RU2101019C1

RU2101019C1 - Method of preparing the antiprocoagulating preparation from medicinal leech

Info

Publication number: RU2101019C1
Application number: RU94031069A
Authority: RU
Inventors: Геннадий Иванович Никонов; Елена Александровна Титова; Константин Георгиевич Селезнев
Original assignee: Медицинская коллективная научно-внедренческая фирма "Биокон"
Priority date: 1994-08-24
Filing date: 1994-08-24
Publication date: 1998-01-10

Abstract

FIELD: medicine, bioactive substances. SUBSTANCE: method involves leeches freezing, lyophilization and the following milling, dilution with water, acidification to pH = 5.8-7.0, heating on boiling water bath for 3-15 min followed by filtrate collection. Preparation shows antithrombic activity, prolongs plasma recalcification time, inhibits aggregation and adhesion of platelets due to the presence of leech prostaglandins. EFFECT: improved method of preparing, enhanced effectiveness. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ. The invention relates to medicine, namely to methods for producing biologically active substances.

Известен способ получения препарата из медицинской пиявки, обладающего антитромботическим, тромболитическим и антиатеросклеротическим действием, взятый в качестве прототипа. A known method of obtaining a drug from a medical leech with antithrombotic, thrombolytic and anti-atherosclerotic action, taken as a prototype.

Но препарат обладает следующими недостатками: при ряде заболеваний может оказать отрицательное действие. Это прежде всего заболевания, связанные с риском тромбообразования (гипотенция, различные оперативные вмешательства, тромбоцитопения и др.), он содержит балластные вещества, ограничивающие растворимость препарата (максимальная растворимость по белку 50 мг/мл). But the drug has the following disadvantages: with a number of diseases it can have a negative effect. This is primarily a disease associated with the risk of thrombosis (hypotension, various surgical interventions, thrombocytopenia, etc.), it contains ballast substances that limit the solubility of the drug (maximum protein solubility is 50 mg / ml).

Цель предлагаемого способа получение препарата, обладающего профилактическим противотромботическим действием. The purpose of the proposed method is to obtain a drug with a prophylactic antithrombotic effect.

Поставленная цель достигается тем, что полученный гомогенат пиявок разбавляют водой, подкисляют до pH 5,8 7.0, прогревают на кипящей бане в течение 3 15 мин, после чего собирают фильтрат. This goal is achieved by the fact that the resulting leech homogenate is diluted with water, acidified to pH 5.8 7.0, heated in a boiling bath for 3 to 15 minutes, after which the filtrate is collected.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

Пиявок промывают, замораживают при температуре не ниже -15^o, лиофилизуют, размалывают в порошок. После этого порошок разбавляют водой, подкисляют до значения pH 5,8 7,0, прогревают в кипящей бане в течение 3 - 15 мин, затем собирают надосадочную жидкость.The leech is washed, frozen at a temperature not lower than -15 ^o , lyophilized, ground into powder. After that, the powder is diluted with water, acidified to pH 5.8 7.0, heated in a boiling bath for 3 to 15 minutes, then the supernatant is collected.

Полученный препарат обладает антитромбиновой активностью, обеспечиваемой гирудином, удлиняет время рекальцификации плазмы крови, обусловленной ингибитором калликреина плазмы крови, а также блокирует агрегацию и адгезию тромбоцитов за счет пиявочных простагландинов, подобных простациклину. The resulting preparation has the antithrombin activity provided by hirudin, prolongs the time of recalcification of blood plasma due to a plasma kallikrein inhibitor, and also blocks platelet aggregation and adhesion due to leech prostaglandins like prostacyclin.

Эти свойства препарата определяют его противотромботическое действие, которое больше, чем у препарата-прототипа, в среднем в 6 раз. These properties of the drug determine its antithrombotic effect, which is 6 times greater than that of the prototype drug.

Способы определения:
1. Антитромбиновая активность определяется по удлинению времени свертывания фибриногена тромбином. Определяют время образования сгустка в системе, состоящей из 0,2 мл 0,3% раствора фибриногена и 0,1 мл анализируемого препарата после добавления 0,1 мл тромбина, содержащего 1 тромбиновую единицу. Активность гирудина выражают в антитромбиновых единицах (АТЕ).Ways to determine:
1. Antithrombin activity is determined by lengthening the clotting time of fibrinogen with thrombin. The clot formation time is determined in a system consisting of 0.2 ml of a 0.3% fibrinogen solution and 0.1 ml of the analyzed drug after adding 0.1 ml of thrombin containing 1 thrombin unit. Hirudin activity is expressed in antithrombin units (ATU).

2. Время рекальцификации плазмы крови определяют в системе, содержащей 0,1 мл цитратной плазмы крови и 0,1 мл анализируемого препарата после добавления 0,1 мл 0,025 М раствора CaCl₂. Отмечают время образования сгустка. Удлинение времени образования сгустка в присутствии АПК выражают в антипрокоагулянтных единицах (АПКЕ), т.е. время рекальцификации в опыте делят на время рекальцификации в контроле (равный объем физиологического раствора).2. The time of recalcification of blood plasma is determined in a system containing 0.1 ml of citrated blood plasma and 0.1 ml of the analyzed drug after adding 0.1 ml of a 0.025 M CaCl ₂ solution. The time of clot formation is noted. The lengthening of the time of clot formation in the presence of APC is expressed in antiprocoagulant units (APC), i.e. Recalcification time in the experiment is divided by the recalcification time in the control (equal volume of physiological saline).

3. Содержание простагландинов определяют используя набор реактивов и пропись фирмы "Amersham" (Англия) для радиоиммунологического анализа 6-Keto-PGF/альфа. 3. The content of prostaglandins is determined using a reagent kit and a copy of the company "Amersham" (England) for radioimmunological analysis of 6-Keto-PGF / alpha.

4. Противотромботическое действие АПК определяют на крысах с использованием метода тромбообразования в изолированном участке вены по Весслеру (Vessler, et. al.). 4. The antithrombotic effect of the APC is determined in rats using the method of thrombosis in an isolated section of the vein according to Wessler (Vessler, et. Al.).

Степень блокады тромбообразования оценивали при интервале между введением раствора АПК и активированной стеклом сыворотки крови человека, составляющем 4 ч. Степень блокады тромбообразования выражали в относительно контроля (введение крысам равного объема физиологического раствора). The degree of thrombosis blockade was evaluated during the interval between administration of an APC solution and activated glass of human blood serum of 4 hours. The degree of thrombosis blockade was expressed in relative control (administration to rats of an equal volume of saline).

Пример 1. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Тестируют активность этого раствора (см. таблицу). Подкисляют раствор концентрированной муравьиной кислотой до значения pH 6,0. Затем прогревают в кипящей бане в течение 10 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость тестируют (см. таблицу). Как видно из таблицы, полученный АПК обладает высокой антитромбиновой активностью, превышающей исходную в 60 раз; значительно возросла активность ингибитора калликреина (в 60 раз) и возросло содержание простагландинов относительно исходного раствора. Сочетание этих активностей приводит к полному (100% ) блокированию тромбообразования в экспериментах на животных. Example 1. Prepare an aqueous solution of the prototype drug. Test the activity of this solution (see table). The solution is acidified with concentrated formic acid to a pH of 6.0. Then heated in a boiling bath for 10 minutes The precipitate formed is removed by centrifugation. The supernatant is tested (see table). As can be seen from the table, the obtained APC has a high antithrombin activity, which exceeds the initial one by 60 times; the activity of the kallikrein inhibitor increased significantly (60 times) and the content of prostaglandins relative to the initial solution increased. The combination of these activities leads to complete (100%) blocking of thrombus formation in animal experiments.

Пример 2. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют его 0,1 н HCl до значения pH 5,4. Выпал осадок, т.е. произошло перераспределение активности между водной фазой и осадком, прогревают 5 мин. По данным таблицы видно, что препарат не соответствует целевому продукту. Example 2. Prepare an aqueous solution of the prototype drug. It is acidified with 0.1 N HCl to a pH of 5.4. Precipitation, i.e. there was a redistribution of activity between the aqueous phase and the precipitate, heated for 5 minutes According to the table shows that the drug does not match the target product.

Пример 3. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Снижают значение pH до 7,2, используя 0,1н HCl. Затем прогревают 5 мин в кипящей бане. Осадок не образовался. Значения активностей не превышают исходные (см. таблицу). Example 3. Prepare an aqueous solution of the prototype drug. Reduce pH to 7.2 using 0.1 N HCl. Then warm for 5 minutes in a boiling bath. No precipitate formed. The activity values do not exceed the initial values (see table).

Пример 4. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют до значения pH 6,0 концентрированной муравьиной кислотой. Затем в течение 2 мин прогревают в кипящей бане. Осадок не образовался. Полученный препарат по активности соответствует исходному (см. таблицу). Example 4. Prepare an aqueous solution of the prototype drug. Acidified to pH 6.0 with concentrated formic acid. Then, they are heated in a boiling bath for 2 minutes. No precipitate formed. The resulting preparation according to activity corresponds to the initial one (see table).

Пример 5. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Доводят значение pH до 6,0 0,1н HCl. Прогревают в кипящей бане в течение 18 мин. Из таблицы видно, что в результате продолжительного прогревания произошла денатурация белковых компонентов исходного раствора. Example 5. Prepare an aqueous solution of the prototype drug. The pH was adjusted to 6.0 with 0.1 N HCl. Warm up in a boiling bath for 18 minutes. The table shows that as a result of prolonged heating, the protein components of the initial solution were denatured.

Claims

A method of obtaining an antiprocoagulant drug from medical leeches, including freezing leeches, lyophilization followed by grinding, characterized in that the resulting powder is diluted with water, acidified to pH 5.8 7.0, heated in a boiling water bath for 3 to 15 minutes, and then collected filtrate.