Настоящее изобретение относится к области ветеринарии, в частности для оценки контроля иммуногенности вакцины против болезни Марека (БМ). The present invention relates to the field of veterinary medicine, in particular for evaluating the control of the immunogenicity of a vaccine against Marek's disease (BM).
Существуют методы определения сенсибилизированных лимфоцитов, такие, как иммунофлюоресценция, адсорбция лимфоцитов на антигенсодержащих колонках, непрямое розеткообразование, однако они разработаны для других инфекций, требуют специального оборудования и дефицитных реактивов. There are methods for determining sensitized lymphocytes, such as immunofluorescence, adsorption of lymphocytes on antigen-containing columns, indirect rosette formation, but they are designed for other infections, require special equipment and deficient reagents.
Известен способ получения спонтанных розеток к лимфоцитам кур. Но этот способ характеризует иммунный ответ совокупности лимфоцитов, способных образовывать спонтанное связывание с этитроцитами барана. Контролирует иммунное розеткообразование только тех лимфоцитов, активность которых обусловлена введением вакцины против БМ. Предлагаемый способ дает специфическую характеристику качества вакцины против БМ, характеризуя вызываемый ею клеточный ответ, и анализирует ее иммунногенность. A known method of producing spontaneous sockets for chicken lymphocytes. But this method characterizes the immune response of a combination of lymphocytes capable of forming spontaneous binding to ram etitrocytes. It controls the immune rosette formation of only those lymphocytes whose activity is due to the introduction of the vaccine against BM. The proposed method gives a specific characteristic of the quality of the vaccine against BM, characterizing the cellular response caused by it, and analyzes its immunogenicity.
Целью настоящего изобретения является способ получения иммунных розеток для учета сенсибилизированных лимфоцитов в результате введения вакцины против БМ. The aim of the present invention is a method for producing immune sockets for sensitized lymphocytes as a result of the introduction of a vaccine against BM.
Поставленная цель достигается тем, что эритроциты барана нагружаются антигеном, клеточно-свободной вакциной вируса герпеса индеек (ВГИ). Нативные эритроциты трижды промывают от среды Олсвера и готовят их 5% рабочее разведение в 0,15М растворе хлорида натрия (NaCl). Клеточно-свободную вакцину ВГИ, разведенную в 2 мл 0,15М раствора хлористого натрия, диализуют от фосфатных солей 18 ч при t = 4oC в физиологическом растворе. Соединяют 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов барана и 1 мл разбавленного в 10 раз отдиализованного вируса на 30 мин при t = 230oC. К смеси добавляют 0,1 мл 0,1% раствора треххлористого хрома на 5-6 мин, затем, чтобы остановить действие хрома, добавляют среду 199 и промывают трижды в 0,15М NaCl. Полученные таким образом эритроциты барана ставят в холодильник в среде 199 с добавлением сыворотки КРС и 2% глюкозы. Через сутки кровь от вакцинированных против БМ кур берут в орошенную гепарином пробирку до 2 мл, наслаивают на фиколверографин ρ 1,082 в соотношении 1:1 и центрифугируют при 350g в течение 40 мин. Лимфоциты отбирают из интерфазы и трижды отмывают средой 199, доводят их концентрацию до 2•106 кл/мл. Суспензию эритроцитов барана отмывают в среде 199 и доводят концентрацию до 1%. Соединяют 0,1 мл лимфоцитов с 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов барана и оставляют на 20 мин при t = 37oC, затем центрифугируют 3 мин при 350g, помещают на 2 ч в холодильник при t = 4oC, добавляют 50 мкл глютарового альдегида (0,6%) на 16 ч. После этого осторожно по стенке наливают 2 мл воды, тут же отсасывают пипеткой 2,1 мл жидкости. Осадок осторожно ресуспензируют и делают мазки на предметном стекле. После высыхания мазок фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза.This goal is achieved by the fact that the sheep erythrocytes are loaded with antigen, a cell-free vaccine of turkey herpes virus (VGI). Native red blood cells are washed three times from Olsver's medium and their 5% working dilution in 0.15 M sodium chloride (NaCl) solution is prepared. The cell-free VGI vaccine, diluted in 2 ml of a 0.15 M sodium chloride solution, is dialyzed from phosphate salts for 18 hours at t = 4 ° C in physiological saline. Combine 1 ml of a 5% suspension of sheep erythrocytes and 1 ml of diluted 10 times dialyzed virus for 30 min at t = 230 o C. To the mixture add 0.1 ml of a 0.1% solution of chromium trichloride for 5-6 minutes, then to stop the action of chromium, add 199 medium and washed three times in 0.15 M NaCl. The ram erythrocytes thus obtained are refrigerated in medium 199 with the addition of cattle serum and 2% glucose. After a day, blood from hens vaccinated against BM is taken in an up to 2 ml test tube irrigated with heparin, layered on ficolverografin ρ 1,082 in a 1: 1 ratio and centrifuged at 350g for 40 minutes. Lymphocytes were taken from the interphase and washed three times with 199 medium, their concentration was adjusted to 2 • 10 6 cells / ml. A sheep erythrocyte suspension is washed in 199 medium and the concentration is adjusted to 1%. Combine 0.1 ml of lymphocytes with 0.1 ml of sensitized sheep erythrocytes and leave for 20 min at t = 37 o C, then centrifuged for 3 min at 350g, placed in a refrigerator for 2 h at t = 4 o C, add 50 μl of glutar aldehyde (0.6%) for 16 hours. After that, carefully pour 2 ml of water on the wall, then 2.1 ml of liquid is sucked off with a pipette. The sediment is carefully resuspended and smears are made on a glass slide. After drying, the smear is fixed and stained according to Romanovsky-Giemsa.
Пример 1. Вводили суточным цыплятам вакцину ВГИ в разных дозах (200 и 2000) фокусообразующих единиц. На седьмой день измеряли уровень иммунного розеткообразования (И-РОК). Метод позволил регистрировать достоверные различия между группами, получившими вакцину с разными дозами разведения: 14,0±1,3% и 16,3±0,8% соответственно при фоновом (в невакционированной группе) И-РОК 8,2±2,1%. Example 1. Intravenous chickens were given the VGI vaccine in different doses (200 and 2000) of focus-forming units. On the seventh day, the level of immune rosette formation (I-ROCK) was measured. The method made it possible to register significant differences between the groups that received the vaccine with different dilution doses: 14.0 ± 1.3% and 16.3 ± 0.8%, respectively, with the background (in the uninvolved group) I-ROCK 8.2 ± 2.1 %
Пример 2. Измеряли уровень розеткообразующих клеток в сравнении двух методик: прототипа - спонтанного розеткообразования и предлагаемого метода - иммунного розеткообразования. На седьмой день в вакцинированной группе И-РОК в 16,3±0,8 оказалось ниже спонтанного уровня Е-РОК 23,0±1,4%. К десятому дню эти показатели сравнялись, а на 16-й день после введения вакцины процент И-РОК составил 22,1±1,0% против 18,0±0,8% спонтанных розеток. Example 2. The level of rosette-forming cells was measured in comparison of two methods: the prototype — spontaneous rosette formation and the proposed method — immune rosette formation. On the seventh day in the vaccinated I-ROCK group, 16.3 ± 0.8 was lower than the spontaneous level of E-ROCK 23.0 ± 1.4%. By the tenth day, these indicators were equal, and on the 16th day after the administration of the vaccine, the percentage of I-ROCK was 22.1 ± 1.0% versus 18.0 ± 0.8% of spontaneous outlets.
Приведенные примеры свидетельствуют о том, что каждый из методов характеризует специфический развивающийся процесс, в котором участвуют различные популяции лимфоцитов. The given examples indicate that each of the methods characterizes a specific developing process in which various populations of lymphocytes participate.