RU210524U1

RU210524U1 - DEVICE FOR EXPRESS DETERMINATION OF SURFACE WATER TOXICITY

Info

Publication number: RU210524U1
Application number: RU2021132458U
Authority: RU
Inventors: Вячеслав Алексеевич Арляпов; Роман Владимирович Лепикаш; Анастасия Сергеевна Медведева; Анна Сергеевна Харькова
Priority date: 2021-11-08
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2022-04-19

Abstract

Полезная модель относится к области экологии, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для экспресс-анализа поверхностных вод. Техническим результатом является улучшение характеристик устройства, в частности увеличение чувствительности биорецепторного элемента к токсикантам и сокращение времени единичного измерения. Устройство для экспресс-определения токсичности поверхностных вод, характеризующееся тем, что содержит измерительную кювету с буферным раствором, содержащую хлорид-серебряный электрод сравнения и рабочий электрод, модифицированный медиатором с иммобилизованным на поверхности по методу адсорбции биоматериалом, отличающееся тем, что в качестве рабочего электрода взят уголь-пастовый, а в качестве биоматериала взяты клетки Е. coli и медиатор-ферроцен. 1 фиг., 1 табл.The utility model relates to the field of ecology, namely to biosensor analytical devices. The device can be used for express analysis of surface waters. The technical result is to improve the characteristics of the device, in particular, increase the sensitivity of the bioreceptor element to toxicants and reduce the time of a single measurement. A device for express determination of toxicity of surface waters, characterized in that it contains a measuring cuvette with a buffer solution containing a chloride-silver reference electrode and a working electrode modified with a mediator with a biomaterial immobilized on the surface by the adsorption method, characterized in that the working electrode is taken charcoal-paste, and E. coli cells and ferrocene mediator were taken as biomaterial. 1 fig., 1 tab.

Description

Полезная модель для экспресс-определения токсичности поверхностных вод относится к области экологического мониторинга окружающей среды и может быть использована в качестве нового метода биотестирования для оценки состояния поверхностных пресных, грунтовых, питьевых и сточных вод.A utility model for express determination of surface water toxicity relates to the field of environmental monitoring of the environment and can be used as a new biotesting method for assessing the state of surface fresh, ground, drinking and waste waters.

Так как стандартные методы биотестирования [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04 «Методика измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris beijer) для определения токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления». - М.: 2004. - 38 с.] имеют низкую воспроизводимость и требуют проведение длительных рутинных операций возникает необходимость специфического оборудования, таким образом, в качестве замены и/или дополнения существующих методов определения токсичности предлагается данное устройство.Since standard biotesting methods [PND Φ Τ 14.1: 2: 3: 4.10-04 "Method of measuring the optical density of a culture of algae chlorella (Chlorella vulgaris beijer) to determine the toxicity of drinking, fresh natural and waste water, water extracts from soils, soils, sediments sewage, production and consumption wastes”. - M.: 2004. - 38 p.] have low reproducibility and require long routine operations, there is a need for specific equipment, thus, this device is proposed as a replacement and / or addition to existing methods for determining toxicity.

Известна модель устройства для экспресс-определения токсичности водных сред, которая представляет собой печатный электрод с иммобилизованными микроорганизмами [Wang X. et al. P-benzoquinone-mediated amperometric biosensor developed with Psychrobacter sp. for toxicity testing of heavy metals // Biosensors and Bioelectronics. - 2013- V. 41. - P. 557-562]. Устройство содержит измерительную кювету, магнитную мешалку, печатный электрод, состоящий из поликарбонатной подложки, на которую нанесен углеродный электрод, а на обратной стороне которой напечатан хлорид-серебряный электрод сравнения. На рабочий электрод нанесена суспензия микроорганизмов Psychrobacter sp.В кювету добавляют медиатор п-бензохинон. Данное устройство позволяет проводить экспресс-анализ токсичности водных сред. Существенным недостатком устройства является низкая чувствительность микроорганизмов к токсикантам: ионам свинца и кадмия, а также к фенолу. Чувствительность оценивается индексом ингибирования IC₅₀ - концентрация токсиканта, которая приводит к снижению метаболической активности микроорганизмов на 50%.A known model of a device for rapid determination of the toxicity of aquatic environments, which is a printed electrode with immobilized microorganisms [Wang X. et al. P-benzoquinone-mediated amperometric biosensor developed with Psychrobacter sp. for toxicity testing of heavy metals // Biosensors and Bioelectronics. - 2013 - V. 41. - P. 557-562]. The device contains a measuring cuvette, a magnetic stirrer, a printed electrode consisting of a polycarbonate substrate, on which a carbon electrode is deposited, and on the reverse side of which a silver chloride reference electrode is printed. A suspension of microorganisms Psychrobacter sp. is applied to the working electrode. The mediator p-benzoquinone is added to the cuvette. This device allows for express analysis of the toxicity of aquatic environments. A significant disadvantage of the device is the low sensitivity of microorganisms to toxicants: lead and cadmium ions, as well as to phenol. Sensitivity is assessed by the inhibition index IC ₅₀ - the concentration of the toxicant, which leads to a decrease in the metabolic activity of microorganisms by 50%.

Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-определения токсичности водных сред [Gao G et al. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute biotoxicity assessment of wastewater // Talanta. - 2017. - V. 167. - P. 208-216.]. Устройство содержит измерительную кювету с магнитной мешалкой, биосенсорную систему, состоящую из двух электродов: хлорид серебряного электрода сравнения и рабочего электрода из стеклоуглерода, модифицированного медиатором-медионином, с иммобилизованными на нем дрожжами S. cerevisiae, дополнительно в кювету вводится медиатор гексацианоферрат (III) калия.The closest in its features, taken as a prototype, is a device for rapid determination of the toxicity of aquatic environments [Gao G et al. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute biotoxicity assessment of wastewater // Talanta. - 2017. - V. 167. - P. 208-216.]. The device contains a measuring cuvette with a magnetic stirrer, a biosensor system consisting of two electrodes: a silver chloride reference electrode and a working electrode made of glassy carbon modified with a mediator-medianine, with the yeast S. cerevisiae immobilized on it, an additional mediator potassium hexacyanoferrate (III) is introduced into the cuvette .

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого устройства, является амперометрический способ фиксирования аналитического сигнала, а также использование клеток микроорганизмов одного штамма, что обеспечивает экспрессность анализа с помощью данного устройства и воспроизводимость получаемых результатов. Чувствительность биорецепторного элемента к токсикантам у прототипа значительно лучше, чем у аналога за счет обеспечения более эффективной передачи электронов на электрод, что достигается благодаря использованию системы двух медиаторов. Недостатками устройства являются низкая чувствительность микроорганизмов к токсикантам: ионам свинца и кадмия, а также к фенолу; высокая трудоемкость анализа, связанная с использованием дополнительного раствора медиатора.Signs of the prototype, coinciding with the essential features of the proposed device, is an amperometric method of fixing the analytical signal, as well as the use of cells of microorganisms of the same strain, which ensures rapid analysis using this device and reproducibility of the results. The sensitivity of the bioreceptor element to toxicants in the prototype is much better than that of the analogue by providing a more efficient transfer of electrons to the electrode, which is achieved through the use of a system of two mediators. The disadvantages of the device are the low sensitivity of microorganisms to toxicants: lead and cadmium ions, as well as phenol; high complexity of the analysis associated with the use of an additional mediator solution.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является улучшение технических характеристик биосенсора для определения токсичности водных сред, в частности снижение трудоемкости анализа, а также увеличение чувствительности к токсикантам.The task to be solved by the claimed technical solution is to improve the technical characteristics of the biosensor for determining the toxicity of aquatic environments, in particular, reducing the complexity of the analysis, as well as increasing the sensitivity to toxicants.

Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для экспресс-определения токсичности поверхностных вод, характеризующееся тем, что содержит измерительную кювету с буферным раствором, содержащую хлорид-серебряный электрод сравнения и рабочий электрод, модифицированный медиатором с иммобилизованным на поверхности по методу адсорбции биоматериалом, причем в качестве рабочего электрода взят уголь-пастовый, а в качестве биоматериала взяты клетки Е. coli и медиатор-ферроцен.This problem is solved due to the fact that the claimed device for rapid determination of the toxicity of surface waters, characterized in that it contains a measuring cuvette with a buffer solution containing a chloride-silver reference electrode and a working electrode modified with a mediator with a biomaterial immobilized on the surface by the adsorption method, moreover, a carbon-paste electrode was taken as a working electrode, and E. coli cells and a ferrocene mediator were taken as a biomaterial.

В таблице 1 представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства для экспресс-определения токсичности водных сред.Table 1 shows the characteristics of the prototype and the proposed device for rapid determination of the toxicity of aquatic environments.

Увеличение чувствительности связано с заменой дрожжей S. cerevisiae на бактерии Е. coli. то может связано с тем, что прокариоты Е. coli имеют более простое строение, чем дрожжи S. cerevisiae, поэтому перенос электронов осуществляется быстрее в связи с большей доступностью ферментативных центров для медиатора [Sayed Ε. Т., Abdelkareem Μ. A. // Old Yeasts-New Questions. InTech, 2017]. Поэтому при использовании клеток Ε. coli необходим только один медиатор, вводимый в измерительную кювету, в отличие от принятого прототипа, в котором для эффективной работы биоэлектрода на основе дрожжей S. cerevisiae требуется дополнительное введение в измерительную кювету медиатора гексацианоферрата (III) калия, что значительно упрощает конструкцию заявляемою устройства. Бактерии Е. coli используются в качестве тест-объекта в методах биотестирования [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.1-96 «Методика определения токсичности вод, почв и донных отложений по ферментативной активности бактерий». - М.: 1996. - 8 с.], остро реагируют на присутствие тяжелых металлов в растворах, что повышает чувствительность при оценке токсичности.The increase in sensitivity is associated with the replacement of the yeast S. cerevisiae by the bacteria E. coli. This may be due to the fact that E. coli prokaryotes have a simpler structure than the yeast S. cerevisiae, so electron transfer is faster due to the greater availability of enzymatic centers for the mediator [Sayed Ε. T., Abdelkareem M. A. // Old Yeasts-New Questions. Intech, 2017]. Therefore, when using cells E. coli requires only one mediator introduced into the measuring cuvette, in contrast to the accepted prototype, in which the effective operation of the bioelectrode based on the yeast S. cerevisiae requires additional introduction of the potassium hexacyanoferrate (III) mediator into the measuring cuvette, which greatly simplifies the design of the proposed device. E. coli bacteria are used as a test object in biotesting methods [PND Φ Τ 14.1:2:3:4.1-96 "Method for determining the toxicity of waters, soils and bottom sediments by the enzymatic activity of bacteria." - M.: 1996. - 8 S.], react sharply to the presence of heavy metals in solutions, which increases the sensitivity in assessing toxicity.

Использование в качестве медиатора-ферроцена существенно снижает время единичного измерения за счет более низкой константы гетерогенного переноса электронов с молекулы медиатора на электрод, благодаря чему биохимическая реакция происходит на порядок быстрее. [Kharkova A.S., Arlyapov, V.Α., Turovskaya, A.D., Shvets, V.I., & Reshetilov, A.N. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity // Enzyme and Microbial Technology- 2019. - P. 1 - 13.]. Кроме того, использование одного медиатора снижает трудоемкость одного анализа, так как медиатор-ферроцен сразу встроен в конструкцию электрода и не требует дополнительного введения/удаления из измерительной кюветы после каждого измерения.The use of ferrocene as a mediator significantly reduces the time of a single measurement due to a lower constant of heterogeneous electron transfer from the mediator molecule to the electrode, due to which the biochemical reaction occurs an order of magnitude faster. [Kharkova A.S., Arlyapov, V.A., Turovskaya, A.D., Shvets, V.I., & Reshetilov, A.N. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity // Enzyme and Microbial Technology- 2019. - P. 1 - 13.]. In addition, the use of one mediator reduces the laboriousness of one analysis, since the ferrocene mediator is immediately integrated into the electrode design and does not require additional introduction/removal from the measuring cuvette after each measurement.

Заявляемое устройство для экспресс-определения токсичности поверхностных вод (фиг. 1) состоит из следующих элементов: угольно-пастовый электрод 1, модифицированный ферроценом с иммобилизованными на поверхность бактериями штамма Escherichia coli 2. Рабочий электрод 1 и хлорид-серебряный электрод сравнения 3 помещены в измерительную кювету 4 объемом 5 мл. Перемешивание раствора осуществляется с помощью магнитной мешалки 5.The inventive device for rapid determination of the toxicity of surface waters (Fig. 1) consists of the following elements: a carbon-paste electrode 1 modified with ferrocene with Escherichia coli strain bacteria 2 immobilized on the surface. The working electrode 1 and the silver chloride reference electrode 3 are placed in a measuring cuvette 4 with a volume of 5 ml. Mixing of the solution is carried out using a magnetic stirrer 5.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение характеристик устройства, в частности увеличение чувствительности биорецепторного элемента к токсикантам, что связано с использованием в качестве биоматериала клеток прокариот Е. coli, и сокращение времени единичного измерения за счет применения медиатора-ферроцена.The technical result provided by the above combination of features is to improve the characteristics of the device, in particular, to increase the sensitivity of the bioreceptor element to toxicants, which is associated with the use of E. coli prokaryotic cells as a biomaterial, and to reduce the time of a single measurement due to the use of a ferrocene mediator.

Рабочий угольно-пастовый электрод 1 готовят на основе графитовой пасты следующего состава: ферроцен - 10 мг, графитовая пудра - 90 мг, минеральное масло - 40 мкл. Ферроцен растворяют в ацетоне объемом 500 мкл. После испарения ацетона данной смесью наполняют пластиковый корпус электрода. Затем на зачищенную поверхность электрода наносят биоматериал с титром 330 мг/см³, при этом наносимый объем суспензии составляет 10 мкл, который закрывают диализной мембраной для предотвращения вымывания. Мембрану фиксируют пластиковым кольцом. Принцип работы устройства заключается в следующем: измерения проводят в двухэлектродной системе, погруженной в измерительную кювету 4 объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буфер (рН=6,8). Рабочим электродом 1 служил угольно-пастовый, модифицированный медиатором-ферроценом с иммобилизованными клетками, электродом сравнения 3 - насыщенный хлорсеребряный. Измерения проводят при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки 5. Температура измерения составляет 20°С, объем ячейки равен 5 см³.The working carbon-paste electrode 1 is prepared on the basis of graphite paste of the following composition: ferrocene - 10 mg, graphite powder - 90 mg, mineral oil - 40 μl. Ferrocene is dissolved in acetone with a volume of 500 μl. After evaporation of the acetone, the plastic body of the electrode is filled with this mixture. Then, a biomaterial with a titer of 330 mg/cm ³ is applied to the cleaned electrode surface, while the applied volume of the suspension is 10 μl, which is covered with a dialysis membrane to prevent leaching. The membrane is fixed with a plastic ring. The principle of operation of the device is as follows: measurements are carried out in a two-electrode system immersed in a measuring cuvette 4 with a volume of 5 ml containing potassium-sodium phosphate buffer (pH=6.8). The working electrode 1 served as a carbon-paste, modified mediator-ferrocene with immobilized cells, reference electrode 3 - saturated silver chloride. The measurements are carried out with continuous stirring using a magnetic stirrer 5. The measurement temperature is 20°C, the volume of the cell is 5 cm ³ .

После установления стабильного тока в кювету вносят анализируемую пробу. Для приготовления анализируемой пробы отбирают воду в объеме 100 см³, фильтруют и переносят в стакан на 200 см³. Для получения анализируемых проб в четыре аналогичных стакана добавляют по 48 см³ дистиллированной воды, после чего в первый из них переносят 24 см³ тестируемой воды, во второй, третий и четвертый - по 24 см³, соответственно, из первого, второго и третьего стаканов. 24 см³ из последнего стакана отбрасывают. В анализируемые пробы добавляют глюкозу, конечная концентрация которой составляет 0,1 моль/дм³. Каждую подготовленную пробу, а также контрольный раствор глюкозы вводят в измерительную кювету 4 в количестве 500 мкл, и фиксируют скорость биоразложения глюкозы, как амплитуду силы тока до и после введения в измерительную кювету 4 (ответ сенсора, ΔΙ, мкА). Для каждого разбавления, содержащего анализируемый образец, рассчитывают индекс ингибирования по формулеAfter a stable current is established, the analyzed sample is introduced into the cuvette. To prepare the analyzed sample, water is taken in a volume of 100 cm ³ , filtered and transferred into a glass of 200 cm ³ . To obtain the analyzed samples, 48 cm ^{3 of} distilled water are added to four similar glasses, after which 24 cm ³ of the tested water are transferred to the first of them, 24 cm ³ each, respectively, from the first, second and third glasses are transferred to the second, third and fourth . Discard 24 cm ³ of the last beaker. In the analyzed samples add glucose, the final concentration of which is 0.1 mol/DM ³ . Each prepared sample, as well as a control solution of glucose, is injected into the measuring cuvette 4 in an amount of 500 μl, and the rate of glucose biodegradation is recorded as the amplitude of the current strength before and after injection into the measuring cuvette 4 (sensor response, ΔΙ, μA). For each dilution containing the analyzed sample, the inhibition index is calculated using the formula

,

где ΔI_{глюкоза} - ответ биосенсора на контрольный образец глюкозы,where ΔI _glucose is the response of the biosensor to the control sample of glucose,

ΔI_{анализируемая проба} - ответ биосенсора на анализируемую пробу.ΔI _{analyzed sample} - response of the biosensor to the analyzed sample.

Вывод о токсичности каждого разбавления делают в соответствии с ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04: проба является токсичной, если индекс ингибирования или индекс стимулирования превышает 20% и 30% соответственно [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04 «Методика измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris beijer) для определения токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления». - М.: 2004. - 38 с.].The toxicity of each dilution is determined in accordance with IPA Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04: a sample is toxic if the inhibition index or stimulation index exceeds 20% and 30%, respectively [ISP Φ Τ 14.1:2:3:4.10 -04 "Methodology for measuring the optical density of a culture of chlorella algae (Chlorella vulgaris beijer) to determine the toxicity of drinking, fresh natural and waste waters, water extracts from soils, soils, sewage sludge, production and consumption wastes." - M.: 2004. - 38 p.].

Таким образом, заявленное устройство для экспресс-определения интегральной токсичности позволяет отслеживать качество водных сред в режиме реального времени, отличается своей портативностью и не требует привлечения высококвалифицированного персонала для проведения анализа.Thus, the claimed device for rapid determination of integral toxicity allows monitoring the quality of aquatic environments in real time, is portable and does not require the involvement of highly qualified personnel for analysis.

Claims

A device for express determination of toxicity of surface waters, characterized in that it contains a measuring cuvette with a buffer solution containing a chloride-silver reference electrode and a working electrode modified with a mediator with a biomaterial immobilized on the surface by the adsorption method, characterized in that the working electrode is taken charcoal-paste, and E. coli cells and ferrocene mediator were taken as biomaterial.