RU2136313C1

RU2136313C1 - Stabilizing composition for preparing reference-sera containing igm-antibodies

Info

Publication number: RU2136313C1
Application number: RU97113547A
Authority: RU
Inventors: А.Н. Канев; Л.Г. Карпович; Т.В. Калашникова; А.Г. Майданюк
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1997-08-06
Publication date: 1999-09-10

Abstract

FIELD: biotechnology, immunology. SUBSTANCE: composition has the following quantitative ratio of components, wt.-%: bovine serum albumin 0.5-1.5; ethylenediaminetetraacetate 0.01-0.1; ascorbic acid 0.01-0.001; peptone 0.5-2.5; sucrose 4.5-10.0; potassium chloride 0.5-1.5; bacteriostatic 0.01-0.15 and negative donor serum of the group 0(1) - the rest up to 100%. Stabilizing composition provides the retention of specific indices of IgM-antibodies in reference-sera for the long time (for two years, not less) at their storage at (+4 ± 2 C). EFFECT: improved quality and properties of the composition. 2 cl, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохраняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени. В частности изобретение касается стабилизирующих составов для изготовления референс-сывороток и/или панелей сывороток, содержащих антитела IgM к вирусным антигенам. The invention relates to biotechnology and immunology and can be used to obtain stable forms of immunobiological preparations that retain their specific characteristics for a long time. In particular, the invention relates to stabilizing compositions for the manufacture of reference sera and / or serum panels containing IgM antibodies to viral antigens.

Сыворотки с нормированным уровнем антител IgM, сохраняющие этот уровень неизменным в течение не менее 2 лет, необходимы для ранней диагностики ряда особо опасных вирусных инфекций, например гепатита A и ВИЧ, т.к. они нарабатываются в крови инфицированных в среднем на 2 - 3 недели раньше, чем IgG-антитела. Serum with a normalized level of IgM antibodies, keeping this level unchanged for at least 2 years, is necessary for the early diagnosis of a number of especially dangerous viral infections, such as hepatitis A and HIV, because they are produced in the blood of infected people on average 2 to 3 weeks earlier than IgG antibodies.

Действующее начало положительной сыворотки - специфические антитела (иммуноглобулины, например IgM или IgG). Стабилизирующий состав должен, во-первых, способствовать сохранению активности антител, во-вторых, предотвращать появление ложноположительного сигнала за счет неспецифической сорбции компонентов сыворотки. Белковые компоненты положительной сыворотки являются защитной средой для специфических антител, одна они не обеспечивают полного сохранения активности антител при лиофилизации и хранении. The active principle of positive serum is specific antibodies (immunoglobulins, such as IgM or IgG). The stabilizing composition should, firstly, help maintain the activity of antibodies, and secondly, prevent the appearance of a false-positive signal due to non-specific sorption of serum components. The protein components of positive serum are a protective environment for specific antibodies, but they alone do not fully preserve the activity of antibodies during lyophilization and storage.

Известны стабилизирующие составы для получения лиофилизированных препаратов положительных сывороток крови, включающий углеводы, например сахарозу и глюкозу (Подольский М.В. Высушивание препаратов крови и кровезаменителей. М. : Медицина, 1973, с. 101-102). Known stabilizing compositions for producing lyophilized preparations of positive blood serum, including carbohydrates, such as sucrose and glucose (Podolsky M.V. Drying of blood products and blood substitutes. M.: Medicine, 1973, S. 101-102).

Однако такие стабилизирующие составы в составе указанных препаратов затрудняют достижение заданной влажности препаратов (1-3%) в процессе их лиофильной сушки, требуют специальных режимов досушивания, что значительно усложняет технологический процесс получения препарата. Кроме того, такие стабилизаторы не обеспечивают длительное хранение сухих препаратов при положительных температурах, в частности они не обеспечивают сохранение сигналов в иммуно-ферментном анализе (ИФА). However, such stabilizing compositions in the composition of these drugs make it difficult to achieve a given moisture content of the preparations (1-3%) in the process of their freeze drying, require special drying modes, which greatly complicates the manufacturing process of the drug. In addition, such stabilizers do not provide long-term storage of dry preparations at positive temperatures, in particular, they do not ensure the preservation of signals in immuno-enzyme analysis (ELISA).

Известен стабилизирующий состав для получения лиофилизированных контрольных положительных сывороток крови на IgG-антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1), включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов (Экспериментально производственный регламент. Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека "Рекомбинат ВИЧ". - НПО "Вектор", Новосибирск , 1988, с. 1 - 7). В качестве пептидных компонентов используют отрицательную сыворотку крови человека, не содержащую специфические антитела к ВИЧ - 7% и сахарозу - 4,7%. Known stabilizing composition for producing lyophilized control positive blood serum for IgG antibodies to human immunodeficiency virus (HIV-1), including peptide and / or a mixture of peptide and carbohydrate components (Experimental production schedule. Immunoenzyme test system for detecting antibodies to human immunodeficiency virus “Recombinant HIV.” - NPO Vector, Novosibirsk, 1988, pp. 1-7). As peptide components, negative human blood serum is used that does not contain specific antibodies to HIV - 7% and sucrose - 4.7%.

Однако такие стабилизаторы не обеспечивают длительное хранение сухих препаратов, содержащих IgG- и IgM-антитела, при положительных температурах, в частности они не обеспечивают сохранение сигнала в иммуноферментном анализе (ИФА). However, such stabilizers do not provide long-term storage of dry preparations containing IgG and IgM antibodies at positive temperatures, in particular, they do not provide signal preservation in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Известен стабилизирующий состав для получения лиофилизированных положительных контрольных сывороток, содержащих IgG-антитела (патент РФ N 2011202, кл. G 01 N 33/531, опубл. 1994), включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Этилендиаминтетраацетат - 0,02 - 0,22
Пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов - 1,0 - 20,0
Вода - Остальное
Основным недостатком данного стабилизирующего состава является то, что он разработан для стабилизации IgG-антител в сыворотках крови, которые по своим структурным и физико-химическим характеристикам значительно отличаются от IgM-антител. Это обусловлено тем, что IgM-антитела имеют в 5 раз более высокую молекулярную массу, чем IgG-антитела. Соответственно структура IgM менее упорядочена и менее устойчива в отношении воздействия температуры, pH, физических стрессов и химических агентов. Следовательно, и состав стабилизатора, и режим лиофилизации будут существенно отличаться.Known stabilizing composition for obtaining lyophilized positive control sera containing IgG antibodies (RF patent N 2011202, class G 01 N 33/531, publ. 1994), including peptide and / or a mixture of peptide and carbohydrate components, ethylene diamine tetraacetate (EDTA) and water, in the following ratio of components, wt.%:
Ethylene diamine tetraacetate - 0.02 - 0.22
Peptide and / or a mixture of peptide and carbohydrate components - 1.0 - 20.0
Water - Else
The main disadvantage of this stabilizing composition is that it is designed to stabilize IgG antibodies in blood serum, which in their structural and physicochemical characteristics differ significantly from IgM antibodies. This is due to the fact that IgM antibodies have 5 times higher molecular weight than IgG antibodies. Accordingly, the structure of IgM is less ordered and less stable in relation to the effects of temperature, pH, physical stress and chemical agents. Therefore, both the composition of the stabilizer and the lyophilization regime will differ significantly.

Наиболее близким техническим решением (прототипом), является человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и хлорид натрия в буферном растворе, N-ацетил триптофанат, натрий каприлат, азид натрия и фосфатный буферный раствор (международная заявка (WO) N 90/11091, кл. A 61 K 39/395, опубл. 04.10.90), при следующем количественном соотношении компонентов:
ЧСА в количестве от 2,5% (w/v) до 5% (w/v);
хлористый натрий - 270 мМ;
N-ацетил триптофанат 2 - 4 мМ;
натрий каприлат 2 - 4 мМ;
азид натрия 0,1%;
фосфатный буфер (от 8 мМ до 20 мМ натрий фосфат) при pH 6,8 - 7,4;
или трометаниновый буфер (от 5 мМ до 100 мМ трометанина) при pH 8,0-10,0.The closest technical solution (prototype) is human serum albumin (HSA) and sodium chloride in a buffer solution, N-acetyl tryptophanate, sodium caprylate, sodium azide and phosphate buffer solution (international application (WO) N 90/11091, class A 61 K 39/395, publ. 04.10.90), with the following quantitative ratio of components:
HSA in an amount of from 2.5% (w / v) to 5% (w / v);
sodium chloride - 270 mm;
N-acetyl tryptophanate 2-4 mM;
sodium caprylate 2 - 4 mm;
sodium azide 0.1%;
phosphate buffer (from 8 mm to 20 mm sodium phosphate) at a pH of 6.8 - 7.4;
or tromethanine buffer (from 5 mM to 100 mM tromethanine) at a pH of 8.0-10.0.

Данный стабилизатор предназначен для инъекционных препаратов в жидкой и сухой форме, содержащих IgM-атитела в количестве около 5 мг/мл. Предлагаемый состав увеличивает стабильность IgM-антител в растворах. Полученный раствор может быть лиофилизирован для получения сухой формы, более устойчивой к воздействию физических и химических (повреждающих) факторов. Он разработан для предотвращения агргегации молекул IgM и сохранения биологических свойств препаратов для инъекций. This stabilizer is intended for injection in liquid and dry form, containing IgM antibodies in an amount of about 5 mg / ml. The proposed composition increases the stability of IgM antibodies in solutions. The resulting solution can be lyophilized to obtain a dry form that is more resistant to physical and chemical (damaging) factors. It is designed to prevent the aggregation of IgM molecules and preserve the biological properties of injectable drugs.

К основным недостаткам прототипа следует отнести следующие:
1. Нежелательное использование в качестве бактерицидной добавки азида натрия. Для сухих биологических препаратов, приготовленных методом лиофилизации, Советом экспертов ВОЗ не рекомендуется использовать азид натрия, т. к. он обладает высокой летучестью и удаляется из препаратов в процессе лиофильной сушки.The main disadvantages of the prototype include the following:
1. Undesirable use of sodium azide as a bactericidal additive. For dry biological preparations prepared by lyophilization, the WHO Expert Council does not recommend the use of sodium azide, because it has high volatility and is removed from the preparations during freeze drying.

2. Отсутствие экспериментальных данных, подтверждающих сохранение качества (годности) жидких или сухих препаратов в течение 2-х лет. На основании приведенных в патенте результатов по термической деградации инъекционных форм, содержащих IgM-антитела, можно оценить срок их годности не более 1 - 1,5 лет. 2. Lack of experimental data confirming the preservation of the quality (shelf life) of liquid or dry preparations for 2 years. Based on the results of the thermal degradation of injectable forms containing IgM antibodies given in the patent, their shelf life can be estimated at no more than 1-1.5 years.

3. Использование в качестве компонента стабилизатора ЧСА для референс-материалов экономически невыгодно по сравнению с другими сывороточными альбуминами: бычий сывороточный альбумин (БСА) или лошадиный сывороточный альбумин (ЛСА), которые выполняют те же функции по стабилизации протеинов, что и ЧСА, в 3 - 5 раз дешевле. 3. The use of a CSA stabilizer as a component of reference materials is economically disadvantageous in comparison with other serum albumin: bovine serum albumin (BSA) or horse serum albumin (LSA), which perform the same functions of protein stabilization as HSA in 3 - 5 times cheaper.

Подводя итог изложенному выше, следует отметить, что используемые в известных источниках научно-технической и патентной информации стабилизирующие составы не могут быть использованы при изготовлении референс-сывороток с нормированным уровнем IgM-антител, вследствие чего требуется разработка составов-стабилизаторов для получения препаратов со специфическими характеристиками, остающимися неизменными в течение длительного времени в соответствии с требованиями комитета экспертов ВОЗ к референс-материалам. Summarizing the above, it should be noted that the stabilizing compositions used in well-known sources of scientific, technical and patent information cannot be used in the manufacture of reference serums with a normalized level of IgM antibodies, which therefore requires the development of stabilizing compositions to obtain preparations with specific characteristics remaining unchanged for a long time in accordance with the requirements of the WHO expert committee on reference materials.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания такого стабилизирующего состава, который обеспечивал бы сохранение специфических характеристик IgM-антител в референс-сыворотках в течение длительного времени (не менее 2 лет) при хранении их при температуре (+4 ± 2)^oC.The basis of the present invention is the task of creating such a stabilizing composition, which would ensure the preservation of specific characteristics of IgM antibodies in reference serums for a long time (at least 2 years) when stored at a temperature of (+4 ± 2) ^o C.

Указанная задача решается тем, что в стабилизирующем составе для получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела, включающем сывороточный белок, неорганическую соль и бактериостатик, согласно изобретению состав дополнительно содержит этилендиаминтетраацетат (Трилон Б), пептон, сахарозу, отрицательную донорскую сыворотку группы 0(I) и аскорбиновую кислоту, в качестве сывороточного белка используют бычий сывороточный альбумин, а в качестве неорганической соли - хлористый калий, при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,5 - 1,5
Этилендиаминтетраацетат - 0,01 - 0,1
Аскорбиновая кислота - 0,01 - 0,001
Пептон - 0,5 - 2,5
Сахароза - 4,5 - 10,0
Хлористый калий - 0,5 - 1,5
Бактериостатик - 0,01 - 0,15
Отрицательная донорская сыворотка группы 0(I) - Остальное до 100%
В качестве бактериостатика используют мертиолят.This problem is solved in that in the stabilizing composition for obtaining reference sera containing IgM antibodies, including whey protein, inorganic salt and bacteriostatic, according to the invention, the composition additionally contains ethylenediaminetetraacetate (Trilon B), peptone, sucrose, negative donor serum group 0 ( I) and ascorbic acid, bovine serum albumin is used as whey protein, and potassium chloride is used as inorganic salt, in the following quantitative ratio of components, .% Al:
Bovine Serum Albumin - 0.5 - 1.5
Ethylene diamine tetraacetate - 0.01 - 0.1
Ascorbic acid - 0.01 - 0.001
Peptone - 0.5 - 2.5
Sucrose - 4.5 - 10.0
Potassium Chloride - 0.5 - 1.5
Bacteriostatic - 0.01 - 0.15
Negative donor serum group 0 (I) - The rest is up to 100%
Merthiolate is used as a bacteriostatic.

Предлагаемый стабилизирующий состав предназначен для приготовления сухой устойчивой формы сывороток, содержащих IgM-антитела. Большие молекулы IgM состоят из нескольких субъединиц, соединенных слабыми водородными связями. В условиях хранения в закрытом флаконе при постоянных pH и температуре основным повреждающим фактором для молекул IgM являются, по-видимому, перекисные радикалы. Антиоксиданты, направленные на ограничение развития окислительных процессов, увеличивают сохранность IgM-молекул. Таким образом, для увеличения антиокислительной устойчивости сывороток с нормированным уровнем IgM-антител в состав стабилизатора введены аскорбиновая кислота и ЭДТА (Трилон Б). Известно, что ЭДТА блокирует перекисное окисление липидов за счет связывания ионов тяжелых металлов в препарате. Причем в этих взаимодействиях активные ионы металлов замещаются на пассивные к обмену ионы калия из-за наличия в стабилизаторе соли хлористого калия. В то же время аскорбиновая кислота является ловушкой для перекисных радикалов. В этой связи совместное использование таких антиоксидантов, как аскорбиновая кислота и ЭДТА, значительно повышается устойчивость (сохранность) препаратов из сыворотки крови, содержащих IgM-антитела. Кроме того, для стабилизации уровня IgM-антител предлагается использовать белковые компоненты (бычий сывороточный альбумин), которые являются для них защитной средой. Из различных опробованных гидролизатов протеинов наилучшие результаты показал пептон в количестве до 2,5 мас. %. Существенное уменьшение содержания белка в стабилизаторе (относительно прототипа в 2-3 раза) достигается за счет использования углеводов (лучше всего сахарозы в количестве 3 - 6 мас.% и аминокислот или низкомолекулярных продуктов деструкции белков (маленьких пептидов в составе пептона), не обладающих иммуногенной активностью. С позиций физической химии введение углеводов и аминокислот эквивалентно созданию вокруг IgM-молекулы дополнительной защитной оболочки, вытесняющей активную воду из ближайшего окружения молекулы, недоступную для больших молекул альбуминов. The proposed stabilizing composition is intended for the preparation of a dry, stable form of serum containing IgM antibodies. Large IgM molecules are composed of several subunits connected by weak hydrogen bonds. Under storage conditions in a closed vial at constant pH and temperature, the main damaging factor for IgM molecules is apparently peroxide radicals. Antioxidants aimed at limiting the development of oxidative processes increase the safety of IgM molecules. Thus, to increase the antioxidant stability of sera with a normalized level of IgM antibodies, ascorbic acid and EDTA (Trilon B) were introduced into the stabilizer. It is known that EDTA blocks lipid peroxidation by binding heavy metal ions in the drug. Moreover, in these interactions, active metal ions are replaced by passive potassium ions due to the presence of potassium chloride salt in the stabilizer. At the same time, ascorbic acid is a trap for peroxide radicals. In this regard, the joint use of antioxidants such as ascorbic acid and EDTA significantly increases the stability (safety) of serum preparations containing IgM antibodies. In addition, to stabilize the level of IgM antibodies, it is proposed to use protein components (bovine serum albumin), which are a protective environment for them. Of the various protein hydrolysates tested, peptone showed the best results in an amount of up to 2.5 wt. % A significant decrease in the protein content in the stabilizer (2-3 times relative to the prototype) is achieved through the use of carbohydrates (best sucrose in the amount of 3-6 wt.% And amino acids or low molecular weight protein degradation products (small peptides in peptone) that do not have immunogenicity From the standpoint of physical chemistry, the introduction of carbohydrates and amino acids is equivalent to creating an additional protective shell around the IgM molecule, displacing active water from the immediate environment of the molecule, inaccessible higher albumin molecules.

Отрицательная донорская сыворотка крови используется в стабилизирующем составе как разводящий раствор, компоненты которого оказывают дополнительное стабилизирующее действие на приготовляемый препарат за счет высоких антиоксидантных свойств. Кроме того, отрицательная донорская сыворотка выполняет функции буферной системы, обеспечивающей поддержание pH в оптимальном режиме. Negative donor blood serum is used in the stabilizing composition as a diluting solution, the components of which have an additional stabilizing effect on the preparation due to its high antioxidant properties. In addition, negative donor serum functions as a buffer system, ensuring the maintenance of pH in the optimal mode.

При уменьшении количественного содержания ингредиентов предлагаемого состава ниже нижнего предела не обеспечивается необходимый срок хранения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела, а увеличение количественного их содержания выше верхнего предела - ограничено значительным увеличением стоимости стабилизирующего состава без существенного повышения срока хранения референс-сывороток. With a decrease in the quantitative content of the ingredients of the proposed composition below the lower limit, the required shelf life of reference serums containing IgM antibodies is not provided, and an increase in their quantitative content above the upper limit is limited by a significant increase in the cost of the stabilizing composition without a significant increase in the shelf life of reference serums.

Пример 1. Приготовление стабилизирующего состава для получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела. Example 1. Preparation of a stabilizing composition to obtain reference serums containing IgM antibodies.

Донорские сыворотки крови группы 0(I), отрицательные на содержание маркеров вирусных инфекций, помещают в емкость, установленную на магнитной мешалке, и смешивают в течение 10 мин при 300 об/мин. Смешанную отрицательную донорскую сыворотку используют для приготовления разводящего раствора. Готовят стабилизирующий состав на 1 л смешанной отрицательной донорской сыворотки группы 0(I). Последовательно растворяя БСА, пептон, сахарозу, KCl, ЭДТА и аскорбиновую кислоту в отрицательной донорской сыворотке крови в следующих количествах: БСА - 12 г, пептон 25 г, сахароза 50 г, KCl 10 г, ЭДТА 1,0 г, аскорбиновая кислота 0,02 г. Group 0 (I) donor blood serums negative for the content of viral infection markers are placed in a container mounted on a magnetic stirrer and mixed for 10 min at 300 rpm. Mixed negative donor serum is used to prepare a reconstitution solution. A stabilizing composition is prepared per 1 liter of mixed negative group 0 (I) donor serum. Consistently dissolving BSA, peptone, sucrose, KCl, EDTA and ascorbic acid in negative donor blood serum in the following amounts: BSA - 12 g, peptone 25 g, sucrose 50 g, KCl 10 g, EDTA 1.0 g, ascorbic acid 0, 02 g

Раствор (стабилизирующий состав) доводят до pH 6,8 - 7,1 с помощью 0,1 M NaCl. В качестве бактериостатика вводят мертиолят в количестве 0,01% от массы раствора. Полученный раствор фильтруют, разливают в емкости по 250-500 см³ и используют для разведения иммунной сыворотки, содержащей IgM-антитела, или хранят при температуре 2 - 8^oC в течение не более 1 месяца.The solution (stabilizing composition) was adjusted to a pH of 6.8 - 7.1 with 0.1 M NaCl. As bacteriostatic, merthiolate is introduced in an amount of 0.01% by weight of the solution. The resulting solution is filtered, poured into containers of 250-500 cm ³ and used to dilute the immune serum containing IgM antibodies, or stored at a temperature of 2-8 ^o C for no more than 1 month.

Пример 2. Технология получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела. Example 2. The technology of obtaining reference sera containing IgM antibodies.

Нативные иммунные сыворотки для изготовления сывороток с нормированным уровнем IgM-антител подбирают по результатам скриннинга сывороток пациентов инфекционной клиники в тест-системе "Вектогеп A IgM" на содержание иммуноглобулинов М. Native immune sera for the manufacture of serums with a normalized level of IgM antibodies are selected according to the results of screening of the sera of patients of the infectious disease clinic in the Vectogep A IgM test system for the content of immunoglobulins M.

По результатам иммуноферментного анализа (ИФА) отбирают сыворотки для изготовления референс-препаратов с различным уровнем IgM-антител. Иммунную сыворотку (плазму), предназначенную для получения референс-сыоротки, содержащей IgM-антитела, подвергают инактивации прогреванием при температуре (56 ± 2)^oC в термостате в течение 50 - 60 мин.Based on the results of an enzyme immunoassay (ELISA), sera are selected for the manufacture of reference preparations with different levels of IgM antibodies. Immune serum (plasma) intended for obtaining a reference serum containing IgM antibodies is subjected to inactivation by heating at a temperature of (56 ± 2) ^o C in an incubator for 50-60 minutes.

Реактивную (положительную) сыворотку, содержащую IgM-антитела, каждого номера смешивают с разводящим раствором отрицательной донорской сыворотки группы 0(I) (заявляемый стабилизирующий состав) в соотношении, заданном коэффициентом разведения. Разведение для каждого номера сыворотки осуществляют в емкости объемом 500 см³, установленной на магнитной мешалке в течение 5 - 7 мин.Reactive (positive) serum containing IgM antibodies of each number is mixed with a diluting solution of negative donor serum of group 0 (I) (the claimed stabilizing composition) in the ratio specified by the dilution factor. Dilution for each serum number is carried out in a container with a volume of 500 cm ³ mounted on a magnetic stirrer for 5-7 minutes.

Готовую (разведенную) стабилизованную положительную сыворотку, содержащую IgM-антитела, разливают в ламинарном шкафу по 0,2 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка - 60^oC в течение 10 - 12 ч.Ready (diluted) stabilized positive serum containing IgM antibodies is poured in a 0.2 ml laminar cabinet into 5 ml vials, closed with rubber stoppers and placed in metal cassettes for freezing. Freezing the drug in bottles is carried out at a temperature of the counter - 60 ^o C for 10 to 12 hours

Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 35^oC. Температура препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-30^oC).The frozen preparation in vials is transferred to the sublimation chamber of the TG-50 freeze dryer, the shelves of which are cooled to minus 35 ^o C. The temperature of the preparation at the stage of freeze-drying is kept below its glass transition temperature (-30 ^o C).

Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет не выше 4 град/мин, время досушивания при 25^oC составляет 10 часов. Общее среднее время сушки 30 ч.The average heating rate of the material at the stage of drying is not higher than 4 deg / min, the drying time at 25 ^o C is 10 hours. The total average drying time of 30 hours

Лиофильно высушенные препараты имеют остаточное содержание воды от 1,0 до 2,0 мас.%. Определение проводят по методике (МИ 123.39.002 - 88. Методика определения остаточной влажности малых количеств материала. - Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 1988, 7 с.). Freeze-dried preparations have a residual water content of from 1.0 to 2.0 wt.%. The determination is carried out according to the method (MI 123.39.002 - 88. The method of determining the residual moisture content of small amounts of material. - Novosibirsk, State Scientific Center VB "Vector", 1988, 7 pp.).

Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом. Vials with the drug are sealed under vacuum.

Пример 3. Данные по хранению препаратов с использованием предлагаемого стабилизирующего состава. Example 3. Data on the storage of drugs using the proposed stabilizing composition.

Контроль специфической активности лиофилизованных сывороток с нормированным уровнем IgM-антител, содержащих предлагаемый стабилизирующий состав, проводят в иммуноферментных тест-системах отечественного и зарубежного производства. Результаты контроля приведены в табл. 1. The control of the specific activity of lyophilized sera with a normalized level of IgM antibodies containing the proposed stabilizing composition is carried out in enzyme-linked immunosorbent assay systems of domestic and foreign production. The control results are given in table. 1.

Как следует из результатов аттестации все препараты идентифицированы как положительные на содержание IgM-антител. Наиболее высокие титры имеют сыворотки NN 3 и 4, а наименее низкие титры - сыворотки NN 1 и 6. As follows from the certification results, all drugs were identified as positive for the content of IgM antibodies. The highest titers are serum NN 3 and 4, and the lowest titers are serum NN 1 and 6.

Для проведения испытаний срока годности изготовленные препараты термостатируют (тест термодеградации) при температуре 20^oC в течение 9 месяцев.To conduct shelf life tests, the manufactured products are thermostated (thermal degradation test) at a temperature of 20 ^o C for 9 months.

Сыворотки после хранения (термостатирования) анализируют в иммуноферментной тест-системе "Мультитест" (Москва). Результаты представлены в табл. 2. Serum after storage (temperature control) is analyzed in the enzyme immunoassay system "Multitest" (Moscow). The results are presented in table. 2.

Из результатов испытаний следует, что концентрация анти-HAV IgM в тестированных референс-сыворотках практически не изменилась после хранения в течение 9 месяцев при комнатной температуре. From the test results, it follows that the concentration of anti-HAV IgM in the tested reference sera practically did not change after storage for 9 months at room temperature.

На основании полученных результатов можно оценить срок годности препаратов с нормированным уровнем IgM-антител по стандартной методике (E.Y.Shalaev, A. N. Kanev. Solid-liquid state diagram of the water glycine-sucrose system. Cryobiology, 1994, vol.31, p. 374-382). Based on the results obtained, it is possible to evaluate the shelf life of preparations with a normalized level of IgM antibodies according to the standard method (EYShalaev, AN Kanev. Solid-liquid state diagram of the water glycine-sucrose system. Cryobiology, 1994, vol.31, p. 374- 382).

t = 9 мес • 2² = 36 мес
Таким образом, годность препаратов может быть оценена сроком до 3 лет при хранении при 4^oC.t = 9 months • 2 ² = 36 months
Thus, the shelf life of the drugs can be estimated for up to 3 years when stored at 4 ^o C.

По результатам тестирования на отечественных и зарубежных иммуноферментных тест-системах, а также по результатам теста термодеградации референс-сыворотки с нормированным уровнем IgM-антител были аттестованы Национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) в качестве референс-материалов - отраслевых стандартных образцов (ОСО). According to the results of testing on domestic and foreign enzyme-linked immunosorbent assay systems, as well as the results of the thermal degradation test, reference serums with a normalized level of IgM antibodies were certified by the National Control Authority (L. A. Tarasevich GISK) as reference materials - industry standard samples (CCA).

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии и медицине. Industrial applicability. The invention can be used in biotechnology and medicine.

Claims

1. A stabilizing composition for producing reference serums containing IgM antibodies, including whey protein, inorganic salt and bacteriostatic agent, characterized in that the composition further comprises ethylenediaminetetraacetate (Trilon B), peptone, sucrose, negative group 0 (I) donor serum, and ascorbic acid, bovine serum albumin is used as whey protein, and potassium chloride is used as inorganic salt, in the following quantitative ratio of components, wt.%:
Bovine Serum Albumin - 0.5 - 1.5
Ethylene diamine tetraacetate - 0.01 - 0.1
Ascorbic acid - 0.01 - 0.001
Peptone - 0.5 - 2.5
Sucrose - 4.5 - 10.0
Potassium Chloride - 0.5 - 1.5
Bacteriostatic - 0.01 - 0.15
Negative donor serum group 0 (I) - The rest is up to 100%
2. The stabilizing composition according to p. 1, characterized in that as a bacteriostatic used thiolate.