентрация байтана была значительно увеличена. Использовали концентрации байтана от 300 до 600 мг/л. Показано, что байтан в зависимости от концентрации подавляет не только рост микрокаллусов, но и регенерацию растений из эмбриогенных каллусов (табл.6). Концентрация байтана 600 мг/л была выбрана как сублетальная. Из устойчивых микрокаллусов были получены органогенные каллусы с последующей регенерацией из них растений. На стандартной среде МС для черенкования побеги укореняли и затем переносили в почву. Большинство растений-регенерантов не отличались от контрольных по морфологии. Полученные растения-регенеранты были проанализированы на устойчивость к фитофторе.Example 5. Obtaining regenerated plants resistant to baytan (grade Tallalihin)
The sublethal concentration of baytan for tomato microcallus was preliminarily selected. Baytan was dissolved in DMSO; therefore, culture medium was used as another control, to which 1 mg / L DMSO was added. The cell culture of tomatoes was less sensitive to baytan, so the concentration of baytan was significantly increased. Used concentrations of baytan from 300 to 600 mg / L. It was shown that Baytan, depending on the concentration, inhibits not only the growth of microcalli, but also the regeneration of plants from embryogenic calli (Table 6). A concentration of baytan 600 mg / L was selected as sublethal. Organogenic calli were obtained from stable microcalli with subsequent regeneration of plants from them. On standard MS propagation medium, the shoots were rooted and then transferred to the soil. Most regenerated plants did not differ from the control ones in morphology. The resulting regenerant plants were analyzed for late blight resistance.
Пример 6. Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану (сорт Утро)
По той же схеме подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов сорта Утро. В отличие от сорта Таллалихин, микрокаллусы сорта Утро оказались более чувствительными к селективному агенту. Уже при концентрации 400 мг/л продолжали активный рост единичные микрокаллусы (табл. 7), которые формировали органогенный каллус. Из органогенного каллуса активно формировались растения-регенеранты. В результате для сорта Утро было получено большее число растений, устойчивых к байтану по сравнению с сортом Таллалихин.Example 6. Obtaining regenerated plants resistant to baytan (Morning variety)
According to the same scheme, a sublethal concentration of baytan was selected for microcalli of the Morning variety. Unlike the Tallallikhin cultivar, the Morning microcallus proved to be more sensitive to the selective agent. Already at a concentration of 400 mg / l, single microcalli continued to grow actively (Table 7), which formed organogenic callus. Regenerant plants were actively formed from organogenic callus. As a result, a greater number of Baytan-resistant plants were obtained for the Morning variety compared with the Tallallikhin variety.
Пример 7. Оценка устойчивости к фитофторе in vitro растений-регенерантов томатов
Устойчивость растения к фитофторе определяли так же, как у картофеля по двум признакам - процент некротических зон и процент спороношения гриба. Балльная шкала использована та же: 0 - устойчивое, 4 - максимально восприимчивое. Анализировали только растения с нормальным фенотипом. Каждое растение было разделено черенкованием на 4 части, поэтому возможным оказалось провести несколько повторностей опыта. В таблице 8 приведено среднее значение по каждому признаку, вычисленное на основе нескольких повторностей опытов. Изменчивость по повторностям практически отсутствовала. Исходные растения, например, сорта Утро оказались максимально восприимчивыми (балл 4). Спороношение наблюдали по всей поверхности и в результате они в течение нескольких дней гибли. Растения, выделенные как устойчивые к байтану, показали достаточно высокую степень устойчивости к фитофторе. В результате, для сорта Утро получено 9 растений, устойчивых к фитофторозу. Аналогично были получены устойчивые к фитофторозу растения для сорта Таллалихин, Алпатьева, Бизон.Example 7. Assessment of resistance to late blight in vitro tomato regenerant plants
Plant resistance to late blight was determined in the same way as in potatoes according to two signs — the percentage of necrotic zones and the percentage of fungal sporulation. The point scale used is the same: 0 - stable, 4 - most susceptible. Only plants with a normal phenotype were analyzed. Each plant was divided by cuttings into 4 parts, so it was possible to carry out several repetitions of the experiment. Table 8 shows the average value for each sign, calculated on the basis of several replicates of experiments. Variability in repetitions was practically absent. Initial plants, for example, Morning varieties were most susceptible (score 4). Sporulation was observed over the entire surface and as a result, they died within a few days. Plants isolated as resistant to baytan showed a rather high degree of resistance to late blight. As a result, 9 plants resistant to late blight were obtained for the Morning cultivar. Similarly, late blight-resistant plants were obtained for the varieties Tallallikhin, Alpateva, Bison.
Таким образом, предложенный способ позволяет получать устойчивые к патогенам, и, в частности, к фитофторозу растения разных видов: картофель, томаты. Важно, что предложенный способ не требует использования мутагенов, а полученные растения являются биологически чистыми. Thus, the proposed method allows you to get resistant to pathogens, and, in particular, to late blight plants of different types: potatoes, tomatoes. It is important that the proposed method does not require the use of mutagens, and the resulting plants are biologically pure.
Источники информации
1. J. D.Watson, M.Gilman et al. Recombinant DNA. ch.15.Genetic engineering of plants. New York. 1991. (P. 273-293).Sources of information
1. JDWatson, M. Gilman et al. Recombinant DNA. ch.15. Genetic engineering of plants. New York 1991. (P. 273-293).
2. В.А. Сидоров. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Гл. 2. Сомаклональная изменчивость. Киев. Наукова Думка. 1990. (Стр. 29-49). 2. V.A. Sidorov. Plant biotechnology. Cell selection. Ch. 2. Somaclonal variability. Kiev. Naukova Dumka. 1990. (pp. 29-49).
3. Л.А. Лутова, Е.А. Левашина, Л.В. Бондаренко, Н.Л. Байрамова, Е.В. Андронова, С.Г. Инге-Вечтомов. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов // Генетика. 1992. Т. 28. N 2. (Стр. 129-136). 3. L.A. Lutova, E.A. Levashina, L.V. Bondarenko, N.L. Bayramova, E.V. Andronova, S.G. Inge-Vechtomov. Mutants of higher plants on sterol biosynthesis // Genetics. 1992.V. 28.
4. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Сытник К.М., Глеба Ю.Ю. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев. Наукова Думка. 1985. 216 с. 4. Sidorov V.A., Piven N.M., Sytnik K.M., Gleb Yu.Yu. Somatic hybridization of nightshade. Kiev. Naukova Dumka. 1985.216 s.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96113409A RU2141196C1 (en) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96113409A RU2141196C1 (en) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2141196C1 true RU2141196C1 (en) | 1999-11-20 |
| RU96113409A RU96113409A (en) | 1999-11-27 |
Family
ID=20182738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96113409A RU2141196C1 (en) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2141196C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2453601C2 (en) * | 2006-10-24 | 2012-06-20 | Джей.Ди. ИРВИНГ, ЛИМИТЕД | Seedlings improved with endophyte with increased resistance to pests |
| CN114467578A (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-13 | 海南大学 | Method for preventing and treating plant nematodes |
-
1996
- 1996-07-04 RU RU96113409A patent/RU2141196C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В. и др. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов. - Генетика, 1992, т. 28, N 2, с. 129-135. J.D. Watson. Gilman et al. Recombinant DNA. ch. 15. Genetic engineering of plants New York, 1991, p. 273-293. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Гл. 2. Сомаклональная изменчивость. - Киев, Наукова думка, 1990, с. 29-49. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2453601C2 (en) * | 2006-10-24 | 2012-06-20 | Джей.Ди. ИРВИНГ, ЛИМИТЕД | Seedlings improved with endophyte with increased resistance to pests |
| CN114467578A (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-13 | 海南大学 | Method for preventing and treating plant nematodes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Provasoli et al. | Destruction of chloroplasts by streptomycin | |
| Jones | Cyanogenesis in animal—plant interactions | |
| Liu et al. | In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum | |
| US4443971A (en) | Herbicide-tolerant plants | |
| Kariyat et al. | Sorghum 3-deoxyanthocyanidin flavonoids confer resistance against corn leaf aphid | |
| Boiteux et al. | Genetic resistance to root‐knot nematode (Meloidogyne javanica) in eggplant (Solanum melongena) | |
| Kozar et al. | Factors affecting DH plants in vitro production from microspores of European radish | |
| RU2080780C1 (en) | Clonal plant micro propagation method | |
| Kenfield et al. | Curvulin and O-methylcurvulinic acid: Phytotoxic metabolites of Drechslera indica which cause necroses on purslane and spiny amaranth | |
| RU2141196C1 (en) | Method of obtaining plants with complex phytosterol dependent pest stability | |
| Flores et al. | Amaranths (Amaranthus spp.): Potential grain and vegetable crops | |
| Prakash et al. | Plant regeneration from protoplasts of Capsicum annuum L. cv. California Wonder | |
| US4937970A (en) | In vitro screening for and selection of glycine max resistant to phialophora gregata | |
| Mookiah et al. | Host plant resistance | |
| Silva et al. | Characterization of pro-embryogenic calli and somatic embryogenesis of Byrsonima intermedia A. Juss. | |
| Adeniji et al. | Genetics and nature of resistance to powdery mildew in crosses of butternut with calabaza squash and ‘Seminole Pumpkin’ | |
| Cai et al. | Morphological response of witchweed (Striga asiatica) to in vitro culture | |
| Newsholme et al. | Studies of selection in vitro for novel resistance to phytotoxic products of Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & De Not. in secondary embryogenic lines of Brassica napus ssp. oleifera (Metzg.) Sinsk., winter oilseed rape | |
| POLOWICK et al. | In vitro floral development of oilseed rape (Brassica napus L.): The effects of pH and plant growth regulators | |
| Tolmay et al. | A six week screening method for mechanisms of host plant resistance to Diuraphis noxia in wheat accessions | |
| Kaur et al. | Inheritance of alloplasmic fertility restoration in eggplant (Solanum melongena L.) | |
| Kindler et al. | Comparison of host suitability of western wheat aphid with the Russian wheat aphid | |
| Płażek et al. | In vitro culture as a tool for studying plant developmental processes at the physiological level in Poland | |
| Elek et al. | Aphid resistance in wheat varieties | |
| Coble et al. | Nutrient culture medium components affecting plant recovery from immature embryos of three Glycine genotypes and an interspecific hybrid grown in vitro |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110705 |