RU2114120C1 - Protein binding insulin-like growth factor, pharmaceutical composition - Google Patents

Protein binding insulin-like growth factor, pharmaceutical composition Download PDF

Info

Publication number
RU2114120C1
RU2114120C1 RU93058185A RU93058185A RU2114120C1 RU 2114120 C1 RU2114120 C1 RU 2114120C1 RU 93058185 A RU93058185 A RU 93058185A RU 93058185 A RU93058185 A RU 93058185A RU 2114120 C1 RU2114120 C1 RU 2114120C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
igf
bsifr
protein
bsif
bone
Prior art date
Application number
RU93058185A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU93058185A (en
Inventor
Мохан Суббураман
Дж.Бэйлинк Дэвид
Original Assignee
Берингер Маннхайм ГмбХ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Берингер Маннхайм ГмбХ filed Critical Берингер Маннхайм ГмбХ
Publication of RU93058185A publication Critical patent/RU93058185A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2114120C1 publication Critical patent/RU2114120C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry of proteins, pharmacy. SUBSTANCE: invention relates to protein that can be used for diagnosis of bone tissue metabolism disturbance as a component of pharmaceutical composition for treatment of patients with osteoporosis. Protein has molecular mass 29 kDa, it binds hydroxylapatite in the presence of 4 M guanidine hydrochloride and insulin-like growth factor-1 at the range of concentrations 10-8-10-10 M. N-Terminal amino acid sequence of this protein is the following: Leu-Gly-Phe-Phe-Val-X-Val-Glu-Pro-Asp-Asp-Lys-Ala-Ala-Leu where X is not determined. EFFECT: enhanced effectiveness of protein factor. 3 cl, 4 dwg , 4 tbl

Description

Изобретение относится к проблемам костного метаболизма, в частности к метаболическим процессам в кости, в которых задействован ранее неизвестный белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста (БСИФР). Более конкретно, изобретение относится к БСИФР, полученному из кости человека и обозначенному кч-БСИФР. Данный белок усиливает действие инсулин-подобного фактора роста-II (ИФР-II) на пролиферацию костных клеток. The invention relates to problems of bone metabolism, in particular to metabolic processes in the bone, in which a previously unknown protein that binds insulin-like growth factor (BSIF) is involved. More specifically, the invention relates to BSIFR derived from human bone and designated CC-BSIFR. This protein enhances the action of insulin-like growth factor-II (IGF-II) on bone cell proliferation.

ИФР-I и ИФР-II - два наиболее часто обнаруживаемые в плазме крови человека фактора роста, составляют семейство полипептидов, которые напоминают по структуре проинсулин и обладают как анаболическим, так и ярко выраженным инсулин-подобным действием на многочисленные ткани (Daughaday, и др., Endocrine Rev., 10:68-91 (1989)). Хотя предыдущие исследования на крысах и мышах придавали особое значение ИФР-I как первостепенному ИФР, поскольку ИФР-II является фетальным гормоном, недавние эксперименты указывают на важную роль ИФР-II в метаболизме костей взрослого человека. Обнаружено, что ИФР-II является наиболее распространенным фактором роста, присутствующим в кости человека, и наиболее распространенным фактором роста, который вырабатывается клетками кости человека. Более того, ИФР-II является одним из немногочисленных факторов роста, обладающих митогенной активностью по отношению к клеткам кости человека. Также установлено, что недавно выделенный ингибирующий БСИФР, названный БСИФР-4, подавляет пролиферацию базальных костных клеток приблизительно на 40% в отсутствие сыворотки крови. На основании указанного можно предположить, что эндогенная выработка ИФР вносит существенный вклад в клеточную пролиферацию при отсутствии дополнительных факторов роста. И, наконец показано, что антитела, блокирующие рецепторы ИФР-II, ингибируют пролиферацию базальных костных клеток, что позволяет рассматривать ИФР-II как ключевой фактор роста костных клеток (Mohan, и др. Growth, Genetics and Hormones, 6:1-9 (1990) и Mohan и др., Clin. Orthopedics & Rel. Res., 263:30-48 (1990)). IGF-I and IGF-II, the two most frequently detected growth factors in human blood plasma, comprise a family of polypeptides that resemble proinsulin in structure and have both anabolic and pronounced insulin-like effects on numerous tissues (Daughaday, etc. Endocrine Rev. 10: 68-91 (1989)). Although previous studies in rats and mice have emphasized IGF-I as the primary IGF, since IGF-II is a fetal hormone, recent experiments indicate the important role of IGF-II in adult bone metabolism. It has been found that IGF-II is the most common growth factor present in human bones and the most common growth factor that is produced by human bone cells. Moreover, IGF-II is one of the few growth factors with mitogenic activity in relation to human bone cells. It has also been found that a newly isolated inhibitory BSIFR, called BSIFR-4, inhibits the proliferation of basal bone cells by approximately 40% in the absence of blood serum. Based on the above, it can be assumed that endogenous production of IGF makes a significant contribution to cell proliferation in the absence of additional growth factors. Finally, antibodies that block IGF-II receptors have been shown to inhibit proliferation of basal bone cells, which allows IGF-II to be considered a key factor in bone cell growth (Mohan et al. Growth, Genetics and Hormones, 6: 1-9 ( 1990) and Mohan et al., Clin. Orthopedics & Rel. Res., 263: 30-48 (1990)).

Недавно стало ясно, что семейство структурно родственных белков, которые специфически связывают ИФР, участвуют в модуляции действия ИФР на различные ткани. Выделено 4 класса БСИФР человека (обозначены как БСИФР-1, БСИФР-2, БСИФР-3 и БСИФР-4) и предсказана полная последовательность аминокислот данных белков на основе последовательности нуклеотидов в изолированных клонах к-ДНК. (Mohan et al., Clin. Orthopedics & Rel. Res. 263.30-48 (1990); Baxter et al., Prog. Growth Factor Res. 1: 49-68 (1989); Binkert et al., EMBO J. 8: 2497-2502 (1988); Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152:1289-1297 (1988); Brinkman et al., EMBO J. 7:2417-2423 (1988): Lee et al., Mol. Endocrinol. 2:404-411 (1988); Wood et al., Mol. Endocrinol. 2:1176-1185 (1988); LaTour et al., Mol. Endocrinol. 4:1806-1814 (1990); and Shimosaki, et al., Mol. Endocrinol. 4:1451-1458 (1990). It has recently become clear that a family of structurally related proteins that specifically bind IGF are involved in modulating the action of IGF on various tissues. Four classes of human BSIFR were identified (designated as BSIFR-1, BSIFR-2, BSIFR-3, and BSIFR-4) and the complete amino acid sequence of these proteins was predicted based on the sequence of nucleotides in isolated c-DNA clones. (Mohan et al., Clin. Orthopedics & Rel. Res. 263.30-48 (1990); Baxter et al., Prog. Growth Factor Res. 1: 49-68 (1989); Binkert et al., EMBO J. 8 : 2497-2502 (1988); Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152: 1289-1297 (1988); Brinkman et al., EMBO J. 7: 2417-2423 (1988): Lee et al ., Mol. Endocrinol. 2: 404-411 (1988); Wood et al., Mol. Endocrinol. 2: 1176-1185 (1988); LaTour et al., Mol. Endocrinol. 4: 1806-1814 (1990) ; and Shimosaki, et al., Mol. Endocrinol. 4: 1451-1458 (1990).

БСИФР-1 выделен из различных источников, включающих амниотическую жидкость, оболочки плаценты, децидуальную оболочку матки и HEPG2 клетки гепатомы. Была установлена идентичность N-терминальных аминокислотных последовательностей белков БСИФР-1, выделенных из этих различных источников. Сообщается о клонировании и полной последовательности нуклеотидов к-ДНК, кодирующих БСИФР-1, выделенных из клеток HEPG2 и матки человека и содержащихся в библиотеках к-ДНК плаценты человека. БСИФР-2 выделен из кондиционированной среды клеток печени крысы (BRL-3A) и клеток почек крупного рогатого скота Madin-Dacby. Ген, кодирующий БСИФР-1 клонирован из библиотек кДНК BRL3A и клеток печени плода человека. БСИФР-1 обнаружен в сыворотке крови в виде комплекса размером 150 килодальтон (кДа), состоящего из трех компонентов: ИФР-1 или ИФР-2, кислотолабильного гликопротеина размером около 85 кДа и молекулы БСИФР-3, представляющей собой кислотостабильный гликопротеин размером 53 кДа. BSIFR-1 was isolated from various sources, including amniotic fluid, placental membrane, decidual uterine membrane, and hepatoma HEPG2 cells. The identity of the N-terminal amino acid sequences of BSIFR-1 proteins isolated from these various sources was established. Cloning and the complete sequence of c-DNA nucleotides encoding BSIFR-1 isolated from human HEPG2 and uterine cells and contained in human placenta c-DNA libraries have been reported. BSIFR-2 was isolated from conditioned liver cells of rat liver (BRL-3A) and Madin-Dacby cattle kidney cells. The gene encoding BSIF-1 was cloned from BRL3A cDNA libraries and human fetal liver cells. BSIFR-1 was detected in blood serum as a complex of 150 kilodaltons (kDa) in size, consisting of three components: IGF-1 or IGF-2, an acid labile glycoprotein of about 85 kDa in size, and BSIF-3 molecule, which is an acid-stable glycoprotein of 53 kDa.

БСИФР-3 выделен в очищенной форме из сыворотки человека; сообщается о клонировании и определении последовательности нуклеотидов к-ДНК данного белка. БСИФР-4 выделен из кондиционированной среды костных клеток человека как ингибиторный БСИФР, а также из сыворотки крови крысы. Недавно сообщалось о клонировании и определении последовательности нуклеотидов клона к-ДНК БСИФР-4, полученного из библиотек к-ДНК костных клеток человека и к-ДНК печени. В дополнение к указанным четырем классам БСИФР, Martin и др., J. Biol. Chem. 265: 4124-4130 (1990), Roghani и др., FEBS Lett. 255:253-258 (1989), и Zapf и др. , J. Biol. Chem., 265:14892-14898 (1990) сообщают о частичной очистке БСИФР, выделенных из спиномозговой жидкости человека из питательной среды, кондиционированной трансформированными фибробластами AG 2804 а также из гипогликемической сыворотки соответственно, которые проявляют более сильное сродство к ИФР-2 по сравнению с ИФР-1. BSIFR-3 is isolated in purified form from human serum; Cloning and sequence determination of the cDNA nucleotides of a given protein are reported. BSIF-4 was isolated from the conditioned medium of human bone cells as inhibitory BSIF, as well as from rat serum. Recently, cloning and nucleotide sequence determination of the BSIFR-4 c-DNA clone obtained from human bone cell c-DNA libraries and liver c-DNA libraries has been reported. In addition to these four classes of BSIF, Martin et al., J. Biol. Chem. 265: 4124-4130 (1990), Roghani et al., FEBS Lett. 255: 253-258 (1989), and Zapf et al., J. Biol. Chem., 265: 14892-14898 (1990) report partial purification of BSIF isolated from human cerebrospinal fluid conditioned with transformed fibroblasts AG 2804 and also from hypoglycemic serum, respectively, which show a stronger affinity for IGF-2 compared to IGF-1.

Таким образом, описаны многочисленные БСИФР, которые получены из различных источников, обнаруживают несопоставимую связывающую активность по отношению к ИФР и проявляют различные биологические свойства. Например, БСИФР-1, БСИФР-3 и БСИФР-4 связывают как ИФР-I, так и ИФР-II почти в одинаковой степени, в то время как БСИФР-2 и БСИФР, выделенные из амниотической жидкости, фибробластов и сыворотки крови человека, связывают ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. Указанный аналог можно считать ближайшим аналогом изобретения. Показано, что БСИФР-3 может ингибировать или стимулировать воздействие ИФР-I на фибробласты, в зависимости от условий культивирования (De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156:199-204 (1988)). В противоположность БСИФР-1 и БСИФР-3, БСИФР-4, как было установлено, только ингибирует активность ИФР-I и ИФР-II при их воздействии на костные клетки (Mohan и др. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:8338-8342 (1989)). Исследования также показывают, что выработка различных БСИФР модулируется определенным образом, специфичным для ткани. Например, образование БСИФР-1 модулируется инсулином, в то время как выработка БСИФР-3 модулируется гормоном роста (Baxter и др., Prog. Growth Factor Res., 1:49-68) (1989)). Таким образом, многообразие различных БСИФР в сочетании с их индивидуальной регуляцией может служить причиной того, что активность ИФР модулируется местным, специфичным для ткани образом. Thus, numerous BSIFRs have been described which are obtained from various sources, exhibit incomparable binding activity towards IGF, and exhibit various biological properties. For example, BSIF-1, BSIF-3 and BSIF-4 bind both IGF-I and IGF-II to almost the same degree, while BSIF-2 and BSIF-1 isolated from amniotic fluid, fibroblasts and human serum IGF-II is associated with greater affinity than IGF-I. The specified analogue can be considered the closest analogue of the invention. It was shown that BSIFR-3 can inhibit or stimulate the effects of IGF-I on fibroblasts, depending on the cultivation conditions (De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156: 199-204 (1988)). In contrast to BSIF-1 and BSIFR-3, BSIF-4 has been found to only inhibit the activity of IGF-I and IGF-II when exposed to bone cells (Mohan et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 8338 8342 (1989)). Studies also show that the production of various BSIFRs is modulated in a specific tissue-specific fashion. For example, the production of BSIF-1 is modulated by insulin, while the production of BSIF-3 is modulated by growth hormone (Baxter et al., Prog. Growth Factor Res., 1: 49-68) (1989). Thus, the diversity of different BSIFs in combination with their individual regulation may cause the activity of IGF to be modulated in a local, tissue-specific manner.

Существует необходимость исследования взаимосвязи функции ИФР-I и ИФР-II в процессах костного метаболизма, осуществляемых посредством БСИФР и, следовательно, необходимость идентификации БСИФР, вырабатываемых костными клетками и содержащихся в матриксе костей человека. Такие БСИФР, вероятно, участвуют в метаболизме кости и могут быть использованы в клинических исследованиях при диагностике нарушений метаболизма костной ткани. БСИФР, усиливающие ИФР-зависимый рост костей, могут быть, в частности полезными для терапевтического применения при лечении нарушений костного метаболизма, таких как остеопороз. There is a need to study the relationship between the functions of IGF-I and IGF-II in bone metabolism processes carried out by BSIFR and, therefore, the need to identify BSIF produced by bone cells and contained in the human bone matrix. Such BSIFs are probably involved in bone metabolism and can be used in clinical studies to diagnose bone metabolism disorders. BSIFR, enhancing IGF-dependent bone growth, may be particularly useful for therapeutic use in the treatment of bone metabolism disorders such as osteoporosis.

Изобретение относится к белку, связывающему инсулин-подобный фактор роста, который выделен из кости человека (кч-БСИФР). The invention relates to a protein that binds an insulin-like growth factor that is isolated from human bone (cf-BSIF).

Данный белок имеет мол. массу, равную 20 кДа, он связывает гидроксиапатит в присутствии 4Н гуанидин HCl. кч-БСИФР связывает инсулин-подобный фактор роста I в пределах 10-8 - 10-10 М, а инсулин-подобный фактор роста II в пределах 10-9 - 10-11 М. N-концевая аминокислотная последовательность данного белка имеет следующую структуру: лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей, где X не определен.This protein has a mole. a mass of 20 kDa, it binds hydroxyapatite in the presence of 4H guanidine HCl. cc-BSIFR binds an insulin-like growth factor I in the range of 10 -8 - 10 -10 M, and an insulin-like growth factor II in the range of 10 -9 - 10 -11 M. The N-terminal amino acid sequence of this protein has the following structure: lei-gly-fen-fen-val-X-val-glu-pro-asp-asp-lys-ala-ala-lei, where X is not defined.

Кч-БСИФР действует как синергист с ИФР-II, усиливая ИФР-II-опосредованную пролиферацию клеток при условиях одновременного действия ИФР-II и БСИФР. Способность кч-БСИФР связывать гидроксиапатит позволяет использовать его в качестве эффективного лекарственного средства при заболеваниях костной ткани, например, остеопорозе или остеосаркоме. Кроме того, данный белок можно успешно использовать при переломах костей, для заживления ран, восстановления целостности кожи, в качестве диагностического реагента и т.д. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей кч-БСИФР и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может дополнительно содержать ИФР-I или ИФР-II. Cc-BSIFR acts as a synergist with IGF-II, enhancing IGF-II-mediated cell proliferation under conditions of simultaneous action of IGF-II and BSIF. The ability of cc-BSIFR to bind hydroxyapatite allows it to be used as an effective drug for bone diseases, for example, osteoporosis or osteosarcoma. In addition, this protein can be successfully used for bone fractures, to heal wounds, restore skin integrity, as a diagnostic reagent, etc. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising cc-BSIFR and a pharmaceutically acceptable carrier. The composition may further comprise IGF-I or IGF-II.

На фиг. 1 дано сравнение N-терминальной аминокислотной последовательности заявленного кч-БСИФР с таковыми других известных БСИФР. Последовательности расположены таким образом, чтобы выявить максимальное сходство, где
кч-БСИФР лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей
ч-БСИФР-1 ала-про-W-Q-цис-ала-про-цис-сер-ала-глу-лиз-лей-ала
ч-БСИФР-2 глу-вал-лей-фен-R-цис-про-про-цис-T-про-глу-R-лей-ала
ч-БСИФР-3 гли-ала-сер-сер-гли-гли-лей-гли-про-вал-вал-R-цис-глу-про-цис-асп-асп-R- ала-лей-ала
ч-БСИФР-4 асп-глу-ала-илей-гис-цис-про-про-цис-сер-глу-глу-лиз-лей-ала
спиномозговая жидкость лей-ала-про-гли-X-гли-Q-гли-вал-Q-вал-гли-ала-про-гли
фибробласты CM R-ала-про-гли-цис-гли-Q-гли-вал-Q-ала-гли
сыворотка человека ала-ала-про-гли-X-гли-Q-гли-вал-Q-ала-гли-цис-про-гли
На фиг. 2 показаны сравнительные кривые связывания кч-БСИФР. Образец исследовался на предмет выявления белок-связывающей активности с использованием меченого ИФР-II в присутствии или отсутствии немеченого ИФР-I и ИФР-II.In FIG. 1 shows a comparison of the N-terminal amino acid sequence of the claimed cc-BSIFR with those of other known BSIFRs. The sequences are arranged so as to reveal the maximum similarity, where
cc-BSIFR lei-gli-fen-fen-val-X-val-glu-pro-asp-asp-liz-ala-ala-lei
h-BSIFR-1 ala-pro-WQ-cis-ala-pro-cis-ser-ala-glu-lys-lei-ala
h-BSIFR-2 glu-val-lei-phen-R-cis-pro-pro-cis-T-pro-glu-R-lei-ala
h-BSIFR-3 gli-ala-ser-ser-gli-gli-lei-gli-pro-val-val-R-cis-glu-pro-cis-asp-asp-R-ala-lei-ala
h-BSIFR-4 asp-glu-ala-ilei-gis-cis-pro-pro-cis-ser-glu-glu-lys-lei-ala
cerebrospinal fluid lei-ala-pro-gli-X-gli-Q-gli-shaft-Q-shaft-gli-ala-pro-gli
fibroblasts CM R-ala-pro-gli-cis-gli-Q-gli-val-Q-ala-gli
human serum ala-ala-pro-gly-X-gly-Q-gly-val-Q-ala-gly-cis-pro-gly
In FIG. 2 shows comparative binding curves for cf-BSIFR. The sample was examined for protein binding activity using labeled IGF-II in the presence or absence of unlabeled IGF-I and IGF-II.

На фиг. 3 изображен: А белковый профиль; B - характеристики активности БСИФР из экстракта кости человека, полученные при хроматографическом исследовании (FPLC) на колонке Мопо Q. In FIG. 3 shows: A protein profile; B - characteristics of the activity of BSIF from human bone extract obtained by chromatographic analysis (FPLC) on a Mopo Q column.

Аликвоты гидроксиапатитсвязывающей фракции объемом 50 мл наносят на аффинную колонку с ИФР-II. Полученные три пограничные фракции собирают и пропускают через анионообменную колонку Мопо Q. Профиль элюции белка измеряют по поглощению при 280 нм. Собирают 2 мл - фракции в течение 2 мин. Аликвоты фракций разводят в 10 раз и изучают белок-связывающую активность. Активность БСИФР выражают количественно по специфическому связыванию меченого ИФР-II. Aliquots of a 50 ml hydroxyapatite binding fraction were applied to an IGF-II affinity column. The resulting three boundary fractions were collected and passed through a Mopo Q anion exchange column. The protein elution profile was measured by absorbance at 280 nm. Collect 2 ml fractions for 2 minutes. Aliquots of the fractions were diluted 10-fold and protein-binding activity was studied. BSIFR activity is quantified by the specific binding of labeled IGF-II.

Изобретение относится к выделенному и очищенному БСИФР из кости человека, который специфически связывает ИФР-II в большей степени, чем ИФР-I. Указанный белок может быть получен в гомогенном состоянии из белковых экстрактов, препаратов кости человека, из кондиционированной среды костных клеток человека, или из сыворотки крови человека. Предпочтительная степень очистки белка составляет, по крайней мере 50%, более предпочтительная - до 70 - 80% и наиболее предпочтительная - до 95-99% и более, особенно при фармацевтическом применении. Очищенный частично или до состояния гомогенности БСИФР может использоваться как диагностическое средство, терапевтический препарат, иммуноген и т.д. The invention relates to isolated and purified BSIFR from human bone, which specifically binds IGF-II to a greater extent than IGF-I. The specified protein can be obtained in a homogeneous state from protein extracts, preparations of human bones, from the conditioned environment of human bone cells, or from human blood serum. The preferred degree of protein purification is at least 50%, more preferred up to 70-80% and most preferred up to 95-99% or more, especially in pharmaceutical use. BSIFR, partially or partially purified to homogeneity, can be used as a diagnostic tool, therapeutic agent, immunogen, etc.

Кч-БСИФР, полученный в соответствии с настоящим изобретением, может быть очищен с помощью хроматографии на колонке с гидроксиапатитом, с последующей хроматографией по сродству на колонке с ИФР-II, и, наконец, дополнительно очищен с помощью хроматографической анионообменной колонки Мопо Q (система FPLC). Гомогенность очищенного белка подтверждается например, его миграцией в виде единой полосы при осуществлении SDS - PAGE (SDS - PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и получением одной аминокислотной последовательности при использовании метода анализа N-терминальных последовательностей. В процессе очистки может быть также применена хроматография по сродству на колонке с антителами к кч-БСИФР. Добавочную очистку можно осуществить каким-либо химическим способом, например жидкостной хроматографией, градиентным центрифугированием, электрофорезом в геле и т.д. The Cs-BSIFR obtained in accordance with the present invention can be purified by chromatography on a hydroxyapatite column, followed by affinity chromatography on an IGF-II column, and finally further purified using a Mopo Q chromatographic anion exchange column (FPLC system ) The homogeneity of the purified protein is confirmed, for example, by its migration in the form of a single strip during SDS - PAGE (SDS - PAGE - polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate) and obtaining one amino acid sequence using the method of analysis of N-terminal sequences. In the purification process, affinity chromatography on an anti-cc-BSIFR antibody column may also be used. Additional purification can be carried out by any chemical method, for example, liquid chromatography, gradient centrifugation, gel electrophoresis, etc.

Специфическое связывание кч-БСИФР с ИФР-II и ИФР-I демонстрируется с помощью реакции преципитации при использовании полиэтиленгликоля. В этой точки зрения очищенный белок может оказаться полезным для изучения структуры и функции детерминант ИФР, обуславливающих их связывание со специфическими рецепторами, а также с кч-БСИФР. The specific binding of cc-BSIFR to IGF-II and IGF-I is demonstrated by the precipitation reaction using polyethylene glycol. From this point of view, the purified protein may be useful for studying the structure and function of the determinants of IGF, which determine their binding to specific receptors, as well as to cf-BSIF.

Полученный согласно изобретению в очищенной форме БСИФР является уникальным и отличается от ранее идентифицированных БСИФР. БСИФР-1, БСИФР-2, БСИФР-3 и БСИФР-4 человека характеризуются аминокислотными последовательностями, которые были опубликованы и которые отличаются от аминокислотной последовательности кч-БСИФР. N-терминальная аминокислотная последовательность БСИФР, выделенного из спиномозговой жидкости, из кондиционированной среды фибробластов, и из сыворотки крови человека, также отличается от таковой для кч-БСИФР. The BSIF obtained in accordance with the invention in a purified form is unique and differs from the previously identified BSIF. BSIFR-1, BSIFR-2, BSIFR-3, and BSIFR-4 are characterized by the amino acid sequences that have been published and which differ from the amino acid sequence of cc-BSIFR. The N-terminal amino acid sequence of BSIF isolated from cerebrospinal fluid, fibroblast conditioned media, and human serum is also different from that for cc-BSIF.

Полученный в гомогенной форме БСИФР характеризуется N-терминальной аминокислотной последовательностью (фиг. 1). При этом указанная последовательность может содержать консервативные аминокислотные замены, вставки или делеции, которые не влияют на способность кч-БСИФР связывать ИФР-I или ИФР-II и другие его функции. The BSIF obtained in a homogeneous form is characterized by an N-terminal amino acid sequence (Fig. 1). Moreover, this sequence may contain conservative amino acid substitutions, insertions or deletions that do not affect the ability of cc-BSIFR to bind IGF-I or IGF-II and its other functions.

Полученный согласно настоящему изобретению кч-БСИФР связывает ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. На фиг. 2 приведены кривые конкурентного связывания кч-БСИФР, меченного 125I, с ИФР-II в качестве лиганда при использовании ИФР-I и ИФР-II в качестве конкурентов. Для замещения 50% [125I] ИФР -II из БСИФР требуется около 10 нг/мл ИФР-I и 1 нг/мл ИФР-II. Это свидетельствует о том, что ИФР-II в 10 раз более активен, чем ИФР-I при вытеснении метки. Когда в качестве радиоактивной метки используется [125I] ИФР-I, ИФР-II все равно более активен (в 4 раза) в вытеснении метки, чем ИФР-I. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что БСИФР связывает ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. Обычно связывающая активность кч-БСИФР по отношению к ИФР-II составляет около 10-9 - 10-12 М, наиболее вероятно 10-10 - 10-11 М, в то время как связывающая активность данного белка по отношению к ИФР-I примерно в 10 раз меньше и составляет около 10-8 - 10-10 М. Избирательное сродство кч-БСИФР к ИФР-II объясняет тот факт, что в кости человека ИФР-II содержится в 10-15 раз больше, чем ИФР-I.The cc-BSIFR obtained according to the present invention binds IGF-II with a greater affinity than IGF-I. In FIG. Figure 2 shows the curves of competitive binding of cc-BSIFR labeled 125 I with IGF-II as a ligand using IGF-I and IGF-II as competitors. To replace 50% of [ 125 I] IGF-II from BSIF, about 10 ng / ml of IGF-I and 1 ng / ml of IGF-II are required. This suggests that IGF-II is 10 times more active than IGF-I when label is being forced out. When [ 125 I] IGF-I is used as a radioactive label, IGF-II is still more active (4 times) in label displacement than IGF-I. The above results indicate that BSIFR binds IGF-II with a greater affinity than IGF-I. Typically, the binding activity of cc-BSIFR with respect to IGF-II is about 10 -9 - 10 -12 M, most likely 10 -10 - 10 -11 M, while the binding activity of this protein with respect to IGF-I is approximately 10 times less and is about 10 -8 - 10 -10 M. The selective affinity of cc-BSIFR to IGF-II is explained by the fact that in a human bone, IGF-II contains 10-15 times more than IGF-I.

Z Сродство кч-БСИФР к гидроксиапатиту составляет 10-9 - 10-11 М. Данный белок связывает гидроксиапатит даже в присутствии сильных денатурирующих агентов, таких как 4М гуанидин-HCl, в то время как очищенный ИФР-II не связывает гидроксиапатит.Z The affinity of cc-BSIFR for hydroxyapatite is 10 -9 - 10 -11 M. This protein binds hydroxyapatite even in the presence of strong denaturing agents, such as 4M guanidine-HCl, while purified IGF-II does not bind hydroxyapatite.

Для получения фармацевтической композиции используют кч-БСИФР, дополнительно ИФР-II и фармацевтически приемлемый носитель. Можно использовать водные носители, например воду, в чистом виде или водный буферный раствор, 0,4%-ный раствор NaCl, 0,3%-ный глицин и т.д. Композиции стерилизуют с помощью хорошо известных методов; они могут содержать дополнительные фармацевтически приемлемые вещества, если это необходимо для улучшения физиологических свойств композиции, такие как агенты, регулирующие pH и токсичность и т.д., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и др. Концентрация кч-БСИФР и кч-БСИФР /ИФР-II в фармацевтических препаратах может широко варьировать, например, от менее чем 0,00001%, обычно от 0,001, до 0,05 - 0,1% по весу; концентрации должны подбираться, прежде всего, в зависимости от объема жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с выбранным конкретным способом введения препаратов, с состояниями, подвергаемыми лечению (например, заживление переломов, остеопороз, заживление хирургических и травматических ран, опухоли, такие как остеосаркома или карцинома грудной железы и т.д.), а также в зависимости от возраста больного (взрослый, ребенок или новорожденный). To obtain the pharmaceutical composition, cc-BSIFR, optionally IGF-II, and a pharmaceutically acceptable carrier are used. Aqueous carriers, for example, pure water or an aqueous buffer solution, 0.4% NaCl solution, 0.3% glycine, etc., can be used. The compositions are sterilized using well-known methods; they may contain additional pharmaceutically acceptable substances, if necessary, to improve the physiological properties of the composition, such as agents that control pH and toxicity, etc., for example, sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, etc. The concentration of cs-BSIFR and cs-BSIF / IGF-II in pharmaceutical preparations can vary widely, for example, from less than 0.00001%, usually from 0.001 to 0.05 - 0.1% by weight; concentrations should be selected, first of all, depending on the volume of fluid, viscosity, etc., in accordance with the chosen specific method of drug administration, with the conditions being treated (for example, healing of fractures, osteoporosis, healing of surgical and traumatic wounds, tumors, such as osteosarcoma or breast carcinoma, etc.), as well as depending on the age of the patient (adult, child or newborn).

Так, типичная фармацевтическая композиция для внутривенного вливания при лечении взрослых, страдающих от остеодегенеративных заболеваний умеренной тяжести, может содержать 250 мл стерильного раствора Рингера и от 50 мг до 5 г кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II. Способы приготовления препарата для парентерального или орального введения хорошо известны специалистам в данной области исследований. Thus, a typical pharmaceutical composition for intravenous infusion in the treatment of adults suffering from moderate osteodegenerative diseases may contain 250 ml of sterile Ringer's solution and from 50 mg to 5 g of cc-BSIFR or of the cc-BSIF / IGF-II complex. Methods for preparing a preparation for parenteral or oral administration are well known to those skilled in the art.

Композиции, содержащие полученный кч-БСИФР или комплекс кч-БСИФР/ИФР-II или их смеси, могут применяться в профилактических и/или терапевтических целях. При терапевтическом применении композиции вводятся больному, страдающему от заболевания, ассоциированного кч-БСИФР или ИФР-II, в количествах, достаточных для лечения или, по крайней мере, частичной остановки развития процесса и его осложнений. Количество препарата, адекватное для достижения этих целей, определяется как "терапевтически эффективная доза", которая зависит от типа заболевания, (остеопороз, перелом, рана, опухоль и т.д.), от его тяжести, возраста больного и общего состояния здоровья. Обычно терапевтически эффективная доза составляет около 1,0-500 мкг кч-БСИФР или кч-БСИФР/ИФР-II на килограмм веса тела за час инфузии, наиболее часто от 10 до 50 мкг кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II на килограмм веса тела за час инфузии. Иногда желательно использовать фармацевтические композиции с избытком активного вещества. Compositions containing the obtained cc-BSIFR or the cc-BSIFR / IGF-II complex or mixtures thereof can be used for prophylactic and / or therapeutic purposes. For therapeutic use, the compositions are administered to a patient suffering from a disease associated with CC-BSIF or IGF-II, in amounts sufficient to treat or at least partially arrest the development of the process and its complications. An amount of the drug that is adequate to achieve these goals is defined as a “therapeutically effective dose”, which depends on the type of disease (osteoporosis, fracture, wound, tumor, etc.), its severity, age of the patient, and general health. Typically, the therapeutically effective dose is about 1.0-500 μg cc-BSIFR or cc-BSIF / IGF-II per kilogram of body weight per hour of infusion, most often 10 to 50 μg cc-BSIFR or the cc-BSIF / IGF-II complex per kilogram of body weight per hour infusion. It is sometimes desirable to use pharmaceutical compositions with an excess of active substance.

В профилактических целях композиции, содержащие заявленный кч-БСИФР или комплекс кч-БСИФР/ИФР-II или их смеси, вводятся пациенту для повышения резистентности к определенным заболеваниям. Количество препарата в этом случае определяется как "профилактически эффективная доза", которая опять-таки зависит от состояния здоровья пациента и т.д., но в основном, варьируют в пределах от 1 до 500 мкг на килограмм веса тела за час инфузии, чаще в пределах от 10 до 50 мкг на килограмм веса тела за час инфузии. Предпочтительно профилактические дозы используются для предупреждения развития остеодегенеративных заболеваниях. For prophylactic purposes, compositions containing the claimed cc-BSIFR or the cc-BSIF / IGF-II complex or mixtures thereof are administered to a patient to increase resistance to certain diseases. The amount of the drug in this case is defined as a “prophylactically effective dose”, which again depends on the patient’s health status, etc., but generally vary from 1 to 500 micrograms per kilogram of body weight per hour of infusion, more often in ranges from 10 to 50 micrograms per kilogram of body weight per hour of infusion. Preferably, prophylactic doses are used to prevent the development of osteodegenerative diseases.

Способ введения препаратов, эффективные дозы, множественность инъекций определяются лечащим врачом. В любом случае, фармацевтические препараты должны обеспечить такую дозу кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II, которой достаточно для лечения больного. The method of administration of drugs, effective doses, multiplicity of injections are determined by the attending physician. In any case, pharmaceutical preparations must provide such a dose of cc-BSIFR or the cc-BSIFR / IGF-II complex, which is sufficient to treat the patient.

Полученный согласно изобретению кч-БСИФР эффективно стимулирует пролиферацию костных клеток в ответ на ИФР-II. Экзогенное добавление ИФР-II к клеткам кости в отсутствии сыворотки увеличивает их пролиферацию. Указанный пролиферативный эффект ИФР-II усиливается добавлением кч-БСИФР в комплексе с ИФР-II. Данное синергическое действие комбинации кч-БСИФР и ИФР-II, большее, чем суммарный эффект, определяемый при сложении результатов применения каждого из агентов индивидуально, ранее не был описан для других БСИФР по отношению к любым типам клеток. Таким образом, изобретение обеспечивает возможность получения терапевтического средства для лечения поражений костной ткани (например, остеопороза), при которых ослаблены процессы формирования кости. Фармацевтические композиции будут включать кч-БСИФР и, при необходимости, ИФР, в физиологически приемлемых носителях и/или наполнителях. The cc-BSIFR obtained according to the invention effectively stimulates bone cell proliferation in response to IGF-II. The exogenous addition of IGF-II to bone cells in the absence of serum increases their proliferation. The indicated proliferative effect of IGF-II is enhanced by the addition of cc-BSIFR in combination with IGF-II. This synergistic effect of the combination of cc-BSIFR and IGF-II, greater than the total effect determined by adding up the results of using each of the agents individually, has not been previously described for other BSIFs with respect to any cell type. Thus, the invention provides the possibility of obtaining a therapeutic agent for the treatment of bone tissue lesions (for example, osteoporosis), in which the processes of bone formation are weakened. Pharmaceutical compositions will include CC-BSIFR and, if necessary, IGF, in physiologically acceptable carriers and / or excipients.

Полученный согласно изобретению кч-БСИФР можно использовать для лечения любых ран и заживления кожи, поскольку данный белок увеличивает время полужизни ИФР путем защиты их от действия протеолитических ферментов, способен избирательно направлять транспорт БСИФР в костную ткань и/или усиливать ее пролиферацию. The cc-BSIFR obtained according to the invention can be used to treat any wounds and skin healing, since this protein increases the half-life of IGF by protecting them from the action of proteolytic enzymes, is capable of selectively directing the transport of BSIF to bone tissue and / or enhancing its proliferation.

Комплексы кч-БСИФР/ИФР можно приготовить различными способами, например, инкубацией растворов очищенных ИФР и кч-БСИФР определенных концентраций при нейтральном pH в течение ночи, предшествующей применению препарата. Концентрации кч-БСИФР и ИФР в композициях могут широко варьировать, но предпочтительно должны быть эквимолярными. Приготовленные отдельно препараты кч-БСИФР, могут применяться индивидуально или одновременно с композициями ИФР-II. При раздельном введении желательно первым вводить кч-БСИФР, а вслед за ним ИФР-II. Подобные композиции можно вводить местно, чтобы стимулировать образование кости в определенном участке (например, для заживления перелома) или системно, чтобы усилить общие процессы образования кости при лечении таких заболеваний как остеопороз. The cc-BSIFR / IGF complexes can be prepared in various ways, for example, by incubating solutions of purified IGF and cc-BSIFR of certain concentrations at a neutral pH during the night preceding the use of the drug. The concentration of cc-BSIFR and IGF in the compositions can vary widely, but preferably should be equimolar. Separately prepared cc-BSIFR preparations can be used individually or simultaneously with IGF-II compositions. If administered separately, it is advisable to administer cc-BSIFR first, followed by IGF-II. Such compositions can be administered topically to stimulate bone formation in a specific area (for example, to heal a fracture) or systemically to enhance the general processes of bone formation in the treatment of diseases such as osteoporosis.

Пример 1. Приготовление экстракта из кости человека для выделения кч-БСИФР
Головки бедренных костей человека, полученные при тотальных ампутациях, хранятся при температуре -20oC до момента использования. Кости разрезают с помощью пилы для разрезания гипсовых повязок и измельчают в мельнице для последующей экстракции кч-БСИФР. Костные белки извлекают путем деминерализации порошка из головок бедренных костей 10% этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) в присутствии 4М гуанидин-HCl и ингибиторов протеаз (гуанидин-ЭДТА экстракт) после первоначальной экстракции водой и 4М гуанидин-HCl, как описано Mohan et al., (Biochem Biophys. Acta 884:234-242 (1986). Гуанидин-ЭДТА экстракт затем концентрируют с помощью мембраны Amicon УМ5 (через мембрану проходят соединения с мол.массой менее 5 кДа) и используют для очистки кч-ИФРСБ.Example 1. Preparation of extract from human bone to isolate cc-BSIFR
The heads of the human thigh bones obtained during total amputations are stored at a temperature of -20 o C until use. The bones are cut with a saw for cutting gypsum dressings and ground in a mill for subsequent extraction of cc-BSIFR. Bone proteins are removed by demineralizing the powder from the femoral heads with 10% ethylene diamine tetraacetate (EDTA) in the presence of 4M guanidine-HCl and protease inhibitors (guanidine-EDTA extract) after the initial extraction with water and 4M guanidine-HCl, as described by Mohan et al., (Biochem Biophys. Acta 884: 234-242 (1986). The guanidine-EDTA extract is then concentrated using an Amicon UM5 membrane (compounds with a molar mass of less than 5 kDa pass through the membrane) and are used to purify cf-IFRSB.

Пример 2. Очистка и характеристика кч-ИФРСБ из экстракта кости человека
Экстракт из костей человека подвергают гидроксиапатитной (НА) хроматографии в 4М гуанидин-HCl, как описано Mohan et al., (см. выше). Аффинную колонку с ИФР-II готовят связыванием 250 мкг ИФР-II, выделенного из кости человека, с гранулами Сефарозы 4В, активированной бромистым цианом. Пул связанных HA фракций концентрируют с помощью мембраны Amicon YM5 до 300 мл и вновь подвергают диализу против 20-кратного объема буфера на основе фосфата калия (10 мМ фосфат калия, pH 6,0) содержащего ингибиторы протеаз (100 мМ эпсилон-аминокапроновой кислоты, 5 мМ бензамидина, 1 мМ фенилметилсульфонил фторида). Аффинную колонку с ИФР-II уравновешивают фосфатом калия, после чего на колонку наслаивают 50 мл-аликвоту (приблизительно 3 - 4 мг общего белка/мл) диализованной фракции, связывающей HA. Колонку затем интенсивно промывают буфером, содержащим фосфат калия, до полного удаления несвязанных белков. Связанные белки элюируют с помощью 20 - 25 мл 30 мМ трис-ацетата (pH 7,2)/ 4М гуанидин-HCl. Полученную фракцию концентрируют с помощью мембраны Amicon YM5 и затем диализуют в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) буфере. Полученную после диализа фракцию пропускают через анионообменную колонку FHARMAClA FPLC Мопо Q предварительно уравновешенную трис-HCl буфером. Связанные белки элюируют линейным градиентом 0-1 М NaCl в 20 мМ трис-HCl буфере в течение 100 мин.Example 2. Purification and characterization of cc-IFRSB from human bone extract
The human bone extract was subjected to hydroxyapatite (HA) chromatography in 4M guanidine-HCl as described by Mohan et al. (See above). An affinity column with IGF-II is prepared by binding 250 μg of IGF-II isolated from human bones to Sepharose 4B granules activated by cyanogen bromide. The pool of HA-bound fractions was concentrated using an Amicon YM5 membrane to 300 ml and dialyzed again against a 20-fold volume of potassium phosphate buffer (10 mM potassium phosphate, pH 6.0) containing protease inhibitors (100 mM epsilon-aminocaproic acid, 5 mM benzamidine, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride). The IGF-II affinity column is equilibrated with potassium phosphate, after which a 50 ml aliquot (approximately 3-4 mg total protein / ml) of the dialyzed HA binding fraction is layered onto the column. The column is then washed extensively with a buffer containing potassium phosphate until the unbound proteins are completely removed. Bound proteins are eluted with 20-25 ml of 30 mM Tris-acetate (pH 7.2) / 4M guanidine-HCl. The resulting fraction was concentrated using an Amicon YM5 membrane and then dialyzed in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer. The fraction obtained after dialysis was passed through an FHARMAClA FPLC Mopo Q anion exchange column, pre-equilibrated with Tris-HCl buffer. Bound proteins are eluted with a linear gradient of 0-1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl buffer for 100 min.

Активность кч-БСИФР определяют методом преципитации в полиэтиленгликоле. Вкратце, 50 мкл, образца, подвергаемого исследованию, инкубируют с 25000 - 50000 cpm меченного 125I ИФР-I или ИФР-II в течение 60 мин при комнатной температуре в 250 мкл раствора следующего состава: 0,1 М HEPES /0,1% альбумин бычьей сыворотки /0,1% Тритон Х100 /44 мМ Na2CO3/ Na2N3, pH 6,0. К указанной смеси добавляют 100 мкл 2%-ного сывороточного иммуноглобулина и 500 мкл 25%-ного полиэтиленгликоля, после чего смесь центрифугируют. При этих условиях полиэтиленгликоль осаждает большую часть комплекса ИФР-I или ИФР-II и кч-БСИФР, но не осаждает несвязанные ИФР-I или ИФР-II. Затем подсчитывают количество 125I-ИФР-II в преципитате. Неспецифическое связывание определяют исследованием в присутствии избытка немеченого ИФР-I или ИФР-II и количество 125I-ИФР-I или 125I-ИФР-II в преципитате вычитают из значения, полученного как указано выше. Для определения молекулярной массы кч-БСИФР используют метод блоттинга с лигандом с применением в качестве радиоактивного изотопа 125I (125I-ИФР-II). При этом 50 мкл образца подвергают электрофорезу в пластинках 3 - 27% полиакриламидного геля заводского изготовления. После переноса образцов посредством электроблоттинга на нитроцеллюлозную мембрану, последнюю инкубируют с меченным радиоактивным изотопом ИФР-II. После отмывания несвязанного меченого ИФР-II мембрану подвергают ауторадиографии.The activity of cc-BSIFR is determined by the precipitation method in polyethylene glycol. Briefly, 50 μl of the sample to be tested is incubated with 25,000 - 50,000 cpm of labeled 125 I IGF-I or IGF-II for 60 min at room temperature in 250 μl of a solution of the following composition: 0.1 M HEPES / 0.1% bovine serum albumin / 0.1% Triton X100 / 44 mM Na 2 CO 3 / Na 2 N 3 , pH 6.0. To this mixture was added 100 μl of 2% serum immunoglobulin and 500 μl of 25% polyethylene glycol, after which the mixture was centrifuged. Under these conditions, polyethylene glycol precipitates most of the IGF-I or IGF-II and cc-BSIFR complex, but does not precipitate unbound IGF-I or IGF-II. Then count the amount of 125 I-IGF-II in the precipitate. Non-specific binding is determined by assay in the presence of an excess of unlabeled IGF-I or IGF-II and the amount of 125 I-IGF-I or 125 I-IGF-II in the precipitate is subtracted from the value obtained as described above. To determine the molecular weight of cc-BSIFR, the ligand blotting method is used using 125 I ( 125 I-IGF-II) as a radioactive isotope. In this case, 50 μl of the sample is subjected to electrophoresis in plates of 3 - 27% factory-made polyacrylamide gel. After transferring the samples by electroblotting to a nitrocellulose membrane, the latter is incubated with the labeled radioactive isotope IGF-II. After washing the unbound labeled IGF-II, the membrane is subjected to autoradiography.

Аминокислотный состав образцов устанавливают с помощью анализатора модели 420 Applied Biosystems, a N-терминальную последовательность определяют при использовании секвенсера белков той же фирмы. The amino acid composition of the samples was determined using an Applied Biosystems model 420 analyzer, and the N-terminal sequence was determined using a protein sequencer of the same company.

На фиг. 3 показаны профили белка и активность БСИФР в афинной связанной фракции, полученные при хроматографии на колонке Мопо Q. На участке элюции аутентичного БСИФР-4 не наблюдается пика абсорбции белка, а также пика активности БСИФР (9-15 фракции, 0,1 М NaCl), что свидетельствует о том, что выделенный из кости БСИФР не является БСИФР-4. Тем не менее, обнаруживаются четыре пика абсорбции белка при различных концентрациях NaCl. Из этих четырех пиков первые два (A и B) содержат значительную активность БСИФР, в то время как два последних пика (C и D) обнаруживают малую активность БСИФР. In FIG. Figure 3 shows the protein profiles and the activity of BSIF in the affinity bound fraction obtained by chromatography on a Mopo Q column. At the elution site of the authentic BSIF-4, there is no peak in protein absorption or peak activity of BSIF (9-15 fractions, 0.1 M NaCl) , which indicates that the BSIFR isolated from the bone is not BSIFR-4. However, four peaks of protein absorption are detected at various NaCl concentrations. Of these four peaks, the first two (A and B) contain significant BSIFR activity, while the last two peaks (C and D) show low BSIF activity.

Для определения молекулярных масс БСИФР, содержащихся в экстракте из кости человека, используют методы блоттинга с лигандом и мечение ИФР-II радиоактивным изотопом 125I. При этом HA-связанные, ИФР-II-связанные и белковые пики, полученные на колонке Мопо Q, подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, переносят на нитроцеллюлозные фильтры и тестируют с помощью радиоактивно меченного (125I) ИФР-II. Большая часть БСИФР, присутствующих в HA-связанных с ИФР-II-связанных фракциях, имеет молекулярную массу 29 кДа. Кроме того в этих фракциях обнаруживается широкая менее интенсивная полоса между маркерами с молекулярными массами 68 и 43 кДа. Большую часть БСИФР с молекулярной массой 29 кДа отделяют от БСИФР с большей молекулярной массой путем хроматографии на колонке Мопо Q. Мопо Q пик A обнаруживает большую полосу с мол. массой 29 кДа и меньшую полосу с мол. массой 24 кДа. Мопо Q пик B обнаруживает широкую диффузную полосу между маркерами мол. массой 68 и 43 кДа и меньшую полосу с мол. массой 29 кДа. Мопо Q пик C (основной пик абсорбции белка) и пик D обнаруживает только слабую полосу с мол. массой 29 кДа. Полученные данные означают, что большая часть БСИФР в экстракте кости человека имеет мол. массу 29 кДа.To determine the molecular mass of BSIFR contained in the extract from human bone, ligand blotting methods and labeling of IGF-II with the radioactive isotope 125 I are used. In this case, HA-linked, IGF-II-linked and protein peaks obtained on a Mopo Q column are subjected to polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate, transferred to nitrocellulose filters and tested with radioactively labeled ( 125 I) IGF-II. Most of the BSIFs present in HA-bound IGF-II-bound fractions have a molecular weight of 29 kDa. In addition, a wider less intense band is found in these fractions between markers with molecular weights of 68 and 43 kDa. Most of the BSIFR with a molecular weight of 29 kDa is separated from the BSIFR with a higher molecular weight by chromatography on a Mopo Q column. Mopo Q peak A shows a large band with a mol. mass of 29 kDa and a smaller strip with mol. mass of 24 kDa. Mopo Q peak B exhibits a wide diffuse band between the mole markers. mass of 68 and 43 kDa and a smaller strip with mol. mass of 29 kDa. Mopo Q peak C (the main peak of protein absorption) and peak D shows only a weak band with mol. mass of 29 kDa. The data obtained mean that the majority of BSIFR in the human bone extract has a mole. mass 29 kDa.

Аминокислотый состав и N-концевая аминокислотная последовательность БСИФР в пике A Мопо Q мол. мас. 29 кДа уникальны и имеют ограниченное сходство с другими известными БСИФР (табл. 1 и фиг. 1). Amino acid composition and N-terminal amino acid sequence of BSIFR at peak A Mopo Q mol. wt. 29 kDa are unique and have limited similarity with other known BSIFR (table. 1 and Fig. 1).

Фрагменты мембраны "иммобилон" диаметром 10 мм пропитывают метанолом, помещают в фильтрационную установку Millipore и укрепляют на месте резиновыми кольцами. После отмывания мембраны водой, СБ в пике A фиксируют на мембране посредством фильтрования через нее 1 мл пика A. Половину мембраны используют для изучения аминокислотного состава. Immobilon membrane fragments with a diameter of 10 mm are impregnated with methanol, placed in a Millipore filtration unit and strengthened in place with rubber rings. After washing the membrane with water, SB in peak A is fixed on the membrane by filtering 1 ml of peak A through it. Half of the membrane is used to study the amino acid composition.

50 пмоль кч-БСИФР используют для N-концевого аминокислотного анализа. Комбинированная средняя повторяемость составляет 86,3%. X - неизвестен (табл. 2). 50 pmol cc-BSIFR is used for the N-terminal amino acid analysis. The combined average repeatability is 86.3%. X is unknown (tab. 2).

Таким образом, БСИФР размером 29 кДа был определен как БСИФР, полученный из кости человека (кч-БСИФР). В добавление к основной последовательности (лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей) получены данные, свидетельствующие о присутствии в Мопо Q пике A дополнительной последовательности, в которой недостает одной или двух аминокислот. Выделенный кч-БСИФР чувствителен к протеолитическому расщеплению, поскольку выдерживание полученного 29 кДа БСИФР при 5oC в течение ночи приводит к исчезновению полосы размером 29 кДа и появлению основной полосы размером 24 кДа и нескольких низкомолекулярных малых полос. Согласно N-концевому анализу последовательности полосы размером 24 кДа, полученная последовательность (лей-гли-фен-X-вал-X-X-глу-про-X-X-лиз) подобна таковой БСИФР мол. массы 29 кДа. Дальнейшее выдерживание 24 кДа БСИФР приводит к исчезновению соответствующей полосы и появлению нескольких низкомолекулярных белковых полос, обладающих небольшой активностью БСИФР, как показывает блот-анализ с лигандом. Недавно появилось сообщение о протеазах, связанных с БСИФР, что согласуется с результатами настоящих исследований.Thus, a 29 kDa BSIFR was defined as a BSIFR derived from human bone (cf-BSIFR). In addition to the main sequence (lei-gly-fen-fen-val-X-val-glu-pro-asp-asp-liz-ala-ala-lei), data were obtained indicating the presence of an additional sequence in Mopo Q peak A, in which one or two amino acids are deficient. The isolated cc-BSIFR is sensitive to proteolytic cleavage, since keeping the obtained 29 kDa BSIFR at 5 ° C overnight leads to the disappearance of the 29 kDa band and the appearance of the main band of 24 kDa and several low molecular weight small bands. According to the N-terminal sequence analysis of a 24 kDa band, the obtained sequence (leu-gly-phen-X-shaft-XX-glu-pro-XX-lysis) is similar to that of BSIF mol. masses 29 kDa. Further incubation of 24 kDa BSIFR leads to the disappearance of the corresponding band and the appearance of several low molecular weight protein bands with low BSIFR activity, as shown by blot analysis with a ligand. Recently, there has been a report on proteases associated with BSIF, which is consistent with the results of these studies.

Мопо Q пик B имеет другой аминокислотный состав и не усиливает действия ИФР-II на клетки кости. Попытки установить аминокислотную последовательность пика B оказались безуспешными. Определение этой последовательности в первых нескольких циклах основного белкового пика (фракция 45, пик C) выявляет многочисленнные аминокислоты с нечитаемой последовательностью. Таким образом, Мопо Q пики C и D, обладающие незначительной активностью БСИФР, могут представлять собой продукты распада БСИФР мол. массы 29 кДа. Mopo Q peak B has a different amino acid composition and does not enhance the action of IGF-II on bone cells. Attempts to establish the amino acid sequence of peak B were unsuccessful. The determination of this sequence in the first few cycles of the main protein peak (fraction 45, peak C) reveals numerous amino acids with an unreadable sequence. Thus, Mopo Q peaks C and D, with insignificant activity of BSIFR, can be the breakdown products of BSIFR mol. masses 29 kDa.

Поскольку N-концевая последовательность очищенного кч-БСИФР в пике Мопо Q обнаруживалась в дополнение к основной последовательности, и в дополнительных последовательностях были утрачены одна или две аминокислоты (возможно, благодаря параллельному выделению БСИФР-протеазы, расщепляющей этот БСИФР), и поскольку не были выделены остатки цистеина, валин в положении 7 последовательности заявленного кч-БСИФР и аспаргиновая кислота в положении 10 могут быть остатками цистеина (остатки цистеина характерны для различных представителей семейства БСИФР). Выдерживание очищенного БСИФР Мопо Q, выделенного из кости человека, при 5oC приводит к исчезновению полосы БСИФР размером 29 кДа и появлению БСИФР, обладающих меньшей молекулярной массой, при осуществлении SDS -PAGE. При определении последовательности БСИФР с меньшей молекулярной массой валин и аспаргиновая кислота в положениях 7 и 10 соответственно не обнаруживаются. Эти исследования позволяют предположить, что кч-БСИФР может иметь одну из следующих последовательностей: лей-гли-фен-фен-вал-X-цис-глу-про-цис-асп-лиз-ала-ала-лей. Альтернативная последовательность, полученная с учетом приведенных выше соображений может быть такой: лей-гли-сер-фен-вал-гис-цис-глу-про-цис-асп-глу-лиз-ала-лей; эта последовательность сходна с последовательностью СБ-5, опубликованной Kiefer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 176:219-225 (1991), Shimasaki et al., J. Biol Chem. 266: 10646-10653 (1991), и раскрытой Drop. Endocrinol. 130:1736-1737 (1992). Последовательность может подвергаться различным изменениям, основанным на естественных или искусственно внедренных заменах, добавлениях или делециях, эти варианты последовательности могут быть аллельными вариантами или полученными с помощью специальных методик, примененных в описанных исследованиях. В дальнейшем, N-терминальная последовательность позволит конструировать вырожденные олигонуклеотидные пробы для клонирования гена, кодирующего заявленный кч-БСИФР.Since the N-terminal sequence of purified cc-BSIFR at the Mopo Q peak was detected in addition to the main sequence, and one or two amino acids were lost in the additional sequences (possibly due to the parallel isolation of the BSIFR protease that cleaves this BSIFR), and since they were not isolated cysteine residues, valine at position 7 of the sequence of the claimed cc-BSIFR and aspartic acid at position 10 may be cysteine residues (cysteine residues are characteristic of various members of the families and BSIFR). Sustaining the purified BSIFR Mopo Q isolated from human bone at 5 ° C. leads to the disappearance of the BSIFR band of 29 kDa and the appearance of the BSIFR having a lower molecular weight during SDS-PAGE. When determining the sequence of BSIFR with a lower molecular weight, valine and aspartic acid at positions 7 and 10, respectively, are not detected. These studies suggest that cf-BSIFR may have one of the following sequences: lei-gly-phen-phen-val-X-cis-glu-pro-cis-asp-lys-ala-ala-lei. An alternative sequence obtained taking into account the above considerations may be: leu-gly-ser-fen-val-gis-cis-glu-pro-cis-asp-glu-lys-ala-lei; this sequence is similar to the sequence of SB-5 published by Kiefer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 176: 219-225 (1991), Shimasaki et al., J. Biol Chem. 266: 10646-10653 (1991), and Drop disclosed. Endocrinol. 130: 1736-1737 (1992). The sequence may undergo various changes based on natural or artificially introduced substitutions, additions or deletions, these sequence variants can be allelic variants or obtained using special techniques used in the described studies. Further, the N-terminal sequence will allow the construction of degenerate oligonucleotide probes for cloning a gene encoding the claimed cc-BSIFR.

Пример 3. Применение кч-БСИФР для исследования пролиферации костных клеток
При изучении пролиферации костных клеток, опосредованной в бессывороточной культуральной среде (Mohan et al., Biochem. Biophys. Acta, 884:234-242 (1986) измеряют включение (3H-тимидина в клеточный материал, осаждаемый трихлоруксусной кислотой. Исследование проводят при использовании мышиных остеобластов линии МС3Т3-Е1. Приблизительно 10000 клеток на ячейку в бессывороточной среде Игла, модифицированной Дульбекко, помещают в 48-луночные панели и используют для анализа включения (3H) тимидиновой пробы, как это описано Mohan et al., (см. выше).Example 3. The use of cc-BSIFR to study bone cell proliferation
When studying bone cell proliferation mediated in a serum-free culture medium (Mohan et al., Biochem. Biophys. Acta, 884: 234-242 (1986), the incorporation of ( 3 H-thymidine into the cell material precipitated with trichloroacetic acid was measured. The study was carried out using murine MC3T3-E1 line osteoblasts: Approximately 10,000 cells per cell in Dulbecco's modified serum-free medium are placed in 48-well panels and used to analyze the incorporation of ( 3 H) thymidine samples as described by Mohan et al. (see above) )

Результаты экспериментов показывают, что кч-БСИФР сам по себе обладает небольшой митогенной активностью, что подтверждается включением (3H)-тимидина в макромолекулы, нерастворимые в трихлоруксусной кислоте (табл. 3). Однако, когда кч-БСИФР добавляют с субмаксимальными концентрациями ИФР-II к культурам костных клеток мыши, не содержащим сыворотки, он усиливает пролиферативное действие ИФР-II. Показано, что ИФРСБ-3 усиливает действие ИФР-I только в том случае, когда добавляют в культуры за несколько часов до внесения ИФР-I (Mohan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:8338-8342 (1989) и De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 156:199-204 (1988) и никакие другие БСИФР не усиливают действия ИФР, когда ИФР и БСИФР вносят в культуры одновременно. Эти результаты позволяют предположить, что БСИФР не просто пассивный носитель ИФР, но также позитивно регулирует действие ИФР. Хотя механизм (или механизмы), посредством которого кч-БСИФР усиливает включение (3H) тимидина, под действием ИФР-II, не известен (не известны), предложено несколько моделей, объясняющих данный факт. Например, кч-БСИФР наводит ИФР-II на клеточную мембрану для облегчения доступа ИФР-II к соответствующему рецептору (возможно посредством последовательности RGD, как в случае БСИФР-1). Или же кч-БСИФР увеличивает сродство ИФР-II к рецептору посредством его связывания с ИФР-II и/или увеличивает период полужизни ИФР-II, защищая его от протеаз.The experimental results show that cc-BSIFR itself has little mitogenic activity, as evidenced by the incorporation of ( 3 H) -thymidine into macromolecules insoluble in trichloroacetic acid (Table 3). However, when cc-BSIFR is added with submaximal concentrations of IGF-II to serum-free mouse bone cell cultures, it enhances the proliferative effect of IGF-II. IFRSB-3 has been shown to enhance the action of IGF-I only when added to the culture several hours before the introduction of IGF-I (Mohan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 8338-8342 (1989) and De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 156: 199-204 (1988) and no other BSIFs enhance the effects of IGF when IGF and BSIF are added to cultures simultaneously, suggesting that BSIFR is not just a passive carrier of IGF, but also positively regulates the action of IGF, although the mechanism (or mechanisms) by which cc-BSIF enhances the incorporation of ( 3 H) thymidine by IGF-II is not known (unknown), several models have been proposed to explain this fact, for example, cc-BSIFR induces IGF-II on the cell membrane to facilitate access of IGF-II to the corresponding receptor (possibly via the RGD sequence, as in the case of BSIF-1). cc-BSIFR increases the affinity of IGF-II to the receptor by binding to IGF-II and / or increases the half-life of IGF-II, protecting it from proteases.

Не содержащие сыворотки культуры мышиных остеобластов линии МС3Т3 инкубируют в течение 18 ч с эффекторами до внесения (3H)-тимидина. Конечные концентрации ИФР-II и кч-БСИФР составляют 3 и 10 нг/мл соответственно. Данные табл. 3 - среднее арифметическое ± допустимое отклонение шести повторных экспериментов (одинаковые лунки). Включение (3H) тимидина в контрольных культурах, обработанных бычьим сывороточным альбумином (БСА), составляет 1404±217, 237±53 и 730±91 соответственно в трех экспериментах.Serum-free culture of murine osteoblasts of the MC3T3 line was incubated for 18 h with effectors until ( 3 H) -thymidine was added. Final concentrations of IGF-II and cf-BSIFR are 3 and 10 ng / ml, respectively. The data table. 3 - arithmetic mean ± permissible deviation of six repeated experiments (identical wells). The incorporation of ( 3 H) thymidine in control cultures treated with bovine serum albumin (BSA) was 1404 ± 217, 237 ± 53 and 730 ± 91, respectively, in three experiments.

Пример 4. Выделение кч-БСИФР из кондиционированной среды костных клеток
Поскольку костные клетки в культуре продуцируют кч-БСИФР, бессывороточную кондиционированную среду костных клеток, можно использовать для выделения БСИФР. Вкратце, кондиционированную среду костных клеток концентрируют с помощью системы Amicon с применением УM5 (отсеиваются фракции мол. массой 5 кДа), подкисляют уксусной кислотой до конечной концентрации 1М и подвергают гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-100 для отделения ИФР от БСИФР. Белки элюируют 1 М уксусной кислотой. Фракции, содержащие БСИФР, собирают, лиофилизируют, восстанавливают фосфатным буферным раствором и пропускают через аффинную колонку с ИФР-II. Связанные белки затем подвергают анионообменной хроматографии (FPLC Мопо Q) для отделения кч-БСИФР от остальных БСИФР.Example 4. Isolation of cc-BSIFR from conditioned bone cell medium
Since bone cells in the culture produce cc-BSIFR, a serum-free conditioned bone cell medium can be used to isolate BSIF. Briefly, the conditioned medium of bone cells is concentrated using an Amicon system using UM5 (fractions of a molar mass of 5 kDa are screened out), acidified with acetic acid to a final concentration of 1 M and gel filtered on a Sephadex G-100 column to separate IGF from BSIF. Proteins elute with 1 M acetic acid. Fractions containing BSIFR were collected, lyophilized, reduced with phosphate buffered saline and passed through an affinity column with IGF-II. The bound proteins are then subjected to anion exchange chromatography (FPLC Mopo Q) to separate cc-BSIFR from the remaining BSIF.

Пример 5. Количественный диагностический анализ содержания кч-БСИФР
Кч-БСИФР, выделенный из кости человека или полученный рекомбинантным путем, используют для получения поликлональных или моноклональных антител, которые затем применяются для количественного диагностического анализа содержания кч-БСИФР. Вкратце, кч-БСИФР смешивают с полным адъювантом Фрейнда и вводят кроликам, морским свинкам, крысам или мышам с последующим наблюдением за выработкой антител. Позже животным вводят кч-БСИФР, смешанный с неполным адьювантом Фрейнда, каждые 3 - 4 недели. Для получения поликлональной антисыворотки у животных отбирают кровь после 3-4 инъекций, и определяют титр антител к кч-БСИФР радиоиммуноанализом или другими методами. Моноклональные антитела вырабатываются культурами клеток, продуцирующими антитела, полученными от иммунизированных животных при помощи хорошо известных методик. Очищенный кч-БСИФР метят радиоактивным изотопом и используют в качестве сигнального радиоактивного соединения. Моноклональные антитела или антисыворотку с высоким титром затем используют в радиоиммунологическом определении кч-БСИФР в сыворотке, моче и других биологических жидкостях.Example 5. Quantitative diagnostic analysis of the content of cc-BSIFR
Cs-BSIFR isolated from human bone or obtained recombinantly is used to produce polyclonal or monoclonal antibodies, which are then used for the quantitative diagnostic analysis of the content of cs-BSIFs. Briefly, cc-BSIFR is mixed with Freund's complete adjuvant and administered to rabbits, guinea pigs, rats or mice, followed by monitoring antibody production. Later, animals were injected with cc-BSIFR mixed with Freund's incomplete adjuvant every 3 to 4 weeks. To obtain a polyclonal antiserum, animals are sampled after 3-4 injections, and the titer of antibodies to cc-BSIFR is determined by radioimmunoassay or other methods. Monoclonal antibodies are produced by cell cultures producing antibodies obtained from immunized animals using well-known techniques. Purified cc-BSIFR is labeled with a radioactive isotope and used as a signal radioactive compound. Monoclonal antibodies or high titer antiserum are then used in the radioimmunoassay of cc-BSIFR in serum, urine and other body fluids.

В целом, выработка кч-БСИФР усиливается после обработки костных клеток агентами, повышающими пролиферацию костных клеток. Таким образом, кч-БСИФР может применяться как диагностический маркер болезненных состояний, связанных с нарушением пролиферации костных клеток, таких как остеопороз. Соответственно, низкий уровень кч-БСИФР в сыворотке свидетельствует об остеопорозе, связанном с пониженным образованием костной ткани. Поскольку кч-БСИФР усиливает действие ИФР-II, высокое содержание его в сыворотке может быть связано с некоторыми видами рака. In general, the production of cc-BSIFR is enhanced after treatment of bone cells with agents that increase bone cell proliferation. Thus, cc-BSIFR can be used as a diagnostic marker of painful conditions associated with impaired proliferation of bone cells, such as osteoporosis. Accordingly, a low serum cc-BSIFR level indicates osteoporosis associated with reduced bone formation. Since cc-BSIFR enhances the action of IGF-II, its high serum content may be associated with certain types of cancer.

Пример 6. Кч-БСИФР фиксирует ИФР-II в кости
Кость человека содержит относительно большое количество ИФР-II. Однако, как показано в табл. 4, ИФР-II, меченный 125I, сам по себе не связывается специфическим образом с гидроксиапатитом (табл. 4 демонстрирует лишь неспецифическое связывание, которое составляет менее 10% общего количества связанной метки) или коллагеном. В противоположность ИФР-II, меченный кч-БСИФР обнаруживает специфическое связывание с гидроксиапатитом. Связывание кч-БСИФР с гидроксиапатитом является специфическим, поскольку основной сывороточный связывающий белок, т. е. БСИФР-3, не обладает подобной активностью, и кч-БСИФР не связывается с коллагеном, другим составным компонентом кости. Кроме того, связывание кч-БСИФР с гидроксиапатитом является прочным, обработка 4 М гуанидином-HCl приводит к диссоциации комплекса кч-БСИФР-гидроксиапатит (4 М гуанидин-HCl, как было показано, вызывает диссоциацию комплекса антиген - антитело). Преинкубация меченного ИФР-II с кч-БСИФР до переноса на гидроксиапатитную колонку значительно увеличивала его связывание с последней. Это свойство кч-БСИФР облегчать присоединение ИФР-II к гидроксиапатиту является специфическим, в то время как ИФРСБ-3 не обладает таким свойством. Приведенные результаты согласуются с заключением, что при нормальных условиях ИФР-II фиксируется в кости с помощью кч-БСИФР.Example 6. Cch-BSIFR fixes IGF-II in the bone
Human bone contains a relatively large amount of IGF-II. However, as shown in the table. 4, IGF-II labeled 125 I alone does not specifically bind to hydroxyapatite (Table 4 shows only non-specific binding, which is less than 10% of the total amount of bound label) or collagen. In contrast to IGF-II, labeled cc-BSIFR exhibits specific binding to hydroxyapatite. The binding of cc-BSIFR to hydroxyapatite is specific because the main serum binding protein, i.e., BSIF-3, does not have similar activity, and cc-BSIFR does not bind to collagen, another component of the bone. In addition, the binding of cc-BSIFR to hydroxyapatite is strong; treatment with 4 M guanidine-HCl leads to dissociation of the cc-BSIFR-hydroxyapatite complex (4 M guanidine-HCl has been shown to cause dissociation of the antigen-antibody complex). The preincubation of labeled IGF-II with cc-BSIFR before transfer to the hydroxyapatite column significantly increased its binding to the latter. This property of cc-BSIFR to facilitate the attachment of IGF-II to hydroxyapatite is specific, while IFRSB-3 does not have this property. The results are consistent with the conclusion that, under normal conditions, IGF-II is fixed in the bone using cf-BSIFR.

Пример 7. Регуляция выработки БСИФР клетками кости человека in vitro
Чтобы определить, вырабатывают ли костные клетки человека кч-БСИФР in vitro, Нозерн-блоты общей фракции РНК, экстрагированной из бессывороточных культур MG63, TE85, TE89, SaO31 и U2 клеток отеосаркомы человека, гибридизуют с помощью олигонуклеотидной пробы K/N-концевой последовательности кч-БСИФР и с помощью пробы к-ДНК, кодирующей БСИФР-5 (Д-р Shimasaki, La Jolla, CA).Example 7. Regulation of the production of BSIFR by human bone cells in vitro
In order to determine whether human bone cells produce cc-BSIFR in vitro, Northern blots of the total RNA fraction extracted from serum-free cultures of MG63, TE85, TE89, SaO 3 1 and U2 cells of human otosarcoma are hybridized using a K / N-terminal oligonucleotide probe cf-BSIFR sequences and using a c-DNA probe encoding BSIF-5 (Dr. Shimasaki, La Jolla, CA).

Эти исследования показали, что у всех тестированных клеточных линий экспрессируется м-РНК кч-БСИФР. Согласно Вестерн-блоттингу с лигандом, ИФР-I и ИФР-II увеличивают образование кч-БСИФР в клетках U2. Биологическое изучение кч-БСИФР показывает, что этот белок усиливает пролиферативное действие ИФР-II на костные клетки. These studies showed that all tested cell lines expressed m-RNA hs-BSIF. According to Western blotting with a ligand, IGF-I and IGF-II increase the formation of cc-BSIFR in U2 cells. A biological study of cc-BSIFR shows that this protein enhances the proliferative effect of IGF-II on bone cells.

Сообщалось о стимулирующем действии прогестерона на пролиферацию остеобластов человека и образование ИФР-II in vitro. В настоящем эксперименте действие прогестерона на другие компоненты ИФР-регуляторной системы (ИФР-I, БСИФР и ИФР-рецепторы) изучалось на остеобластоподобных клетках остеосаркомы человека линии MG63. Во всех экспериментах клетки MG63 помещали в среду DMEM, содержащую 1% сыворотки теленка, с плотностью 7500 клеток/см2. После инкубации в течение ночи, среду заменяли на бессывороточную, до внесения в нее прогестерона или растворителя (этанола). В ходе эксперимента клетки поочередно инкубировали с 100 нМ прогестерона в течение 0,5; 2; 4 и 6 ч. Нозерн-блоттинг обнаружил повышение уровня м-РНК ИФР-II, ИФР-I, кч-БСИФР и рецептора ИФР-I и ИФР-II в течение 30 мин по сравнению с 6 ч в соответствующих контролях. Уровни м-РНК ингибиторного БСИФР-4, однако, понизились через 30 мин после добавления прогестерона. Отчетливых изменений уровней м-РНК БСИФР-3 не наблюдалось. Таким образом, прогестерон, стероидный гормон, который как оказалось, стимулирует пролиферацию костных клеток человека, увеличивает выработку БСИФР-5 в костных клетках человека. Стимулирующий эффект прогестерона по отношению к пролиферации костных клеток может быть опосредован только возрастающей продукцией ИФР, но также и увеличением экспрессии рецепторов ИФР, увеличением содержания кч-БСИФР (усиливает действие ИФР) и уменьшением образования ингибиторного БСИФР-4.The stimulating effect of progesterone on the proliferation of human osteoblasts and the formation of IGF-II in vitro has been reported. In the present experiment, the effect of progesterone on other components of the IGF regulatory system (IGF-I, BSIF and IGF receptors) was studied on osteoblast-like cells of human osteosarcoma MG63 line. In all experiments, MG63 cells were placed in DMEM medium containing 1% calf serum with a density of 7500 cells / cm 2 . After incubation overnight, the medium was replaced with serum-free, before progesterone or solvent (ethanol) was added to it. During the experiment, cells were alternately incubated with 100 nM progesterone for 0.5; 2; 4 and 6 hours. Northern blotting revealed an increase in the levels of mRNA of IGF-II, IGF-I, cc-BSIF and the receptor of IGF-I and IGF-II for 30 minutes compared to 6 hours in the corresponding controls. Inhibitor BSIF-4 mRNA levels, however, decreased 30 min after the addition of progesterone. No distinct changes in BSIFR-3 mRNA levels were observed. Thus, progesterone, a steroid hormone that, as it turns out, stimulates the proliferation of human bone cells, increases the production of BSIF-5 in human bone cells. The stimulating effect of progesterone in relation to bone cell proliferation can be mediated only by increasing production of IGF, but also by increasing the expression of IGF receptors, increasing the content of cc-BSIF (enhances the effect of IGF) and reducing the formation of inhibitory BSIF-4.

Claims (3)

1. Белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста, имеющий следующие характеристики: выделен из кости человека; молекулярный вес 29 кДа; N-концевая аминокислотная последовательность лей-гли-фен-фен-вал-x-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей, где X не определен; связывает гидроксиаппатит в присутствии 4М гуанидин HCl; связывает инсулин-подобный фактор роста I в пределах 10-8 - 10-10 м; связывает инсулин-подобный фактор роста II в пределах 10-9 - 10-11 М.1. A protein that binds an insulin-like growth factor, having the following characteristics: isolated from human bone; molecular weight 29 kDa; The N-terminal amino acid sequence of lei-gly-phen-phen-val-x-val-glu-pro-asp-asp-lys-ala-ala-lei, where X is not defined; binds hydroxyappatite in the presence of 4M guanidine HCl; binds insulin-like growth factor I within 10 -8 - 10 -10 m; binds insulin-like growth factor II in the range of 10 -9 - 10 -11 M. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста из кости человека и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного начала содержит белок по п. 1. 2. A pharmaceutical composition comprising a protein that binds an insulin-like growth factor from human bone and a pharmaceutically acceptable carrier, characterized in that it contains the protein of claim 1 as an active principle. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит инсулин-подобный фактор роста I или инсулин-подобный фактор роста II. 3. The composition according to claim 2, characterized in that it further comprises an insulin-like growth factor I or insulin-like growth factor II.
RU93058185A 1991-04-19 1992-04-15 Protein binding insulin-like growth factor, pharmaceutical composition RU2114120C1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68835391A 1991-04-19 1991-04-19
US688,353 1991-04-19
US688353 1991-04-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU93058185A RU93058185A (en) 1996-11-10
RU2114120C1 true RU2114120C1 (en) 1998-06-27

Family

ID=24764088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU93058185A RU2114120C1 (en) 1991-04-19 1992-04-15 Protein binding insulin-like growth factor, pharmaceutical composition

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0580752A4 (en)
JP (1) JP2527896B2 (en)
KR (1) KR0129864B1 (en)
AU (1) AU658187B2 (en)
CA (1) CA2107475A1 (en)
CZ (1) CZ283601B6 (en)
FI (1) FI934588A (en)
HU (1) HUT70297A (en)
NO (1) NO933742L (en)
RU (1) RU2114120C1 (en)
WO (1) WO1992018154A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8642037B2 (en) 2001-01-05 2014-02-04 Amgen Fremont Inc. Antibodies to insulin-like growth factor I receptor

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0556344B1 (en) 1991-01-08 2003-08-13 Chiron Corporation New insulin-like growth factor binding protein
US5643867A (en) * 1992-08-26 1997-07-01 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for treating catabolic conditions
US5407913A (en) * 1992-12-03 1995-04-18 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method and composition for systemic treatment of tissue injury
US6124259A (en) * 1993-01-28 2000-09-26 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for treating ophthalmic disorders with IGFBP
CA2195474A1 (en) * 1994-07-20 1996-02-01 Cedo Martin Bagi Igf/igfbp complex for promoting bone formation and for regulating bone remodeling
PT1486565E (en) 1995-10-11 2008-02-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Combination of pdgf, kgf, igf, and igfbp for wound healing
US10212614B2 (en) * 2015-12-31 2019-02-19 Facebook, Inc. Igniting network nodes in a multi-hop wireless network
CN108699127A (en) * 2015-12-31 2018-10-23 西门子医疗保健诊断公司 Non-recombinant actrapid monotard-like growth factor binding protein concentrate

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7907958A (en) * 1979-10-30 1981-06-01 Wijn Adriaan Jacques De CART OR FRAME FITTED WITH FOLDING WHEELS.
IL68218A (en) * 1983-03-23 1985-12-31 Univ Ramot Compositions for cartilage repair comprising embryonal chondrocytes
DE3851776T2 (en) * 1987-04-28 1995-05-04 Boehringer Mannheim Gmbh Use of IGF-II for the treatment of bone diseases.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, v. 86, p. 8338 - 8342, 1989. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8642037B2 (en) 2001-01-05 2014-02-04 Amgen Fremont Inc. Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US9234041B2 (en) 2001-01-05 2016-01-12 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor I receptor

Also Published As

Publication number Publication date
JPH06501270A (en) 1994-02-10
HUT70297A (en) 1995-09-28
WO1992018154A1 (en) 1992-10-29
EP0580752A1 (en) 1994-02-02
CZ219093A3 (en) 1994-12-15
FI934588A0 (en) 1993-10-18
AU658187B2 (en) 1995-04-06
AU1784492A (en) 1992-11-17
FI934588A (en) 1993-10-18
EP0580752A4 (en) 1994-08-24
NO933742L (en) 1993-10-18
HU9302942D0 (en) 1994-01-28
CA2107475A1 (en) 1992-10-20
CZ283601B6 (en) 1998-05-13
KR0129864B1 (en) 1998-04-09
JP2527896B2 (en) 1996-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wolf et al. Antibodies against transforming growth factor-beta 1 suppress intimal hyperplasia in a rat model.
EP0494264B1 (en) Inhibiting transforming growth factor to prevent accumulation of extracellular matrix
JP2648951B2 (en) Human somatomedin carrier protein subunits and methods for their production
US5811393A (en) Heparin binding mitogen with homology to epidermal growth factor (EGF)
EP0369943A1 (en) Binding protein for insulin-like growth factors
JPH07504650A (en) Inhibition of transforming growth factor β to prevent extracellular matrix accumulation
JPH05506030A (en) How to predispose mammals to promote tissue repair
JPH04235135A (en) Drug composition
US7795215B2 (en) MNTF peptides and compositions and methods of use
Perkel et al. Human prostatic cancer cells, PC3, elaborate mitogenic activity which selectively stimulates human bone cells
US4980279A (en) Cellular fibronectin: polypeptides, anti-polypeptide antibodies and assay methods
RU2114120C1 (en) Protein binding insulin-like growth factor, pharmaceutical composition
EMOTO et al. Identification and characterization of basic fibroblast growth factor in porcine thyroids
Phillips et al. Nutrition and somatomedin. XI. Studies of somatomedin inhibitors in rats with streptozotocin-induced diabetes
WO1998004245A1 (en) Use of transglutaminase modulators to promote wound healing
Eisenstein et al. Growth inhibitory activities in avascular tissues are recognized by anti-transforming growth factor β antibodies
JPH07103156B2 (en) Osteogenic growth polypeptides identified from regenerated bone marrow
JP2004008027A (en) New peptide having camp-producing activity
WO1999049894A1 (en) Antagonists to growth arrest specific gene 6 to treat insulin-resistant disorders
US5693754A (en) Inhibitory binding protein for insulin-like growth factors
EP0771877A1 (en) Gene coding for modified bone morphogenic protein receptor
CA1295940C (en) Therapeutic treatment of abnormal cell growth with follicle regulatoryprotein
US20060153830A1 (en) Proteases from Carica having mitogenic activity and their methods of use
US20030223984A1 (en) Proteases from carica having mitogenic activity and their methods of use
AU2079900A (en) Inhibiting transforming growth factor beta to prevent accumulation of extracellular matrix