RU2101023C1

RU2101023C1 - Method of preparing the agent showing anticoagulating activity

Info

Publication number: RU2101023C1
Application number: RU95108660A
Authority: RU
Inventors: Е.А. Чирятьев; А.Ш. Бышевский; Н.В. Яковлева; Е.В. Платонов
Original assignee: Тюменский медицинский институт
Priority date: 1995-05-29
Filing date: 1995-05-29
Publication date: 1998-01-10
Also published as: RU95108660A

Abstract

FIELD: medicine, biochemistry. SUBSTANCE: method involves extraction, purification and drying the end product. Native sapropel is used as raw being without any preliminary treatment. Sapropel extract is obtained using three-fold volume of 0.05 M ammonia solution. Extract is concentrated by evaporation by 80-100 times, kept for 24 h at -15 C, insoluble particles were removed by centrifugation at 3000-4000 g and dialyzed through cellophane T-100 against 200-fold volume of distilled water. Nondialyzable fraction is evaporated until dry and the end product is obtained as light-brown, good water-soluble powder. The end product is anticoagulant, its activity is 95 ± 3 units (UA)/1 mg dry matter. The yield is 8000-10000 UA from 1 kg sapropel. EFFECT: improved method of preparing, high yield of product. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине и биохимии, точнее к способам получения антикоагулянтов из природных продуктов. The invention relates to medicine and biochemistry, more specifically to methods for producing anticoagulants from natural products.

Известны способы получения экстрактов с антикоагулянтной активностью из растительного сырья, характеризующиеся использованием дорогостоящих органических растворителей и ограниченностью сырьевой базы. Known methods for producing extracts with anticoagulant activity from plant materials, characterized by the use of expensive organic solvents and limited raw materials.

Так, известен способ получения из травы медуницы мягчайшей экстракта с антикоагулянтной активностью (Бышевский А.Ш. Герберт И.Я. Влияние некоторых растений Западной Сибири на процесс гемокоагуляции. Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. Всесоюз. научн. конф. Новосибирск, 1983. с.181-181). Сущность способа заключается в том, что высушенную траву экспонируют в 70% этаноле, получая водно-этанольный экстракт, отгоняют этанол, водный экстракт концентрируют, получая целевой продукт в виде концентрированного водного экстракта. So, there is a known method of obtaining the mildest extract with anticoagulant activity from Lungwort herb (Byshevsky A.Sh. Herbert I.Ya. Influence of some plants of Western Siberia on the process of hemocoagulation. Problems of development of medicinal resources of Siberia and the Far East. Abstract. All-Union Scientific. Conf. Novosibirsk, 1983, p. 181-181). The essence of the method is that the dried grass is exposed in 70% ethanol, receiving a water-ethanol extract, ethanol is distilled off, the aqueous extract is concentrated, obtaining the target product in the form of a concentrated aqueous extract.

Приведенный выше способ является аналогом заявляемого способа. Его недостатки использование для экстракции этилового спирта, трудность дозировки целевого продукта, полное отсутствие очистки целевого продукта от примесей. The above method is an analog of the proposed method. Its disadvantages are the use for extraction of ethyl alcohol, the difficulty of dosing the target product, the complete lack of purification of the target product from impurities.

Известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтным действием путем экстракции высушенной травы медуницы мягчайшей 70% этанолом, упаривания экстракта и последовательной обработки хлороформом и этилацетатом, концентрирования на водяной бане и высушивания посредством обезвоживания 96% этанолом (П.И. Левен, И.Я. Геребер. Антикоагулянты прямого действия из медуницы мягчайшей. Тез. докл. У Всесоюз. биохимического съезда. М. Наука, 1982. т.2 с.280-280). A known method of obtaining funds with anticoagulant effect by extraction of dried grass of the medunica with the mildest 70% ethanol, evaporation of the extract and subsequent treatment with chloroform and ethyl acetate, concentration in a water bath and drying by dehydration with 96% ethanol (P.I. Leven, I.Ya. Gleber Anticoagulants of direct action from the softest lungwort. Thesis dokl. At the All-Union Biochemical Congress. M. Nauka, 1982. v.2 p.280-280).

Для получения средства траву медуницы мягчайшей высушивают до сухо-воздушного состояния, и высушенную траву обрабатывают 70%-ным этанолом в соотношении 1: 20 в течении 60 мин дважды на кипящей водяной бане с обратным холодильником. To obtain the remedy, the grass of the honeyfish of the mildest is dried to a dry-air state, and the dried grass is treated with 70% ethanol in a ratio of 1: 20 for 60 minutes twice in a boiling water bath under reflux.

Спирто-водные извлечения объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, спирт из фильтрата отгоняют под вакуумом, и полученный водный остаток оставляют на 1 сутки при температуре +5^oC для осаждения хлорофилла и других балластных веществ. Выпавший осадок отделяют фильтрованием.The alcohol-water extracts are combined, filtered through a paper filter, the alcohol from the filtrate is distilled off under vacuum, and the resulting aqueous residue is left for 1 day at a temperature of +5 ^o C to precipitate chlorophyll and other ballast substances. The precipitate formed is filtered off.

Фильтрат обрабатывают хлороформом в соотношении 1:1, добиваясь бесцветного хлороформного слоя (4 повтора), затем этилацетатом в соотношении 1:1 до получения бесцветного этилацетатного слоя (5 повторов). The filtrate is treated with chloroform in a ratio of 1: 1, achieving a colorless chloroform layer (4 repetitions), then with ethyl acetate in a ratio of 1: 1 to obtain a colorless ethyl acetate layer (5 repetitions).

Водное извлечение концентрируют выпариванием на кипящей водяной бане до сиропообразной консистенции и добавляют 96% этанол в соотношении 1:8. The aqueous extract is concentrated by evaporation in a boiling water bath to a syrupy consistency and 96% ethanol is added in a 1: 8 ratio.

Выпадающий осадок отделяют центрифугированием при 3000 и высушивают в токе воздуха, получая сухой экстракт целевой продукт. Из 100 г травы получают около 90 условных единиц активности (ЕА) антикоагулянта на 1 мг массы сухого вещества. The precipitate is separated by centrifugation at 3000 and dried in a stream of air, obtaining a dry extract of the target product. About 100 conventional units of activity (EA) of the anticoagulant per 1 mg of dry matter are obtained from 100 g of grass.

Этот способ мы рассматриваем как прототип предложенного способа. К его недостаткам относятся ограниченность сырьевой базы (медуница мягчайшая), применение дорогостоящих и токсичных реактивов (этанол, хлороформ, этилацетат), присутствие в качеств примесей других биологически активных веществ (полисахариды, дубильные вещества, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты). We consider this method as a prototype of the proposed method. Its shortcomings include the limited raw material base (the easiest honeyfish), the use of expensive and toxic reagents (ethanol, chloroform, ethyl acetate), the presence of other biologically active substances (polysaccharides, tannins, flavonoids, phenolcarboxylic acids) as impurities.

Задача изобретения получение экстракта с антикоагулянтной активностью из доступного сырья без использования дорогостоящих и токсичных реактивов. The objective of the invention is to obtain an extract with anticoagulant activity from available raw materials without the use of expensive and toxic reagents.

Технический результат изобретения заключается в следующем:
1. В качестве материала для получения экстракта с антикоагулянтной активностью используется сапропель распространенный и не нуждающийся в предварительной обработке продукт;
2. В том, что выделения целевого продукта применяются недорогие и нетоксичные материалы (дистиллированная вода, водный раствор аммиака и целлофан отечественного производства.The technical result of the invention is as follows:
1. As a material for obtaining an extract with anticoagulant activity, sapropel is used, which is a common and non-pretreated product;
2. The fact that the selection of the target product uses inexpensive and non-toxic materials (distilled water, aqueous ammonia and cellophane produced domestically.

Существенные признаки изобретения заключаются в следующем:
1. Из цельного сапропеля извлекаются водорастворимые соединения путем настаивания его с 3-х кратным объемом 0,05 М водного раствора аммиака;
2. Аммиачные экстракты сапропеля упаривают в 80-100 раз с помощью ротационного испарителя и отделяют выпадающие частицы с помощью центрифугирования;
3. Надосадок выдерживают при температуре -15^oC в течение 24 ч. Размораживают при комнатной температуре, выпавший при этом осадок отделяют центрифугированием;
4. Супернатант диализуют против дистиллированной воды через целлофан Т-100 и затем выпаривают до получения светло-коричневого сухого порошка;
5. Полученный негигроскопичный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. Условной единицей активности (ЕА) является то количество раствора порошка, которое в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной нормальной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля содержится 8000-10000 ЕА.The essential features of the invention are as follows:
1. Water-soluble compounds are extracted from whole sapropel by infusing it with a 3-fold volume of a 0.05 M aqueous ammonia solution;
2. Ammonia extracts of sapropel are evaporated 80-100 times using a rotary evaporator and precipitated particles are separated by centrifugation;
3. The supernatant is maintained at a temperature of -15 ^° C. for 24 hours. It is thawed at room temperature, the precipitate formed is separated by centrifugation;
4. The supernatant is dialyzed against distilled water through T-100 cellophane and then evaporated to give a light brown dry powder;
5. The obtained non-hygroscopic powder is the target product, soluble in 0.14 M sodium chloride solution and having anticoagulant activity. The conventional unit of activity (EA) is the amount of powder solution that 2 times lengthens the clotting time of an equal volume of recalcified normal human plasma. The product obtained from 1 kg of native sapropel contains 8000-10000 EA.

Положительный эффект предлолженного способа по сравнению со способом-прототипом заключается:
1. В использовании недорогого и чрезвычайно распространенного сырья, не требующего предварительной обработки, в то время как медуница мягчайшая после сбора подлежит высушиванию в течение продолжительного времени и имеет ограниченное распространение.The positive effect of the proposed method compared to the prototype method is:
1. In the use of inexpensive and extremely widespread raw materials that do not require pre-treatment, while the softest honeyfish after collection is subject to drying for a long time and has a limited distribution.

2. В отказе от дорогостоящих и токсичных реактивов этанола, хлороформа и этилацетата. 2. The rejection of expensive and toxic reagents of ethanol, chloroform and ethyl acetate.

3. В отсутствии посторонних примесей других биологически активных веществ. 3. In the absence of impurities of other biologically active substances.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Information confirming the possibility of carrying out the invention.

Для получения целевого продукта предусмотрена следующая последовательность операций:
1. Один объем нативного сапропеля заливают 3-х кратным объемом 0,05 М водного раствора аммиака и настаивают при постоянном перемешивании в течение 2-3 ч.To obtain the target product provides the following sequence of operations:
1. One volume of native sapropel is poured with a 3-fold volume of 0.05 M aqueous ammonia and insisted with constant stirring for 2-3 hours

2. Настой отстаивают в течение суток при комнатной температуре и собирают надосадок с помощью сифона или осторожно сливая. 2. The infusion is defended during the day at room temperature and the supernatant is collected using a siphon or carefully draining.

3. Порции надосадка объединяют и упаривают на водяной бане или с помощью ротационного испарителя в 80-100 раз (до 30-40 мл при обработке 1 кг сапропеля). 3. The portions of the supernatant are combined and evaporated in a water bath or using a rotary evaporator 80-100 times (up to 30-40 ml when processing 1 kg of sapropel).

4. Концентрат центрифугируют в течение 15 мин при 3000-4000 g. 4. The concentrate is centrifuged for 15 min at 3000-4000 g.

5. Надосадок выдерживают при температуре -15^oC в течение 24 ч. Размораживают при комнатной температуре, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000-4000 g.5. The supernatant is kept at a temperature of -15 ^o C for 24 hours. It is thawed at room temperature, the precipitate is separated by centrifugation for 15 min at 3000-4000 g.

6. Супернатант диализуют против дистиллированной воды через мембрану Т-100 (пленка гидратцеллюлозная для гемодиализ со средним размером пор 1,74 ангстрема(К. И.Мышкин, В.Н.Леонов, А.Т.Староверов. Сравнительная характеристика некоторых образцов целлофана, применяемых для экстракопорального гемодиализа. -Сов.медицина,1967 N6, с.55-58)- 10 мл надосадка против 2-3 л воды в течение 12 ч. 6. The supernatant is dialyzed against distilled water through a T-100 membrane (a hydrated cellulose film for hemodialysis with an average pore size of 1.74 angstroms (K. I. Myshkin, V. N. Leonov, A. Staroverov. Comparative characteristics of some cellophane samples, used for extraporal hemodialysis. -Sov.meditsina, 1967 N6, p.55-58) - 10 ml supernatant against 2-3 liters of water for 12 hours.

7. Недиализующуюся часть надосадка выпаривают досуха на ротационном испарителе. Полученный светло-коричневый порошок целевой продукт. В целевом продукте из 1 кг сапропеля содержится 8000-10000 ЕА. 7. The non-dialyzable portion of the supernatant is evaporated to dryness on a rotary evaporator. The resulting light brown powder is the desired product. The target product of 1 kg of sapropel contains 8000-10000 EA.

Приведенная ниже таблица характеризует предложенный способ в сравнении со способом-прототипом. The table below characterizes the proposed method in comparison with the prototype method.

Таким образом, целевой продукт с помощью предложенного способа получен без предварительной обработки недорогого сырья сапропеля существенно отличается по качеству от получаемого из травы медуницы, распространение которой ограничено, а сбор и сушка требуют значительных затрат. В предлолженном способе не используются токсичные и дорогостоящие органические растворители, а выход целевого продукта примерно одинаков в пересчете на 1 кг исходного сырья. Thus, the target product using the proposed method is obtained without preliminary processing of inexpensive raw materials of sapropel significantly different in quality from that obtained from the grass of the Lungwort, the distribution of which is limited, and the collection and drying require significant costs. In the proposed method, toxic and expensive organic solvents are not used, and the yield of the target product is approximately the same in terms of 1 kg of feedstock.

Как и антикоагулянт из травы медуницы, антикоагулянт из сапропеля представлен гликопептидами с небольшой молекулярной массой, после введения которых животным снижается свертывающая активность на 6-12 ч, что позволяет использовать целевой продукт для блокады свертывания крови у экспериментальных животных и как материал для проведения исследований, предшествующих клиническим испытаниям. Like the anticoagulant from the grass of the Lungwort, the anticoagulant from sapropel is represented by glycopeptides with a small molecular weight, after the introduction of which the coagulation activity is reduced by 6-12 hours for animals, which allows the target product to be used for blocking blood coagulation in experimental animals and as a material for previous studies clinical trials.

Claims

The method of obtaining funds with anticoagulant activity by extraction of natural raw materials with a solvent, evaporation of the extract, purification of the target product and its drying, characterized in that sapropel is used as natural raw material, extraction is carried out by insisting in a 3-fold volume of a 0.05 M ammonia solution, evaporated 80 100 times the original volume, was kept overnight at a temperature of -15 ^o C and purification are carried out by centrifugation for 15 minutes at 3000 4000 q, dialyzed against 200-fold volume distillirova -water through the membrane of T-100 for 12 hours and the concentrate was evaporated on a rotary evaporator.