RU2115926C1

RU2115926C1 - Method of aureole-forming blood cell detection

Info

Publication number: RU2115926C1
Application number: RU96112034A
Authority: RU
Inventors: А.И. Кичигин
Original assignee: Институт биологии Коми Научного центра Уральского отделения РАН
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 1998-07-20

Abstract

FIELD: biology, medicine, immunology. SUBSTANCE: blood is diluted with sodium chloride-base hyperosmotic medium where sucrose is added additionally. Cell suspension is applied on slide as a thin layer and incubated at 18-20 C for 30 min. Then preparation is dried, fixed and stained by conventional methods used in hematology followed by counting aureole and leukocytes not forming aureoles under microscope. Obtained preparation is stained constantly that ensures to carry out more profound analysis. Method can be used for immune state estimation. EFFECT: improved method of blood cell detection.

Description

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам выявления ореолообразующих клеток, и может быть использовано при оценке иммунного статуса. The invention relates to biology and medicine, and in particular to methods for detecting halo-forming cells, and can be used in assessing immune status.

Известен способ выявления ореолообразующих клеток [1, 2], согласно которому к гепаринизированной крови или суспензии исследуемых клеток добавляют фоновые клетки (эритроциты, дрожжи) или тушь, смесь разводят гиперосмотическим раствором хлорида натрия (10-200 мг/мл), затем помещают в камеру Горяева или в камеру из предметного и покровного стекол, изолированных по краю вазелином, и после непродолжительной инкубации (10 мин при 18-20^oC) под микроскопом подсчитывают кариоциты, вокруг которых образовались зоны, свободные от фоновых клеток или частиц туши.There is a method for detecting halo-forming cells [1, 2], according to which background cells (red blood cells, yeast) or mascara are added to heparinized blood or a suspension of test cells, the mixture is diluted with a hyperosmotic solution of sodium chloride (10-200 mg / ml), then placed in a chamber Goryaev camera or from slides and cover glasses, isolated on the edge vaseline, and after a brief incubation (10 min at 18-20 ^o C) were counted under the microscope kariotsity around which formed zones free from background cells or particles m shek.

Недостатком этого способа является то, что согласно ему готовится препарат, анализ которого необходимо проводить сразу после приготовления. В условиях дефицита времени это обстоятельство ограничивает количество анализируемых проб. The disadvantage of this method is that according to it a preparation is being prepared, the analysis of which must be carried out immediately after preparation. In conditions of time pressure this circumstance limits the number of analyzed samples.

Задачей изобретения является разработка способа выявления ореолообразующих клеток путем приготовления постоянного окрашенного препарата, что при недостатке времени позволяет увеличить количество анализируемых проб путем приостановки анализа на одном из этапов. В этом состоит технический результат, находящийся в причинно-следственной связи с существенными признаками изобретения. The objective of the invention is to develop a method for detecting halo-forming cells by preparing a constant stained preparation, which, if there is a lack of time, allows to increase the number of analyzed samples by suspending the analysis at one of the stages. This is the technical result, which is in a causal relationship with the essential features of the invention.

К существенным признакам изобретения относят следующие: стабилизированную кровь разводят гиперосмотической средой на основе хлорида натрия, в которую дополнительно введена сахароза, полученную суспензию наносят на предметное стекло, размазывают таким образом, чтобы клетки расположились в 1-2 слоя, затем помещают во влажную камеру и при температуре 18-20^oC проводят инкубацию продолжительностью не более 30 мин, после чего препарат высушивают, а затем фиксируют и окрашивают общепринятыми в гематологии методами и под микроскопом подсчитывают количество ореолов и количество лейкоцитов, не образовавших ореолы.The essential features of the invention include the following: stabilized blood is diluted with a sodium chloride-based hyperosmotic medium into which sucrose is added, the resulting suspension is applied to a glass slide, smeared so that the cells are placed in 1-2 layers, then placed in a moist chamber and a temperature of 18-20 ^o C is incubated for up to 30 minutes, after which the preparation is dried and then fixed and stained by conventional methods in hematology and count up under microscope number of halos and the number of leukocytes not form halos.

Суть способа состоит в следующем. В капле крови, разведенной хлоридом натрия в гиперосмотической концентрации, некоторые лейкоциты за счет избыточного электрического заряда отталкивают эритроциты от своей поверхности. Под микроскопом они имеют вид клетки в центре свободного от эритроцитов пространства округлой формы. В литературе за этими образованиями закрепилось название "ореолы". Типичная ореолообразующая клетка - это малодифференцированная клетка с высокой функциональной активностью и часто с повышенным пролиферативным потенциалом. В экспериментах на животных увеличение количества ореолов в крови наблюдали в условиях иммунного конфликта или иммуностимуляции, так как в периферической крови способностью к ореолообразованию обладают иммуноциты с высокой функциональной активностью [2, 3]. Поэтому подсчет количества ореолообразующих клеток в крови или в органах иммунной системы является простым, быстрым и дешевым методом анализа состояния иммунитета. The essence of the method is as follows. In a drop of blood diluted with sodium chloride in a hyperosmotic concentration, some leukocytes repel red blood cells from their surface due to excessive electric charge. Under a microscope, they look like cells in the center of erythrocyte-free space of a rounded shape. In the literature, the name "halos" was attached to these formations. A typical halo-forming cell is a low-differentiated cell with high functional activity and often with increased proliferative potential. In animal experiments, an increase in the number of halos in the blood was observed under conditions of immune conflict or immunostimulation, since in peripheral blood immunocytes with high functional activity have the ability to halo formation [2, 3]. Therefore, counting the number of halo-forming cells in the blood or in the organs of the immune system is a simple, fast and cheap method for analyzing the state of immunity.

Получить постоянный препарат из временного препарата, приготовленного по способу [1] , невозможно: при высушивании клеточной суспензии на предметном стекле препарат разрушается образующимися кристаллами хлорида натрия, а ореолы деформируются силами поверхностного натяжения по фронту высыхающей жидкости. Поэтому способ был модифицирован путем добавления в гиперосмотическую среду сахарозы, которая, блокируя кристаллообразующие центры, препятствует образованию крупных кристаллов хлорида натрия, а повышая вязкость среды, препятствует разрушению ореолов силами поверхностного натяжения. It is impossible to obtain a permanent preparation from a temporary preparation prepared according to the method [1]: when the cell suspension is dried on a glass slide, the preparation is destroyed by the formed sodium chloride crystals, and the halos are deformed by surface tension along the front of the drying liquid. Therefore, the method was modified by adding sucrose to the hyperosmotic medium, which, blocking the crystal-forming centers, prevents the formation of large crystals of sodium chloride, and increasing the viscosity of the medium prevents the destruction of halos by surface tension.

Для получения препарата кровь, стабилизированную гепарином или цитратом натрия, разводят 1:1 гиперосмотической средой, представляющей собой 12%-ный раствор сахарозы на 9%-ном растворе хлорида натрия. Каплю полученной суспензии переносят пипеткой на предметное стекло и размазывают до квадрата с размером сторон 1,5 см так, чтобы клетки разместились на стекле в один-два слоя без разрывов и пузырьков. Предметное стекло с клеточной суспензией помещают для инкубации во влажную камеру при температуре 18-20^oC. По окончании инкубации крышку влажной камеры открывают и дают препарату высохнуть. В течение всего периода инкубации препарат следует предохранять от случайных встряхиваний. Высохший препарат фиксируют и окрашивают общепринятыми в гематологии методами. Под микроскопом подсчитывают количество ореолов и количество лейкоцитов, не образовавших ореолы.To obtain the drug, blood stabilized with heparin or sodium citrate is diluted 1: 1 with a hyperosmotic medium, which is a 12% solution of sucrose in a 9% solution of sodium chloride. A drop of the resulting suspension is pipetted onto a glass slide and smeared to a square with a side size of 1.5 cm so that the cells are placed on the glass in one or two layers without gaps and bubbles. A glass slide with a cell suspension is placed for incubation in a wet chamber at a temperature of 18-20 ^o C. At the end of the incubation, the lid of the wet chamber is opened and the preparation is allowed to dry. During the entire incubation period, the drug should be protected from accidental shaking. The dried preparation is fixed and stained with methods generally accepted in hematology. Under the microscope, the number of halos and the number of leukocytes that did not form halos are counted.

В препарате ореол имеет вид округлой свободной от эритроцитов зоны с остатками ореолообразующей клетки. Величина ореола зависит от плотности клеточной суспензии и, по-видимому, от состояния самой ореолообразующей клетки. Сама ореолообразующая клетка разрушена. Ее остатки находятся в центре или реже с краю и имеют лучевидные тяжи, словно клетка "взорвалась". При высыхании препарата ореол может немного деформироваться, иногда внутрь "затягиваются" два-три эритроцита. Не образующие ореолов клетки имеют плотную окраску и сморщены. In the preparation, the halo has the appearance of a rounded red blood cell-free zone with the remains of the halo-forming cell. The magnitude of the halo depends on the density of the cell suspension and, apparently, on the state of the halo-forming cell itself. The halo-forming cell itself is destroyed. Its remains are located in the center or less often with the edge and have lucid cords, as if the cell "exploded". When the drug dries, the halo can be slightly deformed, sometimes two or three red blood cells are "drawn in" inside. Non-ghosting cells are dense and wrinkled.

Довольно часто на препарате встречаются набухшие и частично разрушившиеся клетки, вокруг которых не образовался ореол или он очень мал (диаметром не больше двух диаметров эритроцита). По-видимому, это клетки с набухшим гликокаликсом, но с низким электрическим зарядом, недостаточным для образования ореола. Их следует учитывать отдельно. Quite often, swollen and partially destroyed cells are found on the preparation, around which no halo has formed or is very small (with a diameter of no more than two erythrocyte diameters). Apparently, these are cells with swollen glycocalyx, but with a low electric charge, insufficient for the formation of a halo. They should be considered separately.

Иногда встречаются округлые свободные от эритроцитов зоны без центральной клетки, но заполненные зернистой слабоокрашенной базофильной субстанцией. На наш взгляд, эта субстанция тромбоцитарного происхождения и не имеет отношения к ореолообразующим клеткам. Необходимо отличать эти артефакты от настоящих ореолов. Sometimes there are rounded erythrocyte-free zones without a central cell, but filled with a granular, slightly colored basophilic substance. In our opinion, this substance is of platelet origin and is not related to halo-forming cells. It is necessary to distinguish these artifacts from real halo.

Пример. Для получения препарата 0,02 мл гепаринизированной крови разводят 1: 1 гиперосмотической средой, представляющей собой 12%-ный раствор сахарозы на 9%-ном растворе хлорида натрия. Каплю полученной суспензии переносят пипеткой на предметное стекло и размазывают до квадрата с размером сторон 1,5 см так, чтобы клетки разместились на стекле в один-два слоя без разрывов и пузырьков. Предметное стекло с клеточной суспензией помещают для инкубации во влажную камеру, которая представляет собой чашку Петри со смоченным ватным тампоном. Продолжительность инкубации 30 мин, температура 18-20^oC. По окончании инкубации крышку влажной камеры открывают и дают препарату высохнуть. Высохший препарат фиксируют 5 мин метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимза. Под микроскопом при 1000-кратном увеличении просматривают 300 лейкоцитов, отмечая ореолообразующие клетки и лейкоциты, не образовавшие ореолы. Результат выражают как долю ореолообразующих клеток (в %) от общего количества лейкоцитов и, если известна концентрация лейкоцитов в крови, как количество ореолообразующих клеток в 1 мкл крови.Example. To obtain the drug, 0.02 ml of heparinized blood is diluted 1: 1 with a hyperosmotic medium, which is a 12% solution of sucrose in a 9% solution of sodium chloride. A drop of the resulting suspension is pipetted onto a glass slide and smeared to a square with a side size of 1.5 cm so that the cells are placed on the glass in one or two layers without gaps and bubbles. A slide with a cell suspension is placed for incubation in a moist chamber, which is a Petri dish with a moistened cotton swab. The incubation time is 30 minutes, the temperature is 18-20 ^o C. At the end of the incubation, the lid of the moist chamber is opened and the preparation is allowed to dry. The dried preparation is fixed for 5 min with methanol and stained according to Romanovsky-Giemsa. Under a microscope at a 1000-fold magnification, 300 leukocytes are examined, noting halo-forming cells and leukocytes that have not formed halos. The result is expressed as the proportion of halo-forming cells (in%) of the total number of leukocytes and, if the concentration of leukocytes in the blood is known, as the number of halo-forming cells in 1 μl of blood.

Для приготовления клеточной суспензии на предметном стекле требуется не более 30 с (время с момента взятия крови до начала инкубации препарата). Снятие через 30 мин крышки влажной камеры не требует много времени. Фиксацию препаратов можно провести в конце рабочего дня, а окраску и анализ - в любое удобное время. Таким образом, предлагаемый способ позволяет рационально использовать рабочее время при проведении анализов. To prepare a cell suspension on a glass slide, no more than 30 s is required (the time from the moment of blood sampling to the start of drug incubation). Removing the cover of the wet chamber after 30 minutes does not require much time. Fixation of drugs can be carried out at the end of the working day, and coloring and analysis - at any convenient time. Thus, the proposed method allows the rational use of working time when conducting analyzes.

Claims

A method for detecting halo-forming blood cells, including diluting stabilized blood with a sodium chloride-based hyperosmotic medium, applying a thin layer of the cell suspension to a glass slide, incubating it and counting the halo-forming cells, characterized in that sucrose is additionally introduced into the hyperosmotic medium, and the preparation is dried at the end of the incubation fix and stain.