RU2104524C1

RU2104524C1 - Method for producing preparations of isolated cells

Info

Publication number: RU2104524C1
Application number: RU94018751A
Authority: RU
Inventors: А.Л. Зашихин; Ю.В. Агафонов; Л.В. Лисишников
Original assignee: Архангельский государственный медицинский институт
Priority date: 1994-05-23
Filing date: 1994-05-23
Publication date: 1998-02-10

Abstract

FIELD: cytology for cytologic study of processes involved in histogenetic development of various tissues, study of cytophysiological laws governing hypertrophic and atrophic processes. SUBSTANCE: preparations of only those of cells are produced which must be studied. For this purpose tissues fixed with formalin for 14-20 days are subjected to freezing. Fragment is isolated from prescribed tissue components of organs taken in the form of cuts 20-40 mcm thick, followed by dissociating fragment thus-isolated in 50-% KOH for 2.5-3 h at temperature 18-20 C. Fragment is washed five times with water at 18-20 C, each for 5 min. EFFECT: method it possible to achieve high-precision isolation of microfragments from tissues of various organs, thereby enabling selective analysis of dissociated cells making part of only tissue structures to be studied. 1 dwg

Description

Изобретение относится к цитологии. The invention relates to cytology.

Препараты изолированных клеток применяются в цитологических исследованиях при изучении процессов гистогенетического развития различных тканей, изучении цитофизиологических закономерностей формирования гипертрофических и атрофических процессов. The preparations of isolated cells are used in cytological studies when studying the processes of histogenetic development of various tissues, studying the cytophysiological patterns of the formation of hypertrophic and atrophic processes.

В настоящее время известны способы получения изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей [1, 2]. Currently known methods of producing isolated cells by alkaline dissociation of formalin-fixed tissues [1, 2].

В качестве прототипа использован способ получения препаратов изолированных клеток [2], включающий в себя длительную (14 - 20 сут) фиксацию ткани в 10% формалине, диссоциацию в 50% водном растворе KOH в течение 16 - 20 часов, гомогенизацию полученного материала стеклянной палочкой, промывку полученной суспензии и нанесение ее на предметное стекло с последующей окраской. As a prototype, a method of obtaining preparations of isolated cells [2] was used, which includes long-term (14–20 days) tissue fixation in 10% formalin, dissociation in a 50% aqueous KOH solution for 16–20 hours, homogenization of the obtained material with a glass rod, washing the resulting suspension and applying it to a glass slide with subsequent coloring.

Однако недостатком существующего способа является невозможность избирательного выделения заданных тканевых компонентов органов, что является необходимым условием осуществления количественного селективного анализа определенных клеточных элементов. However, the disadvantage of the existing method is the inability to selectively select the given tissue components of the organs, which is a necessary condition for quantitative selective analysis of certain cellular elements.

Задачей изобретения является получение препаратов, содержащих только те типы клеток, которые необходимо исследовать. The objective of the invention is to obtain preparations containing only those types of cells that need to be investigated.

Указанная задача достигается тем, что фиксированные ткани замораживают, из срезов толщиной 20 - 40 мкм прицельно выделяют фрагмент из заданных тканевых компонентов органов, диссоциируют его в 50% KOH 2,5 - 3 ч при t = 18 - 20^oC, отмывку производят пятикратно водой t = 18 - 20^oC по 5 мин.This task is achieved by the fact that fixed tissues are frozen, a fragment from targeted tissue components of organs is selectively targeted from sections with a thickness of 20-40 μm, dissociated in 50% KOH 2.5-3 hours at t = 18-20 ^o C, washing five times water t = 18 - 20 ^o C for 5 minutes

Предложенный способ заключается в том, что фиксированный в течение 14 - 20 сут в 10% формалине кусочек органа замораживают хлорэтилом. Из срезов толщиной 20 - 40 мкм прицельно, под контролем микроскопа, выделяют фрагмент, содержащий заданные тканевые компоненты, диссоциируют его в 50% водном растворе KOH в течение 2,5 - 3 ч, отмывают материал дистиллированной водой при температуре 18 - 20^oC пятикратно по 5 мин. Гомогенизацию полученного материала производят при помощи струи воды из микропипетки. Из полученной суспензии готовят мазки по общепринятой методике. Ввиду того, что при прицельном выделении объем получаемой ткани составляет 0,1 - 0,05 см³, чтобы избежать повреждения клеток необходимо проводить диссоциацию не более 2,5 - 3 ч при температуре 18-20^o. Как правило, при данном режиме диссоциации происходит корректное разделение клеток, без нарушения целостности клеточных мембран. Изменение режимов обработки в сторону уменьшения времени экспозиции в щелочи или снижения температуры раствора не приводит к полному разделению клеток. Отмывку материала от щелочи производят пятикратно по 5 мин дистиллированной водой, удаляя старую порцию надосадочной жидкости и добавляя дистиллированную воду (до 10 мл). При этом достигается полное освобождение материала от щелочи. Менее тщательная отмывка материала служит источником появления кристаллов KOH на мазках и ухудшению взаимодействия материала с красителями при окраске. Увеличение числа промывок ведет к неоправданной потере клеточного материала.The proposed method consists in the fact that a piece of an organ fixed for 14-20 days in 10% formalin is frozen with chloroethyl. From sections with a thickness of 20 - 40 μm, a fragment containing the desired tissue components is isolated, under the microscope control, dissociated in a 50% aqueous KOH solution for 2.5 - 3 hours, the material is washed with distilled water at a temperature of 18 - 20 ^o C five times 5 min each Homogenization of the obtained material is carried out using a jet of water from a micropipette. Smears are prepared from the resulting suspension according to the generally accepted technique. Due to the fact that with targeted extraction, the volume of tissue obtained is 0.1-0.05 cm ³ , in order to avoid damage to the cells, dissociation should be carried out for no more than 2.5-3 hours at a temperature of 18-20 ^o . As a rule, in this mode of dissociation, the correct separation of cells occurs, without violating the integrity of the cell membranes. Changing the treatment regimes in the direction of decreasing the exposure time in alkali or lowering the temperature of the solution does not lead to complete separation of the cells. The material is washed from alkali five times for 5 minutes with distilled water, removing the old portion of the supernatant and adding distilled water (up to 10 ml). In this case, complete release of material from alkali is achieved. Less thorough washing of the material is the source of the appearance of KOH crystals on smears and the deterioration of the interaction of the material with dyes during coloring. An increase in the number of washes leads to an unjustified loss of cellular material.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. The proposed method is as follows.

При исследовании миоцитов, входящих в состав стенки бронхов легкого и проведении диссоциации способом, описанным в [1, 2], взвесь клеток будет включать в себя гладкие миоциты и бронхов и расположенных рядом кровеносных сосудов. Это не позволяет проводить дифференцированный анализ мышечных клеток, входящих в состав стенки воздухоносных путей. When examining the myocytes that make up the walls of the bronchial tubes of the lung and dissociating in the manner described in [1, 2], the suspension of cells will include smooth myocytes and bronchi and adjacent blood vessels. This does not allow for differential analysis of muscle cells that make up the walls of the airways.

Поэтому кусочки ткани фиксируют в 10% формалине на фосфатном буфере (pH = 7,2 - 7,4) в течение 14 - 20 сут. После этого материал замораживают хлорэтилом и на санном микротоме изготавливают срезу толщиной 50 - 60 мкм. Полученные срезы переносят на предметное стекло и под стереомикроскопом, в режиме темного поля, с помощью микроманипулятора производят выделение из препарата нужного участка ткани. Для точной ориентации один из срезов толщиной 10 мкм, предварительно окрашивают гематоксилин-эозином и используют в качестве ориентира. Необходимый фрагмент вырезают и помещают в пробирку с 1,0 мл 50% водного раствора KOH на 2,5 - 3 ч при температуре 18 - 20^o. По прошествии данного времени избыток щелочи удаляют микропипеткой, и в пробирку добавляют 10 мл дистиллированной воды t = 18 - 20^o на 5 мин. После этого воду удаляют из пробирки микропипеткой и материал вновь заливают свежей порцией дистиллированной воды. Указанную операцию повторяют 4 - 5 раз. Контроль pH материала осуществляют постоянно в течение операции. После полного освобождения материала от щелочи последнюю порцию воды тщательно удаляют микропипеткой и в пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды. При гомогенизации материала используют силу гидроудара струи жидкости из микропипетки, что оказывает более щадящее воздействие, чем при разрушении агломератов клеток стеклянной палочкой или другом механическом воздействии. Для этого путем осторожного пассажа содержимого пробирки микропипеткой достигают получения однородной взвеси клеток, из которой готовят мазки по общепринятой методике.Therefore, tissue pieces are fixed in 10% formalin on phosphate buffer (pH = 7.2 - 7.4) for 14 to 20 days. After that, the material is frozen with chloroethyl and a slice with a thickness of 50-60 microns is made on a sled microtome. The obtained sections are transferred to a glass slide and under a stereo microscope, in the dark field mode, using the micromanipulator, the desired tissue site is extracted from the preparation. For accurate orientation, one of the sections with a thickness of 10 μm is pre-stained with hematoxylin-eosin and used as a guide. The required fragment is cut out and placed in a test tube with 1.0 ml of a 50% aqueous KOH solution for 2.5 - 3 hours at a temperature of 18 - 20 ^o . After this time, the excess alkali is removed with a micropipette, and 10 ml of distilled water t = 18 - 20 ^{o is} added to the tube for 5 minutes. After that, the water is removed from the test tube with a micropipette and the material is again poured with a fresh portion of distilled water. The specified operation is repeated 4 to 5 times. Monitoring the pH of the material is carried out continuously during the operation. After the material is completely free of alkali, the last portion of water is carefully removed with a micropipette and 1 ml of distilled water is added to the test tube. In the homogenization of the material, the force of the hydro-shock of the liquid jet from the micropipette is used, which has a more gentle effect than when the agglomerates of the cells are destroyed by a glass rod or other mechanical effect. To do this, by careful passage of the contents of the test tube with a micropipette, a homogeneous suspension of cells is obtained, from which smears are prepared according to the generally accepted method.

На чертеже показан препарат, содержащий диссоциированные гладкие миоциты бронхов (увеличение 200). The drawing shows a preparation containing dissociated smooth myocytes of the bronchi (magnification 200).

В отличие от серийных срезов при анализе препаратов изолированных клеток снимается комплекс технических ошибок (неравномерность толщины гистологических препаратов, различный уровень срезов клеток и ядер, нечеткость границ клеток в составе пласта), возникающих при морфометрических и цитоспектрофотометрических исследованиях. In contrast to serial sections, the analysis of isolated cell preparations removes a set of technical errors (uneven thickness of histological preparations, different levels of sections of cells and nuclei, blurred cell boundaries in the formation) arising from morphometric and cytospectrophotometric studies.

Данный способ позволяет:
производить прицельное выделение микрофрагментов тканей различных органов, что дает возможность селективного анализа диссоциированных клеток, входящих только в состав изучаемых структур тканей,
не деформирует структуру исследуемой ткани,
позволяет подготовить избирательную диссоциацию любых типов клеточных элементов, т. к. структуры, содержащие клетки другого вида, исключаются из анализа на предварительном этапе данного метода исследования,
щадящий режим обработки материала сокращает время, затрачиваемое на выполнение исследования, приблизительно в 10 раз и увеличивает на выходе количество неповрежденных клеточных форм.This method allows you to:
to produce targeted isolation of microfragments of tissues of various organs, which makes it possible to selectively analyze dissociated cells that are only part of the studied tissue structures,
does not deform the structure of the test tissue,
allows you to prepare selective dissociation of any type of cellular elements, because structures containing cells of a different kind are excluded from analysis at the preliminary stage of this research method,
gentle treatment of the material reduces the time spent on the study by about 10 times and increases the number of intact cell forms at the output.

Источники информации
1. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А. и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Цитология, 1975, т. 12, N 11, стр. 1332-1338.Sources of information
1. Belov L.N., Kogan M.E., Leontiev T.A. et al. Obtaining isolated cells by alkaline dissociation of formalin-fixed tissues. Cytology, 1975, v. 12, No. 11, pp. 1332-1338.

2. Коган М.Е., Белов Л.Н., Леонтьева Т.А. Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации - Архив патологии, 1976, т. 38, N 1, стр. 77-80 (прототип). 2. Kogan M.E., Belov L.N., Leontiev T.A. Determination of the number of cells in various organs and tissues after alkaline dissociation - Archive of pathology, 1976, v. 38, No. 1, pp. 77-80 (prototype).

Claims

The method of obtaining preparations of isolated cells by alkaline dissociation of formalin-fixed tissues, followed by washing and separation, characterized in that the fixed tissues are frozen, a fragment from the specified tissue components of organs is targetedly selected from sections with a thickness of 20-40 microns, 2.5 3.0 hours are dissociated into alkali at 18 20 ^o C, washing is carried out five times with water at 18 20 ^o C for 5 minutes