RU2136747C1 - Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity - Google Patents
Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2136747C1 RU2136747C1 RU96117316A RU96117316A RU2136747C1 RU 2136747 C1 RU2136747 C1 RU 2136747C1 RU 96117316 A RU96117316 A RU 96117316A RU 96117316 A RU96117316 A RU 96117316A RU 2136747 C1 RU2136747 C1 RU 2136747C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- human
- ethanol
- hiv
- cells
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности предназначено для инактивации вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) в биологических жидкостях и других биологических материалах для получения антигена, используемого в диагностических тест-системах, а также для иммунизации лабораторных животных с целью получения иммунного ответа и вакцинопрофилактики. The invention relates to medicine, in particular, is intended for inactivation of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in biological fluids and other biological materials to obtain the antigen used in diagnostic test systems, as well as for immunization of laboratory animals in order to obtain an immune response and vaccination.
Известен способ инактивации ВИЧ-1 для получения антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах путем введения в вирусосодержащую суспензию (вирус выращивают на лимфоцитах человека МТ-4) твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией не менее 24 часов при температуре 6oC (авт. свид. СССР N 1717631, МКИ C 12 N 7/00, опубл. 07.03.92).A known method of inactivating HIV-1 to obtain an antigen suitable for use in diagnostic test systems by introducing Tween-80 to a final concentration of 0.1% into a virus-containing suspension (the virus is grown on human lymphocytes MT-4) followed by incubation for at least 24 hours at a temperature of 6 o C (ed. certificate. USSR N 1717631, MKI C 12 N 7/00, publ. 07.03.92).
Недостатком данного способа является длительность процесса инактивации вируса, цитотоксическое действие твина-80 на культуры клеток, а при иммунизации полученным антигеном животных могут наблюдаться аллергические реакции. The disadvantage of this method is the length of the process of inactivation of the virus, the cytotoxic effect of Tween-80 on cell culture, and when immunized with the resulting antigen of animals, allergic reactions can be observed.
Известен способ инактивации вируса, включающий ведение в суспензию культуры клеток, инфицированных вирусом бешенства, раствора этанола в конечной концентрации 20% инкубирование смеси при 30-31oC в течение 12-14 суток (авт. свид. СССР N 770196, МКИ C 12 N 7/00, 07.04.83).A known method of inactivation of the virus, comprising maintaining a suspension of cells infected with rabies virus, a solution of ethanol at a final concentration of 20% incubation of the mixture at 30-31 o C for 12-14 days (ed. Certificate. USSR N 770196, MKI C 12 N 7/00, 04/07/83).
Недостатком способа является длительность процесса инактивации вируса и высокая концентрация этанола в суспензии, что может вызвать цитотоксическое действие реагента на культуру клеток. The disadvantage of this method is the length of the process of inactivation of the virus and a high concentration of ethanol in suspension, which can cause the cytotoxic effect of the reagent on cell culture.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ ингибирования инфекционной активности ВИЧ-1, включающий обработку вирусосодержащей суспензии культур клеток человека или животных этанолом в конечной концентрации не менее 70% с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре (СПИД в акушерстве и перинатологии// Учебное пособие для студентов, субординаторов, врачей-интернов и слушателей ФУВ. - Минздрав РФ, Хабаровск, 1992, с. 31). The closest technical solution (prototype) is a method of inhibiting the infectious activity of HIV-1, which includes treating a virus-containing suspension of human or animal cell cultures with ethanol in a final concentration of at least 70%, followed by incubation of the mixture at room temperature (AIDS in obstetrics and perinatology // Tutorial for students, subordinates, interns and trainees of the Faculty of Internal Medicine - Ministry of Health of the Russian Federation, Khabarovsk, 1992, p. 31).
Недостатком прототипа является высокая концентрация этанола в вирусосодержащей суспензии, что может вызвать цитотоксическое действие реагента на культуру клеток. The disadvantage of the prototype is the high concentration of ethanol in the virus-containing suspension, which can cause the cytotoxic effect of the reagent on the cell culture.
Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа, который позволил бы при низких концентрациях реагента инактивировать инфекционную активность вируса иммунодефицита человека с сохранением антигенности и иммуногенности вирусных белков и других биологически активных веществ (иммуноглобулинов) с сохранением жизнеспособности и нормальной функции культур клеток человека или животных. The objective of the invention is the creation of such a method that would allow at low concentrations of the reagent to inactivate the infectious activity of the human immunodeficiency virus while maintaining the antigenicity and immunogenicity of viral proteins and other biologically active substances (immunoglobulins) while maintaining the viability and normal function of human or animal cell cultures.
Указанная задача решается тем, что в способе ингибирования инфекционной активности вируса иммунодефицита человека, включающем обработку ВИЧ-содержащей суспензии культур клеток человека или животных этанолом с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре, согласно изобретению обработку этанолом проводят в конечных концентрациях, достаточных для потери инфекционной активности вируса иммунодефицита человека не менее чем на 1 lg и не влияющих на жизнеспособность и нормальную функцию культур клеток человека или животных. This problem is solved by the fact that in the method of inhibiting the infectious activity of the human immunodeficiency virus, comprising treating an HIV-containing suspension of human or animal cell cultures with ethanol, followed by incubating the mixture at room temperature, according to the invention, the treatment with ethanol is carried out in final concentrations sufficient to lose the infectious activity of the virus human immunodeficiency by at least 1 lg and not affecting the viability and normal function of human or animal cell cultures.
Конечная концентрация этанола в ВИЧ-содержащей суспензии культур клеток человека или животных составляет (1,0 - 7,0)%. The final concentration of ethanol in the HIV-containing suspension of human or animal cell cultures is (1.0 - 7.0)%.
Для получения антигена вируса иммунодефицита человека обработку ВИЧ-содержащей суспензии проводят не менее 30 минут. To obtain the human immunodeficiency virus antigen, the treatment of the HIV-containing suspension is carried out for at least 30 minutes.
Инактивация ВИЧ-1 инфекции основана на вирулицидном и антивирусном действии этанола. Inactivation of HIV-1 infection is based on the virucidal and antiviral effects of ethanol.
При конечной концентрации этанола 10% и более наблюдается его токсическое действие на лимфоидные клетки, а при конечной концентрации менее 1,0% отмечается снижение инактивирующих свойств этанола. At a final concentration of ethanol of 10% or more, its toxic effect on lymphoid cells is observed, and at a final concentration of less than 1.0%, a decrease in the inactivating properties of ethanol is noted.
Способ ингибирования инфекционной активности ВИЧ-1 осуществляют следующим образом. A method of inhibiting the infectious activity of HIV-1 is as follows.
Пример 1. Оценка токсического действия этанола на биологические объекты из периферической крови человека. Example 1. Assessment of the toxic effects of ethanol on biological objects from human peripheral blood.
Вначале выделяют лимфоциты по методике Boyom (1966) и подсчитывают по обычной методике в камере Горяева. Далее клетки суспензируют в питательной среде RPMI-1640 с 15% сыворотки плода коровы, 2мМ L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина, 160 мкг/мл гентамицина. После чего клеточную суспензию с концентрацией 1 млн. клеток в 1 мл разливают в 24-х луночные культуральные планшеты фирмы "Costar" (Нидерланды) с последующим введением туда различных конечных концентраций медицинского этанола. Диапазон концентраций составляет (20-1,25)%. Клеточную суспензию инкубируют при 37 градусах C, в увлажненной атмосфере (95%) с 5% CO2, отмечают ее состояние в течение 96 часов путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе "Diavert" (Германия) и подсчитывают количество клеток в каждой лунке с определением жизнеспособности клеток по обычной методике (окраска 0,04% раствором трипанового синего). Полученные результаты приведены в табл. 1.First, lymphocytes are isolated according to the Boyom method (1966) and counted according to the usual method in the Goryaev chamber. The cells are then suspended in RPMI-1640 culture medium with 15% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 μg / ml kanamycin, 160 μg / ml gentamicin. Then a cell suspension with a concentration of 1 million cells in 1 ml is poured into 24-well culture plates of the company "Costar" (Netherlands), followed by the introduction of various final concentrations of medical ethanol. The concentration range is (20-1.25)%. The cell suspension is incubated at 37 degrees C, in a humidified atmosphere (95%) with 5% CO 2 , its state is noted for 96 hours by visual inspection with an inverted Diavert microscope (Germany), and the number of cells in each well is determined to determine the viability cells according to the usual method (staining with a 0.04% trypan blue solution). The results are shown in table. 1.
Как видно из таблицы 1, препарат этанола оказывал токсическое воздействие на жизнеспособность лимфоцитов человека в концентрации 20% и 10%, в то время как концентрации 5%, 2,5% и 1,25% не оказывали токсического воздействия на клетки человека. As can be seen from table 1, the ethanol preparation had a toxic effect on the viability of human lymphocytes at a concentration of 20% and 10%, while concentrations of 5%, 2.5% and 1.25% did not have a toxic effect on human cells.
Пример 2. Оценка ингибирующей активности этанола (конечная концентрация 2,5% и 5,0%) на штамм ВИЧ-1 в течение 10 минут. Example 2. Evaluation of the inhibitory activity of ethanol (final concentration of 2.5% and 5.0%) per strain of HIV-1 for 10 minutes.
Исследования проводились на штамме ВИЧ-1 путем инкубации нетоксичных конечных концентраций (5% и 2,5%) равных объемов этанола и исходной концентрации вируссодержащей суспензии-ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого готовят десятикратные разведения вирусосодержащей суспензии в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2мМ L- глутамина, 100 мкг/мл канамицина, 160 мкг/мл гентамицина, вносят в пермессивную лимфобластоидную культуру клеток человека МТ-4, рассеченную в 96-луночные культуральные планшеты фирмы "Costar" в объеме 200 мкл с концентрацией клеток 1 млн/мл. Клеточную суспензию инкубируют при температуре 37oC, во влажной атмосфере (95%) с 5% CO2 и проводят титрование инфекционности ВИЧ-1 на культуре перевиваемых лимфобластоидных клеток человека МТ-4. Наблюдение проводят ежедневно путем микроскопии лунок планшета под инвертированным микроскопом "Diavert" с регистрацией процесса кластерообразования, жизнеспособности клеток и приготовлением мазков клеток на предметном обезжиренном стекле с целью определения количества инфицированных клеток МТ-4 в реакции непрямой иммунофлуоресценции (НИФ). Мазки клеток после высушивания фиксируют в растворе охлажденного до минус 20 градусов C ацетона в течение 12 ч. Затем их обрабатывают рабочими разведениями сывороток, содержащих специфические антитела к ВИЧ-1 (1:100) и контрольных в течение 30 мин во влажной камере при температуре 37 градусов С. После чего их трижды отмывают в физиологическом растворе и окрашивают кроличьими антителами против иммуноглобулинов человека, меченными ФИТЦ в разведении 1:32 в течение 20 мин во влажной камере при температуре 37 градусов С. На заключительном этапе мазки дважды промывают забуференным физиологическим раствором и ополаскивают дистиллированной водой, после чего проводят их микроскопию на флуоресцентном микроскопе "Axioskop" фирмы Opton (Германия), определяя процент инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 и интенсивность флуоресцентного свечения инфицированных клеток. Полученные данные при 10-минутной экспозиции этанола с ВИЧ-1 приведены в табл. 2.Studies were conducted on the HIV-1 strain by incubating non-toxic final concentrations (5% and 2.5%) of equal volumes of ethanol and the initial concentration of the virus-containing suspension of HIV-1 at room temperature for 10 minutes. After this, ten-fold dilutions of the virus-containing suspension are prepared in RPMI-1640 nutrient medium with the addition of 10% cow fetal serum, 2 mM L-glutamine, 100 μg / ml kanamycin, 160 μg / ml gentamicin, introduced into the permissive lymphoblastoid cell culture of MT-4 dissected in 96 well Costar culture plates in a volume of 200 μl with a cell concentration of 1 million / ml. The cell suspension is incubated at a temperature of 37 o C, in a humid atmosphere (95%) with 5% CO 2 and titration of HIV-1 infectivity is carried out on a culture of transplantable human lymphoblastoid cells MT-4. The observation is carried out daily by microscopy of the plate wells under an inverted "Diavert" microscope with registration of the process of cluster formation, cell viability and preparation of cell smears on a defatted glass slide in order to determine the number of infected MT-4 cells in the indirect immunofluorescence (NIF) reaction. The smears of the cells after drying are fixed in a solution of acetone chilled to minus 20 degrees C for 12 hours. Then they are treated with working dilutions of sera containing specific antibodies to HIV-1 (1: 100) and control for 30 minutes in a humid chamber at a temperature of 37 degrees C. After that they are washed three times in physiological saline and stained with rabbit antibodies against human immunoglobulins labeled with FITC diluted 1:32 for 20 minutes in a humid chamber at a temperature of 37 degrees C. At the final stage, two smears rows washed with buffered saline, and rinsed with distilled water, and then carry them on a fluorescent microscope microscopy "Axioskop" firm Opton (Germany), by determining the percentage of HIV-1 infected MT-4 cells and the intensity of the fluorescent emission of the infected cells. The data obtained with a 10-minute exposure of ethanol with HIV-1 are given in table. 2.
Как видно из табл. 2, этанол в обеих концентрациях (5% и 2,5%) при 10-минутной обработке ВИЧ-1 ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg и приводит к снижению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток во всех тестированных разведениях, со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток. As can be seen from the table. 2, ethanol in both concentrations (5% and 2.5%) with a 10-minute treatment with HIV-1 inhibits HIV-1 infectivity by 1 lg and leads to a decrease in the percentage of HIV-1 infected cells in all dilutions tested, with a decrease in the fluorescence intensity glow of infected cells.
Пример 3. Оценка ингибирующей активности этанола (конечная концентрация 5% и 2,5%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 20 минут приведена в табл. 3. Методика проведения исследований описана в примере 2. Example 3. Evaluation of the inhibitory activity of ethanol (final concentration of 5% and 2.5%) in relation to the strain of HIV-1 at room temperature for 20 minutes are given in table. 3. The research methodology is described in example 2.
Как видно из табл. 3, этанол в концентрации 5% при 20-минутной обработке ВИЧ-1 ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg и приводит к снижению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток во всех тестированных разведениях по сравнению с контрольной культурой клеток МТ-4 инфицированной ВИЧ-1, со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток во всех разведениях вируса. Отмечается значительное увеличение способности к кластерообразованию инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 почти до уровня (100%) неинфицированного контроля клеток МТ-4 во всех исследуемых концентрациях ВИЧ-1. As can be seen from the table. 3, ethanol at a concentration of 5% with a 20-minute treatment with HIV-1 inhibits HIV-1 infectivity by 1 lg and leads to a decrease in the percentage of HIV-1 infected cells in all tested dilutions compared to the control culture of MT-4 cells infected with HIV-1 , with a decrease in the intensity of the fluorescent glow of infected cells in all dilutions of the virus. There is a significant increase in the ability to cluster formation of HIV-1 infected MT-4 cells to almost (100%) uninfected control of MT-4 cells in all tested HIV-1 concentrations.
Пример 4. Оценка ингибирующей активности этанола (концентраций 5% и 2,5%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 30 минут приведена в табл. 4. Методика проведения исследований описана в примере 2. Example 4. Evaluation of the inhibitory activity of ethanol (concentrations of 5% and 2.5%) in relation to the strain of HIV-1 at room temperature for 30 minutes are given in table. 4. The research methodology is described in example 2.
Как видно из табл. 4, при 30-минутной обработке ВИЧ-содержащей суспензии этанолом в конечной концентрации (5% и 2,5%) происходит значительное изменение инфицирующих свойств вируса, поскольку кластерообразование инфицированных клеток МТ-4 сохранялось во всех исследованных разведениях вируса на уровне неинфицированного контроля клеток. Кроме того, этанол полностью ингибирует инфекционность ВИЧ-1 на 2 lg и приводит к значительному уменьшению процента инфицированных ВИЧ-1 клеток в оставшихся более концентрированных разведениях ВИЧ-1 (10-1 и 10-2) до 5-20%. При этом снижается интенсивность флуоресцентного свечения инфицированных клеток МТ-4, а следовательно, и степень репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в них.As can be seen from the table. 4, a 30-minute treatment of the HIV-containing suspension with ethanol at a final concentration (5% and 2.5%) causes a significant change in the infectious properties of the virus, since the cluster formation of infected MT-4 cells was maintained in all studied dilutions of the virus at the level of uninfected cell control. In addition, ethanol completely inhibits the infectivity of HIV-1 by 2 lg and leads to a significant decrease in the percentage of HIV-1 infected cells in the remaining more concentrated dilutions of HIV-1 (10 -1 and 10 -2 ) to 5-20%. At the same time, the intensity of the fluorescent glow of infected MT-4 cells decreases, and therefore, the degree of reproduction of the human
Пример 5. Оценка ингибирующей активности этанола (конечные концентрации 2,5% и 1,0%) в отношении штамма ВИЧ-1 при комнатной температуре в течение 60 минут приведена в табл. 5. Методика проведения исследований описана в примере 2. Example 5. Evaluation of the inhibitory activity of ethanol (final concentrations of 2.5% and 1.0%) in relation to the strain of HIV-1 at room temperature for 60 minutes are given in table. 5. The research methodology is described in example 2.
Как видно из табл. 5, при 60-минутной обработке ВИЧ-инфицированных клеток этанолом в конечных концентрациях (2,5% и 1,0%) наблюдается изменение инфицирующих свойств вируса, поскольку кластерообразование инфицированных клеток в основном сохраняется во всех исследованных разведениях вируса на уровне неинфицированного контроля клеток, а также отмечается снижение процента светящихся в НИФ инфицированных клеток МТ-4. При этом этанол полностью инактивирует инфекционность ВИЧ-1 на 1 lg со снижением интенсивности флуоресцентного свечения инфицированных клеток МТ-4, а следовательно, и степени репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в них. As can be seen from the table. 5, with a 60-minute treatment of HIV-infected cells with ethanol at final concentrations (2.5% and 1.0%), a change in the infectious properties of the virus is observed, since the clustering of infected cells is mainly preserved in all investigated dilutions of the virus at the level of uninfected cell control, and there is also a decrease in the percentage of infected MT-4 cells glowing in NIFs. Moreover, ethanol completely inactivates HIV-1 infectivity by 1 lg with a decrease in the fluorescence intensity of infected MT-4 cells, and, consequently, the degree of reproduction of the human
Экспериментальные исследования показывают, что при конечной концентрации этанола 10% и более наблюдается его токсическое действие на лимфоидные клетки, а при конечной концентрации менее 1,0% отмечается снижение инактивирующих свойств этанола. Причем установлено, что при повторной или многократной обработке культуры клеток этанолом в концентрациях (1-7%) не чаще чем через 3 часа после предыдущей обработки и длительности курса 1 сутки приводит к усилению инактивирующего действия препарата на ВИЧ-инфекцию без появления токсического эффекта на тестируемую культуру клеток. Experimental studies show that at a final concentration of ethanol of 10% or more, its toxic effect on lymphoid cells is observed, and at a final concentration of less than 1.0%, a decrease in the inactivating properties of ethanol is noted. Moreover, it was found that with repeated or repeated treatment of the cell culture with ethanol in concentrations (1-7%) no more than 3 hours after the previous treatment and the course duration of 1 day leads to an increase in the inactivating effect of the drug on HIV infection without the toxic effect on the test cell culture.
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU96117316A RU2136747C1 (en) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU96117316A RU2136747C1 (en) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU96117316A RU96117316A (en) | 1998-11-20 |
RU2136747C1 true RU2136747C1 (en) | 1999-09-10 |
Family
ID=20184900
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU96117316A RU2136747C1 (en) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2136747C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002020828A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Bioavailability Systems, Llc | Method for simplified shipping of clinical specimens and optional direct analysis |
-
1996
- 1996-08-27 RU RU96117316A patent/RU2136747C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002020828A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Bioavailability Systems, Llc | Method for simplified shipping of clinical specimens and optional direct analysis |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Jawetz et al. | The combined action of penicillin with streptomycin or chloromycetin on enterococci in vitro | |
Waller | Sensitivity of Encephalitozoon cuniculi to various temperatures, disinfectants and drugs | |
Steinhardt et al. | Studies on the cultivation of the virus of vaccinia | |
Deplazes et al. | Dual microsporidial infection due to Vittaforma corneae and Encephalitozoon hellem in a patient with AIDS | |
GB2220939A (en) | Peptide fragments of HIV | |
Spendlove et al. | Effect of antimitotic agents on intracellular reovirus antigen | |
RU2136747C1 (en) | Method of inhibition of human immunodeficiency virus infectious activity | |
Dochez et al. | Study of the Virus of the Common Cold and its Cultivation in Tissue Medium. | |
Phillpotts et al. | A search for persistent virus infection in Crohn's disease. | |
Burke et al. | The isolation of a latent adenolike virus from chicken kidney cell cultures | |
Cleary et al. | Activated macrophages demonstrate direct cytotoxicity, antibody-dependent cellular cytotoxicity, and enhanced binding of Naegleria fowleri amoebae | |
EP1389133B1 (en) | Methods for inactivating viruses | |
Hess et al. | Some properties of the virus of duck plague | |
Gershenfeld | Iodine as a virucidal agent | |
Liebhaber et al. | STUDIES OF A MYXOVIRUS RECOVERED FROM PATIENTS WITH INFECTIOUS HEPATITIS: I. ISOLATION AND CHARACTERIZATION | |
Morton et al. | Some properties of the inhibitor (s) of lymphocyte mitosis derived from Mycoplasma | |
Hinze et al. | Occurrence of focal three-dimensional proliferation in cultured human cells after prolonged infection with herpes simplex virus | |
SU1529119A1 (en) | Method of determining neuroviruses in cerebrospinal fluid | |
RU2802251C1 (en) | Vaccine composition for the prevention of enzootic abortion in sheep | |
Kaplan et al. | A method for preparing smallpox vaccine on a large scale in cultured cells | |
Chacko | A study of the Treponema immobilizing antibody in syphilis | |
RU2026346C1 (en) | Inhibitor of human and animal enteroviruses | |
Shimazaki et al. | Detection of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and hepatitis C virus in donor eyes using polymerase chain reaction. | |
Nester et al. | Antheridiogen activity of Anemia mexicana | |
RU2225223C1 (en) | Lyophilized antiherpetic vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120828 |