RU2109748C1

RU2109748C1 - Method of angiogenine isolation

Info

Publication number: RU2109748C1
Application number: RU96124514A
Authority: RU
Inventors: И.А. Рогов; А.М. Шалыгина; Г.С. Комолова; А.М. Михайлов; Н.А. Тихомирова
Original assignee: Московский государственный университет прикладной биотехнологии
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 1998-04-27

Abstract

FIELD: biotechnology, dairy, medicinal and pharmaceutical industries. SUBSTANCE: cow milk is used for isolation of angiogenine. Raw is purified by centrifugation, proteins are sorbed on ion-exchange resin and protein fractions are eluted at wavelength 280 nm at optical value above 0.1. Then dialysis and ion-exchange chromatography are carried out. Fraction containing angiogenine are identified, combined and hydrophobic chromatography is carried out. Then eluates are desalted and concentrated and obtained angiogenine is stabilized by ammonium sulfate. EFFECT: simple, effective and cheap method of isolation. 2 cl

Description

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к способам выделения биологически активных препаратов. The invention relates to the dairy, biotechnological, medical and pharmaceutical industries, and in particular to methods for isolating biologically active preparations.

Известен способ выделения ангиогенина из культуральной среды клеток НТ-29 [1]. A known method for the isolation of angiogenin from the culture medium of NT-29 cells [1].

Однако выход ангиогенина составляет около 0,5 мкг/л, поэтому для получения ангиогенина данный источник является неэффективным. However, the yield of angiogenin is about 0.5 μg / l; therefore, this source is ineffective for producing angiogenin.

Также известен способ выделения ангиогенина из плазмы или сыворотки крови. Бычья кровь собирается в пластиковый сосуд, очищается центрифугированием и замораживается при минус 20^oC. После очистки на ватмановском стеклянном микроскопическом фильтре плазму пропускают через СМ-52 катионобменную смолу. Переносят в колонку диаметром 2,50 мм и элюируют буфером. Фракцию, содержащую ангиогенин, обозначают "СМ 2". Фракцию концентрируют ультрафильтрацией. Второй этап очистки проводят моно-S катион-обменной хроматографией. На основе конкурентной пробы проводится отбор проб, содержащих ангиогенин. Объединенную фракцию направляют на высокожидкостную хроматографию. Третий этап очистки проводится на HPLC колонках размером 4,6 мм х 250 мм (Synchrom. Inc. ). Выход чистого биологически активного ангиогенина составляет 30-80 мг/л плазмы или сыворотки [2].A method for isolating angiogenin from plasma or blood serum is also known. Bovine blood is collected in a plastic vessel, purified by centrifugation and frozen at minus 20 ^o C. After cleaning on a Whatman glass microscopic filter, the plasma is passed through a SM-52 cation exchange resin. Transfer to a 2.50 mm diameter column and elute with buffer. The fraction containing angiogenin is designated “CM 2”. The fraction was concentrated by ultrafiltration. The second purification step is carried out by mono-S cation exchange chromatography. Based on a competitive sample, samples containing angiogenin are sampled. The combined fraction is sent to high-liquid chromatography. The third stage of cleaning is carried out on HPLC columns measuring 4.6 mm x 250 mm (Synchrom. Inc.). The yield of pure biologically active angiogenin is 30-80 mg / l of plasma or serum [2].

Недостаток этого способа - использование дорогостоящей аппаратуры (HPLC), длительность и многоэтапность очистки. The disadvantage of this method is the use of expensive equipment (HPLC), the duration and multi-stage cleaning.

Задачей изобретения является разработка простого, эффективного и дешевого способа выделения ангиогенина. The objective of the invention is to develop a simple, effective and cheap way to isolate angiogenin.

Это достигается тем, что предлагаемый способ предусматривает очистку от жировой фракции, сорбцию белков, хроматографическое их разделение, определение фракций, содержащих ангиогенин. При этом в качестве сырья для выделения ангиогенина используют биологическую жидкость, продуцируемую молочной железой млекопитающих, например коровье молоко. Очистку сырья осуществляют центрифугированием, сорбцию белков проводят ионообменной хроматографией, элюируют фракции белка с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед. После диализа белки фракционируют хроматографией на сорбенте СМ Toyopearl 650 S (ионообменная хроматография). Определяют фракции, содержащие ангиогенин. Объединяют их и наносят для дальнейшей очистки на хроматографическую колонку с сорбентом Butyl-Toyopearl 650 S (гидрофобная хроматография). В результате получают фракции белка, представленные чистым ангиогенином. После обессоливания и концентрирования диализом белок ангиогенина стабилизируют добавлением сульфата аммония. This is achieved by the fact that the proposed method involves purification from the fat fraction, sorption of proteins, their chromatographic separation, determination of fractions containing angiogenin. Moreover, as a raw material for the isolation of angiogenin, biological fluid produced by mammary mammary gland, for example, cow's milk, is used. Raw materials are purified by centrifugation, sorption of proteins is carried out by ion-exchange chromatography, protein fractions with an optical density at a wavelength of 280 nm of more than 0.1 units are eluted. After dialysis, proteins are fractionated by chromatography on a Toyopearl 650 S CM sorbent (ion exchange chromatography). Fractions containing angiogenin are determined. Combine them and apply for further purification on a chromatographic column with a sorbent Butyl-Toyopearl 650 S (hydrophobic chromatography). The result is protein fractions represented by pure angiogenin. After desalination and dialysis concentration, the angiogenin protein is stabilized by the addition of ammonium sulfate.

Разработан простой 3-х этапный метод получения молочного ангиогенина, исключающий обычно используемую для получения ангиогенина из биологических жидкостей хроматографию высокого давления с применением дорогостоящей аппаратуры. Впервые для хроматографической очистки ангиогенина применены сорбенты CM-Toyopearl 650 S и Butyl- Toyopearl 650 S. A simple 3-stage method for producing milk angiogenin has been developed, which excludes high pressure chromatography commonly used to obtain angiogenin from biological fluids using expensive equipment. For the first time, chromatographic purification of angiogenin was carried out using CM-Toyopearl 650 S and Butyl-Toyopearl 650 S sorbents.

Условия проведения ионообменной и гидрофобной хроматографии на этих сорбентах определены с учетом их свойств и свойств ангиогенина. На этапе хроматографической очистки на CM-Toyopearl 650 S белки элюировали 100 мл 0,05 M трис- HCl, pH 8,3 с градиентом концентраций NaCl от 0,05 до 3 M. Условия гидрофобной хроматографии на Butyl- Toyopearl 650 S: элюция 100 мл 0,05 M К-фосфатным буфером, pH 7,0 с градиентом концентрации сульфата аммония от 2 до О M. The conditions for ion-exchange and hydrophobic chromatography on these sorbents are determined taking into account their properties and the properties of angiogenin. In the chromatographic purification step on CM-Toyopearl 650 S, the proteins were eluted with 100 ml 0.05 M Tris-HCl, pH 8.3 with a gradient of NaCl concentrations from 0.05 to 3 M. Hydrophobic chromatography conditions on Butyl-Toyopearl 650 S: elution 100 ml of 0.05 M K-phosphate buffer, pH 7.0 with a concentration gradient of ammonium sulfate from 2 to O M.

В процессе хроматографической очистки для идентификации ангиогенина в белковых фракциях, наряду с ранее используемыми для этой цели показателями, введен экспресс-тест, основанный на субстратной специфичности ангиогенина (учитывалась величина отношения РНКазной активности белка относительно РНК и полиуридиловой или полицитидиловой кислоты). На этапе ионообменной хроматографии ангиогенин элюируется с колонки при концентрациях NaCl 0,12-0,14 M, а на конечном этапе очистки на Butyl-Toyopearl 650 S при концентрациях сульфата аммония 1,5- 1,6 M. Очищенный ангиогенин электрофоретически чистый, обладает характерной для ангиогенина ферментативной и биологической активностью относительно тканей животных. In the course of chromatographic purification, for the identification of angiogenin in protein fractions, along with the indicators previously used for this purpose, an express test was introduced based on the substrate specificity of angiogenin (the ratio of the RNAse activity of the protein relative to RNA and polyuridyl or polycytidylic acid was taken into account). At the stage of ion-exchange chromatography, angiogenin is eluted from the column at NaCl concentrations of 0.12-0.14 M, and at the final stage of purification on Butyl-Toyopearl 650 S at concentrations of ammonium sulfate 1.5-1.6 M. Purified angiogenin is electrophoretically pure, possesses enzymatic and biological activity characteristic of angiogenin relative to animal tissues.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Ангиогенинсодержащее сырье, а именно биологические жидкости, продуцируемые молочной железой млекопитающих, например коровье молоко, подвергают центрифугированию, проводят сорбцию белков молока на ионообменнике. Целлюлозу отделяют и жидкую фракцию переносят на колонку. Промывают буфером и элюируют. Все фракции с оптической плотностью A₂₈₀ > 0,1_ед объединяют и проводят диализ. Выпавший при диализе осадок удаляют центрифугированием и диализат наносят для ионообменной хроматографии на колонку с сорбентом СМ-Toyopearl 650 S ("Tosoh", Япония), элюируют буфером, собирают фракции объемом 3 мл и определяют в них содержание белка по Лоури.Angiogenin-containing raw materials, namely biological fluids produced by mammalian mammary glands, for example, cow's milk, are centrifuged, and sorption of milk proteins on an ion exchanger. The cellulose is separated and the liquid fraction is transferred to a column. Wash with buffer and elute. All fractions with an optical density of A ₂₈₀ > 0.1 _units are combined and dialyzed. The precipitate formed during dialysis is removed by centrifugation and the dialysate is applied for ion exchange chromatography on a CM-Toyopearl 650 S sorbent column (Tosoh, Japan), elute with buffer, 3 ml fractions are collected, and the Lowry protein content is determined in them.

Дальнейшая очистка ангиогенина осуществляется гидрофобной хроматографией на Butyl-Toyopearl 650 S. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют, обессоливают и концентрируют диализом. Выделенный ангиогенин стабилизируют сульфатом аммония. Further purification of angiogenin is carried out by hydrophobic chromatography on Butyl-Toyopearl 650 S. Fractions containing angiogenin are combined, desalted and concentrated by dialysis. Isolated angiogenin is stabilized with ammonium sulfate.

Полученный препарат ангиогенина проверяют на ферментативную и биологическую активность по методике Комоловой. The resulting preparation of angiogenin is checked for enzymatic and biological activity according to Komolova’s method.

Пример 1. Коровье молоко в количестве 3 л подвергается центрифугированию, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом КМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₈₀ > 0,1. Диализируют против буфера и полученный диализат наносят на колонку с сорбентом CM-Toyopearl 650 S (Tosoh, Япония). Элюируют буфером и в полученных фракциях определяют содержание белка по Лоури. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют и дальнейшую очистку ангиогенина осуществляют гидрофобной хроматографией на сорбенте Butyl-Toyoperl 650 S, обессоливают диализом. Полученный ангиогенин стабилизируют добавлением сульфата аммония. В результате выделения из 3 л коровьего молока выход биологически активного ангиогенина составил 3,27 мг.Example 1. Cow's milk in an amount of 3 l is subjected to centrifugation, then a skimmed fraction is applied to a column with a KM-cellulose sorbent and ion exchange chromatography is carried out, elute, collecting fractions with A ₂₈₀ > 0.1. Dialyze against buffer and the resulting dialysate is applied to a CM-Toyopearl 650 S sorbent column (Tosoh, Japan). Elute with buffer and determine the protein content according to Lowry in the obtained fractions. Fractions containing angiogenin are combined and further purification of angiogenin is carried out by hydrophobic chromatography on a sorbent Butyl-Toyoperl 650 S, desalted by dialysis. The resulting angiogenin is stabilized by the addition of ammonium sulfate. As a result of isolation from 3 l of cow's milk, the yield of biologically active angiogenin was 3.27 mg.

Пример 2. Козье молоко в количестве 1 л подвергается центрифугированию, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом КМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₈₀ > 0,1. Диализируют против буфера и полученный диализат наносят на колонку с сорбентом CM-Toyopearl 650 S (Tosoh, Япония). Элюируют буфером. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют и дальнейшую очистку ангиогенина осуществляют гидрофобной хроматографией на сорбенте Butyl-Toyoperl 650 S, обессоливают диализом. Полученный ангиогенин стабилизируют добавлением сульфата аммония. В результате выделения из 1 л козьего молока выход ангиогенина составил 0,27 мг.Example 2. Goat milk in an amount of 1 liter is subjected to centrifugation, then a skimmed fraction is applied to a column with KM-cellulose sorbent and ion-exchange chromatography is carried out, elute, collecting fractions with A ₂₈₀ > 0.1. Dialyze against buffer and the resulting dialysate is applied to a CM-Toyopearl 650 S sorbent column (Tosoh, Japan). Elute with buffer. Fractions containing angiogenin are combined and further purification of angiogenin is carried out by hydrophobic chromatography on a sorbent Butyl-Toyoperl 650 S, desalted by dialysis. The resulting angiogenin is stabilized by the addition of ammonium sulfate. As a result of isolation from 1 liter of goat milk, the yield of angiogenin was 0.27 mg.

Таким образом, предлагаемый способ исключает использование дорогостоящей аппаратуры и при этом обеспечивает высокий выход биологически и ферментативно активного препарата ангиогенина. Thus, the proposed method eliminates the use of expensive equipment and at the same time provides a high yield of biologically and enzymatically active preparation of angiogenin.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе заявки. Sources of information taken into account during the examination of the application.

1. Fett J.W., Strydom D.L., Lobb R.R., Alderman E.M., Bethune J.I., Riordan Y.F., Vallee B.L. Isolation and chasactesization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry, V 24, N 20, p. 5480-5486, 1985. 1. Fett J.W., Strydom D.L., Lobb R.R., Alderman E.M., Bethune J.I., Riordan Y.F., Vallee B.L. Isolation and chasactesization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry, V 24, N 20, p. 5480-5486, 1985.

2. Bond M.D., Vallee B.L. Isolation of bovine angiogenin using a placental ribonuclease inhibitor binding ussag. Biochemistry, V 27, N 17, p. 6282-6287, 1988. 2. Bond M.D., Vallee B.L. Isolation of bovine angiogenin using a placental ribonuclease inhibitor binding ussag. Biochemistry, V 27, N 17, p. 6282-6287, 1988.

Claims

1. The method of isolation of angiogenin, including purification of raw materials from the fat fraction, sorption of proteins, chromatographic separation, determination of fractions containing angiogenin, characterized in that the biological fluid produced by mammary mammary gland is used as raw material, purification from the fat fraction is carried out by centrifugation, sorption of proteins is carried out on an ion exchanger, fractions of a protein with optical density at a wavelength of 280 nm more than 0.1 units are eluted, then dialysis is carried out, chromatographic separation is carried out After ion fractions containing angiogenin are determined, they are combined, then hydrophobic chromatography with a Butyl Toyopearl 650 S sorbent is carried out, desalted and concentrated by dialysis, and the resulting angiogenin is stabilized with ammonium sulfate.

2. The method according to claim 1, characterized in that as the biological fluid produced by the mammary mammary gland, use cow's milk.