RU2137138C1

RU2137138C1 - Diagnostic composition for identification of syphilis and test-system "akvasif" on its base

Info

Publication number: RU2137138C1
Application number: RU98101333A
Authority: RU
Inventors: А.И. Артюхов; С.В. Родин; М.В. Гаче; Е.Н. Горбачев; А.А. Колобов; Е.А. Кампе-Немм; В.М. Шпень; А.Н. Прусаков
Original assignee: Товарищество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "АКВАПАСТ"; Товарищество с ограниченной ответственностью "Верта"
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1998-01-22
Publication date: 1999-09-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: invention relates to preparations used for diagnosis of syphilis by methods of an immunoenzymatic analysis. Diagnostic composition for identification of syphilis has fragments of genome Treponema pallidum, namely a mixture of peptides Sif-1323-51Tmpa, Sif-1567-87TpD, Sif-1644-61TpD, and indicated composition can contain the above given peptides at ratio = 1:(1-2):(0.5-1.5), respectively. Test-system for identification of syphilis by method of an immunoenzymatic analysis involves plastic plate wells as an immunosorbent on which the diagnostic composition, buffer solutions, blood sera, additional solutions and a mixture of monoclonal antibodies labeled with horse radish peroxidase against the human immunoglobulins as a conjugate are immobilized. EFFECT: selectivity and safety of diagnostic composition, simplicity of the test-system. 3 cl, 2 tbl

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к препаратами диагностикумам (тест-системам) для определения сифилиса методами имунноферментного анализа (ИФА). The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to preparations for diagnosticums (test systems) for the determination of syphilis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

В настоящее время для диагностики сифилиса посредством реакции антиген-антитело используются композиции, содержащие иммуноглобулины человека и(или) животных, как правило, иммобилизованные на носителе (Рассказов Н.И. и др. Вестник, 1990 N1, c.12-16; Пат Японии NN 52114019, 1977 и 61007470, 1986 кл. G 01 N 33/16, 33/571), а также высокомолекулярные белковые соединения, например, белок Tmp А Treponema pallidum (Пат. Японии N 02234063, 1990 кл. G 01 N 33/571, G.Antoni, J. Immunol. Methods 1996, v.189, N1, р.137-140). Currently, for the diagnosis of syphilis through the antigen-antibody reaction, compositions are used that contain human immunoglobulins and (or) animals, usually immobilized on a carrier (Rasskazov N.I. et al. Vestnik, 1990 N1, pp. 12-16; Pat Japan NN 52114019, 1977 and 61007470, 1986, class G 01 N 33/16, 33/571), as well as high molecular weight protein compounds, for example, Tmp A protein Treponema pallidum (US Pat. Japan N 02234063, 1990 class G 01 N 33 / 571, G. Antoni, J. Immunol. Methods 1996, v. 189, N1, p. 137-140).

Недостатками указанных композиций является невысокая селективность, особенно в случае рецидивного, скрытых раннего и позднего сифилиса, вызываемая, по-видимому, стерическими затруднениями, с которыми сталкиваются при проведении реакции. The disadvantages of these compositions is the low selectivity, especially in the case of recurrent, latent early and late syphilis, apparently caused by steric difficulties encountered in the reaction.

Для решения указанной проблемы было предложено использовать фрагмент белка возбудителя сифилиса с молекулярной массой 47 кДа (Патент США N 4868118, 1989, кл. G 01 N 33/53), однако при использовании данного пептида высока вероятность получения ошибочных результатов вследствие того, что не все антитела связываются с данным полипептидом, кроме того, его получение вызывает существенные технологические сложности. To solve this problem, it was proposed to use a protein fragment of the syphilis pathogen with a molecular weight of 47 kDa (US Patent N 4868118, 1989, CL G 01 N 33/53), however, when using this peptide, the probability of obtaining erroneous results is high due to the fact that not all antibodies bind to this polypeptide, in addition, its preparation causes significant technological difficulties.

Прототипом заявляемого решения является композиция и диагностикум, использующие для связывания антител (AT) липопротеиновый фрагмент Treponema pallidum с молекулярной массой 15 кДа (Евр.патент N 0670494, 1996, кл. G 01 N 33/53), подробно описанный в работе (Bunghn R. et all. Infect, Immun. 1996, v.64, N7, p.2457- 2466). Используемая при этом тест-система состоит из планшетов с иммобилизованными пептидами, конъюгата на основе малеимидобензоил- гидроксисукцинимида, реагента Траута (раствора 2-иминотиолана), буферных растворов, сывороток и антисывороток и вспомогательных устройств. The prototype of the proposed solution is a composition and diagnosticum, using for binding of antibodies (AT) a lipoprotein fragment of Treponema pallidum with a molecular weight of 15 kDa (Heb.patent N 0670494, 1996, CL G 01 N 33/53), described in detail in (Bunghn R . et all. Infect, Immun. 1996, v. 64, N7, p. 2457-2466). The test system used for this consists of tablets with immobilized peptides, a conjugate based on maleimidobenzoyl-hydroxysuccinimide, Traut's reagent (solution of 2-iminothiolan), buffer solutions, serums and antisera, and auxiliary devices.

Однако данная композиция также обладает недостаточной селективностью, в ряде случаев дает ложноположительные результаты, а тест-система включает достаточно дорогие и дефицитные компоненты. However, this composition also has insufficient selectivity, in some cases gives false positive results, and the test system includes quite expensive and scarce components.

Задачей, решаемой в рамках заявляемого решения, являлось создание более надежного и точного диагностикума на основе такой композиции пептидов, которая связывалась бы с AT к различным эпитопам белковых молекул и не имела бы стерических затруднений в ходе реакции, обеспечивая тем самым селективность анализа. The problem to be solved within the framework of the proposed solution was the creation of a more reliable and accurate diagnosticum based on such a composition of peptides that would bind AT to various epitopes of protein molecules and would not have steric hindrances during the reaction, thereby ensuring analysis selectivity.

Было найдено, что данная задача решается созданием композиции, содержащей несколько низкомолекулярных пептидных фрагментов белков Tr.pall., каждый из которых мог бы связываться с AT к отдельному эпитопу, а именно состоящей из пептидов 23-51. It was found that this problem is solved by creating a composition containing several low molecular weight peptide fragments of Tr.pall. Proteins, each of which could bind to AT to a separate epitope, namely consisting of peptides 23-51.

TmpA (Sif 13), 67-87 TpD (Sif 15) и 44-61 TpD (Sif 16). (Аминокислотная последовательность указанных фрагментов приведена ниже в тексте описания)
При получении тест-системы указанные пептиды иммобилизуются на поверхности лунок входящего в нее планшета для ИФА в массовом соотношении соответственно 1:1-2:0.5-1.5.TmpA (Sif 13), 67-87 TpD (Sif 15) and 44-61 TpD (Sif 16). (Amino acid sequence of these fragments is given below in the description text)
Upon receipt of the test system, these peptides are immobilized on the surface of the wells of the ELISA plate included in it in a mass ratio of 1: 1-2: 0.5-1.5, respectively.

Данное соотношение обеспечивает повышенную надежность связывания AT, т. к. исходит из ожидаемого соотношения различных AT в сыворотке больного. This ratio provides increased reliability of AT binding, since it is based on the expected ratio of various ATs in the patient's serum.

Тест-система на основе данной смеси включает:
- иммуносорбент - пластиковые планшеты или стрипы планшетов, в лунках которого сорбирована вышеуказанная диагностическая композиция,
- концентрат фосфатного буферного раствора,
- цитратный буферный раствор,
- буферный раствор на основе казеина для разведения анализируемых сывороток (БРС), содержащий 0.02% консерванта,
- стоп-реагент - раствор (4 моль на 1 л) серной кислоты,
- таблетки о-фенилендиамина дигидрохлорида (ОФД),
- таблетки гидроперита,
- положительный контрольный образец (К+) -инактивированная сыворотка больных сифилисом, разведенная на БРС и окрашенная фуксином кислым,
- негативный контрольный образец (К-) -сыворотка здоровых доноров, разведенная на БРС и окрашенная бромтимоловым синим,
- концентраты конъюгата - смесь моноклональных AT против IgG и IgM человека с добавками стабилизаторов и консервантов, меченные пероксидазой хрена. Основными отличиями тест-системы от прототипа является природа иммуносорбента конъюгатов.A test system based on this mixture includes:
- immunosorbent - plastic tablets or strip strips, in the wells of which the above diagnostic composition is sorbed,
- concentrate phosphate buffer solution,
- citrate buffer solution,
- casein-based buffer solution for the dilution of the analyzed sera (BRS), containing 0.02% preservative,
- stop reagent - solution (4 mol per 1 l) of sulfuric acid,
- tablets of o-phenylenediamine dihydrochloride (OFD),
- tablets of hydroperite,
- a positive control sample (K +) -inactivated serum of patients with syphilis, diluted on BRS and stained with fuchsin acid,
- a negative control sample (K-) -serum of healthy donors, diluted in BRS and stained with bromothymol blue,
- Conjugate concentrates - a mixture of monoclonal AT against human IgG and IgM with additives of stabilizers and preservatives, labeled with horseradish peroxidase. The main differences of the test system from the prototype is the nature of the immunosorbent conjugates.

Диагностикум готовят следующим образом. Diagnosticum is prepared as follows.

Полипептиды общей формулы соответственно
Sif-13 23-51 TmpA
Ala-Ser-Glу-Ala-Cуs-Glu-Glu-Ala-GhuLys-Lys-Ala-Ala-Glu- Gln-Alg-Ala-Leu-Leu-Val-Clu-Ser-Ala-His-Ala-Asp-Arg-Arg-Leu.The polypeptides of the General formula, respectively
Sif-13 23-51 TmpA
Ala-Ser-Glu-Ala-Cus-Glu-Glu-Ala-GhuLys-Lys-Ala-Ala-Glu-Gln-Alg-Ala-Leu-Leu-Val-Clu-Ser-Ala-His-Ala-Asp- Arg-Arg-Leu.

Sif-15 67-87 TpD:
Tyr-Phe-Gln-Pro-Val-Glu-Met-His-Pro-Ala-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro- Ser-Lys-Glu-Glu-Ala-Asp,
Sif-16 44-61 TpD:
Ala-Ala-Gly-Phe-Asp-Glu- Phe-Pro-Ile-GlyGlu-Asp-Arg-Asp-Val-Cly-Pro-Leu
получают твердофазным методом по стандартной методике с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом (Barany G. , Merri-field R.B. Solid-phase peptide synthesis In: Pcptides. Analys: s, Syntesis, Biology. Eds.: Gross E.,Meienhofer J., N.Y.-Academic Press. - 1980 - Vol.2,-р.3- 285.). Альфа-аминогруппы блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы:
для лизина - 2-хлорбензилоксикарбонильную,
для гистидина - тозильную,
для треонина и глютаминовой кислоты - соответствующие бензиловые эфиры, для аспарагиновой кислоты - циклогексиловый эфир, для аргинина - мезитиленсульфонильную, для тирозина - 2,6-хлорбензильную.Sif-15 67-87 TpD:
Tyr-Phe-Gln-Pro-Val-Glu-Met-His-Pro-Ala-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Ser-Lys-Glu-Glu-Ala-Asp,
Sif-16 44-61 TpD:
Ala-Ala-Gly-Phe-Asp-Glu-Phe-Pro-Ile-GlyGlu-Asp-Arg-Asp-Val-Cly-Pro-Leu
obtained by the solid phase method according to the standard method with sequential peptide chain growth on a styrene copolymer with 1% divinylbenzene (Barany G., Merri-field RB Solid-phase peptide synthesis In: Pcptides. Analys: s, Syntesis, Biology. Eds .: Gross E. , Meienhofer J., NY-Academic Press. - 1980 - Vol. 2, p. 3-285.). Alpha amino groups are blocked with tert-butyloxycarbonyl groups. The following groups are used to protect the side radicals of trifunctional amino acids:
for lysine - 2-chlorobenzyloxycarbonyl,
for histidine - tosyl,
for threonine and glutamic acid, corresponding benzyl esters, for aspartic acid, cyclohexyl ether, for arginine, mesitylenesulfonyl, for tyrosine, 2,6-chlorobenzyl.

Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или его смесь с 1-оксибензотриазолом. Блокирование ведут с помощью 50% раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане, а нейтрализацию проводят 5% раствором диизопропиламина в дихлорметане. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очистку - гель- и обращеннофазовой хроматографией. For condensation, dicyclohexylcarbodiimide or a mixture thereof with 1-hydroxybenzotriazole is used. Blocking is carried out using a 50% solution of trifluoroacetic acid in dichloromethane, and neutralization is carried out with a 5% solution of diisopropylamine in dichloromethane. Cleavage of the obtained peptides from the polymer and the release of the side protective groups are carried out using HF, and purification by gel and reverse phase chromatography.

Полученный в результате диагностикум позволяет выявить суммарные (IgG, IgM) и IgM-антитела к возбудителю сифилиса в сыворотке или плазме крови доноров, больных, контактных и контингентов риска за счет их взаимодействия с диагностической смесью, сорбированной на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс антиген-антитело обнаруживают с помощью конъюгата - меченных пероксидазой хрена MAT к иммуноглобулинам человека. The resulting diagnosticum allows you to identify total (IgG, IgM) and IgM antibodies to the causative agent of syphilis in the serum or plasma of blood donors, patients, contact and risk contingents due to their interaction with the diagnostic mixture sorbed on the surface of the holes of the polystyrene plate. The resulting antigen-antibody complex is detected using a conjugate labeled with horseradish peroxidase MAT to human immunoglobulins.

Диагностикум позволяет проводить одновременно от 32 до 96 анализов, включая контрольные. Diagnosticum allows you to simultaneously run from 32 to 96 tests, including control.

Для приготовления иммуносорбента пептиды растворяют в 0.05М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, pH 9.5, до конечной концентрации 2-10 мкг на 1 мл. To prepare the immunosorbent, the peptides are dissolved in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer solution, pH 9.5, to a final concentration of 2-10 μg per 1 ml.

Растворы вносят по 0.1 мл в лунки планшетов и инкубируют при 4-6^oC в течение 24 часов. Затем лунки промывают раствором фосфатно-солевого буфера, высушивают и упаковывают.The solutions are added 0.1 ml to the wells of the plates and incubated at 4-6 ^o C for 24 hours. Then the wells are washed with a solution of phosphate-saline buffer, dried and packaged.

Для проведения анализов лунки планшета промывают фосфатно-солевым буфером, содержащим поверхностно-активные вещества, например Твин-20 (ФСРТ), и вносят анализируемые пробы сыворотки, предварительно разведенные в 20 раз ФСРТ, и инкубируют 30-60 мин при 37^oC, после чего несвязанные компоненты смывают многократной промывкой ФСРТ. При наличии в сыворотке антител к сифилису последние специфически связываются пептидами, сорбированными на поверхности лунок, образуя комплекс антиген-антитело (Аг-Ат). Для выявления комплекса в лунки вносят по 0.1 мл конъюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами к иммуноглобулином человека в подходящем разведении ФСРТ и инкубируют 30-60 мин при 37^oC. Несвязанный продукт удаляют промывкой ФСРТ. Связанный коньюгат выявляют обработкой лунок субстратом, содержащим 0.05% орто-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 0.05М фосфатно-цитратном буферном растворе при pH 5.0
Планшет инкубируют 10-20 мин при 15-20^oC, а затем фиксируют реакцию добавлением в лунки 0.05 мл 2М раствора серной кислоты. Наличие комплекса фиксируется с помощью вертикального фотометра на длине волны 490 им.For analysis, the wells of the plate are washed with phosphate-buffered saline containing surfactants, such as Tween-20 (PSRT), and the analyzed serum samples are added, previously diluted 20 times with PSRT, and incubated for 30-60 minutes at 37 ^o C, after whereby unbound components are washed off by repeatedly washing the PSRT. In the presence of antibodies to syphilis in the serum, the latter specifically bind to peptides sorbed on the surface of the wells, forming an antigen-antibody complex (Ag-At). To detect the complex, 0.1 ml of horseradish peroxidase conjugate with monoclonal antibodies to human immunoglobulin in a suitable dilution of PSRT is added to the wells and incubated for 30-60 minutes at 37 ^° C. The unbound product is removed by washing with PSRT. The bound conjugate is detected by treating the wells with a substrate containing 0.05% ortho-phenylenediamine and 0.03% hydrogen peroxide in 0.05M phosphate-citrate buffer solution at pH 5.0
The plate is incubated for 10-20 minutes at 15-20 ^° C, and then the reaction is fixed by adding 0.05 ml of 2M sulfuric acid solution to the wells. The presence of the complex is recorded using a vertical photometer at a wavelength of 490 im.

Результаты анализа сывороток 165 больных и 50 доноров с помощью заявляемого изобретения приведены в табл.1. Влияние соотношения пептидов на свойства диагностикума приведены в табл. 2. The results of the analysis of sera of 165 patients and 50 donors using the claimed invention are shown in table 1. The effect of the ratio of peptides on the properties of the diagnosticum are given in table. 2.

Таким образом, заявляемая тест-система со смесью пептидов на поверхности лунок обладает большей точностью и селективностью по сравнению с прототипом и диагностиками, содержащими индивидуальные пептиды. Thus, the inventive test system with a mixture of peptides on the surface of the wells has greater accuracy and selectivity compared to the prototype and diagnostics containing individual peptides.

Выпуск заявляемой тест-системы налажен в ТОО "Научно-производственное предприятие "Аквапаст" под условным наименованию "АКВАСИФ". The release of the inventive test system has been established at the Aquapast Scientific-Production Enterprise LLP under the symbol "AQUASIF".

Claims

1. Diagnostic composition for determining syphilis by enzyme immunoassay, containing fragments of protein antigens Treponema pallidum, characterized in that as fragments of antigens it contains a mixture of peptides Sif-13 23 - 51 TmpA, Sif-15 67 - 87 TpD, Sif-16 44 - 61 TpD Treponema pallidum.

2. The diagnostic composition according to claim 1, characterized in that it contains a mixture of peptides in the ratio: Sif-13 23 - 51 TmpA: Sif-15 67 - 87 TpD: Sif-16 44 - 61 TpD = 1: 1 - 2: 0.5 - 1.5.

3. Test system for the determination of syphilis by enzyme-linked immunosorbent assay, consisting of an immunosorbent - a plastic tablet with wells containing immobilized fragments of Treponema pallidum protein antigens, buffer solutions, blood serum, conjugate and auxiliary solutions and devices on the inside, characterized in that as fragments of antigens, the immunosorbent contains a mixture of Sif-13 23-51 TmpA peptides; Sif-15 67 - 87 TpD; Sif-16 44 - 61 TpD, Treponema pallidum, and as a conjugate - a mixture of monoclonal antibodies against human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase.