RU2112798C1 - Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing - Google Patents
Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2112798C1 RU2112798C1 RU96107918/13A RU96107918A RU2112798C1 RU 2112798 C1 RU2112798 C1 RU 2112798C1 RU 96107918/13 A RU96107918/13 A RU 96107918/13A RU 96107918 A RU96107918 A RU 96107918A RU 2112798 C1 RU2112798 C1 RU 2112798C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- medium
- pseudomonas putida
- culturing
- soluble agent
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и касается нового штамма и питательной среды, в которой он способен утилизировать мелассу или этанол с образованием эмульгирующего, поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано для повышения нефтеотдачи пластов, очистки окружающей среды. The invention relates to biotechnology and microbiology and relates to a new strain and a nutrient medium in which it is able to utilize molasses or ethanol with the formation of an emulsifying, surfactant that can be used to increase oil recovery, cleaning the environment.
Цель изобретения - новый штамм бактерий, синтезирующий на минеральной среде с мелассой или этанолом, внеклеточный нефтерастворимый агент, не требующий его выделения из культуральной жидкости, и питательная среда для его культивирования. The purpose of the invention is a new strain of bacteria synthesizing on a mineral medium with molasses or ethanol, an extracellular oil-soluble agent that does not require its isolation from the culture fluid, and a nutrient medium for its cultivation.
Ps. putida ВКПМ В-6641 был выделен по способности образовывать стойкую газонефтяную пену в отличие от других продуцентов эмульгаторов и био ПАВ, в том числе и от Ps.fluorescens [1], продуцирующего эмульгатор. По сравнению со штаммом, описанным в АС, заявляемый штамм может быть использован для повышения нефтеотдачи пластов в сухом виде после высушивания культуральной жидкости при 80oC, не теряя при этом своих активных свойств.Ps. putida VKPM B-6641 was isolated by its ability to form stable gas-oil foam unlike other producers of emulsifiers and bio-surfactants, including Ps.fluorescens [1], which produces an emulsifier. Compared with the strain described in AS, the inventive strain can be used to increase oil recovery in dry form after drying the culture fluid at 80 o C, without losing its active properties.
Штамм бактерий Ps.putida ВКПМ В-6641 выделен из нефтезагрязненной почвы. The bacterial strain Ps.putida VKPM B-6641 isolated from oil-contaminated soil.
Выделенный штамм проверен на активность при хранении и пересевах на неселективные среды. The isolated strain was tested for activity during storage and reseeding on non-selective media.
Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 имеет следующую характеристику. Strain Ps.putida VKPM B-6641 has the following characteristics.
Культурально-морфологические признаки. Cultural and morphological characters.
Среда для хранения - мясо-пептонный агар с 1% глюкозы (МПА с глюкозой). На твердой среде МПА с глюкозой образует бежевые неправильной формы пуповидные колонии, а на жидкой - мутный рост. Клетки прямые или слегка изогнутые, грамотрицательные, спор не образуют. На среде КингА и КингБ флюоресцирующий пигмент не образуется. Длина клеток на МПА с глюкозой 2-4 мкм, ширина 0,7-1 мкм. Storage medium - meat-peptone agar with 1% glucose (MPA with glucose). On a solid medium, MPA with glucose forms beige irregularly shaped umbilical colonies, and on a liquid medium, cloudy growth. Cells are straight or slightly curved, gram-negative, do not form spores. On the environment of KingA and KingB fluorescent pigment is not formed. The length of the cells on MPA with glucose 2-4 microns, a width of 0.7-1 microns.
Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.
Аэроб. Температурные пределы 10-40oC, оптимум для роста 28-30oC, пределы pH 4,5-8,5; оптимум pH 6,8-7,2. Крахмал не гидролизует. Обладает оксидазной активностью. Источниками углерода для роста являются глюкоза, глицерин, этанол, нефть, гудрон. Не утилизирует сахарозу, масло трансформаторное, масло подсолнечное, метанол, гексадекан. Не восстанавливает нитраты.Aerobe. Temperature limits 10-40 o C, optimum for growth 28-30 o C, pH limits 4.5-8.5; optimum pH is 6.8-7.2. Starch does not hydrolyze. It has oxidase activity. Sources of carbon for growth are glucose, glycerin, ethanol, oil, tar. It does not utilize sucrose, transformer oil, sunflower oil, methanol, hexadecane. Does not restore nitrates.
Штамм не патогенен. The strain is not pathogenic.
Синтез внеклеточного нефтерастворимого агента штаммом Ps.putida ВКПМ В-6641 происходит на простых синтетических средах, не содержащих каких-либо индукторов. Предпочтительным источником азота являются соли аммония. The synthesis of an extracellular oil-soluble agent by the strain Ps.putida VKPM B-6641 occurs on simple synthetic media that do not contain any inductors. A preferred source of nitrogen is ammonium salts.
Кратковременное хранение штамма осуществляется в полужидких столбиках МПА с глюкозой под слоем вазелинового масла при 4-6oC. По истечении 4-6 мес. желателен пересев на свежие среды МПА с глюкозой. Для более длительного хранения штамм хранят в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах с 10%-ной сахарозой в качестве криопротектора.Short-term storage of the strain is carried out in semi-liquid columns of MPA with glucose under a layer of liquid paraffin at 4-6 o C. After 4-6 months. reseeding on fresh MPA media with glucose is desirable. For longer storage, the strain is stored in a lyophilized state in sealed ampoules with 10% sucrose as a cryoprotectant.
Штамм Ps. putida ВКПМ В-6641 способен через 18-21 ч и 36-48 ч культивирования в среде с мелассой или этанолом синтезировать нефтерастворимый агент в количестве 14 и 8 г/л по сухому весу соответственно. Меласса, используемая в качестве единственного источника углерода и энергии, потребляется за это время на 95%. Strain Ps. putida VKPM B-6641 is able, after 18-21 hours and 36-48 hours of cultivation in a medium with molasses or ethanol, to synthesize an oil-soluble agent in an amount of 14 and 8 g / l by dry weight, respectively. Molasses, used as the sole source of carbon and energy, is consumed during this time by 95%.
Внеклеточный нефтерастворимый агент из фильтрата культуральной жидкости осаждают этиловым спиртом в отношении 1:4. An extracellular oil-soluble agent from the filtrate of the culture fluid is precipitated with ethyl alcohol in a ratio of 1: 4.
Высушенная при 80oC культуральная жидкость (препарат "Псевдопол") обладает поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами при последующем ресуспендировании.Dried at 80 o C the culture fluid (the drug "Pseudopol") has surface-active and emulsifying properties with subsequent resuspension.
По литературным данным питательные среды, применяемые для бактерий рода Pseudomonas в качестве сред для продуцирования биосурфактантов, непригодны для штамма Ps.putida ВКПМ В-6641 продуцента внеклеточного нефтерастворимого агента [1]. According to published data, nutrient media used for bacteria of the genus Pseudomonas as media for the production of biosurfactants are not suitable for the strain Ps.putida VKPM B-6641 producer of an extracellular oil-soluble agent [1].
Нами был проведен скрининг питательных сред для продуцирования штаммом Ps. putida ВКПМ В-6641 нефтерастворимого агента. Например, Ps.putida ВКПМ В-6641 не растет на питательной среде для культивирования Ps.fluorescens-продуцента эмульгатора [2] , и только заявляемая среда, содержащая мелассу или этанол в качестве источника углерода и энергии и минеральные соли, пригодна для культивирования данного штамма с целью получения активного агента в фильтрате культуральной жидкости. We conducted a screening of culture media for the production of strain Ps. putida VKPM B-6641 oil-soluble agent. For example, Ps.putida VKPM B-6641 does not grow on a culture medium for cultivation of a Ps.fluorescens-producer emulsifier [2], and only the claimed medium containing molasses or ethanol as a source of carbon and energy and mineral salts is suitable for the cultivation of this strain in order to obtain the active agent in the filtrate of the culture fluid.
Свойства штамма синтезировать нефтерастворимый агент подтверждаются примерами. The properties of the strain to synthesize an oil-soluble agent are confirmed by examples.
Пример 1. Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 выращивают в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода технический этанол, состав среды, г/л, водопроводной воды: K2HPO4 4,3; KH2PO4 3,4; (NH4)2SO4 4; MgSO4 0,5; CaCO3 0,3; NaCl 5; KCl 0,2; этанол - 20; pH 7,0-7,2. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 36-48 ч. После 36-48 ч культивирования при 28 - 30oC в колбах на 750 мл, объем среды в колбе 100 мл, на качалке, дающей 200 об/мин, определяют эмульгирующие и поверхностно-активные свойства культуральной жидкости до и после высушивания при 80oC, а нефтерастворимый агент выделяют из культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом.Example 1. The strain Ps.putida VKPM B-6641 is grown in a mineral medium containing technical ethanol as a carbon source, medium composition, g / l, tap water: K 2 HPO 4 4.3; KH 2 PO 4 3.4; (NH 4 ) 2 SO 4 4; MgSO 4 0.5; CaCO 3 0.3; NaCl 5; KCl 0.2; ethanol - 20; pH 7.0-7.2. Sterilization at 1 atm. 20 minutes. The medium is inoculated with a culture grown for 36-48 hours. After 36-48 hours of cultivation at 28 - 30 ° C in 750 ml flasks, the volume of medium in the flask is 100 ml, on a rocking chair giving 200 rpm, emulsifying and surface - the active properties of the culture fluid before and after drying at 80 o C, and the oil-insoluble agent is isolated from the culture fluid by precipitation with ethyl alcohol.
Выход нефтерастворимого агента из расчета на сухой вес 8 г/л. The output of the oil-soluble agent based on the dry weight of 8 g / l.
Пример 2. Штамм Ps.putida ВКПМ В-6641 выращивают в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода мелассу. Состав среды, г/л, водопроводной воды: K2HPO4 4,3; KH2PO4 3,4; (NH4)2SO4 4; MgSO4 0,5; CaCO3 0,3; NaCl 5; KCl 0,2; меласса 20; pH 7,0 - 7,2. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 36-48 ч. После 18-21 ч культивирования при 28-30oC в колбах на 750 мл, объем среды в колбе 100 мл, на качалке, дающей 200 об/мин, определяют эмульгирующие и поверхностно-активные свойства культуральной жидкости до и после высушивания при 80oC. Выход нефтерастворимого агента из расчета на сухой вес 14 г/л.Example 2. The strain Ps.putida VKPM B-6641 is grown in a mineral medium containing molasses as a carbon source. The composition of the medium, g / l, tap water: K 2 HPO 4 4,3; KH 2 PO 4 3.4; (NH 4 ) 2 SO 4 4; MgSO 4 0.5; CaCO 3 0.3; NaCl 5; KCl 0.2; molasses 20; pH 7.0 - 7.2. Sterilization at 1 atm. 20 minutes. The medium is inoculated with a culture grown for 36-48 hours. After 18-21 hours of cultivation at 28-30 ° C in 750 ml flasks, the volume of medium in the flask is 100 ml, on a rocking chair giving 200 rpm, emulsifying and superficial -active properties of the culture fluid before and after drying at 80 o C. The output of oil-soluble agent based on dry weight of 14 g / l.
Определение эмульгирующей активности культуральной жидкости и фильтрата. Determination of emulsifying activity of the culture fluid and filtrate.
Эмульгирующую активность определяют методом пробирочной пробы [3] по способности исследуемой жидкости эмульгировать н-алканы следующим образом. В пробирку с делениями на 25 мл вносят 5 мл пентадекана или гексадекана и 5 мл исследуемой жидкости. Смесь интенсивно встряхивают вручную в течение 2 мин. Эмульгирующую активность определяют измерением высоты образовавшейся эмульсии через 24 ч и выражают в %. Она составляет 50-60%. Emulsifying activity is determined by the method of test tubes [3] by the ability of the test fluid to emulsify n-alkanes as follows. 5 ml of pentadecane or hexadecane and 5 ml of the test fluid are added to a 25 ml test tube. The mixture is shaken vigorously by hand for 2 minutes. Emulsifying activity is determined by measuring the height of the emulsion formed after 24 hours and is expressed in%. It is 50-60%.
Поверхностную активность определяют тестом нестабильности капель на гидрофобной поверхности [4]. В каплю дистиллированной воды на полиэтиленовой пленке вносят на кончике микробиологической иглы культуральную жидкость или фильтрат, перемешивают. При наличии поверхностно-активного вещества капля воды теряет стабильность, т. е. растекается. Культуральная жидкость и фильтрат содержат поверхностно-активное вещество, так как капля дистиллированной воды растекается на полиэтиленовой пленке при соприкосновении с ними. Surface activity is determined by the instability test of drops on a hydrophobic surface [4]. At a tip of a microbiological needle, a culture liquid or filtrate is added to a drop of distilled water on a plastic film and mixed. In the presence of a surfactant, a drop of water loses stability, i.e., spreads. The culture fluid and the filtrate contain a surfactant, since a drop of distilled water spreads on a plastic film in contact with them.
Источники информации. Sources of information.
1. АС СССР 1472496, Бюл.N 14, 1989. 1. AS of the USSR 1472496, Bull. N 14, 1989.
2. АС СССР 1565885, Бюл.N 19, 1990. 2. USSR AS 1565885, Bull.N 19, 1990.
3. Cooper, D.G., C.N.Liss, R.Londay and J.E.Zajic, 1981. Surface activity of Mycobacterium and Preudomonas. J.Ferment. Technol. 59, N 2, 97-101. 3. Cooper, D.G., C.N. Liss, R.Londay and J.E. Zajic, 1981. Surface activity of Mycobacterium and Preudomonas. J. Ferment. Technol. 59, N 2, 97-101.
4. Person A., Molin G., 1987. Capacity for biosurfactant production of environmental Pseudomonas and Vibronaceae growing on carbohydrates. Appl.Microbiol.and Biotechnol. 26, N 5, 439-442. 4. Person A., Molin G., 1987. Capacity for biosurfactant production of environmental Pseudomonas and Vibronaceae growing on carbohydrates. Appl. Microbiol.and Biotechnol. 26, N 5, 439-442.
Claims (2)
Источники углерода - меласса или этанол - 10 - 20
K2HPO4 - 2,0 - 4,8
KH2PO4 - 1,5 - 4,0
(NH4)2SO4 - 0,5 - 4,0
MgSO4 - 0,2 - 0,5
CaCO3 - 0,3 - 3,0
NaCl - 1,0 - 5,0
KCl - 0,1 - 0,5
Вода - Остальное2. Nutrient medium for the cultivation of the bacterial strain Pseudomonas putida VKPM B-6641, characterized in that it contains components in the following quantitative ratio, g / l:
Sources of carbon - molasses or ethanol - 10 - 20
K 2 HPO 4 - 2.0 - 4.8
KH 2 PO 4 - 1.5 - 4.0
(NH 4 ) 2 SO 4 - 0.5 - 4.0
MgSO 4 - 0.2 - 0.5
CaCO 3 - 0.3 - 3.0
NaCl - 1.0 - 5.0
KCl - 0.1 - 0.5
Water - Else
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96107918/13A RU2112798C1 (en) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96107918/13A RU2112798C1 (en) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2112798C1 true RU2112798C1 (en) | 1998-06-10 |
| RU96107918A RU96107918A (en) | 1998-08-10 |
Family
ID=20179667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96107918/13A RU2112798C1 (en) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2112798C1 (en) |
-
1996
- 1996-04-19 RU RU96107918/13A patent/RU2112798C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Raymond | Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons,(Volume 2). | |
| US4814272A (en) | Process for the biotechnical production of rhamnolipids including rhamnolipids with only one β-hydroxydecanoic acid residue in the molecule | |
| Abouseoud et al. | Biosurfactant production from olive oil by Pseudomonas fluorescens | |
| US5395919A (en) | Poly-β-hydroxy alkanoate (PHA) copolymer, method of its production, the microbe which produces it, and PHA copolymer blend | |
| US3960832A (en) | Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation | |
| SU673185A3 (en) | Protein producing method | |
| US5096819A (en) | Hyperproduction of poly-β-hydroxybutyrate during exponential growth by mutant strains of Azotobacter vinelandii | |
| US4634667A (en) | Process for preparing a heteropolysaccharide, heteropolysaccharide obtained thereby, its use, and strain NCIB 11883 | |
| RU2112798C1 (en) | Strain of bacterium pseudomonas putida producing extracellular petroleum-soluble agent and nutrient medium for its culturing | |
| US4355109A (en) | Microbiological production of novel biosurfactants | |
| US4689160A (en) | Acid stable heteropolysaccharide s-421 | |
| Rashedi et al. | Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa growing on carbon sources | |
| Kato et al. | Protease formation by a marine psychrophilic bacterium | |
| US5288618A (en) | Polysaccharide composition and process for preparing same | |
| US4106986A (en) | Manufacture of epoxide using a microorganism | |
| Goresline | Studies of agar-digesting bacteria | |
| US4048013A (en) | Process for producing single-cell protein from methanol using methylomonas sp. DSM 580 | |
| JPS5849232B2 (en) | Nutrient liquid composition and method for culturing microorganisms in a hydrophobic medium using the same | |
| SU1449581A1 (en) | Strain of alcaligenes paradoxus bacteria as producer of catechol-1,2-oxygenase | |
| SU1472496A1 (en) | Strain of pseudomonas fluorescens bacteria synthesizing off-cell emulsifier | |
| KR100495272B1 (en) | Non-pigment mutant, m10356 of Hahella chjuensis 96CJ10356 and method for preparation of extracellular polysaccharide therefrom | |
| RU2211861C1 (en) | Strain of bacterium bacillus subtilis as producer of thermo- and biostable surface-active substance | |
| US3322646A (en) | Method for preparing l-glutamic acid | |
| RU2717025C1 (en) | Strain rhodococcus erythropolis ho-ks22, having high urease activity, capable of generation of an oil-displacing agent bio-surfactant in an oil reservoir | |
| RU2116145C1 (en) | Method of preparing biological preparation to remove petroleum and petroleum products from environmental objects |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050420 |