RU2130071C1

RU2130071C1 - Secretion vector for preparing hirudine hv1 (variants), recombinant strain esherichia coli - a producer of hirudine hv1 and a method of its preparing

Info

Publication number: RU2130071C1
Application number: RU95120078A
Authority: RU
Inventors: Мисава Сатору; Матсуда Хитоси; Иноуе Есифуми; Фуруя Хидеюки
Original assignee: Джапан Энерджи Корпорейшн
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1995-11-23
Publication date: 1999-05-10

Abstract

FIELD: biotechnology, genetic engineering. SUBSTANCE: method of preparing hirudine HV1 is carried out by transformation of recombinant strain Escherichia coli JM-109 (BP-32266) with secretion vector pMTS HV1 or pMKS HV1 followed by its culturing and isolation of the end product from cultural medium or cell periplasm. Secretion vector has PvuI-PvuII-fragment (size is 1440 base pairs) containing a replication region of plasmid pUC18, trp- or tac-promoter, DNA fragment encoding signal peptide of an alkaline phosphatase, DNA fragment encoding hirudine HV1 combined in site AccI and gene determining the resistance to ampicillin as a genetic marker. Hirudine HV1 shows the enhanced antiplatelet activity, decreases hemorrhage effectively. EFFECT: vector and strain indicated above, improved method of producer preparing. 5 cl, 11 dwg, 9 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к вектору секреции для получения чужеродного белка, микроорганизмам, трансформированным с помощью данного вектора, и способу получения гирудина HV1 или HV3 при использовании указанных трансформированных микроорганизмов. The invention relates to a secretion vector for producing a foreign protein, microorganisms transformed using this vector, and a method for producing hirudin HV1 or HV3 using said transformed microorganisms.

Вектор секреции чужеродного белка, такого как аналог гирудина, описанный в данном изобретении, позволяет промышленным путем получать данный белок, поскольку обеспечивает высокий внеклеточный выход гирудина при использовании микроорганизмов E.coli, трансформированных указанным вектором. A vector for secretion of a foreign protein, such as the hirudin analogue described in this invention, allows the industrial production of this protein, since it provides a high extracellular yield of hirudin when using E.coli microorganisms transformed with this vector.

Гирудин - антикоагуляционный фактор, секретируемый слюнными железами медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), который представлен смесью пептидов, состоящих из 65-66 аминокислот. Структура гирудина I (HV1) определена Dodt и др. (FEBS Lett, 165, 180, 1984). Другой вариант гирудина (HV2) (Harvey и др. , Proc. Natl. Acad Sei, США, 83, 1084, 1986) имеет девять различных аминокислотных последовательностей по сравнению с гирудином НV1, и еще один вариант гирудина (HV3) (Dodt и др., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 161, 803, 1986) имеет десять различных аминокислотных последовательностей по сравнению с HV1, чья аминокислотная последовательность совпадает с последовательностью HV2 вплоть до Ser³², и дополнительную аминокислоту (Ala⁶³) на C-концевом участке. Структура аналогов гирудина приведена на фиг. 1. Известна патентная заявка (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 3-164184, 1991), касающаяся получения синтетического гена HV1 и HV3 и экспрессии их в E.coli.Hirudin is an anticoagulant factor secreted by the salivary glands of a medical leech (Hirudo medicinalis), which is represented by a mixture of peptides consisting of 65-66 amino acids. The structure of hirudin I (HV1) was determined by Dodt et al. (FEBS Lett, 165, 180, 1984). Another variant of hirudin (HV2) (Harvey et al., Proc. Natl. Acad Sei, USA, 83, 1084, 1986) has nine different amino acid sequences compared to hirudin NV1, and another variant of hirudin (HV3) (Dodt et al. ., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 161, 803, 1986) has ten different amino acid sequences compared to HV1, whose amino acid sequence matches that of HV2 up to Ser ³² , and an additional amino acid (Ala ⁶³ ) at the C-terminal end . The structure of the hirudin analogues is shown in FIG. 1. A patent application is known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-164184, 1991) for obtaining a synthetic gene HV1 and HV3 and expressing them in E. coli.

Кроме того, были предложены различные системы для получения гирудина методами генной инженерии, однако их нельзя считать удовлетворительными. В частности, с промышленной точки зрения желательно, чтобы белок секретировался из клетки, поскольку в этом случае упрощается разделение и очистка целевого продукта, и, кроме того, обеспечивается его защита от переваривания бактериальными протеазами внутри клетки. In addition, various systems have been proposed for producing hirudin by genetic engineering methods, but they cannot be considered satisfactory. In particular, from an industrial point of view, it is desirable that the protein is secreted from the cell, since in this case the separation and purification of the target product is simplified, and, in addition, it is protected from digestion by bacterial proteases inside the cell.

Для получения секретируемого гирудина были предложены способы с использованием в качестве хозяев Bacillus subtilis, дрожжей или E.coli. To obtain secreted hirudin, methods have been proposed using Bacillus subtilis, yeast, or E. coli as hosts.

Способы, основанные на использовании в качестве хозяев Bacillus subtilis, имеют недостатки. Так например, плазмиды обычно нестойки в бактериях, что приводит к их частому удалению из клеток. Это затрудняет стабильную продукцию белка. Кроме того, содержащиеся в питательной среде продукты расщепляются эндогенными бактериальными протеазами. Способы, предложенные для получения гирудина (например согласно открытому для ознакомления японскому патенту 2-35084, 1990 г.), пока еще не разрешили этих проблем, и выход продукта составляет всего лишь около 100 мг/л. Methods based on the use of Bacillus subtilis as hosts have disadvantages. For example, plasmids are usually unstable in bacteria, which leads to their frequent removal from cells. This makes stable protein production difficult. In addition, the products contained in the nutrient medium are cleaved by endogenous bacterial proteases. The methods proposed for the preparation of hirudin (for example, according to Japanese Patent Publication No. 2-35084, 1990), have not yet resolved these problems, and the yield is only about 100 mg / L.

Известно, что при использовании дрожжей в качестве хозяев C-терминальные аминокислоты целевых продуктов, как правило, гидролизуются карбоксипептидазой. It is known that when using yeast as hosts, the C-terminal amino acids of the target products are usually hydrolyzed by carboxypeptidase.

В опубликованном ранее сообщении (N.Riehi-Bellon и др., Biochemistry 1989, 28, 2941-2949) описывается получение побочных продуктов, содержащих 1 или 2 аминокислотных остатка отщепленных от C-терминального участка HV2. A previously published report (N. Riehi-Bellon et al., Biochemistry 1989, 28, 2941-2949) describes the production of by-products containing 1 or 2 amino acid residues cleaved from the C-terminal portion of HV2.

Для решения данной проблемы был предложен способ, в котором в качестве хозяина использовался дрожжевой штамм с дефицитом карбоксипептидазы; однако этот способ не обеспечил достаточной продуктивности (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 2-104279, 1990). To solve this problem, a method was proposed in which a carboxypeptidase-deficient yeast strain was used as a host; however, this method did not provide sufficient productivity (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-104279, 1990).

Известен способ с применением E.coli в качестве хозяина. При этом используется сигнальная последовательность щелочной фосфатазы (J.Dodt и др., FEBS Lett, 202, 373-377, 1986). Хотя это секреционная система, продукт высвобождается главным образом в периплазматическое пространство, что неудовлетворительно, поскольку необходим разрыв бактериальной клетки за счет дополнительного процесса, такого как осмотический шок, и выход целевого продукта составляет лишь 4 мг/л. A known method using E. coli as a host. The signal sequence of alkaline phosphatase is used (J. Dodt et al., FEBS Lett, 202, 373-377, 1986). Although this is a secretion system, the product is released mainly into the periplasmic space, which is unsatisfactory, since a bacterial cell rupture is necessary due to an additional process, such as osmotic shock, and the yield of the target product is only 4 mg / L.

Изобретение относится к способу внеклеточного продуцирования чужеродных белков с высоким выходом при использовании Е. coli в качестве хозяина. Авторы изобретения установили, что в том случае, когда в качестве оргужина репликации вектора секреции, содержащего последовательности ДНК сигнального пептида, и промотора, используется оргужин (ori) плазмиды pUC, то чужеродный белок секретируется клетками E.coli в больших количествах. The invention relates to a method for the extracellular production of foreign proteins in high yield using E. coli as a host. The inventors have found that when an orguin (ori) of the pUC plasmid is used as the replication organogram of the secretion vector containing the signal peptide DNA sequence and promoter, the foreign protein is secreted in large amounts by E. coli cells.

Настоящее изобретение относится к трансформированным микроорганизмам, полученным путем трансформации E. coli векторами экспрессии, содержащими последовательность ДНК, аналога гирудина с высокой актитромбиновой активностью, и способу получения аналогов гирудина при использовании указанных выше трансформированных микроорганизмов. Для этого, как указано в последнем примере, были сконструированы секретирующие гирудин HV1 плазмиды pMTSHV1 и pMKSHV1, которыми трансформировали E.coli с последующим получением секретируемого HV1. Плазмида pMTSHV1 содержит промотор (Ptrp), последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид (PhoA сигнал), последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность гирудина HV1, оргужин репликации (ori) и последовательность ДНК, включающую терминационный сигнал трансляции (rrnBT₁T₂), как показано на фиг. 3. Согласно данному изобретению для замещения аминокислотной последовательности гирудина HV1 после 53-й аминокислотной группы, аминокислотной последовательностью гирудина HV3, начинающейся после 53-й аминокислотной группы, секретирующую HV1 плазмиду pMTSHV1 расщепляют ферментом рестрикции для удаления последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, начинающуюся после 53-й аминокислотной группы гирудина HV1. С другой стороны, с использованием фермента рестрикции из экспрессионной плазмиды pUCHV3 вырезают последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, начинающуюся после 53-й аминокислотной группы гирудина HV3. Согласно данному изобретению ДНК с удаленным участком, кодирующим последовательность, начинающуюся после 53-й аминокислотной группы гирудина HV1, полученную при расщеплении плазмиды pMTSHV1, и ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, начинающуюся после 53-й аминокислотной группы гирудина HV3, полученную при расщеплении плазмиды pUCHV3, сшивают ДНК лигазой с получением плазмиды pMTSHV1C3, содержащей ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность аналога гирудина, отвечающего данному изобретению.The present invention relates to transformed microorganisms obtained by transforming E. coli expression vectors containing a DNA sequence, a hirudin analog with high actitrombin activity, and a method for producing hirudin analogues using the above transformed microorganisms. For this, as indicated in the last example, the hirudin HV1-secreting plasmids pMTSHV1 and pMKSHV1 were constructed by which E. coli was transformed with subsequent secreted HV1. The plasmid pMTSHV1 contains a promoter (Ptrp), a DNA sequence encoding a signal peptide (PhoA signal), a DNA sequence encoding the amino acid sequence of hirudin HV1, replication orguin (ori), and a DNA sequence including a translation termination signal (rrnBT ₁ T ₂ ), as shown in FIG. 3. According to this invention, to replace the amino acid sequence of hirudin HV1 after the 53rd amino acid group, the amino acid sequence of hirudin HV3 starting after the 53rd amino acid group, the HV1 secreting plasmid pMTSHV1 is cleaved with a restriction enzyme to remove the DNA sequence encoding the amino acid sequence starting after 53 hirudin HV1 amino acid group. On the other hand, using a restriction enzyme from the expression plasmid pUCHV3, a DNA sequence is cut that encodes the amino acid sequence starting after the 53rd amino acid group of hirudin HV3. According to the present invention, DNA with a deleted region encoding a sequence starting after the 53rd amino acid group of hirudin HV1 obtained by cleavage of the plasmid pMTSHV1, and DNA encoding an amino acid sequence starting after the 53rd amino acid group of hirudin HV3 obtained by cleavage of plasmid pUCHV3, crosslink DNA with a ligase to obtain plasmid pMTSHV1C3 containing DNA encoding the amino acid sequence of a hirudin analogue of the invention.

Плазмида pMTSHV1C3 содержит последовательность ДНК, кодирующую промотор, сигнальный пептид и оргужин репликации (ori), полученные из плазмиды pMTSHV1, последовательность ДНК, кодирующую с 1-й по 52-ю аминокислотные группы гирудина HV1, и терминационный сигнал трансляции, а также последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, начиная с 53-й аминокислотной группы гирудина HV3, полученную из плазмиды pUCHV3, которая вставляется между указанной последовательностью ДНК, кодирующей с 1-й по 53-ю аминокислоты гирудина HV1 и сигналом терминации трансляции. The plasmid pMTSHV1C3 contains the DNA sequence encoding the promoter, signal peptide and replication organoin (ori) obtained from the plasmid pMTSHV1, the DNA sequence encoding the 1st through 52th amino acid groups of hirudin HV1, and the translation termination signal, as well as the DNA sequence, the coding amino acid sequence starting from the 53rd amino acid group of hirudin HV3, obtained from the plasmid pUCHV3, which is inserted between the indicated DNA sequence encoding from the 1st to 53rd amino acids of hirudin HV1 and the signal of the terminal and translation.

Аналог гирудина образуется в клетке и поступает в культуральную среду при трансформации E.coli плазмидой pMTSHV1C3 с последующим культивированием трансформированного микроорганизма. The hirudin analog is formed in the cell and enters the culture medium during transformation of E. coli with plasmid pMTSHV1C3, followed by cultivation of the transformed microorganism.

Согласно способу данного изобретения аналог гирудина выделяют общеизвестным способом и очищают такими методами, как обратно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения или хроматография на колонке. According to the method of the present invention, the hirudin analog is isolated by a well-known method and purified by methods such as reverse phase liquid chromatography or column chromatography.

Полученный аналог гирудина проявляет более высокую антитромбиновую активность и эффективнее снижает кровоточивость, чем гирудин HV1, при испытании на животных. The obtained hirudin analog exhibits higher antithrombin activity and more effectively reduces bleeding than hirudin HV1 when tested in animals.

Кроме того, как уже отмечалось ранее, настоящее изобретение относится к вектору секреции для получения чужеродного белка, в частности к вектору секреции для внеклеточного получения гирудина или его аналогов в больших количествах. In addition, as previously noted, the present invention relates to a secretion vector for the production of a foreign protein, in particular to a secretion vector for the extracellular production of hirudin or its analogues in large quantities.

Настоящее изобретение относится также к вектору секреции, содержащему последовательность ДНК, кодирующую гирудин или его аналоги, микроорганизму (E. coli), трансформированному данным вектором секреции, и способу получения гирудина или его аналогов путем культивирования указанного трансформированного микроорганизма и выделения целевого продукта из культуральной среды. The present invention also relates to a secretion vector containing a DNA sequence encoding hirudin or its analogs, a microorganism (E. coli) transformed by this secretion vector, and a method for producing hirudin or its analogues by culturing said transformed microorganism and isolating the desired product from the culture medium.

Вектор секреции чужеродного белка, отвечающий данному изобретению, содержит последовательность ДНК, оргужина репликации (ori), полученного из плазмиды pUC, последовательность ДНК промотора tac или промотора trp, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, и последовательность ДНК, кодирующую чужеродный белок. The foreign protein secretion vector of the invention comprises a DNA sequence, a replication origin (ori) derived from a pUC plasmid, a tac or trp promoter DNA sequence, a DNA sequence encoding a signal peptide, and a DNA sequence encoding a foreign protein.

Фрагмент ДНК, содержащий оргужин репликации (ori) плазмиды pUC, может быть получен путем расщепления коммерчески доступных плазмид семейства pUC, например рUС9, рUC18, или pUC19, ферментами рестрикции в соответствующей комбинации. Так например, фрагмент ДНК размером около 1440 пар оснований (вр), включая оргужин репликации (ori), полученный путем расщепления плазмиды pUC18 рестриктазами PvuI, или PvuI и PvuII, совместно может быть использован как оргужин репликации плазмиды pUC. A DNA fragment containing the replication orgugin (ori) of the pUC plasmid can be obtained by cleaving commercially available pUC family plasmids, for example pUC9, pUC18, or pUC19, with restriction enzymes in an appropriate combination. For example, a DNA fragment with a size of about 1440 base pairs (bp), including replication orguin (ori), obtained by cleavage of the pUC18 plasmid with PvuI restriction enzymes, or PvuI and PvuII, can be used together as a pUC plasmid replication orgugin.

Фрагмент промоторов tac или trp имеет нуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 7 и 8 соответственно, и они могут быть легко синтезированы с помощью ДНК синтезатора и другими методами. Таким образом, указанные промоторы могут быть синтезированы и соединены с фрагментами, содержащими оргужин репликации (ori) плазмиды pUC18. С другой стороны, они могут быть относительно легко получены путем легирования фрагментов ДНК, образованных при расщеплении коммерчески доступных плазмид ферментами рестрикции. Так например, плазмида рМК2 может быть получена с использованием Т4 ДНК лигазы путем соединения фрагментов ДНК, включающих ДНК последовательность промотора, полученных при расщеплении коммерчески доступной плазмиды рКК223-3 (Pharmacia) рестриктазами PvuI и NruI, и фрагмента ДНК, включающего оргужин репликации (ori), полученного путем расщепления коммерчески доступной плазмиды pUC18 рестриктазами PvuI и PvuII. The tac or trp promoter fragment has the nucleotide sequences shown in FIG. 7 and 8, respectively, and they can be easily synthesized using DNA synthesizer and other methods. Thus, these promoters can be synthesized and linked to fragments containing the replication organoin (ori) of plasmid pUC18. On the other hand, they can be relatively easily obtained by doping DNA fragments formed by cleavage of commercially available plasmids with restriction enzymes. For example, the plasmid pMK2 can be obtained using T4 DNA ligase by combining DNA fragments including the DNA promoter sequence obtained by cleaving the commercially available plasmid pKK223-3 (Pharmacia) with restriction enzymes PvuI and NruI, and a DNA fragment including replication organisms (ori) obtained by cleavage of the commercially available plasmid pUC18 with restriction enzymes PvuI and PvuII.

С другой стороны, плазмида pMT1 может быть получена при удалении фрагмента ДНК, соответствующего промотору tac, путем расщепления указанной выше плазмиды рМК2 ферментами рестрикции EcoRI и Есо47III, и последующей вставке фрагмента, соответствующего промотору trp, синтезированного с помощью ДНК-синтезатора. Alternatively, the plasmid pMT1 can be obtained by removing the DNA fragment corresponding to the tac promoter by cleaving the above plasmid pMK2 with restriction enzymes EcoRI and Eco47III, and then inserting the fragment corresponding to the trp promoter synthesized using a DNA synthesizer.

В качестве последовательности ДНК сигнального пептида может быть использована последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид белков, локализирующихся в периплазме E.coli, например ферментов, таких как щелочная фосфатаза (phoА) и B-лактамаза (bla) или белков наружной мембраны. Например, OmpA, OmpB и OmpF. Указанные фрагменты ДНК могут быть легко получены с помощью ДНК-синтезатора. As a DNA sequence of a signal peptide, a DNA sequence encoding a signal peptide of proteins localized in the periplasm of E. coli, for example, enzymes such as alkaline phosphatase (phoA) and B-lactamase (bla) or outer membrane proteins, can be used. For example, OmpA, OmpB, and OmpF. These DNA fragments can be easily obtained using a DNA synthesizer.

Хотя в настоящем изобретении любой белок может считаться чужеродным, наиболее подходящими являются гирудин и его варианты. Аминокислотная последовательность этих белков приведена на фиг. 1 (гирудины HV1, HV2, HV3 и HV1C3). Although in the present invention any protein may be considered foreign, hirudin and its variants are most suitable. The amino acid sequence of these proteins is shown in FIG. 1 (hirudins HV1, HV2, HV3 and HV1C3).

Краткое описание чертежей. A brief description of the drawings.

Фиг. 1 иллюстрирует аминокислотную последовательность гирудинов HV1, HV2, HV3, HV1C3. FIG. 1 illustrates the amino acid sequence of hirudins HV1, HV2, HV3, HV1C3.

Фиг. 2 иллюстрирует ДНК последовательность сигнального пептида phoA. FIG. 2 illustrates the DNA sequence of the phoA signal peptide.

Фиг. 3 дает общую схему построения плазмиды pMTSHV1, секретирующей гирудин HV1. FIG. 3 gives a general scheme for constructing the plasmid pMTSHV1 secreting hirudin HV1.

Фиг. 4 дает общую схему построения плазмиды pMKSHV1. FIG. 4 gives a general scheme for the construction of plasmid pMKSHV1.

Фиг. 5 дает общую схему построения плазмиды pMTSHV1CS, секретирующей гирудин HV1C3. FIG. 5 gives a general scheme for constructing the plasmid pMTSHV1CS secreting hirudin HV1C3.

Фиг. 6 - (А) кривая С4 обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения, показывающая профиль гирудина HV1; (В) кривая С4 обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения, показывающая профиль гирудина HV1C3. FIG. 6 - (A) C4 curve of high-resolution reverse phase liquid chromatography showing the hirudin HV1 profile; (B) C4 curve of high-resolution reverse phase liquid chromatography showing the hirudin profile of HV1C3.

Фиг.7 - последовательность ДНК промотора tac, используемого согласно данному изобретению. 7 is a DNA sequence of the tac promoter used according to this invention.

Фиг.8 - последовательность ДНК промотора trp, используемого согласно данному изобретению
Фиг. 9 дает общую схему построения плазмиды pMTSHVS, секретирующей гирудин HV3.8 is a DNA sequence of the trp promoter used according to this invention
FIG. 9 gives a general scheme for constructing the plasmid pMTSHVS secreting hirudin HV3.

Фиг. 10 иллюстрирует ДНК последовательность сигнального пептида phoA для секреции гирудина HV3, используемую в примере 5. FIG. 10 illustrates the DNA sequence of the phoA signal peptide for hirudin HV3 secretion used in Example 5.

Фиг. 11 - кривая С4 обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения, показывающая профиль очищенного гирудина HV3. FIG. 11 is a C4 curve of high resolution reverse phase liquid chromatography showing the profile of purified hirudin HV3.

Наилучший вариант осуществления данного изобретения. The best embodiment of the present invention.

В нижеследующих примерах описывается конструирование плазмид pUCHV1, pMT1 и рМК2 для получения плазмиды pHTSHV1 или pMKSHV1 секретирующей HV1, которая используется в данном изобретении, а также конструирование плазмиды pUCHV3 для получения плазмиды pMTSHV1C3. The following examples describe the construction of plasmids pUCHV1, pMT1 and pMK2 to obtain the plasmid pHTSHV1 or pMKSHV1 secreting HV1, which is used in this invention, as well as the construction of plasmid pUCHV3 to obtain plasmid pMTSHV1C3.

Пример 1. Получение плазмид pUCHV1 и pUCHV3. Example 1. Obtaining plasmids pUCHV1 and pUCHV3.

10 мкг коммерчески доступной плазмиды pUC18 обрабатывают 30 ед. EcoRI и 30 ед. Hind III при температуре 37^oC в течение 2 ч. Затем векторную часть отделяют и экстрагируют путем электрофореза в агарозном геле. Затем удаляют белки с помощью фенольной экстракции, осаждают их холодным этанолом и растворяют в 50 мкл буферного раствора ТE (10 мМ Трис-HCl, pH=8,0, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты). К количеству данного раствора, содержащего 50 нг ДНК, добавляют 10 мкл раствора (66 мМ Трис-HCl, pH=7,5, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ DTT,1 мМ АТП и 300 ед. Т4 ДНК лигазы), содержащего двухнитевую ДНК гирудина НV1 или HV3. Далее проводят реакцию в течение ночи при температуре 16^oC и получают плазмиду pUCHV1 или pUCHV3, в которые вставлен соответственно ген HV1 или ген HV3 между EcoRI и Hind III сайтом плазмиды pUC18.10 μg of the commercially available plasmid pUC18 is treated with 30 units. EcoRI and 30 units. Hind III at a temperature of 37 ^o C for 2 hours. Then the vector part is separated and extracted by agarose gel electrophoresis. The proteins are then removed by phenol extraction, precipitated with cold ethanol and dissolved in 50 μl of TE buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid). To the amount of this solution containing 50 ng of DNA, add 10 μl of a solution (66 mm Tris-HCl, pH = 7.5, 5 mm MgCl ₂ , 5 mm DTT, 1 mm ATP and 300 units of T4 DNA ligase) containing double-stranded Hirudin DNA HV1 or HV3. The reaction is then carried out overnight at a temperature of 16 ^° C. and the plasmid pUCHV1 or pUCHV3 is obtained, into which the HV1 gene or HV3 gene is inserted between the EcoRI and Hind III site of plasmid pUC18.

Пример 2. Получение плазмид рМК2 и PMT1. Example 2. Obtaining plasmids pMK2 and PMT1.

a) Получение плазмиды рМК2. a) Obtaining plasmids pMK2.

Фрагмент, содержащий tac-промотор, полученный путем расщепления промышленно доступной плазмиды рКК223-3 (Pharmacia) ферментами рестрикции PvuI и NruI, фрагмент, содержащий оргужин репликации (ori), полученный путем расщепления промышленно доступной плазмиды pUC18 ферментами рестрикции PvuI и PvuII и фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину, сшивают с помощью ДНК лигазы Т4. Полученный таким образом фрагмент вводят в штамм E.coli JM109 с последующим культивированием и селекцией по устойчивости к ампициллину, и получают вектор, содержащий как промотор, так и оргужин репликации (ori) плазмиды pUC18. Данный вектор обозначают рМК2. A fragment containing the tac promoter obtained by cleavage of the industrially available plasmid pKK223-3 (Pharmacia) with PvuI and NruI restriction enzymes, a fragment containing replication orguzhin (ori) obtained by cleavage of the industrially available plasmid pUC18 with PvuI and PvuII restriction enzymes, and a fragment ampicillin resistance gene, crosslinked using T4 ligase DNA. The fragment thus obtained was introduced into the E. coli strain JM109, followed by cultivation and selection for ampicillin resistance, and a vector was obtained containing both the promoter and the replication organoin (ori) of plasmid pUC18. This vector is designated pMK2.

(б) Получение плазмиды pMT1. (b) Obtaining the plasmid pMT1.

10 мкг плазмиды рМК2 обрабатывают 30 ед.ЕсоRI и Eсо47 III, удаляют фрагмент, содержащий tac-промотор, и затем выделяют фрагмент, содержащий оргужин репликации (ori) путем электрофореза в агарозном геле. Одновременно с этим синтезируют фрагмент ДНК, содержащий trp-промотор, с помощью синтезатора ДНК. Указанный фрагмент сшивают с полученным выше (расщепление плазмиды рМК2 EcoR1 и Есо47 III) при использовании ДНК лигазы Т4 при температуре 16^oС в течение ночи. Полученным конструктом трансформируют E.coli JM109 для получения вектора, содержащего как trp-промотор, так и ориджин репликации (ori) плазмиды рМК2. Последовательность ДНК данной плазмиды определяют методом Сэнгера и др., и указанную плазмиду обозначают pMT1.10 μg of plasmid pMK2 was treated with 30 units of EcoRI and Eco47 III, the fragment containing the tac promoter was removed, and then the fragment containing replication orguzhin (ori) was isolated by agarose gel electrophoresis. At the same time, a DNA fragment containing the trp promoter is synthesized using a DNA synthesizer. The specified fragment is crosslinked with the above (cleavage of plasmid pMK2 EcoR1 and Eco47 III) using T4 DNA ligase at a temperature of 16 ^{° C.} overnight. The resulting construct is transformed with E. coli JM109 to obtain a vector containing both the trp promoter and the origin of replication (ori) of plasmid pMK2. The DNA sequence of this plasmid is determined by the method of Sanger et al., And the indicated plasmid is designated pMT1.

Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется следующими примерами. The present invention is illustrated in more detail by the following examples.

Пример 1. Example 1

(1) Получение плазмиды секреции pMTSHV1 гирудина HV1. (1) Obtaining plasmid secretion pMTSHV1 hirudin HV1.

Плазмиду pMTSHV1 получают как показано на фиг. 3. Синтезируют четыре олигонуклеотида, приведенных на фиг. 2, для построения фрагмента ДНК, соответствующего сигнальному пептиду щелочной фосфатазы (phoA) E.coli, и фрагмента ДНК, кодирующего Val₁-Val₂ N-терминальной аминокислотной последовательности гирудина HV1. После снятия защиты каждый нуклеотид очищают путем электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле.Plasmid pMTSHV1 was obtained as shown in FIG. 3. The four oligonucleotides shown in FIG. 2, to construct a DNA fragment corresponding to the signal peptide of alkaline phosphatase (phoA) of E. coli, and a DNA fragment encoding Val ₁ -Val ₂ N-terminal amino acid sequence of hirudin HV1. After deprotection, each nucleotide is purified by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel.

После фосфорилирования 500 пкМ каждого из двух олигонуклеотидов (S2, S4) 20 пкМ каждого из четырех олигонуклеотидов смешивают, отжигают и затем обрабатывают при 16^oC в течение ночи 20 мкл раствора, содержащего ДНК лигазу Т4. После удаления белка фенолом и хлороформом и осаждения холодным этанолом, получают нужный фрагмент двухнитевой ДНК. 1/10 количества полученного таким образом фрагмента и 100 нг плазмиды pUCHV1 (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 3-164184, 1991 г.), расщепленной ферментами рестрикции EcoRI и АссI, обрабатывают ДНК лигазой Т4 при 16^oC в течение ночи. Гибридную плазмиду pSHV1, содержащую ген слияния, в котором последовательность ДНК, кодирующая гирудин HV1, расположена непосредственно после последовательности, кодирующей сигнальный пептид phoА, получают путем трансформации штамма E.coli JM109. Последовательность ДНК плазмиды pSHV1 определяют методом Сэнгера и др.After phosphorylation of 500 pcM of each of the two oligonucleotides (S2, S4), 20 pcM of each of the four oligonucleotides are mixed, annealed and then treated at 16 ^° C. overnight with 20 μl of a solution containing T4 DNA ligase. After removal of the protein with phenol and chloroform and precipitation with cold ethanol, the desired double-stranded DNA fragment is obtained. 1/10 of the thus obtained fragment and 100 ng of the plasmid pUCHV1 (Japanese Patent Application Laid-open No. 3-164184, 1991) digested with EcoRI and AssI restriction enzymes were digested with T4 ligase at 16 ^° C. overnight. A pSHV1 hybrid plasmid containing a fusion gene in which the DNA sequence encoding hirudin HV1 is located immediately after the sequence encoding the phoA signal peptide is obtained by transformation of E. coli strain JM109. The DNA sequence of plasmid pSHV1 is determined by the method of Sanger et al.

10 мкг плазмиды pSHV1 обрабатывают ферментами рестрикции EcoRI (30 ед.), и Hind III (30 ед.) и фрагмент слитого гена размером 276 пар оснований (вр) очищают путем электрофореза в агарозном геле. 10 μg of the plasmid pSHV1 was digested with EcoRI restriction enzymes (30 units), and Hind III (30 units) and a 276 base pair (bp) fusion gene fragment were purified by agarose gel electrophoresis.

100 нг полученного таким образом фрагмента ДНК и 100 нг фрагмента ДНК, полученного при расщеплении вектора экспрессии E.coli pMT1 (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 3-76579, 1991 г.) ферментами рестрикции EcoRI и Hind III с последующей очисткой фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле, соединяют с помощью ДНК лигазы Т4 при температуре 16^oC в течение ночи. Указанной реакционной смесью трансформируют E.coli JM109 для получения плазмиды pMTSHV1, секретирующей HV1, в которой ген слияния, кодирующий сигнальный пептид phoA и гирудин HV1, расположен за trp-промотором. Последовательность ДНК плазмиды pMTSHV1 определяют методом Сэнгера и др.100 ng of the thus obtained DNA fragment and 100 ng of the DNA fragment obtained by digesting the expression vector of E. coli pMT1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-76579, 1991) with restriction enzymes EcoRI and Hind III followed by purification of the DNA fragments by electrophoresis in agarose gel, connect using T4 ligase DNA at a temperature of 16 ^o C during the night. The reaction mixture is transformed with E. coli JM109 to obtain the plasmid pMTSHV1 secreting HV1, in which the fusion gene encoding the phoA signal peptide and hirudin HV1 is located behind the trp promoter. The DNA sequence of the plasmid pMTSHV1 is determined by the method of Sanger et al.

(2) Получение плазмиды pMKSHV1, секретирующей гирудин HV1. (2) Obtaining plasmid pMKSHV1 secreting hirudin HV1.

Плазмиду pMKSHV1 получают, как показано на фиг. 4. Plasmid pMKSHV1 was obtained as shown in FIG. 4.

Указанную выше ДНК слияния, кодирующую сигнальный пептид phoA, и гирудин HV1 и фрагмент ДНК, полученный при расщеплении плазмид экспрессии E.coli рМК2 (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 3-76579, 1991 г. ) ферментами рестрикции EcoRI и Hind III сшивают с помощью ДНК лигазы Т4, трансформируют E.coli JM109, и получают плазмиду pMKSHV1, секретирующую гирудин HV1, в которой ген слияния расположен ниже tac-промотора. Последовательность ДНК плазмиды pMKSHV1 определяют методом Сэнгера и др. The above fusion DNA encoding the phoA signal peptide and hirudin HV1 and a DNA fragment obtained by digesting E. coli expression plasmids pMK2 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-76579, 1991) with restriction enzymes EcoRI and Hind III are crosslinked with using T4 ligase DNA, transform E. coli JM109 to obtain the plasmid pMKSHV1 secreting hirudin HV1, in which the fusion gene is located below the tac promoter. The DNA sequence of the plasmid pMKSHV1 determined by the method of Sanger et al.

(3) Секреторная продукция гирудина HV1 с помощью вектора DMTSHV1. (3) Secretory production of hirudin HV1 using the DMTSHV1 vector.

Клетки E. coli JM109, трансформированные плазмидами pMTSHV1 и pMKSHV1, полученными как указано выше в (1) и (2), культивируют в среде 2 х УТ (16 г/л бактотриптона, 10 г/л бактодрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl), содержащей 100 мкг/мл ампициллина. После культивирования при 37^oC в течение 24 ч собирают 1 мл культуральной среды.E. coli JM109 cells transformed with plasmids pMTSHV1 and pMKSHV1, obtained as described above in (1) and (2), were cultured in 2 x CT (16 g / L bactotryptone, 10 g / L bacterium yeast extract and 5 g / L NaCl ) containing 100 μg / ml ampicillin. After culturing at 37 ^° C. for 24 hours, 1 ml of culture medium was collected.

Осажденные клетки каждого из образцов суспендируют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH=7,5), содержащего 25% сахарозы и 1 мМ ЕДТА, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. После сбора клеток путем центрифугирования при 6000 х g в течение 10 мин, их суспендируют в 1 мл холодной воды для высвобождения вещества в периплазматическое пространство путем осмотического шока. Затем клетки удаляют из периплазматической фракции центрифугированном при 6000 х g в течение 10 мин. Количество секретированного и накопившегося в периплазме гирудина определяют путем измерения его антитромбиновой активности в супернатанте. Антитромбиновую активность определяют по количественному измерению интенсивности окраски создаваемой гидролитическим действием тромбина на синтетический хромогенный субстрат хромозим ТН (тоцилглицил - пролиларгинин - 4-нитроанилидацетат, Boeringer-Mannhaim) и ингибирующему действию гирудина на тромбин, которое подавляет проявление окраски. The precipitated cells of each of the samples are suspended in 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) containing 25% sucrose and 1 mM EDTA, then they are kept at room temperature for 10 minutes. After collecting the cells by centrifugation at 6000 x g for 10 min, they are suspended in 1 ml of cold water to release the substance into the periplasmic space by osmotic shock. Then the cells are removed from the periplasmic fraction centrifuged at 6000 x g for 10 minutes. The amount of hirudin secreted and accumulated in the periplasm is determined by measuring its antithrombin activity in the supernatant. Antithrombin activity is determined by quantitatively measuring the color intensity generated by the hydrolytic action of thrombin on the synthetic chromogenic substrate chromozyme TH (tocilylglycyl - prolylarginine - 4-nitroanilidacetate, Boeringer-Mannhaim) and the inhibitory effect of hirudin on thrombin, which inhibits the manifestation of color.

В результате выявляется, что штамм, содержащий плазмиду pMTSHV1, обнаруживает 450 ед. антитромбиновой активности (ATU) на 1 мл культуральной среды. As a result, it is revealed that the strain containing the plasmid pMTSHV1, detects 450 units. antithrombin activity (ATU) per 1 ml of culture medium.

Кроме того, штамм, содержащий плазмиду pMKSHV1, обнаруживает 360 ATU на 1 мл среды разведения. В табл. 1 представлены результаты других исследований, касающихся получения гирудина при использовании различных штаммов E. coli, таких как JM101, JM103, JM109, TG1, HB101, JA221, IF03301, C600, RR1 и DH5, в которые методом трансформации по Hanahan et al. введена плазмида pMTSHV1. In addition, the strain containing the plasmid pMKSHV1 detects 360 ATU per 1 ml of dilution medium. In the table. 1 shows the results of other studies regarding the production of hirudin using various E. coli strains, such as JM101, JM103, JM109, TG1, HB101, JA221, IF03301, C600, RR1 and DH5, into which by the method of transformation according to Hanahan et al. introduced the plasmid pMTSHV1.

При использовании RRI в качестве хозяина внеклеточная продукция HV1 составляет примерно 2000 ATU/мл. When using RRI as a host, the extracellular production of HV1 is about 2000 ATU / ml.

(4) Секреция гирудина HV1 в культуральную среду при использовании трансформированных клеток E.coli JM109/pMTSHV1. (4) Secretion of hirudin HV1 into the culture medium using transformed E. coli JM109 / pMTSHV1 cells.

При культивировании штамма E.coli JM109, трансформированного плазмидой pMTSHV1 (E.coli JM109/pMTSHV1) (FERM BP-3266), в 2 л питательной среды 2хУТ, содержащей 2% глюкозы, в 5-литровом ферментере с перемешиванием и аэрацией при 37^oC в течение 24 ч внеклеточная продукция гирудина составляет около 5300 ATU на 1 мл среды
(5) Выделение гирудина HV1 из питательной среды.When culturing a strain of E. coli JM109, transformed with plasmid pMTSHV1 (E. coli JM109 / pMTSHV1) (FERM BP-3266), in 2 l of 2xUT nutrient medium containing 2% glucose in a 5-liter fermenter with stirring and aeration at 37 ^o C for 24 hours the extracellular production of hirudin is about 5300 ATU per 1 ml of medium
(5) Isolation of hirudin HV1 from the culture medium.

После ферментации собирают 1,5 л питательной среды и центрифугируют при 6000 х g в течение 10 мин для отделения супернатанта от клеточного дебриса. Поскольку концентрация соли в супернатанте составляет 1,3%, то супернатант четырехкратно разбавляют 10 мМ буферного раствора фосфата калия (pH=7,0) и фильтруют через фильтр с диаметром пор 3,2 мкм (Pole Со.Ltd). Полученный фильтрат наносят на колонку с QAE-toyopearl (4,4 х 7 см), уравновешенную 10 мМ буферным раствором фосфата калия (pH=7,0). После загрузки образца колонку уравновешивают буферным раствором с последующей ступенчатой элюцией гирудина HV1 0,2 М NaCl. Элюированный раствор концентрируют на мембране Diaflow (YM5) фирмы Amicon, и затем осуществляют гель-фильтрацию с помощью Сефакрила Sephacryl S-100HR, предварительно уравновешенного 10 мМ буферным раствором фосфата калия (pH=7,0) для обессоливания. After fermentation, 1.5 L of culture medium is collected and centrifuged at 6000 x g for 10 min to separate the supernatant from the cell debris. Since the salt concentration in the supernatant is 1.3%, the supernatant is diluted four times with 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH = 7.0) and filtered through a filter with a pore diameter of 3.2 μm (Pole Co. Ltd.). The resulting filtrate was applied to a QAE-toyopearl column (4.4 x 7 cm), equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH = 7.0). After loading the sample, the column was equilibrated with a buffer solution, followed by stepwise elution of hirudin HV1 0.2 M NaCl. The eluted solution was concentrated on a Amicon Diaflow (YM5) membrane, and then gel filtration was performed using Sephacryl Sephacryl S-100HR, pre-equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH = 7.0) for desalination.

Активные фракции наносят на колонку с DEAE-toyopearl (4,4 х 40 см), уравновешенную 10 мМ буферным раствором фосфата калия (pH=7,0), тщательно промывают и затем элюируют линейным градиентом, создаваемым между 3 л уравновешивающего буфера и 3 л 0,3 М NaCl в уравновешивающем буфере. Окончательную очистку осуществляют посредством обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения при использовании колонки С4 с Delta-prep 3000, полученным от фирмы Waters. Очищенный гирудин HV1 получают элюированием его из хроматографической колонки с помощью линейного градиента 15-30%-ного (по объему) ацетонитрила, содержащего 0,065% (по объему) трифторацетата. The active fractions are applied onto a DEAE-toyopearl column (4.4 x 40 cm), equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH = 7.0), washed thoroughly, and then eluted with a linear gradient created between 3 L equilibration buffer and 3 L 0.3 M NaCl in equilibration buffer. Final purification is carried out by reverse phase high performance liquid chromatography using a C4 column with a Delta-prep 3000 obtained from Waters. Purified hirudin HV1 is obtained by eluting it from a chromatographic column using a linear gradient of 15-30% (v / v) acetonitrile containing 0.065% (v / v) trifluoroacetate.

Степень очистки, достигаемая на каждом этапе, приведена в табл. 2. The degree of purification achieved at each stage is given in table. 2.

Аминокислотный состав полученного таким образом гирудина HV1 является постоянным по сравнению с природным гирудином HV1, как показано в табл. 3. Антитромбиновая активность составляет 8202 ATU/мг. The amino acid composition of the thus obtained hirudin HV1 is constant compared to the natural hirudin HV1, as shown in table. 3. Antithrombin activity is 8202 ATU / mg.

6) Получение плазмиды pMTSHV1C3, секретирующей химерный гирудин. 6) Obtaining plasmid pMTSHV1C3 secreting chimeric hirudin.

Плазмиду pMTSHV1C3 получают согласно способу, показанному на фиг. 5. Для замены аминокислотных групп гирудина HV1, начиная с 53-й аминокислоты последовательностью гирудина HV3, плазмиду pMTSHV1 (10 мкг), секретирующую HV1 обрабатывают ферментами рестрикции Крn 1 (30 ед.) и Hind III (30 ед.) с последующим электрофорезом в агарозном геле для очистки фрагмента ДНК размером 2,8 т.п.о. Plasmid pMTSHV1C3 was obtained according to the method shown in FIG. 5. To replace the amino acid groups of hirudin HV1, starting from the 53rd amino acid with the sequence of hirudin HV3, the plasmid pMTSHV1 (10 μg) secreting HV1 is treated with restriction enzymes Kpn 1 (30 units) and Hind III (30 units) followed by electrophoresis in agarose gel for purification of a 2.8 kb DNA fragment

Аналогичным образом 10 мкг плазмиды pUCHV3 (выложенная для ознакомления заявка на японский патент 3-164184, 1991) также обрабатывают Kpn 1 и Hind III и получают фрагмент ДНК размером 80 п.о., кодирующий С-терминальную аминокислотную последовательность гирудина HV3. Similarly, 10 μg of the plasmid pUCHV3 (Japanese Patent Application Laid-open No. 3-164184, 1991) was also treated with Kpn 1 and Hind III to obtain an 80 bp DNA fragment encoding the HV3 hirudin C-terminal amino acid sequence.

100 нг обоих фрагментов ДНК обрабатывают ДНК лигазой Т4 при температуре 16^oC в течение ночи, и полученную реакционную смесь используют для трансформации E. coli JM109 с выделением плазмиды pMTSHV1C3, секретирующей химерный гирудин HV1C3. Последовательность ДНК плазмиды pMTSHV1C3 определяют методом Сэнгера и др.100 ng of both DNA fragments were treated with T4 DNA ligase at a temperature of 16 ^° C. overnight, and the resulting reaction mixture was used to transform E. coli JM109 with the isolation of plasmid pMTSHV1C3 secreting chimeric hirudin HV1C3. The DNA sequence of the plasmid pMTSHV1C3 is determined by the method of Sanger et al.

(7) Получение химерного гирудина HV1C3 с помощью плазмиды секреции. (7) Obtaining chimeric hirudin HV1C3 using a secretion plasmid.

Клетки E.coli RRI (FERM ВР-3130), трансформированные плазмидой pMTSHV1C3, полученной как описано выше (6), культивируют в питательной среде 2хУТ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. После культивирования в течение 24 ч при температуре 37^oC, собирают 1 мл культуральной среды и с помощью осмотического шока измеряют антитромбиновую активность переплазматической фракции.E. coli RRI cells (FERM BP-3130) transformed with pMTSHV1C3 plasmid obtained as described above (6) were cultured in 2xUT nutrient medium containing 100 μg / ml ampicillin. After culturing for 24 hours at a temperature of 37 ^° C, 1 ml of culture medium is collected and the antithrombin activity of the re-plasma fraction is measured using osmotic shock.

Результирующая антитромбиновая активность составляет 3060 ATU на 1 мл культуральной среды. The resulting antithrombin activity is 3060 ATU per 1 ml of culture medium.

(8) Секреция химерного гирудина HV1C3 в ферментационную или культуральную среду трансформированным штаммом E.coli JM109/pMTSH1C3
При культивировании штамма E.coli JM109 (FERM ВР-3104), трансформированного плазмидой pMTSHV1C3, в 2 л питательной среды 2хУТ, содержащей 2% глюкозы, в 5-литровом ферментере с перемешиванием и аэрацией при температуре 37^oC в течение 24 ч, обнаруживают общую антитромбиновую активность равную 6050 ATU/мл. Активность в периплазме и культуральной среде составляет 350 ATU/мл и 5700 ATU/мл соответственно.(8) Secretion of the chimeric hirudin HV1C3 into a fermentation or culture medium by a transformed E. coli strain JM109 / pMTSH1C3
When culturing E. coli strain JM109 (FERM BP-3104), transformed with plasmid pMTSHV1C3, in 2 l of 2xUT nutrient medium containing 2% glucose in a 5-liter fermenter with stirring and aeration at a temperature of 37 ^o C for 24 h, find total antithrombin activity of 6050 ATU / ml. Activity in periplasm and culture medium is 350 ATU / ml and 5700 ATU / ml, respectively.

(9) Очистка химерного гирудина HV1C3. (9) Purification of the chimeric hirudin HV1C3.

Гирудин HV1C3 выделяют из культуральной среды, полученной как указано выше (8), согласно способу, описанному в (5). При определении аминокислотной последовательности очищенного химерного гирудина HV1C3, было выявлено, что его С-терминальный участок отличен от такового HV1, как показано на фиг. 1. Специфическая активность составляет 11 250 ATU/мг. Профили HPLC для очищенных HV1 и HV1C3 приведены на фиг. 6. В эксперименте используют хроматографическую колонку с VYDAC С4 (0,46 х 25 см) с линейным градиентом ацетонитрила от 15 до 30% при скорости потока 1 мл/мин в течение 30 мин. Hirudin HV1C3 is isolated from the culture medium obtained as described above (8), according to the method described in (5). When determining the amino acid sequence of purified chimeric hirudin HV1C3, it was found that its C-terminal region is different from that of HV1, as shown in FIG. 1. The specific activity is 11,250 ATU / mg. The HPLC profiles for purified HV1 and HV1C3 are shown in FIG. 6. In the experiment, a VYDAC C4 chromatography column (0.46 x 25 cm) with a linear gradient of acetonitrile from 15 to 30% at a flow rate of 1 ml / min for 30 minutes is used.

Пример 2. Example 2

Ингибирующее действие гирудина на смертельный исход, вызванный тромбином. The inhibitory effect of hirudin on death caused by thrombin.

В организм мышей самцов (весом 20-25 г) без анестезии вводят внутривенно тромбин (10 NIH ед/10 г) и определяют антитромбиновую активность испытываемого соединения при наблюдении за исчезновением уплотнения при рефлексии и смертельном исходе, что служит показателями этой активности. Thrombin (10 NIH units / 10 g) is injected intravenously into male mice (weighing 20-25 g) without anesthesia and the antithrombin activity of the test compound is determined while observing the disappearance of the seal during reflection and death, which serve as indicators of this activity.

При индуцированной тромбином смертельной реакции в условиях "ин виво", химерный гирудин (HV1C3), полученный согласно данному изобретению, обнаруживает примерно в 3-4 раза более сильную ингибирующую активность по сравнению с гирудином HV1. In a thrombin-induced lethal reaction under in vivo conditions, the chimeric hirudin (HV1C3) obtained according to this invention exhibits about 3-4 times stronger inhibitory activity compared to hirudin HV1.

Получение гирудина HV3. Getting hirudin HV3.

(1) Конструирование плазмиды, секретирующей гирудин HV3. (1) Construction of a hirudin HV3 secreting plasmid.

(i) Как показано на фиг. 9, ориджин репликации (ori), полученный при расщеплении плазмиды pUCHV3, сконструированной как описано в примере 1, ферментами рестрикции EcoRI и AccI, векторный фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину, и синтетический ген, кодирующий сигнальную последовательность щелочной фосфатазы (phoA), строение которой приведено на фиг. 10, сшивают с помощью ДНК лигазы Т4. В результате получают плазмиду pSHV3, в которой последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид щелочной фосфатазы (pho А), присоединена к последовательности ДНК, кодирующей HV3. Данную плазмиду вводят в клетки E.coli JM109, культивируют их и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину. (i) As shown in FIG. 9, the origin of replication (ori) obtained by cleavage of the pUCHV3 plasmid constructed as described in Example 1 with EcoRI and AccI restriction enzymes, a vector fragment containing the ampicillin resistance gene and a synthetic gene encoding the alkaline phosphatase signal sequence (phoA), structure which is shown in FIG. 10 are crosslinked using T4 ligase DNA. The result is the plasmid pSHV3, in which the DNA sequence encoding the signal peptide of alkaline phosphatase (pho A) is attached to the DNA sequence encoding HV3. This plasmid is introduced into E. coli JM109 cells, cultured, and ampicillin resistant clones are selected.

(ii) Далее плазмиду pSHV3 расщепляют ферментами рестрикции EcoRI и Hind III и получают фрагмент размером 275 п.о., соответствующий последовательности ДНК сигнального пептида щелочной фосфатазы (phoА), расположенный перед последовательностью ДНК, кодирующей гирудин HV3. (ii) Next, the plasmid pSHV3 is digested with restriction enzymes EcoRI and Hind III to obtain a 275 bp fragment corresponding to the DNA sequence of the signal peptide of alkaline phosphatase (phoA), located in front of the DNA sequence encoding hirudin HV3.

(iii) Одновременно получают плазмиду pMT1, как описано в примере 2, Данная плазмида содержит последовательность ДНК, включающую ориджин репликации (ori) плазмиды pUC18 и trp-промотор, как описано в примере 2. Векторный фрагмент получают при расщеплении плазмиды pMT1 ферментами рестрикции EcoRI и Hind III. (iii) At the same time, plasmid pMT1 is prepared as described in Example 2. This plasmid contains a DNA sequence including the origin of replication (ori) of plasmid pUC18 and a trp promoter as described in Example 2. A vector fragment is obtained by cleaving plasmid pMT1 with EcoRI restriction enzymes and Hind iii.

(iv) Указанный выше фрагмент размером 275 п.о. и векторный фрагмент сшивают ДНК лигазой Т4, вводят в клетки Е.coli JM109, культивируют и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину. В результате получают плазмиду pMTSHV3, вектор экспрессии HV3 размером 2,87 п.о., который содержит последовательность ДНК ориджина репликации (ori) плазмиды pUC, последовательность ДНК trp-промотора, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид щелочной фосфатазы (phoА) и последовательность ДНК, кодирующую HV3. (iv) The above 275 bp fragment and the vector fragment is cross-linked with T4 ligase, introduced into E. coli JM109 cells, ampicillin resistant clones are cultured and selected. The result is the plasmid pMTSHV3, a 2.87 bp HV3 expression vector that contains the replication origin DNA sequence (ori) of the pUC plasmid, the trp promoter DNA sequence, the DNA sequence encoding the alkaline phosphatase signal peptide (phoA) and the DNA sequence encoding HV3.

(2) Получение гирудина HV3 с помощью секреции. (2) Obtaining hirudin HV3 by secretion.

Клетки E. coli RRI (E.coli RRI /pMTSHV3) (PERM BP-3267), трансформированные плазмидой pMTSHV3, которую получают указанным выше способом, культивируют в 2 л питательной среды 2 х УТ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы. Культивирование осуществляют в 2 л питательной среды в 5-литровом сосуде при 37^oC в течение 24 ч. Обнаруживаемая антитромбиновая активность составляет 6073 ATU на 1 мл питательной среды.Cells of E. coli RRI (E. coli RRI / pMTSHV3) (PERM BP-3267) transformed with the plasmid pMTSHV3, which is obtained as described above, are cultured in 2 l of culture medium 2 x UT containing 100 μg / ml ampicillin and 2% glucose . The cultivation is carried out in 2 l of culture medium in a 5-liter vessel at 37 ^o C for 24 hours. Detected antithrombin activity is 6073 ATU per 1 ml of culture medium.

(3) Выделение гирудина HV3 из культуральной среды. (3) Isolation of hirudin HV3 from the culture medium.

Гирудин HV3 получают из культуральной среды способом, описанным в примере 1 (5). После центрифугирования культуральной среды для отделения супернатанта от клеток, его четырехкратно разбавляют 10 мМ буферным раствором фосфата калия (pH= 7,0) и фильтруют. Полученный фильтрат наносят на колонку (4,4 х 13 см) с QAE-toypearl, как описано в примере 5, и осуществляют гель-фильтрацию при использовании колонки с Sephacryl C-100HR. Hirudin HV3 is obtained from the culture medium by the method described in example 1 (5). After centrifugation of the culture medium to separate the supernatant from the cells, it is four times diluted with 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH = 7.0) and filtered. The resulting filtrate was applied to a QAE-toypearl column (4.4 x 13 cm) as described in Example 5, and gel filtration was performed using a Sephacryl C-100HR column.

Активную фракцию наносят на колонку с DEAE toyopearl (4,4 х 40 см), уравновешенную буферным раствором, и затем элюируют с помощью линейного градиента от 0 до 0,3 М NaCl в уравновешивающем буферном растворе. И, наконец, гирудин HV3 очищают посредством обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения с использованием колонки С4 Vydac С4 (4,7 х 30 см) путем элюирования линейным градиентом (1%/мин, 30 мин или более) ацетонитрила от 15 до 30% (по объему). Профиль элюции показан на фиг. 11. Степень очистки, достигаемая на каждом этапе, приведена в табл. 4. The active fraction was applied to a DEAE toyopearl column (4.4 x 40 cm), equilibrated with a buffer solution, and then eluted with a linear gradient from 0 to 0.3 M NaCl in equilibration buffer solution. Finally, hirudin HV3 is purified by high-resolution reverse phase liquid chromatography using a Vydac C4 C4 column (4.7 x 30 cm) by eluting with a linear gradient (1% / min, 30 min or more) of acetonitrile from 15 to 30% (by volume). The elution profile is shown in FIG. 11. The degree of purification achieved at each stage is given in table. 4.

Аминокислотный анализ продукта показывает, что аминокислотный состав гирудина HV3 постоянен и сопоставим с теоретическим, как указано в табл. 5. Как приведено в табл. 6, вплоть до 15-й N-терминальной аминокислоты, аминокислотная последовательность полученного продукта идентична таковой гирудина HV3. Эти результаты показывают, что осуществлен правильный процессинг сигнального пептида и полученным продуктом является гирудин HV3. Amino acid analysis of the product shows that the amino acid composition of hirudin HV3 is constant and comparable with the theoretical, as indicated in the table. 5. As shown in table. 6, up to the 15th N-terminal amino acid, the amino acid sequence of the resulting product is identical to that of hirudin HV3. These results show that the signal peptide is correctly processed and the resulting product is hirudin HV3.

Таким образом, при использовании векторов секреции и трансформированных микроорганизмов согласно изобретению предложенный способ позволяет получать внеклеточно чужеродные белки с высоким выходом. Thus, when using secretion vectors and transformed microorganisms according to the invention, the proposed method allows to obtain extracellular foreign proteins in high yield.

Claims

1. A method of producing hirudin HV1, comprising transforming E. coli with a secretion vector containing a DNA fragment encoding a signal peptide, a DNA fragment encoding the amino acid sequence of hirudin HV1, a promoter, a replication region, culturing said E. coli bacteria and isolating the target product, characterized in that the promoter is a trp or tac promoter, the signal peptide is an alkaline phosphatase signal peptide, the replication region is the replication region of plasmid PUC 18, hirudin HV1 is isolated from the culture the second medium or periplasm of the cells.

2. The secretion vector pMTSHV1 to obtain hirudin HV1, containing 1440 p. PvuI — PvuII fragment containing the replication region of the pUC18 plasmid; trp promoter; A DNA fragment encoding an alkaline phosphatase signal peptide and a DNA fragment encoding hirudin HV1 that are linked together at the AccI site; ampicillin resistance gene as a genetic marker.

3. The secretion vector pMKSHV1 to obtain hirudin HV1, containing 1440 p. PvuI - PvuII fragment containing the pUC18 plasmid replication region; tac promoter; A DNA fragment encoding an alkaline phosphatase signal peptide and a DNA fragment encoding hirudin HV1 that are linked together at the AccI site; ampicillin resistance gene as a genetic marker.

4. Recombinant E. coli strain JM109 / pMTSHV1 (Ferm - BP - 3266) - producer of hirudin HV1.

5. The method according to p. 1, characterized in that the secretion vectors are pTMSHV1 and pMKSHV1.