RU2120799C1

RU2120799C1 - Method of immunostimulating agent preparing

Info

Publication number: RU2120799C1
Application number: RU96123779A
Authority: RU
Inventors: О.Г. Галанова; Т.Ф. Чиркина; С.Д. Жамсаранова
Original assignee: Восточно-Сибирский государственный технологический университет
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 1998-10-27

Abstract

FIELD: food industry. SUBSTANCE: cells are isolated from bone marrow of sheep and goats cattle, washed out and incubated in oncotic solution at concentration 0.85-0.90% and supernatant is centrifuged. The prepared immunostimulating agent is used as a food addition. EFFECT: broadened raw base, decreased cost, accelerated process. 1 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способам получения пищевых добавок. The invention relates to the field of food industry, in particular to methods for producing food additives.

Известен способ получения экстракта для медицинских целей, обладающего иммуностимулирующим действием, из сырья животного происхождения путем изоляции костного мозга, нагревания в свободной от пирогенов воде и выдерживания при 80^oC в течение 5 мин, центрифугирования и использования надосадочной жидкости для последующей ультрафильтрации, электродиализа (см. а.с. N 1442064, МКИ A 61 K 37/24, 1988, БИ N 44).A known method of obtaining an extract for medical purposes, having an immunostimulating effect, from raw materials of animal origin by isolating bone marrow, heating in pyrogen-free water and keeping at 80 ^o C for 5 min, centrifugation and the use of supernatant for subsequent ultrafiltration, electrodialysis (see A.S. N 1442064, MKI A 61 K 37/24, 1988, BI N 44).

Однако известный способ является сложным в исполнении и экономически невыгодным для получения иммуностимулятора в виде пищевой добавки. However, the known method is complicated in execution and economically disadvantageous for obtaining an immunostimulant in the form of a dietary supplement.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения иммуностимулятора путем выделения клеток из костного мозга животных с последующим инкубированием их в питательной среде, концентрированием и элюцией надосадочной жидкости (см. а. с. N 1005790, МКИ A 61 K 39/00, 1983, БИ N 11). The closest way to the claimed invention in terms of features is a method of obtaining an immunostimulant by isolating cells from the bone marrow of animals, followed by incubation of them in a nutrient medium, concentration and elution of the supernatant (see A. S. N 1005790, MKI A 61 K 39/00 1983, BI N 11).

Однако известный способ является трудоемким, т.к. требует строгих стерильных условий, дорогостоящим из-за применения питательной среды 199, в состав которой входят следующие компоненты (г/л):NaCl-8, KCl-0.4, MgCl₂•6H₂O-0.1, MgSO₄•7H₂O-0.1, Na₂HPO₄•7H₂O-0.06, KH₂PO₄•7H₂O-0.06, CaCl₂-0.14, NaHCO₃-0.6, фенолрот-0.02, глюкоза-0.6, применение которой не позволяет использовать ее на пищевые цели. Способ предусматривает применение только рядовой кости свиней.However, the known method is time consuming, because requires strict sterile conditions, expensive due to the use of a nutrient medium 199, which includes the following components (g / l): NaCl-8, KCl-0.4, MgCl ₂ • 6H ₂ O-0.1, MgSO ₄ • 7H ₂ O- 0.1, Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O-0.06, KH ₂ PO ₄ • 7H ₂ O-0.06, CaCl ₂ -0.14, NaHCO ₃ -0.6, phenolroth-0.02, glucose-0.6, the use of which does not allow its use in food goals. The method involves the use of only ordinary pig bones.

Таким образом, задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в получении иммуностимулятора в виде пищевой добавки. Технический результат, получаемый при осуществлении способа, - это упрощение технологического процесса и расширение сырьевой базы. Thus, the problem to be solved in the present invention is to obtain an immunostimulant in the form of a dietary supplement. The technical result obtained by the method is to simplify the process and expand the raw material base.

Для достижения обеспечиваемого предлагаемым изобретением технического результата в способе получения иммуностимулятора путем выделения клеток костного мозга животных с последующей инкубацией их в питательной среде, центрифугирования надосадочной жидкости, согласно изобретению клетки выделяют из костного мозга мелкого рогатого скота, а в качестве питательной среды применяют онкотический раствор с концентрацией 0,85 - 0,90%, при этом клетки берут в заданной концентрации. In order to achieve the technical result provided by the invention, in a method for producing an immunostimulant by isolating animal bone marrow cells and then incubating them in a nutrient medium, centrifuging the supernatant, according to the invention, the cells are isolated from the bone marrow of small cattle, and an oncotic solution with a concentration of 0.85 - 0.90%, while the cells are taken in a given concentration.

В результате проведенных экспериментов, авторы выявили возможность применения онкотического раствора с концентрацией 0,85 - 0,90% в качестве питательной среды для клеток костного мозга животных. При этом авторы обнаружили, что можно использовать не только клетки костного мозга свиней, но и мелкого рогатого скота. Концентрация клеток была подобрана таким образом, чтобы получить максимальный выход биологически активных компонентов и сохранить жизнеспособность клеток. As a result of the experiments, the authors revealed the possibility of using an oncotic solution with a concentration of 0.85-0.90% as a nutrient medium for animal bone marrow cells. At the same time, the authors found that it is possible to use not only pig bone marrow cells, but also small cattle. The cell concentration was selected in such a way as to obtain the maximum yield of biologically active components and maintain cell viability.

Анализ патентной и научно-технический литературы показал, что из уровня техники авторами не выявлены технические решения, включающие совокупность признаков, сходных или эквивалентных заявляемым. An analysis of the patent and scientific and technical literature showed that the authors did not identify technical solutions from the prior art that include a combination of features similar or equivalent to those claimed.

Это позволяет сделать вывод о соответствии предложения критериям "новизна" и "изобретательский уровень". This allows us to conclude that the proposal meets the criteria of "novelty" and "inventive step".

Предлагаемый способ получения иммуностимулятора осуществляется следующим образом. The proposed method of obtaining an immunostimulant is as follows.

При разделывании туш на мясокомбинате извлекаются ребра животных, это могут быть ребра свиней или мелкого рогатого скота. Вымывание клеток из реберной кости производят шприцом с онкотическим раствором с концентрацией 0,85 - 0,90%. Онкотический раствор является естественной средой для жизнедеятельности клеток костного мозга, т.к. поддерживает осмотическое давление в клетке, позволяет проводить как выделение, так и инкубацию, не нарушая целостность клетки. Затем производят трехкратное промывание клеток этим же раствором: взвесь клеток центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок разводят онкотическим раствором. В последнем устанавливают концентрацию путем подсчета клеток, приходящихся на 1 мл онкотического раствора, в камере Горяева. Чтобы достичь заданной концентрации клеток после подсчета производят или концентрацию, или разведение взвеси клеток онкотическим раствором. Какова концентрация клеток в заявляемом способе получения иммуностимулятора авторы конкретно не указывают, так как это является "ноу-хау" в предлагаемом изобретении. И авторам не хотелось бы, чтобы этот момент был раскрыт. В этой концентрации клетки помещают в культуральные флаконы по 100 - 150 мл взвеси на флакон, объем которого один литр. Инкубацию проводят при температуре 37^oC в течение 14 - 18 ч. По окончании инкубации взвесь клеток центрифугируют, в надосадочной жидкости определяют количество белка по методу Лоури, а после этого либо используют в эксперименте, либо хранят при температуре -12^oC.When carcasses are cut, the ribs of animals are removed at the meat processing plant, these can be ribs of pigs or small cattle. The cells are washed out from the costal bone by a syringe with an oncotic solution with a concentration of 0.85-0.90%. Oncotic solution is a natural environment for the life of bone marrow cells, because It supports the osmotic pressure in the cell, allows both isolation and incubation, without violating the integrity of the cell. Then the cells are washed three times with the same solution: the cell suspension is centrifuged, the supernatant is drained, and the sediment is diluted with an oncotic solution. In the latter, the concentration is established by counting the cells per 1 ml of the oncotic solution in the Goryaev chamber. To achieve a given concentration of cells after counting, either concentration or dilution of the suspension of cells with an oncotic solution is performed. What is the concentration of cells in the claimed method of obtaining an immunostimulant, the authors do not specifically indicate, since this is the "know-how" in the present invention. And the authors would not want this moment to be revealed. At this concentration, the cells are placed in culture bottles of 100 - 150 ml of suspension in a vial, the volume of which is one liter. Incubation is carried out at a temperature of 37 ^o C for 14 to 18 hours. At the end of the incubation, the cell suspension is centrifuged, the amount of protein is determined in the supernatant by the Lowry method, and then either used in the experiment or stored at -12 ^o C.

Оценку иммунологической активности полученного иммуностимулятора проводили в системе in vivo на лабораторных животных (мышах). Evaluation of the immunological activity of the obtained immunostimulant was carried out in an in vivo system in laboratory animals (mice).

Заявляемый способ подтверждается следующими примерами конкретного выполнения. The inventive method is confirmed by the following examples of specific performance.

Пример 1. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра свиней. Клетки вымывают из реберной кости свиней физиораствором, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах по 100 - 150 мл суспензии на флакон, объем которого 1 л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2 мг/мл.Example 1. When cutting carcasses in a meat factory, ribs of pigs are removed. Cells are washed from the costal bone of pigs with saline, washed and incubated at a predetermined concentration for 16 hours at a temperature of 37 ^o C in culture bottles of 100 - 150 ml of suspension per bottle, the volume of which is 1 l. The supernatant was separated from the cells by centrifugation at 2000 min. In the supernatant, the amount of protein is determined by Lowry. Its content is 2 mg / ml.

Оценку иммунологической активности проводят в системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана в дозе 100 мкг, содержащейся в 0.1 мл физиораствора, в подушечку задней конечности. В другой группе, служившей контролем, вводят физиораствор. На следующий день у этих мышей извлекают подколенные лимфатические узлы и определяют в них число антителообразующих клеток, сравнивая их количество в опыте и контроле. Evaluation of immunological activity is carried out in an in vivo system with local injection of the fraction into mice for 4 days of a secondary immune response to ram erythrocytes at a dose of 100 μg contained in 0.1 ml of physiological saline in the hind limb pad. In another group that served as a control, saline is administered. The next day, popliteal lymph nodes were removed from these mice and the number of antibody-forming cells was determined in them, comparing their number in the experiment and control.

Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях рассчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле. The antibody stimulation coefficient K is determined in both models by calculation as the ratio of the amount of AOK in the experiment to the corresponding amount of AOK in the control.

Пример 2. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра мелкого рогатого скота, физиораствором вымывают клетки костного мозга из кости, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах по 100 - 150 мл суспензии на флакон, объем которого 1 л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,1 мг/мл. Параллельно проводят выделение клеток средой 199, промыв и инкубацию ведут в той же среде. Условия получения аналогичны примеру 1. Содержание белка - 2,5 мг/мл.Example 2. When cutting carcasses at a meat processing plant, ribs of small cattle are removed, bone marrow cells are washed out of the bone with a saline solution, washed and incubated at a predetermined concentration for 16 hours at a temperature of 37 ^o C in culture bottles of 100-150 ml of suspension per bottle, volume which 1 liter The supernatant was separated from the cells by centrifugation at 2000 min. In the supernatant, the amount of protein is determined by Lowry. Its content is 2.1 mg / ml. At the same time, cells are isolated by medium 199; washing and incubation are carried out in the same medium. The preparation conditions are similar to Example 1. The protein content is 2.5 mg / ml.

Оценку иммунологической активности проводят в системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана. В случае получения композиции на среде 199 в группе, служившей контролем, вводят среду 199. Evaluation of immunological activity is carried out in an in vivo system with local administration of a fraction to mice for 4 days of a secondary immune response to sheep erythrocytes. In the case of obtaining the composition on medium 199 in the group that served as control, enter the medium 199.

Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях расчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле. The antibody stimulation coefficient K is determined in both models by calculation as the ratio of the amount of AOK in the experiment to the corresponding amount of AOK in the control.

Пример 3. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра свиней. Клетки вымывают из реберной кости свиней физиораствором, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,2 мг/мл.Example 3. When cutting carcasses in a meat factory, ribs of pigs are removed. Cells are washed from the costal bone of pigs with saline solution, washed and incubated at a predetermined concentration for 16 hours at a temperature of 37 ^o C in culture bottles. The supernatant was separated from the cells by centrifugation at 2000 min. In the supernatant, the amount of protein is determined by Lowry. Its content is 2.2 mg / ml.

Для доказательства того, что эту композицию можно использовать в продуктах, подвергаемых тепловой обработке, и сохранить при этом ее биологическую активность, надосадочную жидкость нагревают при 100^oC в течение 10 мин.To prove that this composition can be used in products subjected to heat treatment, while maintaining its biological activity, the supernatant is heated at 100 ^o C for 10 minutes

Оценку иммунологической активности композиции, подвергнутой нагреву, проводят в системе in vivo аналогично первым двум примерам. Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях рассчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле. Evaluation of the immunological activity of the composition subjected to heating is carried out in an in vivo system similarly to the first two examples. The antibody stimulation coefficient K is determined in both models by calculation as the ratio of the amount of AOK in the experiment to the corresponding amount of AOK in the control.

Пример 4. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра мелкого рогатого скота. Клетки вымывают, промывают и инкубируют средой 199. Инкубацию в заданной концентрации проводят в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,8 мг/мл.Example 4. When cutting carcasses in a meat factory, ribs of small cattle are removed. Cells are washed, washed and incubated with medium 199. Incubation at a predetermined concentration is carried out for 16 hours at a temperature of 37 ^o C in culture bottles. The supernatant was separated from the cells by centrifugation at 2000 min. In the supernatant, the amount of protein is determined by Lowry. Its content is 2.8 mg / ml.

При выборе способов консервирования пищевой композиции рассматривали возможность охлаждения при 0 - 4^oC, замораживания при -18^oC и хранения при -12^oC в течение 1 мес. Охлаждение оказалось не эффективным в результате быстрого обсеменения, а фракцию, подвергнутую замораживанию и хранению при низких температурах, оценивали по стимуляции антителообразующих клеток системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана.When choosing methods for preserving the food composition, the possibility of cooling at 0-4 ^° C, freezing at -18 ^° C and storage at -12 ^° C for 1 month was considered. Cooling was not effective as a result of rapid seeding, and the fraction subjected to freezing and storage at low temperatures was evaluated by stimulation of antibody-forming cells in vivo with local administration of the fraction to mice for 4 days of a secondary immune response to sheep erythrocytes.

По технической сущности заявляемое изобретение сравнивали с прототипом (см. а.с. N 1005790, кл. A 61 K 39/00, 1983, БИ N 11). The technical nature of the claimed invention was compared with the prototype (see.with. N 1005790, class A 61 K 39/00, 1983, BI N 11).

Данные примеров приведены в таблице. These examples are shown in the table.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать клетки костного мозга не только из костей свиней, но и костей мелкого рогатого скота, что позволяет значительно расширить сырьевую базу для получения пищевой добавки. Иммуностимулятор, полученный данным способом, сохраняет свои биологические свойства как при высоких, так и при низких температурах. По сравнению с уже известным способом получения стимулятора антителопродуцентов предлагаемый способ получения сокращается на 2 - 4 ч; упрощается за счет отказа от проведения гель-фильтрации, лиофилизации; замена питательной среды 199 на онкотический раствор значительно удешевляет способ; композиция, полученная этим способом, может храниться при низких температурах. Thus, the proposed method allows to obtain bone marrow cells not only from the bones of pigs, but also bones of small cattle, which can significantly expand the raw material base for obtaining a nutritional supplement. The immunostimulant obtained by this method retains its biological properties at both high and low temperatures. Compared with the already known method for producing a stimulator of antibody producers, the proposed method for producing is reduced by 2 to 4 hours; simplified due to the rejection of gel filtration, lyophilization; replacing the nutrient medium 199 with an oncotic solution significantly reduces the cost of the method; the composition obtained by this method can be stored at low temperatures.

Использование полученного иммуностимулятора в виде пищевой добавки позволит получать продукты для специализированного питания с иммуностимулирующими свойствами. The use of the obtained immunostimulant in the form of a dietary supplement will make it possible to obtain products for specialized nutrition with immunostimulating properties.

В Проблемной лаборатории "Иммунохимии пестицидов и пищевых добавок" разрабатываются рецептуры мясных продуктов с введением заявляемого иммуностимулятора. In the Problem laboratory "Immunochemistry of pesticides and food additives" are developing formulations of meat products with the introduction of the inventive immunostimulant.

Claims

A method of obtaining an immunostimulant by isolating cells from the bone marrow of animals, followed by incubating them in a nutrient medium, centrifuging the supernatant, characterized in that the cells are isolated from the bone marrow of small cattle, and an oncotic solution with a concentration of 0.85-0 is used as a nutrient medium , 90%, while the cells are taken in a given concentration.