RU2117702C1

RU2117702C1 - Method of glycerol oxidase preparing

Info

Publication number: RU2117702C1
Application number: RU95115005A
Authority: RU
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Импакт"
Priority date: 1995-08-22
Filing date: 1995-08-22
Publication date: 1998-08-20

Abstract

FIELD: biotechnology, medicinal biochemistry, enzymology. SUBSTANCE: invention relates to preparing an enzyme glycerol oxidase (glycerol O₂-oxidoreductase) that catalyzes oxidation of glycerol with air oxygen to glyceraldehyde and hydrogen peroxide. Invention relates to a new producer of this enzyme - mycelial fungi Botrytis allii. Biomass is obtained after culturing sowing material on medium the main component of which is hay decoction in the presence of glycerol as a single carbon substrate. Glycerol oxidase in combination with lipase and peroxidase is used for assay of triglycerides that are used for diagnosis of cardiovascular diseases. EFFECT: improved method of enzyme preparing. 1 tbl

Description

Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно к области клинико-диагностических исследований для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, основанных на способности получаемого с помощью заявляемого способа фермента - глицеролоксидазы, окислять глицерин кислородом воздуха с образованием глицеральдегида и перекиси водорода. Это обеспечивает возможность определения триглицеридов, являющихся одним из основных компонентов липопротеидных комплексов крови, с помощью следующей последовательности реакций:

Известны способы получения глицеролоксидазы с использованием в качестве продуцентов фермента микроорганизмов, относящихся к родам мицелиальных грибов Penicillium, Aspergillus и Nerospora [1 - 5]. Все известные способы получения глицеролоксидазы с использованием указанных микроорганизмов продуцентов равноценны по отношению к предлагаемому способу и любой из них может быть принят за прототип. Однако наиболее подробное описание способа приведено в [5], что позволяет использовать данную работу в качестве прототипа.The invention relates to the field of medical biochemistry, and in particular to the field of clinical diagnostic studies for the diagnosis of cardiovascular diseases, based on the ability of the enzyme glycerol oxidase obtained by the inventive method to oxidize glycerin with atmospheric oxygen to form glyceraldehyde and hydrogen peroxide. This makes it possible to determine triglycerides, which are one of the main components of blood lipoprotein complexes, using the following reaction sequence:

Known methods for producing glycerol oxidase using enzyme producers of microorganisms belonging to the genera of mycelial fungi Penicillium, Aspergillus and Nerospora [1 - 5]. All known methods for producing glycerol oxidase using these producer microorganisms are equivalent in relation to the proposed method and any of them can be taken as a prototype. However, the most detailed description of the method is given in [5], which allows the use of this work as a prototype.

В работе дается описание способа получения глицеролоксидазы путем культивирования продуцентов фермента, относящихся к мицелиальным грибам, включая получение посевного материала и дальнейшего выращивания биомассы на питательной среде, содержащей глицерин в качестве единственного источника углерода, разрушения клеток биомассы, очистку фермента. The work describes a method for producing glycerol oxidase by cultivating enzyme producers related to mycelial fungi, including obtaining seed and further growing biomass on a nutrient medium containing glycerin as the sole carbon source, destroying biomass cells, and cleaning the enzyme.

В рассматриваемом прототипе были исследованы 2400 микроорганизмов, относящихся к разным таксономическим группам, включая 1800 мицелиальных грибов. Выделение новых штаммов микроорганизмов в данной работе проводили из накопительных культур, получаемых при культивировании образцов почв на среде, содержащей глицерин в качестве единственного источника углерода (см. состав среды N1). Затем накопительные культуры рассевали на агаризованной среде и отдельные колонии высевали в жидкую среду N1, культивировали 1-2 суток при 30^oC, клетки собирали центрифугированием или фильтрацией, промывали дистиллированной водой, ресуспендировали в карбонат-боратном буфере (pH 10,0) и разрушали с помощью дезинтегратора Балатини. Активность глицеролоксидазы определяли при 37^oC в системе, содержащей в расчете на 3 мл буфера пероксидазу - 100 ед, глицерин - 50 мкмоль, 1,2 мкмоль аминоантипирина и 21 мкмоль фенола. С использованием данной схемы из 2400 исследованных микроорганизмов, включая 1800 мицелиальных грибов, было выделено 11 штаммов, относящихся к родам Aspergillus, Neurospora и Penicillium. Максимальной активностью обладал штамм Aspergillus japonicum - 1,12 ед на 1 мл среды.In this prototype, 2400 microorganisms belonging to different taxonomic groups, including 1800 mycelial fungi, were investigated. The isolation of new strains of microorganisms in this work was carried out from accumulative cultures obtained by culturing soil samples on a medium containing glycerin as the sole carbon source (see medium composition N1). Then, accumulation cultures were dispersed on an agar medium and individual colonies were seeded in N1 liquid medium, cultured for 1-2 days at 30 ^° C, cells were collected by centrifugation or filtration, washed with distilled water, resuspended in carbonate-borate buffer (pH 10.0) and destroyed using the Balatini disintegrator. The activity of glycerol oxidase was determined at 37 ^o C in a system containing per unit of 3 ml of peroxidase buffer - 100 units, glycerol - 50 μmol, 1.2 μmol of aminoantipyrine and 21 μmol of phenol. Using this scheme, from 2400 investigated microorganisms, including 1800 mycelial fungi, 11 strains belonging to the genera Aspergillus, Neurospora and Penicillium were isolated. The strain Aspergillus japonicum possessed maximum activity - 1.12 units per 1 ml of medium.

С целью получения фермента указанную выше культуру выращивали на среде с глицерином в качестве единственного источника углерода и пересевали в ферментер с объемом среды 15 л. Очистку фермента проводили разрушением клеток в боратном буфере при pH 10, центрифугированием гомогената (10 000g • 20 мин), фракционированием сульфатом аммония (40 - 70% от насыщения) и последующей хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе, гидроксилапатите и сефадексе Г 200. Выход фермента по активности составил 35%, при конечной активности препаратов 142 ед на 1 мг белка. In order to obtain the enzyme, the aforementioned culture was grown on a medium with glycerin as the sole carbon source and was passaged into a fermenter with a medium volume of 15 L. The enzyme was purified by disrupting cells in a borate buffer at pH 10, centrifuging the homogenate (10,000g • 20 min), fractioning with ammonium sulfate (40–70% of saturation) and subsequent chromatography on DEAE-Sephadex, hydroxylapatite and Sephadex G 200. The enzyme yield was determined by activity was 35%, with the final activity of the drugs 142 units per 1 mg of protein.

Общим недостатком известных способов получения глицеролоксидазы, что хорошо видно из способа прототипа, где в качестве продуцентов исследовалось 2400 штаммов микроорганизмов из разных таксономических групп, является крайне низкая вероятность обнаружения штаммов, способных синтезировать данный фермент, а следовательно, и низкая вероятность обнаружения высокоактивных продуцентов. Поэтому весьма актуальна разработка способа получения глицеролоксидазы на основе использования более эффективных микроорганизмов продуцентов. A common drawback of the known methods for producing glycerol oxidase, which is clearly seen from the prototype method, where 2400 strains of microorganisms from different taxonomic groups were studied as producers, there is an extremely low probability of detecting strains capable of synthesizing this enzyme, and therefore a low probability of detecting highly active producers. Therefore, it is highly relevant to develop a method for producing glycerol oxidase based on the use of more efficient microorganisms of producers.

Авторами заявляемого изобретения, во-первых, было обнаружено, что мицелиальные грибы, относящиеся к роду Botrytis, виду allii отличаются высокой способностью к образованию глицеролоксидазы. Причем выделение продуцентов из вида B. allii с глицеролоксидазной активностью может быть проведено с помощью простой методики. The authors of the claimed invention, firstly, it was found that the mycelial fungi belonging to the genus Botrytis, species allii have a high ability to form glycerol oxidase. Moreover, the isolation of producers from the species B. allii with glycerol oxidase activity can be carried out using a simple technique.

Во-вторых, использование условий культивирования, в наибольшей степени учитывающих физиологические особенности B. allii, позволяет значительно увеличить уровень синтеза глицеролоксидазы. Secondly, the use of cultivation conditions that take into account the physiological characteristics of B. allii to the greatest extent can significantly increase the level of glycerol oxidase synthesis.

Нами предложен способ получения глицеролоксидазы, существенным отличием которого от известных ранее является использование в качестве продуцентов фермента мицелиальных грибов, относящихся к виду Botritis allii, выращивание биомассы которых проводится в две стадии с использованием двух типов сред. На первой стадии культуры выращивались на среде, содержащей в качестве основного компонента травяной отвар, после чего пересевались на среду с глицерином в качестве единственного источника углерода. We have proposed a method for producing glycerol oxidase, a significant difference from previously known is the use of mycelial fungi belonging to the species Botritis allii as producers of the enzyme, the biomass of which is grown in two stages using two types of media. At the first stage, the cultures were grown on a medium containing herbal decoction as the main component, after which they were transferred to the medium with glycerin as the sole carbon source.

Приводимый ниже пример 1 демонстрирует возможность выделения высокоактивных штаммов продуцентов с помощью простой методики практически со 100% частотой, пример 2 - увеличение уровня синтеза глицеролоксидазы за счет предлагаемого способа культивирования продуцентов и пример 3 - возможности выделения глицеролоксидазы из предлагаемых продуцентов. The following example 1 demonstrates the possibility of isolating highly active producer strains using a simple technique with almost 100% frequency, example 2 - increasing the level of glycerol oxidase synthesis due to the proposed method for culturing producers and example 3 - the possibility of isolating glycerol oxidase from the proposed producers.

Пример 1. Выделение продуцентов глицеролоксидазы, относящихся к виду B. allii. Для выделения использовали образцы загнивающего лука или лука, имеющего серо-черный налет, выращенного в Подмосковье и разных регионах стран СНГ. Соскобы с луковиц диспергировали в стерильной воде и высевали на сусло-агар для получения отдельных колоний. При необходимости после первого пассажа проводили повторный рассев для получения отдельных колоний. Полученные культуры поддерживали на сусло-агаре. Для выявления активности глицеролоксидазы культуры с твердой среды пересевали в качалочные колбы, содержащие 400 мл среды, являющейся стандартной для выращивания продуцентов глицеролоксидазы (среда N1), следующего состава, г/л водопроводной воды; глицерин - 3, NaNO₃ - 0,30; KH₂PO₄ - 0,10; KCl - 0,05; MgSO₄ - 0,05; FeSO₄ - 0,01; сусло - 0,2, начальное значение pH 6,0. Культуры выращивали на качалке при 28 - 30^oC в течение 3-4 суток. Мицелий отделяли фильтрованием, замораживали в жидком азоте и разрушали на прессе при избыточном давлении 3 000 атм, полученный гомогенат центрифугировали и определяли активность в надосадочной жидкости по методике, описанной в прототипе.Example 1. Isolation of glycerol oxidase producers belonging to the species B. allii. For isolation, samples of rotting onions or onions having a gray-black coating grown in the Moscow Region and various regions of the CIS countries were used. Bulb scrapings were dispersed in sterile water and plated on wort agar to obtain individual colonies. If necessary, after the first passage, repeated sieving was carried out to obtain individual colonies. The resulting culture was supported on wort agar. To detect glycerol oxidase activity, cultures from a solid medium were transferred to rocking flasks containing 400 ml of medium, which is standard for growing glycerol oxidase producers (medium N1), of the following composition, g / l of tap water; glycerin - 3, NaNO ₃ - 0.30; KH ₂ PO ₄ 0.10; KCl - 0.05; MgSO ₄ - 0.05; FeSO ₄ - 0.01; wort - 0.2, the initial pH value of 6.0. The cultures were grown on a rocking chair at 28 - 30 ^o C for 3-4 days. The mycelium was separated by filtration, frozen in liquid nitrogen and destroyed in the press at an overpressure of 3,000 atm, the resulting homogenate was centrifuged and the activity in the supernatant was determined by the method described in the prototype.

При использовании данной схемы из 19 выделенных микроорганизмов все обладали глицеролоксидазной активностью, величины которой составляли для разных культур от 0,200 до 1,3 на 1 мл среды. Таким образом, предлагаемая схема позволила проводить отбор продуцентов глицеролоксидазы практически со 100% вероятностью. When using this scheme, out of 19 isolated microorganisms, all had glycerol oxidase activity, the values of which for different cultures were from 0.200 to 1.3 per 1 ml of medium. Thus, the proposed scheme allowed the selection of glycerol oxidase producers with almost 100% probability.

Активности выделенных штаммов B.allis при известных ранее условиях выращивания продуцентов глицеролоксидазы приблизительно соответствовали активностям, наблюдаемым для наиболее эффективных продуцентов известных ранее. Однако использование условий культивирования в наибольшей степени учитывающих физиологические особенности грибов рода Botrytis, позволяет значительно увеличить уровень синтеза глицеролоксидазы. The activity of the isolated B.allis strains under previously known conditions for the growth of glycerol oxidase producers corresponded approximately to the activities observed for the most effective producers known previously. However, the use of cultivation conditions to the greatest extent possible taking into account the physiological characteristics of Botrytis fungi allows a significant increase in the level of glycerol oxidase synthesis.

Пример 2. Культуры высевали с твердой среды (сусло-агар) в качалочные колбы с общим объемом 750 мл, содержащие 400 мл среды на основе травяного отвара (среда N2). Последняя готовится автоклавированием сена (50 г/л водопроводной воды), фильтрованием и добавлением в отвар минеральных солей, входящих в состав среды N1. После 24 часов выращивания на среде N2 20 - 40 мл культуры пересевали в качалочные колбы с 400 мл среды N1. Через 24 - 48 часов собирали мицелий и анализировали активности, как это описано в примере 1. В таблице представлены данные, полученные при культивировании штаммов B. alli. Example 2. Cultures were plated from solid medium (wort agar) in rocking flasks with a total volume of 750 ml containing 400 ml of medium based on herbal broth (medium N2). The latter is prepared by autoclaving hay (50 g / l of tap water), filtering and adding to the broth the mineral salts that make up the N1 medium. After 24 hours of growth on N2 medium, 20-40 ml of the culture was transferred to rocking flasks with 400 ml of N1 medium. After 24 to 48 hours, mycelium was harvested and the activity was analyzed as described in Example 1. The table shows the data obtained from the cultivation of B. alli strains.

Использование предлагаемой схемы культивирования приводит к увеличению синтеза глицеролоксидазы в 5 - 12 раз по сравнению с результатами, полученными при использовании известной схемы. Using the proposed cultivation scheme leads to an increase in the synthesis of glycerol oxidase by 5-12 times compared with the results obtained using the known scheme.

Пример 3. Описание получения частично очищенных препаратов глицеролоксидазы. B. allii штамм N4 высевали с сусло-агара в колбы со средой N2 (5 колб, содержащих по 200 мл среды). После 18 часов выращивания на качалке посевной материал вносили в ферментер (среда N 1, 10 л) и культивировали 36 часов. Мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрацией, замораживали и разрушали на Х-прессе. Полученный гомогенат центрифугировали (18,000 g, 20 мин), надосадочную жидкость охлаждали до 0^oC, добавляли ацетон, предварительно охлажденный до - 20^oC из расчета 1 объем ацетона на 1 объем надосадочной жидкости. Образующийся осадок собирали центрифугированием, ресуспендировали, в 0,01 М трис-HCl буфере и снова центрифугировали. Супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозу, промывали колонку и элюировали фермент 0,2 М раствором хлористого натрия в том же буфере. Удельная активность препаратов составляла 115 ед/мг белка, выход по активности при проведении очистки - 65%.Example 3. Description of the preparation of partially purified glycerol oxidase preparations. B. allii strain N4 was plated from wort agar in flasks with N2 medium (5 flasks containing 200 ml of medium). After 18 hours of cultivation on a rocking chair, the seed was introduced into the fermenter (medium No. 1, 10 L) and cultivated for 36 hours. The mycelium was separated from the culture fluid by filtration, frozen and destroyed on an X-press. The resulting homogenate was centrifuged (18,000 g, 20 min), the supernatant was cooled to 0 ^o C, acetone was added, previously cooled to -20 ^o C at the rate of 1 volume of acetone per 1 volume of supernatant. The resulting precipitate was collected by centrifugation, resuspended in 0.01 M Tris-HCl buffer and centrifuged again. The supernatant was applied to a DEAE cellulose column, the column was washed and the enzyme was eluted with a 0.2 M sodium chloride solution in the same buffer. The specific activity of the preparations was 115 units / mg of protein; the activity yield during purification was 65%.

Литература
1. Патент США N 4202941.Literature
1. US patent N 4202941.

2. Патент США N 4255519. 2. U.S. Patent No. 4,255,519.

3. Патент Англии 2025979, C 12 N 9/04, 80. 3. England patent 2025979, C 12 N 9/04, 80.

4. Европейский патент N 0033540, C 12 N 9/04, 1981. 4. European patent N 0033540, C 12 N 9/04, 1981.

5. Uwajima T. , Akita H. , Ito K., Mihara A., Aisaka K., Terada O., "Formation and Purifacation of Gliceroloxidase", Agricultiral and Biologicol Chemistry", 1980, v. 44, N 2, pp. 399 - 406а 5. Uwajima T., Akita H., Ito K., Mihara A., Aisaka K., Terada O., "Formation and Purifacation of Gliceroloxidase", Agricultiral and Biologicol Chemistry ", 1980, v. 44, No. 2, pp. . 399 - 406a

Claims

A method of producing glycerol oxidase, which involves the preparation of seed material of a producer - mycelial fungus, culturing it on a nutrient medium containing glycerin as the sole carbon source, cell destruction and purification of the enzyme, characterized in that the strain of Botrytis fllii fungus is used as a producer.

2. The method according to claim 1, characterized in that the seed is prepared by cultivating the fungus on a medium containing hay broth.