RU2133469C1

RU2133469C1 - Label for immunochemical and hybridization assays

Info

Publication number: RU2133469C1
Application number: RU97105274A
Authority: RU
Inventors: А.Г. Полтавченко; О.И. Серпинский
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 1999-07-20

Abstract

FIELD: analytical methods. SUBSTANCE: label represents particles of catalytically active metals 0.003-0.1 mcm in size, capable of depositing metals from solutions of physical developers on their surface. Mentioned particles are attached to particles of inert carrier 0.1-10 mcm in size characterized by density of 1.0-1.5 g/cu.cm. EFFECT: reduced price and simplified preparation of diagnosticum, increased sensitivity of label and accelerated assay procedure. 4 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к иммунохимическим или гибридизационным методам анализа биологических материалов и может быть использовано при выявлении в исследуемых образцах специфических антигенов (АГ), антител (АТ) или специфических последовательностей нуклеиновых кислот в медицине, ветеринарии, биотехнологии, экологических исследованиях и научных экспериментах. The invention relates to immunochemical or hybridization methods for the analysis of biological materials and can be used to detect specific antigens (AG), antibodies (AT) or specific nucleic acid sequences in the studied samples in medicine, veterinary medicine, biotechnology, environmental research and scientific experiments.

Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между компонентами исследуемого образца и известными компонентами аналитической системы. В иммунохимическом анализе такие комплексы образуются между антигенами и антителами, а в гибридизационном анализе - между исследуемой нуклеиновой кислотой и гибридизационным зондом (фрагментом нуклеиновой кислоты с известной структурой). Компоненты аналитической системы метятся каким-либо маркером, который позволяет после отделения несвязавшихся компонентов определять наличие или количество образовавшихся специфических комплексов. Часто, особенно в гибридизационном анализе, используют биотин-авидиновую или биотин-стрептавидиновую систему индикации, при которой гибридизационный зонд конъюгируют с биотином, а выявление образовавшихся с анализируемым образцом комплексов проводят стрептовидином или авидином, связанным с маркером. The essence of this identification is the formation of specific complexes between the components of the test sample and the known components of the analytical system. In immunochemical analysis, such complexes are formed between antigens and antibodies, and in a hybridization analysis, between the nucleic acid under study and a hybridization probe (a fragment of a nucleic acid with a known structure). The components of the analytical system are labeled by some marker, which allows, after separation of unbound components, to determine the presence or quantity of specific complexes formed. Often, especially in a hybridization analysis, a biotin-avidin or biotin-streptavidin indication system is used, in which the hybridization probe is conjugated to biotin, and the complexes formed with the analyzed sample are detected by streptovidin or avidin associated with the marker.

Из многообразия методов иммунологического и гибридизационного анализов, разработанных к настоящему времени, особой популярностью пользуются твердофазные системы, в которых один из компонентов связан с плотной подложкой (матрицей). Такой подход позволяет легко отделять образовавшиеся комплексы от несвязывающихся ингредиентов промывкой матрицы, что значительно сокращает время и упрощает процедуру анализа. Of the variety of immunological and hybridization assays developed to date, solid-phase systems in which one of the components is associated with a dense substrate (matrix) are especially popular. This approach makes it easy to separate the formed complexes from non-binding ingredients by washing the matrix, which significantly reduces the time and simplifies the analysis procedure.

В качестве твердой фазы наиболее часто употребляют пластиковые планшеты с ячейками объемом 250-350 мкл или пористые мембраны из нитроцеллюлозы, найлона или других сорбирующих материалов. Пористые матрицы имеют ряд преимуществ: высокая сорбционная емкость в отношении широкого круга биоматериалов, простое и быстрое нанесение исследуемого материала, относительно низкая стоимость. Широкое распространение пористые подложки нашли в гибридизационном и так называемом поверхностном блот-иммуноанализе. As the solid phase, plastic tablets with cells with a volume of 250-350 μl or porous membranes made of nitrocellulose, nylon or other sorbent materials are most often used. Porous matrices have several advantages: high sorption capacity in relation to a wide range of biomaterials, simple and quick application of the test material, relatively low cost. Porous substrates are widely used in hybridization and the so-called surface blot immunoassay.

В качестве маркеров в твердофазном иммунологическом и гибридизационном анализах наиболее часто используют радиоактивные изотопы и ферменты. Маркер химически связывают (конъюгируют) с известным компонентом (антителами, антигеном, гибридизационным зондом или стрептавидином) тест-системы (Заявка ЕВП N 317001, МКИ G 01 N 33/58, опубл. 1989 г. [1]; Заявка ЕПВ N 254081, МКИ G 01 N 33/68, опубл. 1988 г.) [2]. As markers in solid-phase immunological and hybridization analyzes, radioactive isotopes and enzymes are most often used. The marker is chemically coupled (conjugated) with a known component (antibodies, antigen, hybridization probe or streptavidin) of the test system (Application UWP N 317001, MKI G 01 N 33/58, publ. 1989 [1]; Application EPO N 254081, MKI G 01 N 33/68, publ. 1988) [2].

Однако при этой процедуре значительная часть компонентов тест-системы теряет свою специфическую активность, полученные конъюгаты требуют сложной очистки от несвязавшихся компонентов методами ультрацентрифугирования или колоночной хроматографии. Изотопные и ферментные маркеры дороги, что наряду со сложной процедурой конъюгирования и очистки обуславливает значительную стоимость диагностикумов на их основе. Ферменты легко инактивируются при воздействии физико-химических факторов, а срок использования обычно используемых изотопов (P-32, J-135) не превышает 2 месяцев. Кроме того, при работе с изотопными маркерами необходимо соблюдение специальных требований безопасности. However, during this procedure, a significant part of the components of the test system loses its specific activity, the resulting conjugates require complex purification from unbound components by ultracentrifugation or column chromatography. Isotopic and enzymatic markers are expensive, which, along with a complex conjugation and purification procedure, leads to a significant cost of diagnostics based on them. Enzymes are easily inactivated when exposed to physicochemical factors, and the period of use of commonly used isotopes (P-32, J-135) does not exceed 2 months. In addition, when working with isotopic markers, special safety requirements must be observed.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа, представляющий собой частицы каталитически активных металлов (например, на основе коллоидного золота), имеющие размер в диапазоне (0,005 - 0,1) мкм и способные осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей (Заявка ЕПВ N 015746, МКИ G 01 N 33/553, опубл. 23.10.85 г.) [3]. Согласно описанию гидрозоли золота (маркер) с дисперсностью от 0,005 до 0,1 мкм сорбционно связывают с иммунореагентами и стабилизируют растворами неспецифических синтетических или биополимеров, таких как бычий сывороточный альбумин, полиэтиленгликоль и т.п. Такие препараты при использовании в поверхностном блот-иммуноанализе, накапливаясь на поверхности пористой матрицы, образуют цветное пятно, позволяющее детектировать наличие образовавшегося иммунного комплекса, а возможность усиления цветового сигнала за счет аутокаталитического восстановления на иммобилизованных частицах золота золя серебра из растворов физического проявителя позволяет проводить определение с чувствительностью, не уступающей чувствительности с использованием ферментной или изотопной метки. The closest technical solution (prototype) is a marker for immunochemical and hybridization analysis, representing particles of catalytically active metals (for example, based on colloidal gold), having a size in the range (0.005 - 0.1) microns and capable of precipitating metals from solutions of physical developers (Application EPO N 015746, MKI G 01 N 33/553, publ. 23.10.85,) [3]. According to the description, gold hydrosols (marker) with a dispersion of from 0.005 to 0.1 μm are adsorbed to immunoreagents and stabilized with solutions of non-specific synthetic or biopolymers such as bovine serum albumin, polyethylene glycol, etc. Such preparations, when used in surface blot immunoassay, accumulate on the surface of the porous matrix, form a colored spot that allows to detect the presence of the formed immune complex, and the possibility of enhancing the color signal due to the autocatalytic reduction of silver sol on immobilized gold particles from solutions of a physical developer allows determination with sensitivity not inferior to sensitivity using an enzyme or isotope tag.

Маркеры на основе высокодисперсных золей тяжелых металлов дешевле и стабильнее изотопных и ферментных маркеров, однако на стадии приготовления диагностикумов также требуют применения сложных и дорогостоящих методов очистки, таких как ультрацентрифугирование или гель-хроматография. Markers based on highly dispersed sols of heavy metals are cheaper and more stable than isotopic and enzyme markers, however, at the stage of preparation of diagnostics, they also require the use of complex and expensive cleaning methods, such as ultracentrifugation or gel chromatography.

Основным недостатком маркера-прототипа при постановке анализа на пористых подложках являются малые линейные размеры частиц металла, позволяющие диагностикуму проникать глубоко в поры матрицы, и связанные с этим сложности отмывки твердой фазы от несвязавшегося диагностикума. Как правило отмывочные процедуры предусматривают длительную инкубацию подложки в отмывочном растворе с многократной сменой раствора, часто с активацией раствора на мешалке или шейкере, или сквозную вакуум-фильтрацию отмывочного раствора через пористую подложку. Такие отмывочные процедуры значительно усложняют методику и увеличивают время проведения анализа, однако и они не всегда бывают достаточно эффективными. Следствием недостаточной отмывки матрицы является высокий фон подложки и низкая воспроизводимость результатов анализа. The main disadvantage of the prototype marker when setting up analysis on porous substrates is the small linear dimensions of the metal particles, allowing the diagnosticum to penetrate deep into the pores of the matrix, and the associated complexity of washing the solid phase from an unbound diagnosticum. Typically, washing procedures include prolonged incubation of the substrate in the washing solution with multiple changes of the solution, often with the activation of the solution on a mixer or shaker, or through vacuum filtering the washing solution through a porous substrate. Such washing procedures significantly complicate the technique and increase the analysis time, however, they are not always effective enough. The consequence of insufficient washing of the matrix is a high background of the substrate and low reproducibility of the analysis results.

При решении проблемы повышения эффективности отмывки маркера путем применения более крупных (> 0,1 мкм) частиц металлов приводит к непроизводительному (в 10 и более раз большему) расходу драгоценных или полудрагоценных металлов, что значительно повышает стоимость диагностикума; кроме того, крупные тяжелые частицы маркера менее подвижны, хуже удерживаются в растворе и более склонны к агрегации, следствием чего являются увеличение времени связывания диагностикума с анализируемым веществом и снижение стабильности золя. When solving the problem of increasing the marker washing efficiency by using larger (> 0.1 μm) metal particles, it leads to unproductive (10 or more times) consumption of precious or semiprecious metals, which significantly increases the cost of a diagnosticum; in addition, large heavy marker particles are less mobile, are worse retained in solution and are more prone to aggregation, which results in an increase in the time that the diagnosticum binds to the analyte and decreases the stability of the sol.

Задачей предлагаемого изобретения является создание дешевого, простого в получении и стабильного маркера, обеспечивающего наряду с высокой чувствительностью и воспроизводимостью анализа, более простую и быструю постановку поверхностного иммунологического или гибридизационного анализа по сравнению с приведенными известными решениями. The objective of the invention is the creation of a cheap, easy to obtain and stable marker, which provides, along with high sensitivity and reproducibility of analysis, a simpler and faster formulation of surface immunological or hybridization analysis in comparison with the known solutions.

Поставленная задача решается тем, что маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа, представляющий собой частицы каталитически активных металлов, имеющие размер в диапазоне (0,003 - 0,1) мкм и способные осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей, согласно изобретению дополнительно содержит частицы инертного носителя, имеющие размер (0,1 - 10,0) мкм и плотность вещества (1,0 - 1,5) г/см³, причем частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя в количестве (1 - 10) мг/м² или в соотношении по массе 1:100 - 1:1000.The problem is solved in that the marker for immunochemical and hybridization analysis, which is a particle of catalytically active metals having a size in the range (0.003 - 0.1) microns and capable of precipitating metals from solutions of physical developers on its surface, according to the invention additionally contains particles of inert media having a size of (0.1 - 10.0) μm and a substance density (1.0 - 1.5) g / cm ³ , and particles of catalytically active metals attached to the surface of the particles of an inert carrier in an amount of (1 - 10) mg / m ² or in a ratio by weight of 1: 100 - 1: 1000.

Частицы каталитически активных металлов выполнены из золота, или серебра, или палладия. Particles of catalytically active metals are made of gold, or silver, or palladium.

Частицы инертного носителя выполнены из латекса, или угля, или сажи, или сефадекса, или аэросила. Particles of an inert carrier are made of latex, or coal, or soot, or Sephadex, or Aerosil.

Частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя путем адсорбции или восстановления из растворов каталитически активных металлов на поверхности частиц макроносителя. Particles of catalytically active metals are attached to the surface of particles of an inert carrier by adsorption or reduction from solutions of catalytically active metals on the surface of the particles of macronarrier.

Активация поверхности частиц носителя металлами до уровня 1 - 10 мг/кв.м достигается одним из известных [4] физических и химических методов активации поверхности пластмасс перед их химической металлизацией. При этом невысокая плотность носителя обеспечивает хорошие плавучие характеристики и стабильность золя, наличие металла-активатора (частицы каталитически активных металлов) на поверхности носителя позволяет выявлять полученный маркер с высокой чувствительностью, а небольшой расход металла-активатора и дешевый носитель обуславливают невысокую стоимость предлагаемого маркера. Activation of the surface of carrier particles by metals to a level of 1-10 mg / sq. At the same time, the low density of the carrier provides good floating characteristics and stability of the sol, the presence of an activator metal (particles of catalytically active metals) on the surface of the carrier allows the obtained marker to be detected with high sensitivity, and the low consumption of the activator metal and cheap carrier determine the low cost of the proposed marker.

Связь такого маркера с иммунореагентами производится методом физической сорбции, позволяющим наиболее щадяще и экономно использовать специфические биокомпоненты, а очистка полученного таким образом диагностикума от несвязавшихся ингредиентов может быть достигнута обычным центрифугированием при 10 - 20 тыс.g в течение 10 - 15 минут. Такая процедура получения диагностикума значительно проще и дешевле, чем получение и очистка иммуноферментных конъюгатов или диагностикумов на основе высокодисперсных золей тяжелых металлов [3]. The connection of such a marker with immunoreagents is carried out by the method of physical sorption, which allows the most gentle and economical use of specific biocomponents, and the cleaning of the diagnosticum obtained in this way from unbound ingredients can be achieved by conventional centrifugation at 10 - 20 thousand g for 10 - 15 minutes. Such a procedure for obtaining a diagnosticum is much simpler and cheaper than obtaining and purifying enzyme-linked immunosorbent conjugates or diagnosticums based on highly dispersed heavy metal sols [3].

Крупные размеры диагностикумов на основе предлагаемого маркера не позволяют им проникать в поры подложки. Таким образом, диагностикумы взаимодействуют с анализируемым материалом только по поверхности матрицы, а отмывка от несвязавшихся частиц достигается ополаскиванием подложки в дистиллированной воде в течение 1 - 2 минут, что позволяет упростить отмывки и значительно сократить время отмывочных процедур наряду с достижением более высокой надежности и воспроизводимости анализа. The large sizes of diagnosticums based on the proposed marker do not allow them to penetrate into the pores of the substrate. Thus, the diagnostic charts interact with the analyzed material only on the matrix surface, and washing from unbound particles is achieved by rinsing the substrate in distilled water for 1 to 2 minutes, which allows to simplify washing and significantly reduce the time of washing procedures along with achieving higher reliability and reproducibility of the analysis .

Высокая чувствительность анализа достигается проявлением маркера, иммобилизованного в результате специфического связывания на поверхности подложки, одним из известных [4,5] физических проявителей или растворов химической металлизации. High analysis sensitivity is achieved by the manifestation of a marker, immobilized as a result of specific binding on the surface of the substrate, by one of the known [4,5] physical developers or chemical metallization solutions.

Приготовление маркера включает в себя подготовку инертного носителя с заданной дисперсностью, активирование поверхности частиц носителя металлами, очистку полученного маркера от несвязавшихся компонентов. The preparation of the marker includes the preparation of an inert carrier with a given dispersion, activation of the surface of the carrier particles by metals, purification of the resulting marker from unbound components.

Подготовка инертного носителя подразумевает получение частиц носителя заданной дисперсии. Как правило, для приготовления маркера используют носители с известными дисперсными характеристиками в заданном диапазоне (латексы, сефадексы, сажи), но при необходимости некоторые носители (например, активированный уголь) могут быть дополнительно измельчены любым из известных физических методов. Поверхность частиц носителя должна быть сорбционно активна. Носители, склонные к агрегации (например, угли и сажи), перед активацией целесообразно дезагрегировать, например, ультразвуковой обработкой. The preparation of an inert carrier involves the preparation of carrier particles of a given dispersion. As a rule, carriers with known disperse characteristics in a given range (latexes, Sephadexes, soot) are used to prepare the marker, but if necessary, some carriers (for example, activated carbon) can be further ground by any of the known physical methods. The surface of the carrier particles must be sorption active. Carriers prone to aggregation (for example, coals and soot), before activation, it is advisable to disaggregate, for example, by ultrasonic treatment.

Активация поверхности частиц носителя металлами может быть осуществлена одним из известных [4] методов активации поверхности пластмасс перед химической металлизацией, таким как обработка носителя активными восстановителями (например, SnCl₂) с последующим добавлением растворимых солей металлов или обработка носителя высокодисперсным коллоидным растворами палладия, серебра, золота или платины. В первом случае металл осаждается из раствора на поверхности носителя в виде гранул или нитей, во втором - носитель сорбирует на своей поверхности коллоидные частицы металла. И в том и в другом случаях необходимый уровень активации достигается подбором концентрации металла (ионов или коллоидных частиц) в активирующем растворе. Активация может быть также осуществлена путем обработки носителя предварительно полученным иммунозолем (высокодисперсными частицами металла, связанными с иммунореагентом). Сорбция иммунозоля на поверхности носителя происходит в этом случае за счет белка - иммунореагента. В последнем случае совмещается активация и нагрузка маркера иммунореагентом и после очистки от избытка иммунозоля диагностикум можно использовать для анализа.Activation of the surface of carrier particles by metals can be carried out by one of the known [4] methods of activating the surface of plastics before chemical metallization, such as treatment of the carrier with active reducing agents (for example, SnCl ₂ ) followed by the addition of soluble metal salts or treatment of the carrier with highly dispersed colloidal solutions of palladium, silver, gold or platinum. In the first case, the metal is deposited from the solution on the surface of the carrier in the form of granules or threads, in the second, the carrier sorb colloidal metal particles on its surface. In both cases, the necessary level of activation is achieved by selecting the concentration of the metal (ions or colloidal particles) in the activating solution. Activation can also be carried out by treating the carrier with a pre-prepared immunosol (highly dispersed metal particles bound to the immunoreagent). The sorption of the immunosol on the surface of the carrier occurs in this case due to the protein immunoreagent. In the latter case, the activation and loading of the marker with an immunoreagent is combined, and after clearing the excess of immunosol, the diagnosticum can be used for analysis.

Очистка активированного маркера от избытка восстановителя или ионов металла может быть произведена осаждением частиц маркера центрифугированием при 10-20 тыс. g в течение 10-15 мин или отделением их раствора вакуум-фильтрацией через мембрану с подходящим размером пор. The activated marker can be purified from excess reducing agent or metal ions by precipitating marker particles by centrifugation at 10–20 thousand g for 10–15 min or by separating their solution by vacuum filtration through a membrane with a suitable pore size.

Нагрузка предлагаемого маркера иммунореагентами производится методом физической сорбции (аналогично способам, применяемым для нагрузки высокодисперсных золей металлов [6] ) при минимальной ионной силе раствора и pH, близкой к изоэлектрической точке сорбируемого белка. The proposed marker is loaded with immunoreagents by physical sorption (similar to the methods used to load highly dispersed metal sols [6]) with a minimum ionic strength of the solution and pH close to the isoelectric point of the sorbed protein.

Очистка нагруженного маркера от несвязавшегося иммунореагента производится так же, как очистка маркера после активации металлами. Cleaning a loaded marker from an unbound immunoreagent is the same as cleaning a marker after activation by metals.

Дополнительная блокировка свободных сайтов связывания на поверхности нагруженного маркера и стабилизация диагностикума достигается добавлением в раствор синтетических или биополимеров, таких как альбумины, нормальная сыворотка, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль. При этом во избежание возможных стерических затруднений при иммунном связывании необходимо, чтобы линейные размеры молекул блокирующих и стабилизирующих компонентов были меньше, чем размеры молекул иммунореагента. При использовании в качестве активатора палладия и серебра целесообразно вводить в стабилизирующий раствор белки, обладающие более кислыми свойствами, чем иммунореагент, для связывания следовых количеств растворенных металлов и предотвращения таким образом повреждения иммунореагента. Additional blocking of free binding sites on the surface of the loaded marker and stabilization of the diagnosticum is achieved by adding synthetic or biopolymers such as albumin, normal serum, polyvinylpyrrolidone or polyethylene glycol to the solution. At the same time, in order to avoid possible steric difficulties in immune binding, it is necessary that the linear sizes of the molecules of blocking and stabilizing components are smaller than the sizes of the immunoreagent molecules. When using palladium and silver as an activator, it is advisable to introduce proteins with more acidic properties than the immunoreagent into the stabilizing solution to bind trace amounts of dissolved metals and thus prevent damage to the immunoreagent.

Выявление предлагаемого маркера производится проявлением в одном из известных физических проявителей - растворов химического серебрения, используемых в фотографической технике для увеличения (проявления) зародышей серебра в экспонированных фотоматериалах путем аутокаталитического осаждения серебра из растворов его солей в присутствии восстановителей (фотопроявляющих веществ), таких как метол, парафенилендиамин, гидрохинон и др. Выявление предлагаемого маркера на подложках, устойчивых в сильнощелочной среде (например, на нейлоновых мембранах) может быть осуществлено с помощью боргидридных и формальдегидных растворов химического меднения [7]. При этом в специально подобранных составах растворов меднения удается выявлять до 5 пг серебра. The proposed marker is detected by developing in one of the known physical developers - chemical silvering solutions used in photographic technique to increase (manifest) silver nuclei in exposed photographic materials by autocatalytic deposition of silver from solutions of its salts in the presence of reducing agents (photodeveloping substances), such as metol, paraphenylenediamine, hydroquinone, etc. Identification of the proposed marker on substrates that are stable in a highly alkaline environment (for example, nylon membranes) may be carried out using formaldehyde and borohydride chemical copper plating solution [7]. Moreover, in specially selected compositions of copper plating solutions it is possible to detect up to 5 pg of silver.

Пример. Получение и применение маркеров на основе полистирольных латексов, активированных серебром или палладием с использованием в качестве восстановителя хлорида олова
Получение маркера. 50 мл 0,5%-ной водной суспензии полистирольного латекса (0,7 мкм), модифицированного метакрилатом цинка, смешивают с 50 мл раствора, содержащего 40 г/л SnCl₂ и 40 мл/л концентрированной соляной кислоты. После 1 - 2-минутной экспозиции на мешалке осаждают латекс центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут или промывают на фильтре с размерами пор 0,45 мкм. Осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию смешивают с 10 мл 1%-ного раствора азотнокислого серебра в 65%-ном этаноле или с 10 мл раствора, содержащего 0,1 г/л хлорида палладия и 2 мл/л концентрированной соляной кислоты. После 10-минутного перемешивания суспензии на магнитной мешалке активированные серебром или палладием латексы очищают от избытка реагентов центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Осадки ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для сорбционной нагрузки активированной поверхности латекса иммунореагентами (антигенами, иммуноглобулинами, стафилококковым белком A и др).Example. Preparation and use of markers based on polystyrene latex activated with silver or palladium using tin chloride as a reducing agent
Getting a marker. 50 ml of a 0.5% aqueous suspension of polystyrene latex (0.7 μm), modified with zinc methacrylate, are mixed with 50 ml of a solution containing 40 g / l SnCl ₂ and 40 ml / l concentrated hydrochloric acid. After 1 - 2 minutes of exposure, the latex is centrifuged at 5000 g for 10 minutes on a mixer or washed on a filter with a pore size of 0.45 μm. The precipitate was resuspended in 5 ml of distilled water. The resulting suspension is mixed with 10 ml of a 1% solution of silver nitrate in 65% ethanol or with 10 ml of a solution containing 0.1 g / l of palladium chloride and 2 ml / l of concentrated hydrochloric acid. After 10 minutes of stirring the suspension on a magnetic stirrer, the latex activated with silver or palladium are purified from excess reagents by centrifugation at 5000 g for 10 minutes. Precipitation is resuspended in distilled water and used for sorption load of the activated surface of the latex with immunoreagents (antigens, immunoglobulins, staphylococcal protein A, etc.).

Активированная таким образом поверхность латекса по опубликованным данным [4] несет на себе частицы металла в количестве около 10 мг/м².According to published data [4], the latex surface activated in this way carries metal particles in an amount of about 10 mg / m ² .

Применение маркера. В 2 мл 0,01 М боратного буферного раствора с pH 6,5, содержащего 50 мкг стрептавидина (Sigma, США), в три приема с интервалами по 10 мин равными долями вносят 3 мл 1%-ной суспензии активированного полладием латекса. После 30 мин инкубации при слабом перемешивании в суспензию добавляют стабилизатор - 5 мл 0,1%-ного раствора овальбумина и спустя 1-1,5 часа осаждают латекс при 8000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют пипетированием в 10 мл 0,01 М трис-HCl буферном растворе pH 7,2 с 0,05% БСА и 0,02% азида натрия. Marker application. In 2 ml of 0.01 M borate buffer solution with a pH of 6.5, containing 50 μg of streptavidin (Sigma, USA), 3 ml of a 1% suspension of polladium-activated latex is added in equal doses in three doses at intervals of 10 minutes. After 30 minutes of incubation with gentle stirring, a stabilizer is added to the suspension - 5 ml of a 0.1% solution of ovalbumin and after 1-1.5 hours latex is precipitated at 8000 g for 10 minutes. The precipitate was resuspended by pipetting in 10 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer solution pH 7.2 with 0.05% BSA and 0.02% sodium azide.

На нитроцеллюлозные стрипы наносят разведения белков или нуклеотидного материала, ковалентно связанных с биотином, аликвотами по 1 - 5 мкл. Высушивают стипы на воздухе в течение 10 мин и помещают в блокирующий раствор - 0,01 М трис-HCl буфер с 2% БСА или овальбумина на 30 мин. Переносят блокированные стрипы в суспензию описанного выше латексного диагностикума, инкубируют 30-60 мин и отмывают стрипы ополаскиванием в 2 - 3 сменах трис-HCl буфера pH 7,5 с 0,05% твин-20, а затем в двух сменах дистиллированной воды. Переносят стрипы в раствор метолового проявителя ((г/л): метол 2, лимонная кислота 5, азотнокислое серебро 2) и проявляют 10-15 мин. Dilutions of proteins or nucleotide material covalently bound to biotin are applied to nitrocellulose strips in aliquots of 1 to 5 μl. The styps are dried in air for 10 minutes and placed in a blocking solution of 0.01 M Tris-HCl buffer with 2% BSA or ovalbumin for 30 minutes. Blocked strips are transferred to a suspension of the latex diagnosticum described above, incubated for 30-60 minutes and the strips are washed by rinsing in 2 - 3 shifts of Tris-HCl buffer pH 7.5 with 0.05% tween-20, and then in two shifts of distilled water. The strips are transferred to a solution of methanol developer ((g / l): methol 2, citric acid 5, silver nitrate 2) and develop for 10-15 minutes.

По такой методике удается надежно определять 0,7 нг суммарных белков из стандарта фирмы Bio-Rad (Biotnylated SDS-PAGE Standarts) или 0,2 нг цитохрома C, меченного биотином (20 моль биотина на 1 моль белка) в образце объемом 5 мкл. Using this technique, it is possible to reliably determine 0.7 ng of total proteins from the Bio-Rad standard (Biotnylated SDS-PAGE Standarts) or 0.2 ng of cytochrome C labeled with biotin (20 mol biotin per 1 mol of protein) in a 5 μl sample.

Пример 2. Получение и применение маркеров на основе полистирольных латексов, активированных серебром или палладием, с использованием в качестве восстановителя боргидрата натрия
Получение маркера. В 10 мл 0,5%-ной суспензии полистирольного латекса с размерами частиц 0,3 мкм при интенсивном перемешивании добавляют 15 мг боргидрата натрия и, после его растворения, разом вводят 10 мл 0,02%-ного раствора азотнокислого серебра или хлорида палладия. После 10 - 15-минутной инкубации при умеренном перемешивании латекс осаждают при 14000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для нагрузки иммунореагентами.Example 2. The preparation and use of markers based on polystyrene latex activated with silver or palladium, using sodium borohydrate as a reducing agent
Getting a marker. In 10 ml of a 0.5% suspension of polystyrene latex with a particle size of 0.3 μm, 15 mg of sodium borohydrate is added with vigorous stirring and, after it is dissolved, 10 ml of a 0.02% solution of silver nitrate or palladium chloride are immediately added. After a 10-15 minute incubation with moderate stirring, the latex is precipitated at 14,000 g for 10 minutes. The pellet is resuspended in distilled water and used to load immunoreagents.

При такой активации на поверхности латекса сорбируется около 50 - 60% восстановленного металла, что составляет около 2 мг/м².With this activation, about 50-60% of the reduced metal is adsorbed on the latex surface, which is about 2 mg / m ² .

Применение маркера. 5 мл 1%-ной суспензии активированного серебром латекса равными долями в три приема с интервалами по 10 мин вносят при умеренном перемешивании в 5 мл раствора сифилитического антигена (четыре химерных белка с суммарной концентрацией белков 50 мкг/мл) на 0,01 М фосфатном буфере pH 7,8. Спустя 1 час добавляют стабилизаторы - 2 мл 10%-ного раствора БСА на дистиллированной воде и 1 мл фетальной телячьей сыворотки. После 20-часовой экспозиции латекс дважды осаждают центрифугированием при 15000 g с ресуспендированием в исходном объеме трис-HCl буфера pH 7,2 с 0,05% БСА и 0,02% азида натрия. Marker application. 5 ml of a 1% suspension of silver-activated latex in equal doses in three doses at intervals of 10 minutes is added with moderate stirring in 5 ml of a syphilitic antigen solution (four chimeric proteins with a total protein concentration of 50 μg / ml) in 0.01 M phosphate buffer pH 7.8. After 1 hour, stabilizers are added - 2 ml of a 10% solution of BSA in distilled water and 1 ml of fetal calf serum. After a 20-hour exposure, latex is precipitated twice by centrifugation at 15,000 g with resuspension in the initial volume of Tris-HCl buffer pH 7.2 with 0.05% BSA and 0.02% sodium azide.

На нитроцеллюлозные стрипы наносят разведения исследуемых сывороток аликвотами по 5 мкл, высушивают стрипы на воздухе, помещают на 20 - 30 мин в блокирующий раствор (2% (в/о)-БСА и 10% (о/о) фетальной сыворотки в трис-HСl буфере pH 7,2) и переносят в суспензию латекса. Инкубируют, отмывают и проявляют стрипы, как указано в примере 1. Dilutions of the studied sera are applied to nitrocellulose strips in aliquots of 5 μl, the strips are dried in air, placed for 20-30 minutes in a blocking solution of (2% (w / v) -BSA and 10% (o / o) fetal serum in Tris-HCl buffer pH 7.2) and transferred to a latex suspension. Incubate, wash and develop strips, as described in example 1.

При исследовании панели из 20 сывороток получено полное совпадение с результатами иммунопероксидазного теста, а при исследовании титров положительных на сифилис сывороток с применением иммунозолей достигнута чувствительность, примерно на порядок превышающая чувствительность анализа с использованием аналогичных иммунопероксидазных конъюгатов и проявлением о-фенилендиамином при постановке ИФА в микротитровальных планшетах. When examining a panel of 20 sera, full agreement was obtained with the results of an immunoperoxidase test, and when studying titers of syphilis positive using immunosols, a sensitivity was achieved that was about an order of magnitude higher than the sensitivity of an analysis using similar immunoperoxidase conjugates and the manifestation of o-phenylenediamine when ELISA was performed in microtiter plates .

Пример 3. Получение и применение маркеров на основе угля, активированного коллоидами золота, серебра или палладия. Example 3. The preparation and use of markers based on coal activated with colloids of gold, silver or palladium.

Получение маркера. К 10 мл 0,01%-ного раствора тетрахлорзолотой кислоты или азотнокислого серебра или хлорида палладия при интенсивном перемешивании аликвотами по 200-400 мкл добавляют свежеприготовленный 0,1%-ный раствор боргидрата натрия в общем объеме 3,0 мл. После 10-15-минутного созревания золя при умеренном перемешивании добавляют в полученный коллоид 100 мг измельченного активированного угля марки БАУ-А и обрабатывают взвесь несколько секунд на ультразвуковом дезинтеграторе. После 6-минутной экспозиции при комнатной температуре и умеренном перемешивании осаждают активированный металлом уголь центрифугированием при 15000 g в течение 10 - 12 минут, ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для нагрузки иммунореагентами. Getting a marker. Freshly prepared 0.1% sodium borohydrate solution in a total volume of 3.0 ml is added to 10 ml of a 0.01% solution of tetrachlorosulfonic acid or silver nitrate or palladium chloride with vigorous stirring in aliquots of 200-400 μl. After 10-15 minutes maturation of the sol with moderate stirring, 100 mg of milled BAU-A brand activated carbon is added to the obtained colloid and the suspension is treated for several seconds on an ultrasonic disintegrator. After a 6-minute exposure at room temperature and moderate stirring, the activated carbon is precipitated by centrifugation at 15,000 g for 10-12 minutes, resuspended in distilled water and used for loading immunoreagents.

Частицы угля полностью адсорбируют металлический золь из раствора и нагрузка носителя металлом по массе составляет 100 : 1. Particles of coal completely adsorb metal sol from the solution and the load of the carrier with metal by mass is 100: 1.

Применение маркера. 3 мл 1%-ной водной взвеси угля, активированного коллоидным золотом, нагружают стрептавидином, как указано в примере 1, стабилизируют суспензию добавлением 10%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ м. м. 20 кД) до конечной концентрации 2% и очищают ее двукратным центрифугированием при 14 - 15 тыс.g. Осадок ресуспендируют в 1 мл 0,02%-ного раствора ПЭГ на дистиллированной воде. Перед использованием золь разводят до концентрации 0,5 мг/мл в растворе Денхарта и применяют для выявления результатов гибридизационного анализа с биотинилированными зондами на нитроцеллюлозных или нейлоновых стрипах. В одинаковых условиях суспензии активированного золотом угля с проявлением метоловым проявителем (см. пример 1) выявляют биотинилированные гибридизационные зонды с чувствительностью, на 1,5 - 2 порядка превышающей чувствительность конъюгатов стрептавидин-пероксидаза с проявлением 5-аминосалициловой кислотой, но уступают в чувствительности конъюгатам стрептавидина со щелочной фосфотазой. Marker application. 3 ml of a 1% aqueous suspension of coal activated with colloidal gold is loaded with streptavidin, as described in example 1, the suspension is stabilized by the addition of a 10% solution of polyethylene glycol (PEG m. M 20 kD) to a final concentration of 2% and purified twice. centrifugation at 14 - 15 thousand g. The precipitate was resuspended in 1 ml of a 0.02% PEG solution in distilled water. Before use, the sol is diluted to a concentration of 0.5 mg / ml in a Denhart solution and used to identify the results of a hybridization analysis with biotinylated probes on nitrocellulose or nylon strips. Under the same conditions, suspensions of gold-activated coal with a manifestation of metholic developer (see Example 1) reveal biotinylated hybridization probes with a sensitivity 1.5 to 2 orders of magnitude higher than the sensitivity of streptavidin peroxidase conjugates with a manifestation of 5-aminosalicylic acid, but inferior in sensitivity to streptavidin conjugates with alkaline phosphatase.

Пример 4. Получение маркеров на основе угля, активированного иммунозолем золота
20 мкл иммунозоля - авидин - коллоидное золото 10 нм (ExtrAvidin-Gold), производства фирмы Sigma, США, разводят в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7.2 и добавляют 100 мг измельченного угля марки БАУ-А. После 30 минут инкубации при комнатной температуре и умеренном перемешивании без дополнительной очистки используют полученную суспензию для выявления результатов гибридизационного анализа с использованием гибридизационных зондов и белков, меченных биотином.Example 4. Obtaining markers based on coal activated with gold immunosol
20 μl of immunosol - Avidin - colloidal gold 10 nm (ExtrAvidin-Gold), manufactured by Sigma, USA, diluted in 10 ml of 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 and add 100 mg of crushed coal grade BAU-A. After 30 minutes of incubation at room temperature and moderate stirring without further purification, the suspension obtained is used to reveal the results of hybridization analysis using hybridization probes and proteins labeled with biotin.

Уголь полностью адсорбирует иммунозоль из раствора и нагрузка носителя металлом по массе составляет около 1000:1. Coal completely adsorbs the immunosol from the solution and the mass load of the carrier by metal is about 1000: 1.

Экспериментальные исследования предлагаемого маркера в твердофазном иммунологическом и гибридизационном анализах показывают, что он по сравнению с прототипом и известными аналогами является более дешевым и простым в получении и стабилен в процессе использования. Кроме того, предлагаемый маркер обеспечивает наряду с высокой чувствительностью и воспроизводимостью анализа более простую и быструю постановку поверхностного иммунологического или гибридизационного анализа по сравнению с приведенными известными решениями. Experimental studies of the proposed marker in solid-phase immunological and hybridization analyzes show that it is cheaper and easier to obtain and stable during use compared to the prototype and known analogues. In addition, the proposed marker provides, along with high sensitivity and reproducibility of the analysis, a simpler and faster formulation of surface immunological or hybridization analysis in comparison with the above known solutions.

Изобретение позволяет удешевить процедуру получения диагностикумов за счет экономного расходования металла-катализатора и иммунореагентов, а также простоты приготовления и очистки диагностикумов на основе указанного маркера; значительно сократить время и упростить процедуру отмывок при проведении анализа; а также обеспечить высокую чувствительность выявления маркера при его физическом проявлении. The invention allows to reduce the cost of the procedure for obtaining diagnostic kits due to the economical use of metal catalyst and immunoreagents, as well as the ease of preparation and cleaning of diagnostic kits based on the indicated marker; significantly reduce the time and simplify the washing procedure during the analysis; and also provide high sensitivity detection of the marker during its physical manifestation.

Источники патентной и научно-технической информации:
1. Заявка ЕПВ N 317001, МКИ G 01 N 33/58, опубл. 1989 г.Sources of patent and scientific and technical information:
1. Application EPO N 317001, MKI G 01 N 33/58, publ. 1989 year

2. Заявка ЕПВ N 254081, МКИ G 01 N 33/68, опубл. 1988 г. 2. Application EPO N 254081, MKI G 01 N 33/68, publ. 1988 year

3. Заявка ЕПВ N 158746, МКИ G 01 N 33/553, опубл. 1985 г. 3. Application EPO N 158746, MKI G 01 N 33/553, publ. 1985

4. Шалкаускас М.И., Вашкялис А.Ю. Химическая металлизация пластмасс. - Л., Химия, 1977, с. 168. 4. Shalkauskas M.I., Vashkyalis A.Yu. Chemical metallization of plastics. - L., Chemistry, 1977, p. 168.

5. Shuman D. C. , James T.H. Kinetics of Physical Development. - Phot. Sci. and Eng., 1971, v. 15, N 1, p. 42-47. 5. Shuman D. C., James T.H. Kinetics of Physical Development. - Phot. Sci. and Eng., 1971, v. 15, N 1, p. 42-47.

6. Oliver C. Conjugation of colloidal gold to proteins. - Meth. Mol. Biol., 1994, v. 34, p.303-307. 6. Oliver C. Conjugation of colloidal gold to proteins. - Meth. Mol. Biol., 1994, v. 34, p. 303-307.

7. Turner D. R. , Wolowodiuk C. Electroless Copper Plating as an Image Amplifier for Electrolitic Printing. - J. Electrochem. Soc., 1971, v. 118, N 7, p. 1235-1239. 7. Turner D. R., Wolowodiuk C. Electroless Copper Plating as an Image Amplifier for Electrolitic Printing. - J. Electrochem. Soc., 1971, v. 118, N 7, p. 1235-1239.

Claims

1. Marker for immunochemical and hybridization analysis, representing particles of catalytically active metals having a size of 0.003 - 0.1 μm and capable of precipitating metals on its surface from solutions of physical developers, characterized in that it additionally contains particles of an inert carrier having a size of 0 , 1 - 10.0 μm and a substance density of 1.0 - 1.5 g / cm ³ , and particles of catalytically active metals attached to the surface of the particles of an inert carrier in an amount of 1 - 10 mg / m ² or in a weight ratio of 1: 100 - 1: 1000.

2. The marker according to claim 1, characterized in that the particles of catalytically active metals are made of gold, or silver, or palladium.

3. The marker according to claim 1, characterized in that the particles of an inert carrier are made of latex, or coal, or soot, or Sephadex, or Aerosil.

4. The marker according to claim 1, characterized in that the particles of catalytically active metals are attached to the surface of the particles of an inert carrier by adsorption or recovery from solutions of catalytically active metals on the surface of the particles of an inert carrier.