RU2119495C1

RU2119495C1 - Method of isolation of antibiotic gentamycin

Info

Publication number: RU2119495C1
Application number: RU94038087A
Authority: RU
Inventors: Сергей Викторович Яроцкий; Любовь Федоровна Яхонтова; Маргарита Степановна Булычева; Юрий Васильевич Жданович; Серафима Николаевна Кобзиева; Лидия Ивановна Насонова; Николай Васильевич Садовой; Виктор Александрович Михайлов; Татьяна Сергеевна Шерстобитова; Людмила Михайловна Кузьмина
Original assignee: Сергей Викторович Яроцкий; Любовь Федоровна Яхонтова; Маргарита Степановна Булычева; Юрий Васильевич Жданович; Серафима Николаевна Кобзиева; Лидия Ивановна Насонова; Николай Васильевич Садовой; Виктор Александрович Михайлов; Татьяна Сергеевна Шерстобитова; Людмила Михайловна Кузьмина
Priority date: 1994-10-10
Filing date: 1994-10-10
Publication date: 1998-09-27
Also published as: RU94038087A

Abstract

FIELD: antibiotics. SUBSTANCE: sorbent is contacted with enzymatic fluid for at least 4 h in sorption-washing apparatus. Then firstly 0.03-0.045 N ammonium solution is passed through cationite at the rate 6-10 ml/g-h and then 2 N ammonium solution for 4-5 h. EFFECT: improved method of isolation and purification of gentamycin. 3 ex, 1 dwg

Description

Изобретение относится к области медицинской промышленности, конкретно касается усовершенствования способа выделения антибиотика гентамицина. The invention relates to the field of medical industry, specifically relates to an improvement in the method of isolation of the antibiotic gentamicin.

Гентамицин представляет собой смесь (гентамицин C-комплекс), состоящую из трех основных компонентов C_1a; C₂; C₁, содержание которых в комплексе строго нормировано (согласно кодекса Федеральных правил США FDA-78 содержание C_1a - 15 - 40%; C₂ - 20 - 50%; C₁ - 25 - 50%).Gentamicin is a mixture (gentamicin C-complex) consisting of the three main components of C _1a ; C ₂ ; C ₁ , the content of which in the complex is strictly standardized (according to the US Code of Federal Regulations FDA-78, the content of C _1a is 15 - 40%; C ₂ - 20 - 50%; C ₁ - 25 - 50%).

В процессе биосинтеза гентамицина в ферментационной жидкости наряду с его основными компонентами продуцируются сходные с ним родственные примеси - минорные компоненты, которые сопутствуют целевому продукту при его извлечении из этой ферментационной жидкости. Содержание минорных компонентов в готовом препарате гентамицина в зависимости от способов очистки достигает 5 - 30%. In the process of biosynthesis of gentamicin in a fermentation liquid, along with its main components, related related impurities are produced - minor components that accompany the target product when it is removed from this fermentation liquid. The content of minor components in the finished preparation of gentamicin, depending on the purification methods, reaches 5 - 30%.

Удаление этих примесей из комплекса гентамицина необходимо вследствие возможных нежелательных свойств этих примесей и их низкой биологической активности. Кроме того, присутствие в препаратах гентамицина минорных компонентов не позволяет получить целевое вещество со стандартными качественными характеристиками. Отделению этих примесей от основного комплекса гентамицина, связанному с большими трудностями, посвящен ряд исследований. Removal of these impurities from the gentamicin complex is necessary due to the possible undesirable properties of these impurities and their low biological activity. In addition, the presence in the preparations of gentamicin of minor components does not allow to obtain the target substance with standard qualitative characteristics. A number of studies are devoted to the separation of these impurities from the main gentamicin complex, which is associated with great difficulties.

Известны способы очистки комплекса гентамицина путем сорбции из нативного раствора - отфильтрованной ферментационной жидкости, десорбции минеральной кислотой, осаждением гентамицина из элюата органическим растворителем. Полученный сырец гентамицина многократно переосаждают. Получают сульфат гентамицина 80 - 85% степени чистоты с выходом 25% от содержания антибиотика в нативном растворе (Пат. США, N 3091572). По известному решению (а.с. CCCР N 528775) технический элюат очищают от примесей обработкой водородной формой сильносшитого сульфокатионита, нейтрализацией анионитом, обработкой углем и высушиванием элюата. Гентамицин сульфат, полученный по этому способу, содержит 15 - 20% минорных примесей. Known methods for cleaning the gentamicin complex by sorption from a native solution - filtered fermentation liquid, desorption with mineral acid, precipitation of gentamicin from the eluate with an organic solvent. The obtained raw gentamicin is repeatedly reprecipitated. Get gentamicin sulfate 80 - 85% purity with a yield of 25% of the antibiotic content in the native solution (US Pat. USA, N 3091572). According to a well-known solution (A.C. CCCP N 528775), the technical eluate is purified from impurities by treatment with the hydrogen form of the highly cross-linked sulfocationite, neutralization with anion exchange resin, treatment with charcoal and drying of the eluate. Gentamicin sulfate obtained by this method contains 15 to 20% of minor impurities.

Существуют способы очистки путем кристаллизации из этанола (а.с. СССР N 694034). Этот метод связан с использованием органических растворителей и не гарантирует получение гентамицина необходимого компонентного состава. There are methods of purification by crystallization from ethanol (AS USSR N 694034). This method is associated with the use of organic solvents and does not guarantee the preparation of gentamicin with the required component composition.

Наиболее эффективными способами очистки являются хроматографические методы. По патенту ФРГ N 2130113 гентамицин очищают пропусканием водного раствора сырца гентамицина через колонку с силикагелем или сульфат гентамицина 90% степени чистоты с выходом около 20%. Описан способ хроматографической очистки с использованием силикагеля и смеси растворителей хлороформ-метанол-аммиак (Пат. США N 3.651.042). По этому способу получают из сырца комплекса гентамицина отдельные основные компоненты C_1a; C₂; C₁ 90 - 95% степени чистоты.The most effective purification methods are chromatographic methods. According to the Federal Republic of Germany patent No. 2130113, gentamicin is purified by passing an aqueous solution of raw gentamicin through a silica gel column or gentamicin sulfate of 90% purity with a yield of about 20%. A chromatographic purification method using silica gel and a solvent mixture of chloroform-methanol-ammonia is described (US Pat. No. 3,651,042). By this method, the individual main components C _1a are obtained from the raw gentamicin complex; C ₂ ; C ₁ 90 - 95% purity.

Недостатками способа является длительность процесса, большой расход органических растворителей. The disadvantages of the method is the duration of the process, high consumption of organic solvents.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому положительному эффекту является способ выделения гентамицина по патенту ВНР N 167121 и может служить прототипом предлагаемого изобретения. По этому способу гентамицин комплекс сорбируют из отфильтрованной ферментационной жидкости натриевой формой карбоксильного катионита, помещенного в традиционную ионообменную колонну в течение не менее 24 - 30 часов, десорбируют 4 н. раствором серной кислоты. Элюат нейтрализуют триэтиламином и обрабатывают углем. Фильтрат осаждают десятикратным объемом метанола. Сырец гентамицина сульфата очищают путем его растворения в дистиллированной воде, повторной сорбции на специальном мелкозернистом катионите в аммониевой форме (Амберлит CG-50 тип II), десорбции раствором аммиака постепенно повышающейся в пределах 0,05 - 1,0 н. концентрации. Гентамицин комплекс выделяют из объединенных элюатов путем высушивания элюата досуха. Обработки высушенного порошка основания гентамицина смесью бензола и этанола (1:1) и сушки в вакууме над пятиокисью фосфора при 60^oC. Полученный комплекс основания гентамицина растворяют в дистиллированной воде, раствор подкисляют до pH 4,5 серной кислотой (5 н.). Раствор обрабатывают углем. Фильтрат смешивают с десятикратным объемом метанола. Осадившуюся смесь выдерживают 24 часа при 0^oC, затем отфильтровывают и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора. Получают гентамицин сульфат в выходом 35 - 40% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.The closest in technical solution and the achieved positive effect is a method of isolating gentamicin according to patent NR N 167121 and can serve as a prototype of the invention. According to this method, the gentamicin complex is sorbed from the filtered fermentation liquid with the sodium form of the carboxyl cation exchange resin, placed in a traditional ion-exchange column for at least 24-30 hours, and 4N are desorbed. sulfuric acid solution. The eluate is neutralized with triethylamine and treated with charcoal. The filtrate is precipitated with a ten-fold volume of methanol. The raw gentamicin sulfate is purified by dissolving it in distilled water, repeated sorption on a special fine-grained cation exchange resin in ammonium form (Amberlite CG-50 type II), and desorption with a solution of ammonia gradually increasing in the range of 0.05 - 1.0 n. concentration. Gentamicin complex is isolated from the combined eluates by drying the eluate to dryness. Processing the dried gentamicin base powder with a mixture of benzene and ethanol (1: 1) and drying in vacuo over phosphorus pentoxide at 60 ^° C. The resulting gentamicin base complex is dissolved in distilled water, the solution is acidified to pH 4.5 with sulfuric acid (5 N). The solution is treated with charcoal. The filtrate is mixed with ten times the volume of methanol. The precipitated mixture was incubated for 24 hours at 0 ^° C., then filtered and dried in vacuo over phosphorus pentoxide. Gentamicin sulfate is obtained in a yield of 35-40% of the antibiotic content in the fermentation liquid.

Основными недостатком прототипа являются многостадийность и длительность процесса - 24 стадии, 250 - 300 часов (см. схему), низкий выход целевого продукта (35 - 40%). Длительность процесса десорбции 4 н серной кислотой после первой сорбции (12 - 15 часов) приводит к повышенному загрязнению элюата с целевым веществом окрашивающими примесями и продуктами частичного разложения гентамицина, что приводит к необходимости дополнительной очистки перед второй сорбцией. The main disadvantage of the prototype is the multi-stage and duration of the process - 24 stages, 250 - 300 hours (see diagram), low yield of the target product (35 - 40%). The duration of the desorption process with 4 N sulfuric acid after the first sorption (12-15 hours) leads to increased contamination of the eluate with the target substance by coloring impurities and products of partial decomposition of gentamicin, which leads to the need for additional purification before the second sorption.

Недостатком является также следующее. Для выделения целевого продукта используют большое количество органических растворителей, в том числе особо ядовитого - метанола. Для сорбции гентамицина используют только отфильтрованную ферментационную жидкость. Процесс ее фильтрации трудоемок, требует специального оборудования, наполнителей, является экологически вредным. Сорбцию проводят в традиционных ионообменных колоннах в динамических условиях в системе последовательных колонн. В процессе сорбции создается высокое гидродинамическое сопротивление слоя сорбента движению ферментационной жидкости за счет постепенного уплотнения сорбента. Процесс замедляется до 24 - 36 часов, образуются местные каналы с преимущественным протеканием раствора, т. е. создаются неблагоприятные условия для массообмена между сорбентов и раствором. При увеличении скорости потока ферментационной жидкости через слой сорбента происходит значительный унос сорбента, а, следовательно, потеря сорбированного целевого продукта. The disadvantage is also the following. To isolate the target product, a large number of organic solvents are used, including highly toxic solvents - methanol. For sorption of gentamicin use only filtered fermentation liquid. The process of filtering it is time-consuming, requires special equipment, fillers, is environmentally harmful. Sorption is carried out in traditional ion-exchange columns under dynamic conditions in a system of successive columns. During sorption, a high hydrodynamic resistance of the sorbent layer to the movement of the fermentation liquid is created due to the gradual compaction of the sorbent. The process slows down to 24 - 36 hours, local channels are formed with the predominant course of the solution, i.e. unfavorable conditions are created for mass transfer between the sorbents and the solution. With an increase in the flow rate of the fermentation liquid through the sorbent layer, a significant ablation of the sorbent occurs, and, consequently, the loss of the sorbed target product.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа выделения гентамицина и повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается путем контактирования сорбента с ферментационной жидкостью в течение не менее 4 часов в сорбционно-промывном аппарате, пропускания через катионит сначала 0,03 - 0,045 н. (предпочтительно 0,04 н.) раствора аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствора аммиака за 4-5 часов. The aim of the invention is to simplify the method of isolation of gentamicin and increase the yield of the target product. This goal is achieved by contacting the sorbent with the fermentation liquid for at least 4 hours in a sorption-washing apparatus, passing through cation exchange resin at first 0.03-0.045 n. (preferably 0.04 N.) ammonia solution at a rate of 6 to 10 ml / g-hour, and then 2 N. ammonia solution in 4-5 hours.

Заявляемый способ заключается в следующем: в ферментационную жидкость добавляют щавелевую кислоту до pH 1,8 - 2,2, ПАВ-цетазол - для снижения вязкости и устранения слипания частиц сорбента (в случае использования отфильтрованной ферментационной жидкости цетазол не добавляют), нейтрализуют раствором щелочи до pH 6,2 - 6,8. В колонну с расширителем в верхней зоне, снабженную в узкой цилиндрической части насадками КРИМЗ, а также пульскамерой и аэрлифтом (см. чертеж), помещают катионит КБ-2 (или другой карбоксильный катионит) в Na или NH₄-форме. Ферментационную жидкость контактируют с катионитом пропусканием жидкости снизу вверх в периодическом или непрерывном режиме не менее 4 часов. Катионитом сорбируется 95 - 98% гентамицина, содержащегося в фермертационной жидкости. По окончании сорбции катионит промывают умягченной водой, а затем в течение 16 - 18 часов через катионит пропускают сверху вниз 0,03 - 0,045 н. водный раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час. Длительность промывки - 16 - 18 часов.The inventive method consists in the following: oxalic acid is added to the fermentation liquid to a pH of 1.8 - 2.2, surfactant-cetazole - to reduce the viscosity and eliminate adhesion of sorbent particles (in the case of using filtered fermentation liquid, cetazole is not added), neutralized with an alkali solution until pH 6.2 - 6.8. In a column with an expander in the upper zone, equipped with KRIMZ nozzles in a narrow cylindrical part, as well as with a pulsation chamber and an air lift (see drawing), cation exchange resin KB-2 (or another carboxyl cation exchange resin) in Na or NH ₄ form is placed. The fermentation liquid is contacted with cation exchange resin by passing the liquid from the bottom up in a batch or continuous mode for at least 4 hours. Cation exchanger sorbed 95 - 98% of gentamicin contained in the farming fluid. At the end of the sorption, the cation exchange resin is washed with softened water, and then 0.03-0.045 N is passed through the cation exchange resin from top to bottom for 16-18 hours. aqueous ammonia at a rate of 6 - 10 ml / g-hour. Duration of washing - 16 - 18 hours.

В процессе промывки катионита слабым раствором аммиака из катионита вытесняют минорные компоненты и окрашивающие примеси. Окончание промывки устанавливают по содержанию минорных компонентов и окрашивающих примесей в отдельных фракциях, отбираемых в процессе промывки. Для определения компонентов в комплексе гентамицина (основных и минорных) во фракциях во время промывки 0,03 - 0,045 н. аммиаком, а также при десорбции антибиотика 2 н раствором аммиака используют метод ТСХ. In the process of washing the cation exchange resin with a weak solution of ammonia, minor components and coloring impurities are displaced from the cation exchange resin. The end of the washing is determined by the content of minor components and coloring impurities in separate fractions taken during the washing process. To determine the components in the gentamicin complex (major and minor) in fractions during washing, 0.03-0.045 n. ammonia, as well as the desorption of the antibiotic with 2 n ammonia solution, the TLC method is used.

Антибиотик десорбируют с катионита в течение 4-5 часов 2 н раствором аммиака. Полученный элюат упаривают, концентрат обрабатывают углем (для удаления остатков окрашивающих примесей), подкисляют серной кислотой до pH 4 - 4,5 и удаляют из него воду высушиванием досуха. Получают порошок гентамицина сульфата по качеству, удовлетворяющего требования НТД (ФС N 421267-82). The antibiotic is desorbed from the cation exchanger for 4-5 hours with a 2 N ammonia solution. The resulting eluate is evaporated, the concentrate is treated with charcoal (to remove residues of coloring impurities), acidified with sulfuric acid to pH 4 - 4.5 and the water is removed from it by drying to dryness. Get a powder of gentamicin sulfate in quality, satisfying the requirements of NTD (FS N 421267-82).

Содержание минорных компонентов в препарате не превышает 3 - 5%. Выход гентамицина составляет 52 - 60% от содержания его в ферментационной жидкости. The content of minor components in the preparation does not exceed 3 - 5%. The yield of gentamicin is 52-60% of its content in the fermentation liquid.

Существенное отличие описываемого способа заключается в том, что сорбцию антибиотика проводят как из нефильтрованной ферментационной жидкости, так и после ее фильтрации (предпочтительнее из нефильтрованной). Ферментационную жидкость контактируют с сорбентом в сорбционно-промывном аппарате в течение не менее 4 часов, после чего сорбент промывают сначала 0,03 - 0,045 н. раствором аммиака, который пропускают со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствором аммиака 4-5 часов. A significant difference of the described method lies in the fact that the sorption of the antibiotic is carried out both from unfiltered fermentation liquid, and after its filtration (preferably from unfiltered). The fermentation liquid is contacted with the sorbent in the sorption-washing apparatus for at least 4 hours, after which the sorbent is washed first with 0.03-0.045 N. ammonia solution, which is passed at a speed of 6 - 10 ml / g-hour, and then 2 N. ammonia solution for 4-5 hours.

Описываемый способ позволяет упростить процесс: вместо 24 стадий по прототипу в заявляемом способе весь процесс состоит из 9 стадий (см. Приложение), что позволяет сократить в 4-5 раз общее время процесса (за счет сокращения времени сорбции, устранения второй сорбции из элюата, сокращения времени промывки). По прототипу весь процесс выделения и получения порошка сульфата гентамицина протекает в течение 250 - 300 часов. По предлагаемому способу - 50 часов. Сокращение времени процесса выделения препарата в несколько раз увеличивает соответственно во столько же раз производительность процесса. Кроме того, использование сорбционно-промывного аппарат для сорбции гентамицина позволяет исключить стадию предварительного отделения биомассы и проводить сорбцию непосредственно из нефильтрованной ферментационной жидкости, что значительно сокращает потери продукта. The described method allows to simplify the process: instead of 24 stages of the prototype in the claimed method, the entire process consists of 9 stages (see Appendix), which allows to reduce the total process time by 4-5 times (by reducing the sorption time, eliminating the second sorption from the eluate, reduction of washing time). According to the prototype, the entire process of isolation and preparation of gentamicin sulfate powder proceeds within 250 - 300 hours. The proposed method is 50 hours. Reducing the time of the process of isolating the drug several times increases, respectively, the same time the productivity of the process. In addition, the use of a sorption-washing device for sorption of gentamicin allows you to exclude the stage of preliminary separation of biomass and carry out sorption directly from unfiltered fermentation liquid, which significantly reduces product loss.

Описываемый способ позволяет повысить выход целевого вещества на 17 - 20% по сравнению с прототипом (по прототипу 35 - 40% от ферментационной жидкости, а по предлагаемому способу - 52 - 60%). The described method allows to increase the yield of the target substance by 17 - 20% compared with the prototype (according to the prototype 35 - 40% of the fermentation liquid, and by the proposed method - 52 - 60%).

Способ иллюстрируется следующими примерами. The method is illustrated by the following examples.

Пример 1
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят 220 мл 20%-го раствора цетазола, смесь перемешивают 10 мин, затем в нее вносят 3,65 л насыщенного раствора щавелевой кислоты (pH 1,8 - 2,2). Массу перемешивают 20 - 30 мин, затем ее нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,2 - 6,8. Общий объем смеси - 44 л.Example 1
In 40 l of fermentation liquid of gentamicin with an activity of 800 μg / ml, 220 ml of a 20% solution of cetazole are added, the mixture is stirred for 10 minutes, then 3.65 l of a saturated solution of oxalic acid (pH 1.8 - 2.2) is added to it. The mass is stirred for 20-30 minutes, then it is neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to a pH of 6.2 - 6.8. The total volume of the mixture is 44 liters.

Сорбцию из нефильтрованной ферментационной жидкости проводят в сорбционно-промывном аппарате (см. чертеж), состоящим из узкой цилиндрической насадочной части аппарата и расширителя. Аппарат снабжен пульскамерой и аэрлифтом. Объем цилиндрической части колонны - 10 л; диаметр - 10 см. Объем расширителя - 35 л; диаметр - 30 см; общий объем аппарата - 50 л. В аппарат загружают 1 л карбоксильного катионита КБ-2 в NH₄-форме. При включенной пульскамере (интенсивность пульсации - 600 мм/мин) в аппарат подается весь объем ферментационной жидкости. После этого включают аэрлифт (замкнутый на колонну) и проводят сорбцию в режиме рециркуляции. Время сорбции - 4 часа. При этом катионитом сорбируется 98% гентамицина, содержащегося в фрментационной жидкости.Sorption from unfiltered fermentation liquid is carried out in a sorption-washing apparatus (see drawing), consisting of a narrow cylindrical nozzle of the apparatus and the expander. The device is equipped with a pulse camera and airlift. The volume of the cylindrical part of the column is 10 l; diameter - 10 cm. Expander volume - 35 l; diameter - 30 cm; the total volume of the apparatus is 50 liters. The apparatus is loaded with 1 l of carboxyl cation exchanger KB-2 in the NH ₄ form. When the pulse chamber is on (pulsation intensity - 600 mm / min), the entire volume of fermentation liquid is supplied to the apparatus. After that, turn on the airlift (closed to the column) and carry out sorption in the recirculation mode. Sorption time is 4 hours. In this case, 98% of gentamicin contained in the fluid is sorbed by cation exchanger.

После сорбции катионит отмывают от остатков мицелия умягченной водой, для чего при работающем пульсаторе (интенсивность пульсации не менее 400 мм/мин подают воду подачей снизу вверх. Затем через катионит пропускают сверху вниз 20,2 л 0,04 н. раствор аммиака со скоростью 8 мл/г-час. Длительность промывки - 16 часов. При промывке катионита слабым раствором аммиак отбирают фракции элюатов по 2 л каждую (из расчета двукратного объема сорбента), в которых определяют компонентный состав (методом ТСХ - в системе хлорформ-метанол - 25%-ный раствор аммиака в соотношении 2:1:1, проявление в парах иода). Контролем вымывания является отсутствие минорных примесей в последних фракциях промывок. После вымывания минорных и окрашивающих примесей из катионита через него пропускают в течение 4-5 часов 2,0 н. раствор аммиака. Собирают элюаты фракций, имеющие активность не менее 1000 мкг/мл и содержащие только основные компоненты гентамицина, которые объединяют. Элюат выпаривают в вакууме до концентрации антибиотика, равной 180000 мкг/мл (в 5-6 раз от первоначального объема элюата). Получают 117,7 мл концентрата, который подкисляют серной кислотой до pH 4,5, смешивают с 8 г осветляющего угля, суспензию отфильтровывают, угол промывают 50 мл дистиллированной воды. Промывку присоединяют к основному осветленному раствору. Практически бесцветный раствор гентамицина высушивают на роторном испарителе. Получают 31,8 г белого порошка сульфата гентамицина с активностью 600 мкг/мг и содержанием влаги 5%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество - 631 мкг/мг (98,5% степени чистоты). Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина:
C_1a - 26%; C₂ - 38,5%; C₁ - 34%; содержание минорных примесей - 1,5% (компонентный состав определен методами ТСХ и ВЭЖХ). Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82. Выход гентамицина сульфата составляет 59,6% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.After sorption, the cation exchanger is washed from the mycelium residues with softened water, for which, with a pulsator operating (pulsation intensity of at least 400 mm / min, water is supplied from the bottom up. Then, through the cation exchanger, 20.2 L of a 0.04 N ammonia solution is passed from top to bottom at a rate of 8 ml / g-hour. The washing time is 16 hours. When washing the cation exchange resin with a weak ammonia solution, eluate fractions of 2 l each are selected (from the calculation of the double volume of the sorbent), in which the component composition is determined (by TLC in the chloroform-methanol system - 25% ammonia solution in co ratio 2: 1: 1, manifestation in iodine vapor). The leaching control is the absence of minor impurities in the last fractions of the washes. After washing the minor and staining impurities from the cation exchange resin, 2.0 N ammonia solution is passed through it for 4-5 hours. eluates of fractions having an activity of at least 1000 μg / ml and containing only the main components of gentamicin, which are combined.The eluate is evaporated in vacuo to an antibiotic concentration of 180,000 μg / ml (5-6 times the initial volume of the eluate). 117.7 ml of concentrate are obtained, which is acidified with sulfuric acid to pH 4.5, mixed with 8 g of clarifying charcoal, the suspension is filtered off, the angle is washed with 50 ml of distilled water. Washing is added to the main clarified solution. An almost colorless gentamicin solution is dried on a rotary evaporator. Obtain 31.8 g of a white powder of gentamicin sulfate with an activity of 600 μg / mg and a moisture content of 5%. The activity of the powder in terms of dry matter is 631 μg / mg (98.5% purity). The content of the main components in the substance (powder) of the gentamicin complex:
C _1a - 26%; C ₂ - 38.5%; C ₁ - 34%; the content of minor impurities is 1.5% (the component composition was determined by TLC and HPLC). The remaining quality indicators of the substance of gentamicin sulfate satisfy the requirements of FS N 42-1267-82. The yield of gentamicin sulfate is 59.6% of the antibiotic content in the fermentation liquid.

Пример 2
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят при перемешивании 535 г щавелевой кислоты до pH 1,8, затем в ферментационную жидкость вносят 117,6 г триполифосфата натрия. После выдержки без перемешивания ферментационную жидкость фильтруют на фильтр-прессе, на который перед фильтрацией наносят в виде суспензии фильтрующий наполнитель - перлит. Длительность фильтрации - 10 часов. Затем отфильтрованный мицелий промывают на фильтр-прессе умягченной водой и промывную воду присоединяют к отфильтрованной ферментационной жидкости.Example 2
535 g of oxalic acid are added to 40 g of fermentation liquid of gentamicin with an activity of 800 μg / ml with stirring to a pH of 1.8, then 117.6 g of sodium tripolyphosphate are added to the fermentation liquid. After holding without stirring, the fermentation liquid is filtered on a filter press, on which a filtering agent, perlite, is applied as a suspension before filtration. Filtration duration - 10 hours. Then, the filtered mycelium is washed on the filter press with softened water, and the washing water is added to the filtered fermentation liquid.

Затем фильтрат нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,5 (6,2 - 6,8). Получают 36,7 л нативного раствора с активностью 610 мкг/мл. Потери на стадии фильтрации составляют 30%. Сорбцию гентамицина проводят в сорбционно-промывном аппарате, в который загружают 560 мл катионита КБ-2 в NH₄-форме. Сорбция, отмывка умягченной водой от остатков нативного раствора, промывка слабым раствором аммиака, десорбция, упарка, осветление и выделение порошка гентамицина проводятся в условиях, приведенных в примере 1. Получают 27,8 г сульфата гентамицина с активностью 595 мкг/мг и содержание влаги 6,3%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество 635 мкг/мг (99% степени чистоты).Then the filtrate is neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to a pH of 6.5 (6.2 - 6.8). 36.7 L of a native solution with an activity of 610 μg / ml is obtained. Losses at the filtration stage are 30%. Sorption of gentamicin is carried out in a sorption-washing apparatus, which is loaded with 560 ml of cation exchanger KB-2 in the NH ₄ form. Sorption, washing with softened water from the residues of the native solution, washing with a weak solution of ammonia, desorption, evaporation, clarification and isolation of gentamicin powder are carried out under the conditions described in example 1. Obtain 27.8 g of gentamicin sulfate with an activity of 595 μg / mg and a moisture content of 6 , 3%. The activity of the powder in terms of dry matter is 635 μg / mg (99% purity).

Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина: C_1a - 25,0%; C₂ - 39,5%; C₁ - 34,5%: содержание минорных примесей - 1%. Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82.The content of the main components in the substance (powder) of the gentamicin complex: C _1a - 25.0%; C ₂ - 39.5%; C ₁ - 34.5%: the content of minor impurities is 1%. The remaining quality indicators of the substance of gentamicin sulfate satisfy the requirements of FS N 42-1267-82.

Выход гентамицина сульфата составляет 51,7% от содержания гентамицина в ферментационной жидкости. The yield of gentamicin sulfate is 51.7% of the content of gentamicin in the fermentation liquid.

Пример 3
Отличающийся от примера 1 тем, что сорбцию ведут в динамическом режиме, подавая непрерывно снизу колонны предварительно подготовленную для извлечения ферментационную жидкость с выходом отработанной ферментационной жидкости через верхний выход в расширителе на слив.Example 3
Different from example 1 in that the sorption is carried out in a dynamic mode, feeding continuously from the bottom of the column pre-prepared for extraction fermentation liquid with the outlet of the spent fermentation liquid through the upper outlet in the expander to drain.

С этой целью 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл обрабатывают как описано в примере 1 и разводят обессоленной водой до общего объема 80 л. В сорбционно-промывной аппарат, описанный в примере 1, загружают 500 мл набухшего карбоксильного катионита КБ-2 в NH₄-форме. Включают пульсацию (интенсивность пульсации 600 мм/мин) и в течение 7 часов пропускают 80 л обработанной и разбавленной как указано выше вдвое ферментационной жидкости гентамицина. При этом катионитом сорбируется 98% антибиотика при насыщении 62,7 мг/мл.To this end, 40 l of fermentation liquid of gentamicin with an activity of 800 μg / ml is treated as described in example 1 and diluted with demineralized water to a total volume of 80 l. In the sorption-washing apparatus described in example 1, load 500 ml of swollen carboxylic cation exchanger KB-2 in the NH ₄ form. The pulsation is switched on (pulsation intensity 600 mm / min) and 80 l of processed and diluted gentamicin fermentation liquid, which is twice as described above, are passed within 7 hours. In this case, 98% of the antibiotic is adsorbed by cation exchanger at a saturation of 62.7 mg / ml.

Отмывка остатков мицелия умягченной водой, промывка катионита от сопутствующих примесей, десорбция и выделение субстанции гентамицина сульфата проводится как в примере 1. Washing of the mycelium residues with softened water, washing of the cation exchanger from related impurities, desorption and isolation of the substance of gentamicin sulfate is carried out as in example 1.

Получают 32,0 г порошка сульфата гентамицина с активностью 602 мкг/мг и удовлетворяющего требованиям ФС N 42-1267-82. Содержание минорных примесей - 1,6%. Obtain 32.0 g of gentamicin sulfate powder with an activity of 602 μg / mg and satisfying the requirements of FS N 42-1267-82. The content of minor impurities is 1.6%.

Содержание основных компонентов C_1a - 26,5%; C₂ - 38,0%; C₁ - 33,9%. Выход гентамицина сульфата составляет 60,2% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.The content of the main components of C _1a is 26.5%; C ₂ - 38.0%; C ₁ - 33.9%. The yield of gentamicin sulfate is 60.2% of the antibiotic content in the fermentation liquid.

Claims

A method for isolating a gentamicin antibiotic, including treating a fermentation liquid, sorption with a carboxyl cation exchange resin, washing out impurities from the cation exchange resin, desorption and isolating the target product, characterized in that the sorbent is contacted with the fermentation liquid for at least 4 hours in a sorption-washing device, and then First, 0.03-0.045 N ammonia solution is passed through the cation exchange resin at a rate of 6-10 ml / g-hour, then 2 N ammonia solution for 4-5 hours.