RU2139349C1

RU2139349C1 - Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethylthio)-acetyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid and 3-(carboxymethylthio)- -propionyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid

Info

Publication number: RU2139349C1
Application number: RU96104261/13A
Authority: RU
Inventors: Ари Ланс Бовенберг Рулоф (NL); Ари Ланс Бовенберг Рулоф; Питер Кукман Бертус (NL); Питер Кукман Бертус; Хукема Андреас (NL); Хукема Андреас; Метске Ван Дер Лан Ян (NL); Метске Ван дер Лан Ян; Вервей Ян (NL); Вервей Ян; Де Вром Эрик (NL); Де Вром Эрик
Original assignee: Гист-Брокейдс Б.В.
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1999-10-10

Abstract

FIELD: biotechnology, antibiotics. SUBSTANCE: invention presents the completed effective process of producing and isolation of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethyl- -thio)-acetyl- and 3-(carboxymethylthio)-propionyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid using the transformant strain of Penicillium chrysogenum expressing expandase in combination with acyltransferase. Method involves the use of 3-carboxy- -methylthiopropionic acid as a precursor of by-side chain of the end product. 7-Aminodeacetoxycephalosporanic acid is an intermediate compound used for production of cephalosporins. EFFECT: increased yield of strains. 5 cl, 8 dwg, 2 tbl, 5 ex

Description

Область изобретения и краткое описание известного уровня техники
Данное изобретение относится к процессу биосинтеза для получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).The scope of the invention and a brief description of the prior art
This invention relates to a biosynthesis process for the preparation and isolation of 7-aminodetacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA).

Беталактамные антибиотики образуют наиболее важную группу антибиотических соединений с длительной историей клинического применения. В этой группе выделяются пенициллины и цефалоспорины. Эти вещества природно продуцируются нитчатыми грибами Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum соответственно. Betalactam antibiotics form the most important group of antibiotic compounds with a long history of clinical use. Penicillins and cephalosporins are released in this group. These substances are naturally produced by the filamentous fungi Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum, respectively.

В результате применения методов улучшения классического штамма уровня продукции антибиотиков Penicillium chrisogenum и Acremonium chrisogenum значительно увеличены за последние десятилетия. С увеличением знаний о метаболических путях биосинтеза, приводящих к продукции пенициллинов и цефалоспоринов, и приходом генной инженерии стали доступны новые средства повышения продуктивности штаммов и получения производных соединений in vivo. As a result of applying methods to improve the classic strain, the antibiotic production levels of Penicillium chrisogenum and Acremonium chrisogenum have been significantly increased over the past decades. With an increase in knowledge of the metabolic pathways of biosynthesis leading to the production of penicillins and cephalosporins, and the advent of genetic engineering, new tools have become available to increase the productivity of strains and obtain derivatives of compounds in vivo.

Большая часть ферментов, участвующих в биосинтезе беталактамов, уже идентифицирована, и клонированы соответствующие им гены, что можно найти у Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 -264 (путь биосинтеза и ферменты), и Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461 - 495 (клонирование генов). Most of the enzymes involved in the biosynthesis of betalactams have already been identified and their corresponding genes have been cloned, as can be found in Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (biosynthesis pathway and enzymes), and Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (gene cloning).

Первые два этапа в биосинтезе пенициллина у P. chrisogenum являются конденсацией трех аминокислот, L-5-амино-5- карбоксипентановой кислоты (L-α-аминоадипиновой кислоты) (A), L-цистеина (C) и L-валина (V) в трипептид LLD - ACV с последующей циклизацией этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную беталактамную структуру. The first two steps in penicillin biosynthesis in P. chrisogenum are the condensation of three amino acids, L-5-amino-5-carboxypentanoic acid (L-α-aminoadipic acid) (A), L-cysteine (C) and L-valine (V) to LLD tripeptide - ACV followed by cyclization of this tripeptide to form isopenicillin N. This compound contains a typical betalactam structure.

Третий этап включает замену гидрофильной боковой цепи из L- 5амино-5-карбоксипентановой кислоты на гидрофобную боковую цепь путем воздействия фермента ацетилтрансферазы (AT). При промышленном способе производства пенициллина G боковой цепью выбора является фенилуксусная кислота (ФУ). В ЕР-А-0 532 341 раскрыто применение в качестве сырья для производства адипата (5- карбоксипентаноата). Включение этого субстрата приводит к образованию пенициллинового производного с 5-карбоксипентаноиловой боковой цепью, а именно 5-карбоксипентаноил-6- аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацетилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97 -99). Ферментативная реакция обмена, опосредуемая AT, происходит внутри клеточной органеллы, микротельца, что было описано в ЕР-А-0 488 180. The third step involves replacing the hydrophilic side chain of L-5-amino-5-carboxypentanoic acid with a hydrophobic side chain by exposure to the enzyme acetyltransferase (AT). In an industrial process for the production of penicillin G, the side chain of choice is phenylacetic acid (FU). EP-A-0 532 341 discloses the use as a raw material for the production of adipate (5-carboxypentanoate). The inclusion of this substrate leads to the formation of a penicillin derivative with a 5-carboxypentanoyl side chain, namely 5-carboxypentanoyl-6-aminopenicillanic acid. This inclusion is due to the fact that acetyltransferase has proven broad substrate specificity (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97-99). An enzymatic exchange reaction mediated by AT occurs within the cell organelle, the microbodies, as described in EP-A-0 488 180.

Цефалоспорины значительно более дорогостоящи, чем пенициллины. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем ряда химических превращений. Другой причиной является то, что до сих пор ферментации могут подвергаться только цефалоспорины с D-5-амино-5-карбоксипентаноиловой боковой цепью. Цефалоспорин C, несомненно, наиболее важный исходный материал в этом отношении, очень хорошо растворим в воде при любом pH, что подразумевает длительные и дорогие процессы выделения с использованием громоздкой и дорогостоящей колоночной хроматографии. Цефалоспорин C, полученный таким образом, необходимо превращать в терапевтически применяемые цефалоспорины с помощью ряда химических и ферментативных превращений. Cephalosporins are significantly more expensive than penicillins. One of the reasons for this is that some cephalosporins (e.g. cephalexin) are obtained from penicillins through a series of chemical transformations. Another reason is that so far only cephalosporins with a D-5-amino-5-carboxypentanoyl side chain can be fermented. Cephalosporin C, undoubtedly the most important starting material in this regard, is very soluble in water at any pH, which implies lengthy and expensive isolation processes using bulky and expensive column chromatography. The cephalosporin C thus obtained must be converted into therapeutically useful cephalosporins by a series of chemical and enzymatic transformations.

Промежуточная 7-АДЦК в настоящее время производится с помощью химического получения производных пенициллина G. Необходимые этапы химического процесса получения 7-АДЦК включают расширение пятичленной структуры пенициллинового кольца до 6- членной структуры цефалоспоринового кольца. Однако фермент экспандаза из нитчатой бактерии Streptomyces clavuligerus может осуществлять подобное расширение кольца. При введении в P. chrysogenum он может превращать пенициллиновую кольцевую структуру в цефалоспориновую кольцевую структуру, как описано у Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283 - 289; и в ЕР-А- 0 532 341 и ЕР-А- 0 540 210. Фермент экспандаза хорошо охарактеризован (ЕР-А- 0 366 354) как биохимически, так и функционально, так же как и соответствующий ему ген. Были описаны как физические карты гена cefE (ЕР-А- 0 233 715), последовательность ДНК, так и исследования по трансформации P.chrysogenum с помощью cefE. Еще одним источником подходящего фермента расширения кольца является нитчатая бактерия Nocardia lactamdurans (первоначально Streptomyces lactamdurans). Описаны как биохимические свойства этого фермента, так и последовательность ДНК гена (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453 - 458 соответственно). Intermediate 7-ADCA is currently being produced by chemically preparing penicillin G derivatives. The necessary steps in the chemical process for producing 7-ADCA include expanding the five-membered structure of the penicillin ring to the 6-membered structure of the cephalosporin ring. However, the enzyme expandase from the filamentous bacterium Streptomyces clavuligerus can effect such ring expansion. When introduced into P. chrysogenum, it can convert the penicillin ring structure to a cephalosporin ring structure, as described by Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289; and in EP-A-0 532 341 and EP-A-0 540 210. The expandase enzyme is well characterized (EP-A-0 366 354) both biochemically and functionally, as well as its corresponding gene. Physical maps of the cefE gene (EP-A-0 233 715), a DNA sequence, and studies of P. chrysogenum transformation using cefE have been described. Another source of a suitable ring expansion enzyme is the filamentous bacterium Nocardia lactamdurans (originally Streptomyces lactamdurans). Both the biochemical properties of this enzyme and the DNA sequence of the gene are described (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993 ), 453 - 458, respectively).

Более конкретно в ЕР-А-0 532 341 раскрывается использование фермента экспандазы в P. chrysogenum в сочетании с 5- карбоксипентаноиловой боковой цепью в качестве сырьевого источника, который используется как субстрат для ацетилтрансферазного фермента в P. chrysogenum. Это приводит к образованию 5- карбоксипентаноил-6-АПК, которая превращается с помощью фермента экспандазы, введенного в штамм P. chrysogenum, с получением 5- карбоксипентаноил-7-АДЦК. В конце предполагается удаление 5- карбоксипентаноиловой боковой цепи, дающее 7-АДЦК в качестве конечного продукта. В патентной заявке ЕР-А- 0 540 210 описывается сходный процесс получения 7-АЦК, включающий дополнительные этапы превращения 3-метильной боковой цепи кольца АДЦК в 3-атоксиметильную боковую цепь. Однако в вышеуказанных патентных заявках не раскрывается эффективный и экономически эффективный процесс, потому что прежде всего не была решена проблема своевременной экспрессии фермента экспандазы в клетке, сопутствующей экспрессии фермента ацетилтрансферазы. More specifically, EP-A-0 532 341 discloses the use of the expandase enzyme in P. chrysogenum in combination with the 5-carboxypentanoyl side chain as a feed source, which is used as a substrate for the acetyltransferase enzyme in P. chrysogenum. This leads to the formation of 5-carboxypentanoyl-6-APA, which is converted by the expandase enzyme introduced into the P. chrysogenum strain to give 5-carboxypentanoyl-7-ADCA. In the end, the removal of the 5-carboxypentanoyl side chain is expected to give 7-ADCA as the final product. EP-A-0 540 210 describes a similar process for the preparation of 7-ACC, including the additional steps of converting the 3-methyl side chain of the ADCC ring into a 3-atoxymethyl side chain. However, the above patent applications do not disclose an effective and cost-effective process, because the problem of timely expression of the expandase enzyme in the cell, concomitant expression of the acetyltransferase enzyme, was not solved in the first place.

В отличие от этого данное изобретение представляет эффективный способ продукции 7-АДЦК, при котором экспандаза и ацетилтрансфераза экспрессируются одновременно. In contrast, this invention provides an efficient method for the production of 7-ADCA, in which expandase and acetyltransferase are expressed simultaneously.

Кроме того, применение нового предшественника боковой, а именно 3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты, также раскрыто в этом изобретении. Этот предшественник очень эффективно включается P. chrysogenum в соответствующие пенициллины, кольцо которых расширяется с помощью последующего действия фермента экспандазы. In addition, the use of a new precursor of lateral, namely 3'-carboxymethylthiopropionic acid, is also disclosed in this invention. This precursor is very efficiently incorporated by P. chrysogenum into the corresponding penicillins, the ring of which expands by the subsequent action of the expandase enzyme.

К тому же до сих пор не был описан эффективный способ выделения производного 7-АДЦК из жидкой ферментационной среды перед его диацилированием. Данное изобретение представляет эффективную процедуру экстракции растворителем для выделения производного 7-АДЦК. In addition, an effective method for isolating a 7-ADCA derivative from a liquid fermentation medium before its diacylation has not yet been described. This invention provides an effective solvent extraction procedure for isolating the 7-ADCA derivative.

С помощью данного изобретения обеспечивается эффективный завершенный процесс получения 7-АДЦК, включающий этапы реакции, не раскрытые и не предложенные в прототипах до сих пор. Using this invention provides an effective complete process for producing 7-ADCC, including reaction steps not disclosed and not proposed in the prototypes so far.

Также путем применения данного изобретения и аналогично описанию, данному в ЕР-А-0540210, может быть получена 7-АЦК по завершенному эффективному процессу таким образом. Also, by applying the present invention and similarly to the description given in EP-A-0540210, 7-ACC can be obtained by completing an effective process in this way.

Краткое описание фигур. A brief description of the figures.

Фиг.1: функциональная карта плазмиды pVcTNE. Figure 1: functional map of the plasmid pVcTNE.

Фиг.2: функциональная карта плазмиды pMcTSE. Figure 2: functional map of the plasmid pMcTSE.

Фиг.3: функциональная карта плазмиды pMcTNde. Figure 3: functional map of the plasmid pMcTNde.

Фиг.4: функциональная карта плазмиды pGNETA. Figure 4: functional map of the plasmid pGNETA.

Фиг.5: функциональная карта плазмиды pGSETA. Figure 5: functional map of the plasmid pGSETA.

Фиг.6: функциональная карта плазмиды pANETA. 6: functional map of the plasmid pANETA.

Фиг.7: функциональная карта плазмиды pASETA. 7: functional map of the plasmid pASETA.

Фиг. 8: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше) (нижние строки) в сравнении с последовательностью продукта I ПЦР (верхние строки). FIG. 8: DNA sequence of cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., Supra) (lower lines) compared to the sequence of PCR product I (upper lines).

Краткое описание перечня последовательностей
Последовательности ИД NN с 1 по 13: олигонуклеотиды, использованные в конструировании кассеты экспрессии P. chrysogenum для генов cefE Streptomyces clavuligerus и Nocardia lactamdurans.Summary of Sequence Listing
Sequences of ID NNs 1 through 13: oligonucleotides used in the construction of the P. chrysogenum expression cassette for the cefE Streptomyces clavuligerus and Nocardia lactamdurans genes.

Последовательность ИД N 14: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше). ID 14 sequence: cefE DNA sequence of Nocardia lactamdurans (Coque et al., Supra).

Краткое изложение изобретения
Данное изобретение, таким образом, представляет способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем:
a) трансформации штамма Penicillium chrysogenum с помощью гена экспандазы под транскрипционной и трансляционной регуляцией сигналов экспрессии нитчатого гриба;
b) выращивания указанного штамма в ферментере в культуральной среде и добавления к указанной культуральной среде 3'- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира, подходящих для получения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-6-аминопенициллановой кислоты (2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-6-АПК), кольцо которых in situ расширяется с образованием 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АЛЦК;
с) выделения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК из жидкой ферментационной среды;
d) децилирования указанной 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК; и
е) выделения кристаллической 7-АДЦК.SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention thus provides a process for the preparation and isolation of 7-aminodetacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) by:
a) transforming the Penicillium chrysogenum strain using the expandase gene under the transcriptional and translational regulation of filamentous fungal expression signals;
b) growing said strain in a fermenter in a culture medium and adding 3'-carboxymethylthiopropionic acid or a salt or ester thereof suitable for preparing 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-6-aminopenicillanic acid ( 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-6-APA), the ring of which in situ expands to form 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ALTC;
c) isolating 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA from a liquid fermentation medium;
d) decylating said 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA; and
e) isolation of crystalline 7-ADCC.

Предпочтительно стадия (е) является стадией фильтрации. Preferably, step (e) is a filtration step.

Предпочтительно экспрессия гена экспандазы находится под транскрипционной и трансляционной регуляцией соответствующих контролирующих элементов АТ-гена, что обеспечивает одновременную координацию экспрессии указанных генов. Preferably, the expression of the expandase gene is under the transcriptional and translational regulation of the corresponding control elements of the AT gene, which ensures simultaneous coordination of the expression of these genes.

Предпочтительно 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК выделяют из жидкой ферментационной среды путем экстрагирования фильтрата среды органическим растворителем, несмешиваемым с водой при pH ниже примерно 4.5 и обратным экстрагированием тех же самых веществ водой при pH от 4 до 10. Preferably, 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are isolated from the liquid fermentation medium by extraction of the medium filtrate with an organic solvent immiscible with water at a pH below about 4.5 and back extraction of the same substances with water at a pH from 4 to 10.

Кроме того, представлены вектор рекомбинантной ДНК, содержащий ДНК, кодирующую экспендазу, функционально связанную с транскрипционными и трансляционными контролирующими элементами АТ- гена P. chrysogenum или gpdA гена A. nidulans, и клетки-хозяева, трансформированные такой ДНК. In addition, a recombinant DNA vector is provided that contains expendase-coding DNA operably linked to the transcriptional and translational control elements of the P. chrysogenum AT gene or gpdA of the A. nidulans gene, and host cells transformed with such DNA.

Детальное описание изобретения
Данное изобретение относится к использованию функциональных генных конструкций в P. chrysogenum для расширения in vivo структуры пенициллинового кольца в сочетании с использованием нового субстрата для ферментов биосинтеза для образования производного ключевого промежуточного соединения в биосинтезе цифалоспоринов, 7-аминодезациотоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет химическое такое строение, которое дает возможность эффективной экстракции растворителем, обеспечивая таким образом экономически привлекательный процесс выделения.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
This invention relates to the use of functional gene constructs in P. chrysogenum to expand the in vivo structure of the penicillin ring in combination with the use of a new substrate for biosynthesis enzymes to form a derivative of a key intermediate in the biosynthesis of cyfalosporins, 7-aminodisaciotoxicefalosporanic acid or 7-ADCA. This derivative has a chemical structure that enables efficient solvent extraction, thereby providing an economically attractive isolation process.

Трансформация P. chrysogenum может, в принципе, достигаться с помощью различных средств доставки ДНК, такими как опосредуемое PEG-Ca поглощение протопластов, электропорация или методы обстрела частицами и отбором трансформантов. Смотрите, например, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Применение доминантных и недоминантных маркеров селекции было описано (Van den Hondel, выше). Были описаны маркеры селекции как гомологичного (происходящие из P. chrysogenum) и гетерологичного (происходящие не из P. chrysogenum) происхождения. Transformation of P. chrysogenum can, in principle, be achieved using various DNA delivery vehicles, such as PEG-Ca mediated uptake of protoplasts, electroporation, or particle bombardment and selection of transformants. See, for example, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). The use of dominant and non-dominant selection markers has been described (Van den Hondel, supra). Selection markers have been described as homologous (originating from P. chrysogenum) and heterologous (originating not from P. chrysogenum) origin.

Применение различных маркеров селекции трансформантов, гомологичных или гетерологичных, в присутствии или в отсутствие векторных последовательностей, физически связанных или нет с неселектируемой ДНК, при селекции трансформантов хорошо известно. The use of various selection markers of transformants, homologous or heterologous, in the presence or absence of vector sequences, physically or not physically associated with non-selectable DNA, in the selection of transformants is well known.

Предпочтительно для селекции трансформантов P. chrysogenum используется гомологичный маркер селекции, чтобы ограничить количество гетерологичной ДНК, вводимой в P. chrysogenum. Наиболее предпочтительно использовать доминантный маркер селекции, который может селективно удаляться из трансформированного штамма, например, ген amdS A. nidulans или других нитчатых грибов (Европейская патентная заявка N 94 201 896.1). Эти предпочтительные характеристики маркера селекции трансформанта P. chrysogenum очень благоприятны для процесса и для процедур регистрации продукта, так как в процессе не участвуют маркеры, связанные с антибиотикоустойчивостью, или не будут вводиться в окружающую среду. Preferably, a homologous selection marker is used to select P. chrysogenum transformants to limit the amount of heterologous DNA introduced into P. chrysogenum. It is most preferable to use a dominant selection marker that can be selectively removed from the transformed strain, for example, the amdS gene of A. nidulans or other filamentous fungi (European patent application N 94 201 896.1). These preferred characteristics of the P. chrysogenum transformant selection marker are very favorable for the process and for product registration procedures, since the markers associated with antibiotic resistance are not involved or will not be introduced into the environment.

При наиболее предпочтительном воплощении маркер селекции amdS, который может селективно удаляться из штамма, дает возможность повторных циклов трансформации с использованием той же самой доминантной селекции снова и снова. Это свойство освобождения от маркера селекции у новых штаммов P. chrysogenum, экспрессирующих экспандазу, является определяющим для быстрой разработки высокопродуктивных штаммов по программе улучшения промышленных штаммов. In the most preferred embodiment, the amdS selection marker, which can be selectively removed from the strain, allows repeated transformation cycles using the same dominant selection again and again. This property of releasing from the selection marker in new P. chrysogenum strains expressing expansion, is crucial for the rapid development of highly productive strains under the program for improving industrial strains.

Способность к реакции расширения кольца, опосредуемая ферментом экспандазой, вводится и экспрессируется таким путем в P. chrysogenum, например, штамме Wisconsin 54-1255. Эта реакция расширения кольца происходит также и в их мутантах, дающих увеличенный выход беталактамов. Должно быть понятно, что в этом случае характеристики среды должны быть слегка адаптированы для получения эффективного роста. The ability of the ring expansion reaction mediated by the expandase enzyme is introduced and expressed in this way in P. chrysogenum, for example, strain Wisconsin 54-1255. This ring expansion reaction also occurs in their mutants, giving an increased yield of betalactams. It should be understood that in this case, the characteristics of the medium must be slightly adapted to obtain effective growth.

Кроме того, ген cefE помещается под транскрипционный и трансляционный контроль соответствующих контролирующих ген элементов нитчатого гриба, предпочтительно происходящих из ацилтрансферазного (AT) гена P. chrysogenum, что дает возможность их экспрессии в оптимальных временных рамках, синхронизированных с действием самого фермента ацетилтрансферазы. Эти меры являются решающими для эффективности реакции расширения кольца в пенициллиновой молекуле. In addition, the cefE gene is placed under transcriptional and translational control of the corresponding gene-controlling elements of the filamentous fungus, preferably originating from the acyltransferase (AT) gene of P. chrysogenum, which makes it possible to express them in optimal time frames synchronized with the action of the acetyltransferase enzyme itself. These measures are crucial for the effectiveness of the ring expansion reaction in the penicillin molecule.

В дополнение к синхронизированной экспрессии генов, кодирующих экспандазу и трансферазу, могло быть благоприятным для разработки экономичного процесса производства совместное расположение части экспандазных ферментов с ацетилтрансферазой в микротельцах (внутриклеточная локализация ацетилтрансферазы). При этих предпочтительных осуществлениях будет очень сильно снижаться количество пенициллиновых побочных продуктов, которые не допускаются в конечном продукте 7-АДЦК регистрационными органами. In addition to the synchronized expression of genes encoding expandase and transferase, it could be favorable to develop a cost-effective production process by co-locating a portion of the expandase enzymes with acetyltransferase in microbodies (intracellular localization of acetyltransferase). With these preferred embodiments, the amount of penicillin by-products that are not allowed in the final product of the 7-ADCA by the registration authorities will be greatly reduced.

Резюмируя, в данном изобретении раскрывается, как действие фермента экспандазы, введенного в P. chrysogenum, может быть нацелено на расширение пенициллинового кольца на основе синхронизированной экспрессии. In summary, this invention discloses how the action of the expandase enzyme introduced into P. chrysogenum can be aimed at expanding the penicillin ring based on synchronized expression.

По этому изобретению промежуточные беталактамные соединения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7- АДЦК продуцируются P. chrysogenum с помощью добавления 3- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира. Подходящими солями, например, являются соли натрия или калия. Они же эффективно выделяются из среды путем простой экстракции растворителем, например, следующим образом. According to this invention, the intermediate betalactam compounds 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are produced by P. chrysogenum by adding 3-carboxymethylthiopropionic acid or its salt or ester. Suitable salts, for example, are sodium or potassium salts. They are effectively isolated from the medium by simple extraction with a solvent, for example, as follows.

Жидкая питательная среда отфильтровывается и к фильтрату добавляется не смешиваемый с водой органический растворитель. pH устанавливается так, чтобы проэкстрагировать цефалоспорин из водного слоя. Диапазон pH должен находиться ниже 4.5; предпочтительно в интервале от 4 до 1, более предпочтительно - от 2 до 1. Таким образом цефалоспорин отделяется от многих посторонних примесей, присутствующих в ферментационной среде. Предпочтительно используется небольшой объем органического растворителя, что дает концентрированный раствор цефалоспорина, и таким образом достигается снижение объемных скоростей потоков. Вторая возможность состоит в полной экстракции жидкой питательной среды при pH, равном 4 и ниже. Предпочтительно жидкая питательная среда экстрагируется в интервале от 4 до 1 органическим растворителем, несмешиваемым с водой. The liquid culture medium is filtered off and an organic solvent not miscible with water is added to the filtrate. The pH is adjusted to extract cephalosporin from the aqueous layer. The pH range should be below 4.5; preferably in the range from 4 to 1, more preferably from 2 to 1. Thus, cephalosporin is separated from many foreign impurities present in the fermentation medium. A small volume of an organic solvent is preferably used, which gives a concentrated solution of cephalosporin, and thus a reduction in volumetric flow rates is achieved. The second possibility is the complete extraction of the liquid nutrient medium at a pH of 4 or lower. Preferably, the liquid culture medium is extracted in the range of 4 to 1 with an organic solvent immiscible with water.

Может использоваться любой растворитель, который не взаимодействует с молекулой цефалоспорина. Подходящими растворителями, например, являются бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, подобные бутанолу, и т.д. Предпочтительно используются 1-бутанол или изобутанол. Any solvent that does not interact with the cephalosporin molecule can be used. Suitable solvents, for example, are butyl acetate, ethyl acetate, methyl isobutyl ketone, alcohols like butanol, etc. Preferably, 1-butanol or isobutanol is used.

Затем цефалоспорин экстрагируется обратно водой при pH от 4 до 10, предпочтительно от 6 до 9. И снова конечный объем сильно снижается, выделение может проводиться при температурах от 0 до 50^oC и предпочтительно при температурах окружающей среды.Then cephalosporin is extracted back with water at a pH of from 4 to 10, preferably from 6 to 9. And again, the final volume is greatly reduced, the selection can be carried out at temperatures from 0 to 50 ^o C and preferably at ambient temperatures.

Водный раствор цефалоспорина, полученный таким образом, обрабатывается подходящим ферментом для удаления 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропиониловой боковой цепи и получения желаемой 7-АДЦК. The cephalosporin aqueous solution thus obtained is treated with a suitable enzyme to remove the 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl side chain and obtain the desired 7-ADCA.

Предпочтительно используется иммобилизированный фермент, чтобы было возможно использовать этот фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов была подробно описана в ЕР-А-0222462. pH водного раствора имеет значение, равное, например, от pH 4 до pH 9, при котором реакция деградации цефалоспорина минимизирована, а желаемое превращение с помощью фермента оптимально. Таким образом, фермент добавляется к водному раствору цефалоспорина при поддержании в то же время pH на соответствующем уровне с помощью, например, добавления неорганического основания, такого, как раствор гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием. Другая возможность состоит в применении иммобилизованного фермента в колонке с фиксированным или ожиженным слоем или использовании фермента в растворе и удалении продуктов с помощью мембранной фильтрации. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешиваемого с водой. An immobilized enzyme is preferably used so that it is possible to reuse this enzyme. The methodology for producing such particles and immobilizing enzymes has been described in detail in EP-A-0222462. The pH of the aqueous solution has a value equal, for example, from pH 4 to pH 9, at which the degradation reaction of cephalosporin is minimized, and the desired conversion with the enzyme is optimal. Thus, the enzyme is added to an aqueous solution of cephalosporin while maintaining the pH at an appropriate level by, for example, adding an inorganic base such as a potassium hydroxide solution or using a cation exchange resin. When the reaction is complete, the immobilized enzyme is removed by filtration. Another possibility is to use the immobilized enzyme in a fixed or fluidized bed column or to use the enzyme in solution and remove the products by membrane filtration. The reaction mixture is then acidified in the presence of an organic solvent immiscible with water.

Подходящие ферменты, например, получаются из микроорганизма Pseudomonas SY77, имеющего мутацию в одной или более позиций: 62, 177, 178 и 179. Также могут использоваться ферменты из других микроорганизмов Pseudomonas, предпочтительно Pseudomonas SY77, имеющих произвольно мутацию в одной или более позиций, соответствующих позициям 62, 177, 178 и 179 у Pseudomonas SY77. Suitable enzymes, for example, are derived from a Pseudomonas SY77 microorganism having a mutation in one or more positions: 62, 177, 178 and 179. Enzymes from other Pseudomonas microorganisms, preferably Pseudomonas SY77, having a mutation in one or more positions corresponding to one can also be used. positions 62, 177, 178 and 179 of Pseudomonas SY77.

После доведения pH до примерно от 0.1 до 1.5 слои разделяются и pH водного слоя доводится до примерно 2 - 5. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается. After adjusting the pH to about 0.1 to 1.5, the layers are separated and the pH of the aqueous layer is adjusted to about 2-5. The crystalline 7-ADCA is then filtered off.

Деацилирование может также выполняться химически известным способом, например, через образование иминохлоридной боковой цепи путем добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10^oC и затем изобутанола при температуре окружающей среды или ниже.Deacylation can also be carried out in a chemically known manner, for example, through the formation of an iminochloride side chain by adding phosphorus pentachloride at a temperature below 10 ^° C. and then isobutanol at ambient temperature or below.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения. The following examples are offered by way of illustration, but not limitation.

ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспрессия гена cefE Streptomyces и Nocardia в Penicillium chrysogenum.EXAMPLES
Example 1
Expression of the cefE Streptomyces and Nocardia gene in Penicillium chrysogenum.

а. Общие процедуры клонирования гена и генной трансформации. a. General procedures for gene cloning and gene transformation.

В данной заявке используются обычные методики, используемые в процедурах клонирования гена. Эти методики включают полимеразные цепные реакции (ПЦР), синтез синтетических олигонуклеотидов, анализ нуклеотидной последовательности ДНК, ферментативное лигирование и рестрикцию ДНК, субклонирование вектора в E. coli, трансформацию и селекцию трансформантов, выделение и очистку ДНК, характеристику ДНК с помощью блот-анализа по Саузерну и меченых ³²P зондов, мечение ДНК ³²P путем случайного примирования. Все эти методики очень хорошо известны в этой области технологии и соответственно описаны во многих источниках. Смотрите, например, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, U.S.A. (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPher-son et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).This application uses the usual techniques used in gene cloning procedures. These techniques include polymerase chain reactions (PCR), synthesis of synthetic oligonucleotides, DNA nucleotide sequence analysis, enzymatic ligation and DNA restriction, subcloning of the vector in E. coli, transformation and selection of transformants, DNA isolation and purification, DNA characterization using blot analysis by blot analysis Southern and ³² P-labeled probes, labeling ³² P DNA by random priming. All these techniques are very well known in this field of technology and are accordingly described in many sources. See, for example, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPherson et al., PCR, a Practical Approach , IRL Press (1991).

Общие процедуры, использованные при трансформации нитчатых грибов и селекции трансформантов, включают получение протопластов грибов, перенос ДНК и режим регенерации протопластов, очистку и определение свойств трансформантов. Все эти процедуры хорошо известны в этой области знаний и очень хорошо документированы в: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds. ), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992). General procedures used in the transformation of filamentous fungi and selection of transformants include the preparation of fungal protoplasts, DNA transfer and protoplast regeneration mode, and the purification and determination of the properties of transformants. All of these procedures are well known in the art and are very well documented in: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992).

Более конкретное применение технологии клонирования генов и генной трансформации в отношении Penicillium chrysogenum очень хорошо документально отражено у Bennett and Lasure (выше) и Finkelstein и Ball (выше). A more specific application of gene cloning and gene transformation technology for Penicillium chrysogenum is very well documented by Bennett and Lasure (above) and Finkelstein and Ball (above).

- Синтетические олигонуклеотиды ДНК синтезированы с использованием коммерческого синтезатора ДНК (Applied Biosystems, CA,U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителя. - Synthetic DNA oligonucleotides synthesized using a commercial DNA synthesizer (Applied Biosystems, CA, U.S.A.) In accordance with the manufacturer's instructions.

- ПЦР выполняется с использованием коммерческого автоматического аппарата для ПЦР (Perkin Elmer, U.S.A.) и ДНК- полимеразы (Perkin Elmer, U.S.A.) по инструкциям производителя. - PCR is performed using a commercial automatic PCR apparatus (Perkin Elmer, U.S.A.) and DNA polymerase (Perkin Elmer, U.S.A.) according to the manufacturer's instructions.

- Процедуру hGC ПЦР (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) использовали, чтобы сделать возможной амплификацию кодирующих областей гена cefE хромосомной ДНК N. lactamdurans и S. clavuligerus. - The hGC PCR procedure (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) was used to enable amplification of the coding regions of the cefE gene of the chromosomal DNA of N. lactamdurans and S. clavuligerus.

- Ферменты рестрикции и другие ферменты для модификации ДНК получены из BRL (MD, U.S.A.) и использовались в соответствии с инструкциями производителя. - Restriction enzymes and other enzymes for DNA modification obtained from BRL (MD, U.S.A.) and used in accordance with the manufacturer's instructions.

Вектор Е. coli pBluescript получен от Stratagene (СА, U.S.A.). Vector E. coli pBluescript obtained from Stratagene (CA, U.S.A.).

- Другие использованные химреактивы все имеют аналитическую чистоту и получены от разных поставщиков. - The other chemicals used are all of analytical purity and obtained from different suppliers.

- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК выполняли с использованием аппарата для автоматического анализа последовательности ДНК (Applied Biosystem), основанного на детекции, специфичной для флюоресцентной метки в соответствии с инструкциями производителя. - DNA nucleotide sequence analysis was performed using an apparatus for automatic DNA sequence analysis (Applied Biosystem) based on detection specific for the fluorescent label in accordance with the manufacturer's instructions.

b. Культивирование микроорганизмов
Streptomyces clavuligerus АТСС 27 064 выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).b. Microorganism cultivation
Streptomyces clavuligerus ATCC 27,064 is grown in trypsinized soy broth (Difco). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the cefE gene (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).

Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 также выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Coque et al., выше). Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 is also grown in trypsinized soy broth (Difco). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the cefE gene (Coque et al., Supra).

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28 089) выращивается в полной среде YPD (YPD; 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения 5' и 3' регуляторных областей гена penDE, необходимых для экспрессии гена cefE. Penicillium chrysogenim АТСС 28 089 также используется в качестве хозяина для гена cefE в экспериментах по трансформации. Пригодны также другие штаммы Penicillium chrysogenum, включая мутанты штамма Wisconsin 54-1255, дающие увеличенный выход беталактамов. В зависимости от использованного маркера селекции трансформанта могут использоваться штаммы P. chrysogenum, содержащие мутации в гене pyrG, niaD или facA. Эти мутантные штаммы могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в этой области технологии (Cantoral, Bio/technol. 5(1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519). Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28 089) is grown in complete YPD medium (YPD; 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the 5 'and 3' regulatory regions of the penDE gene necessary for expression of the cefE gene. Penicillium chrysogenim ATCC 28 089 is also used as the host for the cefE gene in transformation experiments. Other strains of Penicillium chrysogenum are also suitable, including mutants of the Wisconsin strain 54-1255 giving an increased yield of betalactams. Depending on the transformant selection marker used, P. chrysogenum strains containing mutations in the pyrG, niaD or facA gene can be used. These mutant strains can be obtained using methods well known in the art (Cantoral, Bio / technol. 5 (1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).

Культивирование P. chrysogenum для образования протопластов, используемых при трансформации, также производилось в среде YPD. Cultivation of P. chrysogenum for the formation of protoplasts used in transformation was also performed in YPD medium.

Хорошо известно, что процедуры образования протопластов и регенерации могут слегка отличаться в зависимости от конкретного использования штамма Penicillium chrysogenum и примененной процедуры селекции трансформанта. It is well known that protoplast formation and regeneration procedures may vary slightly depending on the specific use of the Penicillium chrysogenum strain and the transformant selection procedure used.

Е. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene и NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) сохранялись и культивировались с помощью использования стандартной среды для культивирования Е. coli, (Sambrook, выше). E. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene and NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) were preserved and cultured using standard E. coli culture medium (Sambrook, supra).

с.Конструирование кассет экспрессии cefE
Кассеты экспрессии cefE перечислены в таблице 1 (см. в конце описания), которая также объясняет номенклатуру, которая была использована для этих плазмид.C. Construction of cefE expression cassettes
CefE expression cassettes are listed in Table 1 (see end of description), which also explains the nomenclature that was used for these plasmids.

Опубликованные нуклеотидные последовательности гена cefE S.clavuligerus (Kovacevic, выше); гена cefE N. lac tamdurans (Coque, выше); гена gpdA A. nidulans (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); гена penDE P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) были использованы для создания синтетических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице II (см. в конце описания). Published nucleotide sequences of the S. clavuligerus cefE gene (Kovacevic, supra); cefE gene N. lac tamdurans (Coque, supra); A. nidulans gpdA gene (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); penDE gene P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) were used to create the synthetic oligonucleotides listed in the table II (see the end of the description).

с1. Конструирование плазмид экспрессии cefE Е. coli, pMCTSE и pMCTNE
ПЦР, 1: cefE N. lactamdurans
В первой ПЦР с использованием хромосомной ДНК N. lactamdurans и олигонуклеотидов 1 и 2 была получена открытая рамка считывания cefE N. lactamdurans в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт XbaI на 3'-конце.c1. Construction of E. coli cefE expression plasmids, pMCTSE and pMCTNE
PCR, 1: cefE N. lactamdurans
In the first PCR using N. lactamdurans chromosomal DNA and oligonucleotides 1 and 2, an open reading frame of cefE N. lactamdurans was obtained as a 0.9 kb PCR product containing a single NdeI restriction site at the 5'-end and a single XbaI site at the 3'- the end.

ПЦР, 2: cefE S. clavuligerus
Во второй ПЦР с использованием хромосомной ДНК S. clavuligerus и олигонуклеотидов 3 и 4 была получена открытая рамка считывания cefE S. clavuligerus в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, также содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт рестрикции XbaI на 3'-конце.PCR 2: cefE S. clavuligerus
In the second PCR using S. clavuligerus chromosomal DNA and oligonucleotides 3 and 4, an open reading frame of cefE S. clavuligerus was obtained as a 0.9 kb PCR product also containing a single NdeI restriction site at the 5'-end and a single XbaI restriction site at 3 '-end.

С целью получения экспрессии генов cefE в Е. coli и определения характеристик продуктов ПЦР с помощью анализа последовательности ДНК продукты ПЦР 1 и 2 клонировали в векторе pMCTNde, производный от рМС-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Плазмида pMCTNde была получена из pMC5-8 (Европейская патентная заявка N 0351029) путем встройки фрагмента, кодирующего tac промотор, с последующим сайтом RBS и клонирующим сайтом NdeI (фигура 3). In order to obtain expression of cefE genes in E. coli and characterize PCR products using DNA sequence analysis, PCR products 1 and 2 were cloned into pMCTNde vector derived from pMS-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Plasmid pMCTNde was obtained from pMC5-8 (European Patent Application No. 0351029) by inserting a fragment encoding the tac promoter, followed by the RBS site and the cloning site NdeI (figure 3).

Продукты ПЦР 1 и 2 расщепляли с помощью NdeI и XbaI и лигировали в расщепленный NdeI-XbaI вектор pMCTNde. Смесь лигирования использовали для трансформации Е. coli WK6. Трансформанты отбирали по резистентности к хлорамфениколу. Эти трансформанты используют для изоляции плазмидной ДНК. Вставку кассеты экспрессии cefE сначала анализировали с помощью расщепления рестрикционным ферментом на предсказанную генерацию рестрикционных фрагментов. Плазмиды, содержащие предсказанные сайты для рестрикционных ферментов, окончательно проанализированы с помощью автоматического анализа последовательности ДНК. PCR products 1 and 2 were digested with NdeI and XbaI and ligated into the pooled NdeI-XbaI vector pMCTNde. The ligation mixture was used to transform E. coli WK6. Transformants were selected for chloramphenicol resistance. These transformants are used to isolate plasmid DNA. The insertion of the cefE expression cassette was first analyzed by restriction enzyme digestion to predicted restriction fragment generation. Plasmids containing the predicted restriction enzyme sites are finally analyzed by automated DNA sequence analysis.

Последовательность ДНК открытой рамки считывания cefE S. clavuligerus в плазмиде pMCTSE (фигура 2) была на 100% идентична опубликованной последовательности (Kovacevic, выше). The open-reading DNA sequence of cefE S. clavuligerus in plasmid pMCTSE (Figure 2) was 100% identical to the published sequence (Kovacevic, supra).

Последовательность ДНК (фигура 8) всех клонов, которые были проанализированы, содержащая открытую рамку считывания cefE N. lactamdurans, отличалась от опубликованной последовательности (Coque, выше). The DNA sequence (Figure 8) of all clones that were analyzed containing the open reading frame of cefE N. lactamdurans was different from the published sequence (Coque, supra).

Аминокислотная последовательность, произведенная из опубликованного гена cefE N. lactamdurans, имеет пролин в положении 41 (смотрите Посл. ИД N 14). Этот пролин опущен в клонах, которые получены при ПЦР 1. Эта плазмида названа pMCTNE (фигура 1). The amino acid sequence derived from the published cefE gene of N. lactamdurans has a proline at position 41 (see Last ID No. 14). This proline is omitted in clones obtained by PCR 1. This plasmid is named pMCTNE (Figure 1).

с2. Конструирование плазмид экспрессии cefE P. chrysogenum
ПЦР, 3: промотор gpdA
При этой третьей ПЦР с использованием плазмидной ДНК pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124), содержащей ген hph E. coli под контролем промотора gpdA A. nidulans и олигонуклеотиды 5 и 6, был получен промотор gpdA в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащий единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.c2. Construction of plasmids for expression of cefE P. chrysogenum
PCR 3: gpdA promoter
In this third PCR using plasmid DNA pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124) containing the E. coli hph gene under the control of the A. nidulans gpdA promoter and oligonucleotides 5 and 6, the gpdA promoter was obtained as a 0.9 kb PCR product containing a single EcoRI restriction site at the 5'-end and a single NdeI site at the 3'-end.

ПЦР, 4: AT промотор
В четвертой ПЦР хромосомная ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотиды 7 и 8 были использованы для получения AT промоторного фрагмента, равного 1.5 kb, который также содержит единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.PCR 4: AT promoter
In the fourth PCR, P. chrysogenum chromosomal DNA and oligonucleotides 7 and 8 were used to obtain an AT promoter fragment of 1.5 kb, which also contains a single EcoRI restriction site at the 5'-end and a single NdeI site at the 3'-end.

ПЦР, 5: AT терминатор и 3'-конец гена cefE N. lactamdurans
В пятой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область (AT) penDE с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 9 и 10 и 11 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР содержат, таким образом, 3'-концевую последовательность гена cefE с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).PCR 5: AT terminator and 3'-end of the cefE N. lactamdurans gene
In the fifth PCR, a 0.5 kb terminator region (AT) of penDE was obtained using the chromosomal DNA of P. chrysogenum and oligonucleotides 9 and 10 and 11 and 10, respectively. These PCR products thus contain the 3'-terminal sequence of the cefE gene with or without a targeting signal to the microbody consisting of the C-terminal amino acid sequence of ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213) .

Олигонуклеотиды сконструированы таким образом, что единственный сайт BspEl встраивается на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SreI введен на 3'-конце продукта ПЦР. Oligonucleotides are designed such that a single BspEl site is inserted at the 5'-end of the PCR product and a single SreI site is introduced at the 3'-end of the PCR product.

ПЦР, 6: AT терминатор и 3'-конец гена cefE S. clavuli-gerus
В этой шестой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область penDE (AT) с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 12 и 10 и 13 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР, таким образом, содержат 3'-концевую последовательность гена cefE S. clavuligerus с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).PCR 6: AT terminator and 3'-end of the cefE gene of S. clavuli-gerus
In this sixth PCR, a 0.5 kb penDE terminator region (AT) was obtained using P. chrysogenum chromosomal DNA and oligonucleotides 12 and 10 and 13 and 10, respectively. These PCR products thus contain the 3'-terminal sequence of the cefE gene of S. clavuligerus with or without a targeting signal to the microbody consisting of the SKL C-terminal amino acid sequence (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).

Олигонуклеотиды сконструированы так, что единственный сайт рестрикции BqlI вводится на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SpeI получается на 3'-конце этого продукта ПЦР. Oligonucleotides are designed so that a single BqlI restriction site is introduced at the 5'-end of the PCR product and a single SpeI site is obtained at the 3'-end of this PCR product.

С целью получения экспрессии генов cefE в P. chrysogenum промотор gpdA и фрагмент промотора AT лигировали к фрагментам cefE из плазмид pMCTNE и pMCTSE. Эти лигированные фрагменты клонировали в вектор pBluescript II KS. In order to obtain expression of cefE genes in P. chrysogenum, the gpdA promoter and the AT promoter fragment were ligated to cefE fragments from plasmids pMCTNE and pMCTSE. These ligated fragments were cloned into the pBluescript II KS vector.

Продукт ПЦР 3 расщепляли EcoRI и NdeI. pMCTNE и pMCTSE расщепляли с помощью NdeI и XbaI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Кодирующие фрагменты 0.9 kb cefE очищали из агарозного геля. Промоторный фрагмент EcoRI- NdeI лигировали вместе с фрагментами NdeI-XbaI cefE в расщепленный EcoRI-XbaI вектор pBluescript II KS. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSE и pGNE. The PCR 3 product was digested with EcoRI and NdeI. pMCTNE and pMCTSE were digested with NdeI and XbaI. Restriction fragments were separated by agarose gel electrophoresis. The coding fragments of 0.9 kb cefE were purified from agarose gel. The EcoRI-NdeI promoter fragment was ligated together with NdeI-XbaI cefE fragments into the EcoRI-XbaI digested pBluescript II KS vector. Thus, the following plasmids were obtained: pGSE and pGNE.

Для получения оптимальной экспрессии генов cefE в Р. chrysogenum мы выбираем клонирование сигнальной последовательности терминации AT после генов cefE в плазмидах экспрессии Penicillium, упомянутых выше. To obtain optimal expression of cefE genes in P. chrysogenum, we select the cloning of the AT termination signal sequence after cefE genes in the Penicillium expression plasmids mentioned above.

pGNETA-pGNEWA
Продукты ПЦР 5 расщепляли с помощью BspEI и SpeI и лигировали в расщепленный BspEI и SpeI вектор pGNE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Плазмиды, выделенные из этих трансформантов, охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGNEWA и pGNETA (фигура 4).pGNETA-pGNEWA
PCR 5 products were digested with BspEI and SpeI and ligated into the digested BspEI and SpeI pGNE vector. Ligation mixtures were used to transform E. coli HB101. Transformants were selected for ampicillin resistance. Plasmids isolated from these transformants were characterized by analysis of restriction fragments and then by DNA sequence analysis. Thus, the following plasmids were obtained: pGNEWA and pGNETA (Figure 4).

pGSENA-pGSEWA
Продукты ПЦР 6 расщепляли с помощью BqlI и SpeI и лигировали в расщепленный BqlI и SpeI вектор pGSE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Выделенные из этих трансформантов плазмиды также охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSEWA и pGSETA (фигура 5).pGSENA-pGSEWA
PCR 6 products were digested with BqlI and SpeI and ligated into the digested BqlI and SpeI pGSE vector. Ligation mixtures were used to transform E. coli HB101. Transformants were selected for ampicillin resistance. Plasmids isolated from these transformants were also characterized by analysis of restriction fragments and then DNA sequence analysis. Thus, the following plasmids were obtained: pGSEWA and pGSETA (Figure 5).

pANETA, pANEWA и pASETA и pASEWA
Плазмиды pGNETA, pGNEWA, pGSETA и pGSEWA рacщeпляли с помощью EcoRI и NdeI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и из геля очищали фрагменты 4.5 kb.pANETA, pANEWA and pASETA and pASEWA
Plasmids pGNETA, pGNEWA, pGSETA and pGSEWA were digested with EcoRI and NdeI. Restriction fragments were separated by agarose gel electrophoresis and 4.5 kb fragments were purified from the gel.

Продукт ПЦР 4 расщепляли с помощью EcoRI и NdeI и лигировали с очищенными фрагментами, упомянутыми выше. После трансформации лигированных смесей в Е. coli НВ101 трансформанты отбирали по резистентности к ампициллину. The PCR 4 product was digested with EcoRI and NdeI and ligated to the purified fragments mentioned above. After transformation of the ligation mixtures into E. coli HB101, transformants were selected for ampicillin resistance.

Трансформанты подращивали и выделяли их плазмиды и характеризовали с помощью анализа фрагментов рестрикции и окончательно - с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены желаемые конструкции, а именно: pANETA (фигура 6), pANEWA, pASETA (фигура 7) и pASEWA. Transformants were grown and their plasmids were isolated and characterized by analysis of restriction fragments and, finally, by DNA sequence analysis. Thus, the desired designs were obtained, namely: pANETA (figure 6), pANEWA, pASETA (figure 7) and pASEWA.

d. Трансформация P. chrysogenum
Использована процедура трансформации протопластов, опосредуемой Ca-PEG.d. Transformation of P. chrysogenum
The protoplast transformation procedure mediated by Ca-PEG was used.

Следуя процедурам, описанным у Cantoral (смотрите выше), Gouka et al. (J. Biotechn., смотрите выше) и Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., смотрите выше) для трансформации штаммов P. chrysogenum использовали целую плазмиду или очищенный полигенный экспрессирующий кластер cefE (лишенный векторных последовательностей Е. coli) с генами pyrG, niaD, facA или amdS (Beri et al. , Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) соответственно в качестве маркеров селекции. Following the procedures described by Cantoral (see above), Gouka et al. (J. Biotechn., See above) and Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., See above) for the transformation of P. chrysogenum strains, a whole plasmid or purified cefE expressing cluster (lacking E. coli vector sequences) with pyrG, niaD, facA or amdS genes (Beri et al., Curr Genet. 11 (1987), 639-641), respectively, as selection markers.

Путем использования гомологичных маркеров селекции pyrG, niaD или facA в очищенной форме, лишенных векторных последовательностей Е. coli, были получены трансформированные штаммы P. chrysogenum, которые не содержат генов резистентности бактерий. Using homologous selection markers of pyrG, niaD or facA in purified form lacking E. coli vector sequences, transformed P. chrysogenum strains that do not contain bacterial resistance genes were obtained.

В Европейской патентной заявке N 94201896.1 описывается способ получения рекомбинантных штаммов, лишенных генов маркеров селекции. Этот метод был успешно использован на трансформантах P. chrysogenum, содержащих ген amdS A. nidulans в качестве доминантного маркера селекции. European Patent Application No. 94201896.1 describes a method for producing recombinant strains lacking selection marker genes. This method has been successfully used on P. chrysogenum transformants containing the A. nidulans amdS gene as a dominant selection marker.

В таком случае единственными элементами гетерологичного происхождения являются кодирующая область cefE 0.9 kb и произвольно промоторная область gpdA 0.9 kb. In this case, the only elements of heterologous origin are the coding region of cefE 0.9 kb and the randomly promoter region of gpdA 0.9 kb.

е. Анализ трансформантов
Трансформанты P. chrysogenum очищают путем повторного культивирования на селективной среде. Единичные устойчивые колонии использованы для приготовления устойчивых косяков для получения спор и для проверки на трансформанты, содержащие кассету экспрессии cefE. Кипячение фрагмента свежего мицелия трансформантов на агаровой пластинке использовали для получения достаточного количества матричной ДНК для эффективной проверки сотен трансформантов на присутствие гена cefE при использовании метода ПЦР. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Действуя таким образом, установили эффективность трансформации.e. Analysis of transformants
Transformants of P. chrysogenum are purified by re-cultivation on selective medium. Single resistant colonies were used to prepare resistant shoals for obtaining spores and for testing for transformants containing the cefE expression cassette. Boiling of a fragment of fresh mycelium of transformants on an agar plate was used to obtain a sufficient amount of template DNA to effectively test hundreds of transformants for the presence of the cefE gene using the PCR method. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Acting in this way, they established the effectiveness of the transformation.

Отбор трансформантов также выполняли, применяя биологические исследования. Трансформанты подращивали на агаризованной среде, которая содержала предшественника боковой цепи выбора. Е. coli ESS2231 использовали в качестве индикаторной бактерии в кроющем слое агара, который содержал Бактопеназу, чтобы было возможно отдифференцировать продукцию пенициллина и цефалоспорина по методам, хорошо известным в этой области науки и описанным, например, у Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64. The selection of transformants was also performed using biological studies. Transformants were grown on an agar medium that contained a side chain precursor of choice. E. coli ESS2231 was used as an indicator bacterium in the top coat of agar that contained Bactopenase so that it was possible to differentiate the production of penicillin and cephalosporin according to methods well known in the art and described, for example, by Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64.

Споры используют для посева P. chrysogenum в культуральную среду, как описано в разделе d. После 72 часов культивирования (при 25^oC) из мицелия выделяют хромосомную ДНК. ДНК расщепляют рестрикционным ферментом с распознаваемой последовательность в 6 п.о., подобным EcoRI или PstI.Spores are used for plating P. chrysogenum in culture medium as described in section d. After 72 hours of cultivation (at 25 ^° C.), chromosomal DNA is isolated from the mycelium. DNA is digested with a restriction enzyme with a recognized 6 bp sequence similar to EcoRI or PstI.

Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны Gene screen (New England nuclear). Блоттинг по Саузерну проводили гибридизацией с меченным ³²P продуктом ПЦР 2 в качестве пробы для последовательностей гена cefE. Мечение ³²P очищенного продукта ПЦР 2 достигается с помощью мечения случайным примированием в присутствии α³²P ЦТФ при использовании коммерческого набора для мечения (Boeringer Mannheim).DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis and transferred to Gene screen (New England nuclear) nylon membranes. Southern blotting was performed by hybridization with a ³² P-labeled PCR 2 product as a sample for cefE gene sequences. Labeling ³² P of purified PCR 2 product is achieved by random priming labeling in the presence of α ³² P CTF using a commercial labeling kit (Boeringer Mannheim).

Трансформанты, содержащие кодирующую последовательность cefE, испытаны на экспрессию продукта гена cefE, называемую здесь экспандазной активностью. Transformants containing the cefE coding sequence were tested for expression of the cefE gene product, referred to herein as expandase activity.

Отобранные трансформанты культивируются в среде для продукции пенициллина (смотрите пример 2). Selected transformants are cultured in penicillin production medium (see example 2).

В эксперименте по оценке протекания процесса во времени образцы мицелия отбирали через 48, 72 и 96 часов ферментации. Готовятся экстракты мицелия, и экспандазная активность определяется в неочищенных экстрактах, как описано у Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Трансформанты с экспандазной активностью испытывали на ацилтрансферазную активность также методами, описанными у Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682. In an experiment to evaluate the progress of the process over time, mycelium samples were taken after 48, 72 and 96 hours of fermentation. Mycelium extracts are prepared and the expandase activity is determined in the crude extracts as described by Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Transformants with expandase activity were also tested for acyltransferase activity by the methods described by Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682.

По этим анализам отбирали трансформанты с различными уровнями ацилтрансферазной и экспандазной ферментативной активности для ферментативной продукции производных 7-АДЦК. Transformants with different levels of acyltransferase and expandase enzymatic activity for the enzymatic production of 7-ADCA derivatives were selected from these analyzes.

Пример 2
Ферментативное получение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и их выделение
P. chrysogenum штамм Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089) трансформируется с помощью одной из конструкций ДНК, как описано в примере 1, и засевается в концентрации 2•10⁶ конидий/мл в посевную среду, состоящую из г/л:
глюкозы - 30
(NH₄)₂SO₄ - 10
KH₂PO₄ - 10
раствора микроэлементов I
(MgSO₄•7H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 10
CuSO₄•5H₂O - 0,5
ZnSO₄•7H₂O - 2
Na₂SO₄ - 50
MnSO₄•H₂O - 2
CaCl₂•2H₂O - 5)
10 (мл/л) (pH до стерилизации 6.5).Example 2
Enzymatic preparation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA and their isolation
P. chrysogenum strain Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) is transformed using one of the DNA constructs, as described in example 1, and inoculated at a concentration of 2 • 10 ⁶ conidia / ml in a seed medium consisting of g / l:
glucose - 30
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 10
KH ₂ PO ₄ - 10
trace element I
(MgSO ₄ • 7H ₂ O - 25
FeSO ₄ • 7H ₂ O - 10
CuSO ₄ • 5H ₂ O - 0.5
ZnSO ₄ • 7H ₂ O - 2
Na ₂ SO ₄ - 50
MnSO ₄ • H ₂ O - 2
CaCl ₂ • 2H ₂ O - 5)
10 (ml / l) (pH before sterilization 6.5).

Посевную культуру инкубируют в течение 48-72 часов при 25- 30^oC и затем используют для засева 10-20 объемов производственной среды, содержащей (г/л):
лактозы - 80
мальтозы - 20
CaSO₄ - 4
мочевины - 3
(MgSO₄•7H₂O - 2
KH₂PO₄ - 7
NaCl - 0,5
(NH⁴)₂SO₄ - 6
FeSO₄•7H₂O - 0,1
3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты раствора микроэлементов II - 5
(CuSO₄•5H₂O - 0,5
ZnSO₄•7H₂O - 2
MnSO₄•H₂O - 2
Na₂SO₄ - 50),
10 (мл/л) (pH до стерилизации 5.5 - 6.0). Затем инкубация продолжается в течение еще 96 - 120 часов.The seed culture is incubated for 48-72 hours at 25-30 ^o C and then used for sowing 10-20 volumes of the production medium containing (g / l):
lactose - 80
maltose - 20
CaSO ₄ - 4
urea - 3
(MgSO ₄ • 7H ₂ O - 2
KH ₂ PO ₄ - 7
NaCl - 0.5
(NH ⁴ ) ₂ SO ₄ - 6
FeSO ₄ • 7H ₂ O - 0.1
3'-carboxymethylthiopropionic acid trace element II - 5
(CuSO ₄ • 5H ₂ O - 0.5
ZnSO ₄ • 7H ₂ O - 2
MnSO ₄ • H ₂ O - 2
Na ₂ SO ₄ - 50),
10 (ml / l) (pH before sterilization 5.5 - 6.0). Then, incubation continues for another 96 to 120 hours.

В конце производственной ферментации мицелий отделяется центрифугированием или фильтрованием и 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК анализируется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с обращенной фазой. Использован аппарат ВЭЖХ Beckman System Gold, состоящий из программируемой системы для растворителей модели 168, автоматического пробоотборника модели 507, диодно-сетчатого детектора модели 168 и системы для данных Gold system (5.10). В качестве стационарной фазы используются две (2) катриджных колонки Chrom-spher С18 (100 х 3 мм, Chrompack) в ряд. Подвижная фаза состоит из линейного градиента от 100% 0.07 М фосфатного буфера pH 4.8 до 25% ацетонитрила и 75% фосфатного буфера pH 4.8 через 15 минут при скорости потока, равной 0.5 мл/мин. Продукция 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК определяется количественно при 260 нм при использовании синтетических 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК в качестве веществ для сравнения. At the end of production fermentation, the mycelium is separated by centrifugation or filtration, and 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) on a reverse phase column. The Beckman System Gold HPLC apparatus was used, consisting of a model 168 solvent system, model 507 auto-sampler, model 168 diode-grid detector, and model Gold data system (5.10). As the stationary phase, two (2) Chrom-spher C18 cartridge columns (100 x 3 mm, Chrompack) are used in a row. The mobile phase consists of a linear gradient from 100% 0.07 M phosphate buffer pH 4.8 to 25% acetonitrile and 75% phosphate buffer pH 4.8 after 15 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min. The production of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is quantified at 260 nm using synthetic 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA as substances for comparison .

Идентичность пиков подтверждается путем сравнения кривых ультрафиолетового и ЯМР спектров. The identity of the peaks is confirmed by comparing the curves of the ultraviolet and NMR spectra.

После отфильтровывания жидкой питательной среды к фильтрату добавляется примерно 0.1 объема 1-бутанола. Значение pH доводится до 2 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты и смесь перемешивается в течение 5 минут при комнатной температуре. После разделения органический слой или выпаривается или используется далее для химического деацилирования (пример 3) или обратно экстрагируется объемом воды, равным 0.33, с pH 8 и далее используется для ферментативного деацилирования (примеры 4 и 5). After filtering the liquid culture medium, approximately 0.1 volume of 1-butanol is added to the filtrate. The pH is adjusted to 2 with dilute hydrochloric acid and the mixture is stirred for 5 minutes at room temperature. After separation, the organic layer is either evaporated or used further for chemical deacylation (example 3) or is back extracted with a water volume of 0.33 with a pH of 8 and then used for enzymatic deacylation (examples 4 and 5).

Пример 3
Деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК
К смеси 3 г (8 ммолей) 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК, 3.5 мл (36 ммолей) N,N- диметиланилина 13 мл метиленхлорида и 2.6 мл (21 ммоль) триметилхлорсилана добавляются при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут реакционную смесь охлаждают до примерно -50^oC и добавляют 1.8 г (8.5 ммоля) пентахлорида фосфора, все сразу. Температура поддерживается на уровне -40^oC в течение двух часов и затем реакционную смесь охлаждают до -65^oC. Затем ее обрабатывают 12 мл (137 ммолей) изобутанола с такой скоростью, чтобы температура не повышалась свыше -40^oC. После дополнительного перемешивания в течение двух часов раствор выливают в 15 мл воды и потом сразу добавляют 5 мл 4.5 N аммиака. pH доводится до 4 путем медленного добавления твердого бикарбоната аммония. После охлаждения до 5^oC смесь фильтруют и кристаллическую 7-АДЦК промывают 5 мл водного ацетона (1:1) и отделяют.Example 3
Deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADC
To a mixture of 3 g (8 mmol) of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA, 3.5 ml (36 mmol) of N, N-dimethylaniline, 13 ml of methylene chloride and 2.6 ml (21 mmol) of trimethylchlorosilane at room temperature. After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was cooled to about -50 ^° C and 1.8 g (8.5 mmol) of phosphorus pentachloride were added, all at once. The temperature is maintained at -40 ^o C for two hours and then the reaction mixture is cooled to -65 ^o C. Then it is treated with 12 ml (137 mmol) of isobutanol at such a rate that the temperature does not rise above -40 ^o C. After further stirring for two hours the solution is poured into 15 ml of water and then 5 ml of 4.5 N ammonia are immediately added. The pH is adjusted to 4 by slowly adding solid ammonium bicarbonate. After cooling to 5 ^° C., the mixture was filtered and the crystalline 7-ADCA was washed with 5 ml of aqueous acetone (1: 1) and separated.

Пример 4
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием мутантной ацилазы Pseudomonas SY77
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется в одну энзиматическую стадию с использованием специфической ацилазы, которая производится из ацилазы Pseudomonas SY77 путем направленного на определенную область мутагенеза. Конструирование и идентификация мутантной ацилазы Pseudomonas SY77 с улучшенной активностью в отношении 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионильной боковой цепи было описано в ЕР-А-0453048. В мутанте тирозин в положении 178 в α- субъединице ацилазы Pseudomonas SY77 был заменен на гистидин. Мутантная ацилаза продуцируется в Е. coli. Клетки собираются путем центрифугирования и снова суспендируются в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4, содержащем 140 мМ NaCl. Затем клетки разрушают ультразвуком. После удаления клеточных остатков собирают супернатанты, обладающие ацилазной активностью. Дальнейшую очистку ацилазы выполняли с помощью ряда этапов хроматографии:
(1) ионообменной хроматографии на О-сефарозе с быстрым потоком при pH 8. 8;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия на фенилсефарозе;
(3) гельпроникающей хроматографии на колонке сефакрила S200HR.Example 4
Enzymatic deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA using the mutant acylase Pseudomonas SY77
The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out in one enzymatic step using a specific acylase, which is produced from Pseudomonas SY77 acylase by directed to a specific area of mutagenesis. The construction and identification of the Pseudomonas SY77 mutant acylase with improved activity on the 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl side chains has been described in EP-A-0453048. In the mutant, tyrosine at position 178 in the α-subunit of the acylase Pseudomonas SY77 was replaced by histidine. Mutant acylase is produced in E. coli. Cells are harvested by centrifugation and resuspended in 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 140 mM NaCl. Then the cells are destroyed by ultrasound. After removal of cellular residues, supernatants with acylase activity are collected. Further purification of the acylase was performed using a number of chromatographic steps:
(1) ion exchange chromatography on O-Sepharose with a fast flow at pH 8. 8;
(2) chromatography of hydrophobic interaction on phenylsepharose;
(3) gel permeation chromatography on a Sephacryl S200HR column.

Очищенную ацилазу иммобилизировали на частицах, состоящих из смеси желатина и хитозана. Частицы обрабатывали глутаральдегидом непосредственно перед добавлением фермента. Purified acylase was immobilized on particles consisting of a mixture of gelatin and chitosan. Particles were treated with glutaraldehyde just before the enzyme was added.

Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК проводится в реакторе с мешалкой. Сначала в реактор добавляют водный раствор цефалоспорина. Затем температуру раствора доводят до 30^oC при постоянном перемешивании и pH фиксируется на 8 с помощью гидроксида калия. Затем добавляется иммобилизированный фермент и превращение начинается. Во время превращения pH в реакторе непрерывно контролируется и поддерживается на 8. 3'-карбоксиметилтиопропионовая кислота, которая выделяется во время реакции, титруется КОН. Количество КОН, которое добавляется, суммируется и регистрируется на записывающем устройстве с плоским стендом. Превращение контролируется путем отбора образцов из реактора, которые анализируются на 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и 7-АДЦК с помощью ВЭЖХ, как описано в примере 2.The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out in a stirred reactor. First, an aqueous solution of cephalosporin is added to the reactor. Then the temperature of the solution was adjusted to 30 ^o C with constant stirring and the pH was fixed at 8 with potassium hydroxide. Then the immobilized enzyme is added and the conversion begins. During the conversion, the pH in the reactor is continuously monitored and maintained at 8. 3'-carboxymethylthiopropionic acid, which is released during the reaction, is titrated with KOH. The amount of KOH that is added, added, and recorded on a flat-panel recorder. The conversion is controlled by sampling from the reactor, which are analyzed for 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA and 7-ADCC using HPLC, as described in example 2.

Когда реакция завершена, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием и pH фильтрата доводится до 1, тогда как фильтрат содержит бутилацетат. Слои разделяются, и pH водной фазы, которая содержит 7-АДЦК, доводится до 3. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается. When the reaction is complete, the immobilized enzyme is removed by filtration and the pH of the filtrate is adjusted to 1, while the filtrate contains butyl acetate. The layers are separated, and the pH of the aqueous phase, which contains 7-ADCA, is adjusted to 3. The crystalline 7-ADCA is then filtered off.

Пример 5
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием ацилазы Pseudomonas SE83
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется, как и в примере 4, однако с использованием ацилазы Pseudomonas SE83 в качестве ацилазы с получением того же самого результата.Example 5
Enzymatic deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA using Pseudomonas SE83 acylase
The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out as in Example 4, however using Pseudomonas SE83 acylase as the acylase to obtain the same result.

Claims

1. A method for the preparation and isolation of 7-aminodetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) by a) transforming the Penicillium chrysogenum strain of the expandase gene under the control of transcriptional and translational signal sequences of expression of filamentous fungi; b) growing said strain in a culture medium and adding N-acyl side chain precursor or a salt or ester thereof to said medium suitable for the formation of N-acyl-6-aminopenicillanic acid (N-acyl-6-APA), whose ring is in situ expands with the formation of N-acyl-7-ADCC, c) the isolation of N-acyl-7-ADCC from the fermentation medium, d) the deacylation of said N-acyl-7-ADCC, and e) the isolation of crystalline 7-ADCA, characterized in that N-acyl side chain precursor is 3'-carboxymethylthiopropionic acid suitable for mations 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl-6-APA, which ring in situ expanded to form 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA.

2. The method according to p. 1, characterized in that the said strain of Penicillium chrysogenum is transformed by the expandase gene under the control of transcriptional and translational signal sequences for the expression of the acyltransferase gene.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that stage (d) is a filtration stage.

4. The method according to any one of the preceding paragraphs, characterized in that stage (C) is a filtration step and extracting the filtrate of the liquid nutrient medium with an organic solvent not miscible with water at a pH below about 4.5, and back extraction of the same substances with water at pH 4 to 10.

5. The method according to any one of the preceding paragraphs, characterized in that the expandase gene is obtained from Streptomyces clavuligerus or Nocarlia Lactamdurans.