RU2099348C1 - Method of isolation of the recombinant polypeptide having somatotropin sequence - Google Patents
Method of isolation of the recombinant polypeptide having somatotropin sequence Download PDFInfo
- Publication number
- RU2099348C1 RU2099348C1 SU925052820A SU5052820A RU2099348C1 RU 2099348 C1 RU2099348 C1 RU 2099348C1 SU 925052820 A SU925052820 A SU 925052820A SU 5052820 A SU5052820 A SU 5052820A RU 2099348 C1 RU2099348 C1 RU 2099348C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- molecular weight
- proteins
- solution
- recombinant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение в целом относится к способам выделения рекомбинантных белков в частности к способу выделения рекомбинантных белков из белковых растворов, содержащих высокомолекулярные загрязняющие белки. The invention generally relates to methods for isolating recombinant proteins, in particular to a method for isolating recombinant proteins from protein solutions containing high molecular weight contaminating proteins.
Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны, так гетерологичные сегменты ДНК, кодирующие конкретный белок, с помощью методов биотехнологии внедряют в микроорганизмы-хозяева. Выращиванием микроорганизмов-трансформантов в условиях, индуцирующих экспрессию белков, можно получить такие гетерологичные белки, как инсулин, соматотропины, интерлейкины, интерфероны, соматомедины и т.п. Methods for producing recombinant proteins are well known, as heterologous DNA segments encoding a particular protein are introduced into host microorganisms using biotechnological methods. By cultivating transforming microorganisms under conditions inducing protein expression, heterologous proteins such as insulin, growth hormones, interleukins, interferons, somatomedins, etc. can be obtained.
К сожалению, гетерологичные белки, продуцируемые микроорганизмами-трансформантами, часто биологически неактивны, поскольку такие белки не совпадают с соответствующей третичной структурой при их транскрибировании в микроорганизме. Гетерологичные белки имеют тенденцию к образованию агрегатов, распознаваемых в клетках как "тела включения". Такие тела включения могут также возникнуть в результате образования ковалентных межмолекулярных дисульфидных связей, которыми нескольо белковых молекул связываются друг с другом с образованием нерастворимых комплексов. Тела включения, как правило, содержат в основном гетерологичные белки и небольшую долю загрязняющих белков микроорганизма-хозяина. Unfortunately, heterologous proteins produced by transforming microorganisms are often biologically inactive, since such proteins do not coincide with the corresponding tertiary structure when they are transcribed in the microorganism. Heterologous proteins tend to form aggregates that are recognized in cells as “inclusion bodies”. Such inclusion bodies can also arise as a result of the formation of covalent intermolecular disulfide bonds, by which several protein molecules bind to each other with the formation of insoluble complexes. Inclusion bodies, as a rule, contain mainly heterologous proteins and a small fraction of the contaminating proteins of the host microorganism.
Создано несколько способов извлечения из микроорганизмов тел включения и превращения содержащихся в них гетерологичных белков в белки с нативной биоактивностью, сопоставимой с активностью родственных природных или нерекомбинантных белков. Такие способы обычно включают разрушение клеток микроорганизма, отделение тел включения от клеточных осколков, солюбилизацию белковых тел включения в денатуранте-детергенте, освобождающем белок, отделение гетерологичных белков тел включения от нерастворимых примесей, удаление денатуранта-детергента с восстановлением в результате гетерологичным белком биоактивной третичной конформации и отделение белка от остающихся в растворе загрязняющих белков. Several methods have been developed for extracting inclusion bodies from microorganisms and converting the heterologous proteins contained in them into proteins with native bioactivity comparable to the activity of related natural or non-recombinant proteins. Such methods typically include the destruction of microorganism cells, the separation of inclusion bodies from cell fragments, the solubilization of protein inclusion bodies in a denatured detergent that releases the protein, the separation of heterologous proteins of the inclusion bodies from insoluble impurities, the removal of the denatured detergent with the restoration of the bioactive tertiary conformation and the heterologous protein and separation of the protein from the contaminating proteins remaining in the solution.
Известно несколько схем очистки рекомбинантного белка с применением указанных общих процедур: патенты США NN 4511503 и 4518526 (01son и др.) и патенты США NN 4511502 и 4620948 (BuiIoer и др.) раскрывают многостадийные способы, в которых (1) тела включения солюбилизируют в сильном денатуранте и восстановителе, (2) нерастворимые примеси удаляют из раствора солюбилизированного белка, (3) сильный денатурант заменяют слабым денатурантом, (4) осуществляют распрямление белка путем окисления сульфгидрильных групп до дисульфидных связей с применением молекулярного кислорода и катализатора, обычно катионов металлов и тетратионата натрия, и (5) отделяют белок от других загрязняющих белков с помощью методов разделения на мембранах или хроматографическими методами. Several recombinant protein purification schemes are known using these general procedures: U.S. Patent Nos. 4,511,503 and 4,518,526 (01son et al.) And U.S. Patent Nos. 4,511,502 and 4,620,948 (BuiIoer et al.) Disclose multistage processes in which (1) inclusion bodies are solubilized in strong denaturant and reducing agent, (2) insoluble impurities are removed from the solubilized protein solution, (3) strong denaturant is replaced with weak denaturant, (4) the protein is straightened by oxidizing sulfhydryl groups to disulfide bonds using molecular oxygen and a catalyst, typically metal cations and sodium tetrathionate, and (5) the protein is separated from other contaminating proteins by membrane separation techniques in or chromatographic techniques.
В патенте США N 4677196 (Rausch и др.), приводимом здесь в качестве ссылки, раскрывается конкретный способ очистки и активирования белков, являющийся вариацией вышеприведенной общей схемы. Способ включает солюбилизацию тел включения в НДС, удаление избытка НДС из раствора с помощью диализа или иной приемлемой процедуры, хроматографирование раствора белка в НДС на задерживающей ионы смоле и хроматографирование полученного раствора на анионообменной смоле с выделением белка. US Pat. No. 4,677,196 (Rausch et al.), Incorporated herein by reference, discloses a specific method for purifying and activating proteins, which is a variation of the above general scheme. The method includes solubilizing the inclusion bodies in the VAT, removing excess VAT from the solution using dialysis or other acceptable procedure, chromatography of the protein solution in VAT on the ion-trapping resin, and chromatography of the resulting solution on the anion exchange resin to isolate the protein.
Всем таким известным методикам присуща общая проблема. Раствор белка, полученный после удаления денатуранта-детергента, содержит рекомбинантный белок, низкомолекулярные загрязняющие белки, небелковые примеси и высокомолекулярные белковые примеси, при этом высокомолекулярные белковые примеси часто в основном представлены димерами, олигомерами и агрегатами рекомбинантного белка, но также включают нерекомбинантные белки от гидролиза клетки. Часто отделение рекомбинантного белка от указанных примесей, в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного белка достигается с трудом, требует времени и дорого. Методы хроматографии и разделения на мембранах могут оказаться эффективными при отделении белка от примесей, но такие методы громоздки, длительны, дорогостоящи и часто приводят к низкому процентному выходу выделения белка. All such well-known techniques have a common problem. The protein solution obtained after removal of the denaturing detergent contains a recombinant protein, low molecular weight contaminating proteins, non-protein contaminants and high molecular weight protein contaminants, while high molecular weight protein contaminants are often mainly represented by dimers, oligomers and aggregates of the recombinant protein, but also include non-recombinant cells . Often the separation of the recombinant protein from these impurities, in particular dimers, oligomers and aggregates of the recombinant protein is difficult, time consuming and expensive. Chromatography and membrane separation methods may be effective in separating the protein from impurities, but such methods are cumbersome, time consuming, expensive and often lead to a low percentage yield of protein isolation.
Таким образом, существует необходимость в новых улучшенных способах простого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантного белка из растворов, содержащих высокомолекулярные белковые примеси. Thus, there is a need for new improved methods for simple, fast and inexpensive isolation with high yields of recombinant protein from solutions containing high molecular weight protein impurities.
Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в создании нового способа простого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантных белков из белковых растворов, содержащих высокомолекулярные примесные белки. Thus, the aim of the present invention is to provide a new method for simple, fast and inexpensive isolation with high yields of recombinant proteins from protein solutions containing high molecular weight impurity proteins.
Другая цель настоящего изобретения заключается в создании способа удаления высокомолекулярных примесных белков из раствора рекомбинантного белка, что в результате позволяет легко, быстро и недорого выделить рекомбинантный белок. Another objective of the present invention is to provide a method for removing high molecular weight impurity proteins from a solution of a recombinant protein, which as a result makes it possible to easily, quickly and inexpensively isolate a recombinant protein.
Эти и другие цели изобретения достигают непосредственным добавлением солей металла IIA Группы к раствору, содержащему высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантный белок в количестве, достаточном для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли индуцируют преимущественное осаждение белков с молекулярной массой, примерно в полтора раза превышающей молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности димеры, олигомеры и агрегаты рекомбинантного белка. Осадок отделяют от раствора с оставлением в растворе рекомбинантного белка, низкомолекулярных примесных белков и других небелковых примесей. Рекомбинантный белок выделяют из раствора известными методами и его обработкой получают целевой белковый продукт. These and other objects of the invention are achieved by the direct addition of Group IIA metal salts to a solution containing high molecular weight impurity proteins and a recombinant protein in an amount sufficient to selectively precipitate high molecular weight protein impurities. Salts induce preferential precipitation of proteins with a molecular weight of about one and a half times the molecular weight of the recombinant protein, in particular dimers, oligomers and aggregates of the recombinant protein. The precipitate is separated from the solution, leaving a recombinant protein, low molecular weight impurity proteins and other non-protein contaminants in the solution. The recombinant protein is isolated from the solution by known methods and its processing to obtain the desired protein product.
В рекомендуемом воплощении изобретения соли металла IIА Группы добавляют непосредственно в раствор в количестве, достаточном для создания 0,1-10%-го (об) раствора. Высокомолекулярные примесные белки осаждаются, и их удаляют из раствора обычными способами, такими как фильтрование, центрифугирование и т. п. Полученный белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси, подвергают дальнейшей обработке с помощью обычных процедур, например хроматографии с выделением рекомбинантного белка. In a preferred embodiment of the invention, Group IIA metal salts are added directly to the solution in an amount sufficient to create a 0.1-10% (v) solution. High molecular weight impurity proteins are precipitated and removed from the solution by conventional methods, such as filtration, centrifugation, etc. The resulting protein solution containing recombinant protein, low molecular weight impurity proteins and other non-protein contaminants is further processed using conventional procedures, for example, chromatography with the selection of recombinant protein.
Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания изобретения. Other objectives, advantages and new features of the present invention will become apparent from the following detailed description of the invention.
Термином "рекомбинантный белок" в применяемом здесь значении обозначается белок, полученный рекомбинантными методами, который хотят выделить в сравнительно чистом виде, в том числе белки с аминокислотной последовательностью нативных белков и их аналогов и мутеинов, характеризующиеся замещенной, подвергнутой делеции, заменной или иным способом модифицированной последовательностью. The term "recombinant protein" as used herein refers to a protein obtained by recombinant methods that want to isolate in a relatively pure form, including proteins with the amino acid sequence of native proteins and their analogues and muteins, characterized by substituted, deleted, substituted or otherwise modified sequence.
Термин "рекомбинантный соматотропин" (рСТ) в применяемом здесь значении включает рекомбинантные белки с аминокислотной последовательностью нативного соматотропина, аминоксилотной последовательностью, по существу аналогичной последовательности нативного соматотропина или укороченной последовательностью, а также их аналоги и мутеины, характеризующиеся замещенной, подвергнутой делеции, замененной или иным образом модифицированной последовательностью. В частности, рСТ в применяемом здесь значении включает белок с той же самой последовательностью, что и у нативного соматотропина (СТ), но в которой аминокислоты амино-окончания подвергнуты делеции. Примеры подобных белков включают, но без ограничения только ими: рекомбинантный дельта-7- соматотропин свиньи, рекомбинантный дельта-4-соматотропин коровы и т.п. The term “recombinant somatotropin” (pST) as used herein includes recombinant proteins with an amino acid sequence of a native somatotropin, an amino acid sequence substantially the same as a native somatotropin or a shortened sequence, and their analogs and muteins characterized by a substituted, deletion, substituted or way of a modified sequence. In particular, pST, as used herein, includes a protein with the same sequence as that of native somatotropin (CT), but in which amino acids of the amino termination are deleted. Examples of such proteins include, but are not limited to: recombinant porcine delta-7-somatotropin, cow recombinant delta-4-somatotropin, and the like.
Термин "высокомолекулярные примесные белки" или "высокомолекулярные белковые примеси" в применяемом здесь значении относится к белкам с молекулярной массой, примерно 1,5 раз превышающей молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности к димерам, олигомерам и агрегатам рекомбинантного белка, чья молекулярная масса примерно вдвое превышает молекулярную массу рекомбинантного белка. The term "high molecular weight impurity proteins" or "high molecular weight protein impurities" as used herein refers to proteins with a molecular weight of about 1.5 times the molecular weight of a recombinant protein, in particular dimers, oligomers and aggregates of a recombinant protein, whose molecular weight is approximately double exceeds the molecular weight of the recombinant protein.
Термином "низкомолекулярные примесные белки" или "низкомолекулярные белковые примеси" в применяемом здесь значении обозначаются белки с молекулярной массой примерно в 1,5 раз ниже молекулярной массы рекомбинантного белка. The term "low molecular weight impurity proteins" or "low molecular weight protein impurities" as used herein refers to proteins with a molecular weight of about 1.5 times lower than the molecular weight of the recombinant protein.
Термин "небелковые примеси" в применяемом здесь значении относится к сравнительно низкомолекулярным веществам, таким как осадители, солюбилизирующие средства, окислители, восстановители и т.п. обычно присутствующих в белковых растворах. The term "non-proteinaceous impurities" as used here refers to relatively low molecular weight substances, such as precipitants, solubilizing agents, oxidizing agents, reducing agents, etc. usually present in protein solutions.
Согласно настоящему изобретению, дается способ выделения рекомбинантного белка из белкового раствора, содержащего высокомолекулярные примесные белки. Способ заключается в непосредственном добавлении солей металла IIА Группы к раствору, содержащему высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантный белок в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли металла IIА Группы преимущественно индуцируют осаждение белков, чья молекулярная масса примерно в 1,5 раза превышает молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного белка, молекулярная масса которых примерно в 2 раза превышает молекулярную массу рекомбинантного белка. Способ представляет собой улучшенный способ легкого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантных белков из растворов, содержащих высокомолекулярные белковые примеси. According to the present invention, a method for isolating a recombinant protein from a protein solution containing high molecular weight impurity proteins is provided. The method consists in the direct addition of Group IIA metal salts to a solution containing high molecular weight impurity proteins and recombinant protein in amounts sufficient for the selective precipitation of high molecular weight protein impurities. Group IIA metal salts predominantly induce the precipitation of proteins whose molecular weight is about 1.5 times the molecular weight of the recombinant protein, in particular dimers, oligomers and aggregates of the recombinant protein, the molecular weight of which is about 2 times the molecular weight of the recombinant protein. The method is an improved method for easy, fast and inexpensive isolation with high yields of recombinant proteins from solutions containing high molecular weight protein impurities.
В рекомендуемом воплощении изобретения дается способ выделения рекомбинантных соматотропинов (молекулярная масса примерно 20000) непосредственным добавлением солей металла IIА Группы к растворам, содержащим высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантные соматотропины в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли металла IIА Группы преимущественно индуцируют осаждение белков с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз превышающей молекулярную массу рекомбинантного соматотропина (с молекулярной массой более чем примерно 30000), в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного соматотропина (молекулярная масса примерно 40000 и выше). Таким образом, настоящий способ представляет собой способ отделения рекомбинантного соматотропина от его биологически неактивных димеров, олигомеров и агрегатов. In a preferred embodiment of the invention, there is provided a method for isolating recombinant growth hormones (molecular weight of about 20,000) by directly adding Group IIA metal salts to solutions containing high molecular weight impurity proteins and recombinant growth hormones in amounts sufficient for the selective precipitation of high molecular weight protein impurities. Group IIA metal salts predominantly precipitate proteins with a molecular weight of about 1.5 times the molecular weight of recombinant somatotropin (with a molecular weight of more than about 30,000), in particular dimers, oligomers and aggregates of recombinant somatotropin (molecular weight of about 40,000 or more) . Thus, the present method is a method for separating recombinant growth hormone from its biologically inactive dimers, oligomers and aggregates.
Растворы, содержащие рекомбинантный белок, небелковые примеси, высокомолекулярные белковые примеси и низкомолекулярные белковые примеси и применимые в настоящем изобретении, получают хорошо известными методами. Как правило, белковые тела включения, продуцированные рекомбинантными микроорганизмами, обрабатывают с удалением липидов и клеточных осколков, и полученные сравнительно чистые тела включения, содержащие рекомбинантный белок и примесные белки, в частности высокомолекулярные димеры, олигомеры и агрегаты рекомбинантного белка, солюбилизируют в сильном денатуранте или детергенте, таком как гидрохлорид гуанидина, натрийдодецилсульфат (НДС), Тритон и т.п. Solutions containing recombinant protein, non-protein contaminants, high molecular weight protein contaminants and low molecular weight protein contaminants and useful in the present invention are prepared by well known methods. Typically, protein inclusion bodies produced by recombinant microorganisms are treated to remove lipids and cell debris, and the resulting relatively clean inclusion bodies containing recombinant protein and impurity proteins, in particular high molecular weight dimers, oligomers and aggregates of the recombinant protein, are solubilized in strong denaturant or detergent such as guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate (VAT), Triton, etc.
Полученный белковый раствор отделяют от любых нерастворимых веществ и после удаления сильного денатуранта или детергента получают белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, переведенный в свою нативную биоактивную конфигурацию, высокомолекулярные белковые примеси, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси. Подобные растворы обычно содержат 1-50 мг/мл полного белка и 0,05-4 мг/мл рекомбинантного белка. The resulting protein solution is separated from any insoluble substances and after removal of strong denaturant or detergent, a protein solution is obtained containing a recombinant protein converted to its native bioactive configuration, high molecular weight protein impurities, low molecular weight impurity proteins and other non-protein impurities. Such solutions usually contain 1-50 mg / ml complete protein and 0.05-4 mg / ml recombinant protein.
Отношение полимера к мономеру (П/Мв)в таком растворе включает отношение по массе агрегатов, включая пустого пика к мономеру, в силу чего является мерой чистоты раствора. Раствор обычно проходит стадию "предочистки", на которой отношение П/М снижают до примерно 0,5 или ниже. Затем раствор может быть подвергнут дальнейшей очистке и переработан в конечный продукт, как правило, использованием ЕАЕ-Сефарозы или другой приемлемой колонки. Настоящим изобретением дается способ удаления высокомолекулярных примесных белков с одновременным достижением более высокой степени выделения мономера и более низкого отношения П/М. The ratio of polymer to monomer (P / MW) in such a solution includes the ratio by weight of aggregates, including the empty peak to monomer, which is therefore a measure of the purity of the solution. The solution typically goes through a “pretreatment” step in which the P / M ratio is reduced to about 0.5 or lower. The solution can then be further purified and processed into the final product, typically using EAE-Sepharose or another suitable column. The present invention provides a method for removing high molecular weight impurity proteins while achieving a higher degree of monomer isolation and a lower P / M ratio.
Соли металла IIА Группы добавляют к такому раствору, в соответствии с настоящим изобретением, с целью осаждения высокомолекулярных примесных белков. Высокомолекулярные примесные белки, осаждающиеся при добавлении солей металла IIА Группы, удаляют из раствора обычными средствами, такими как фильтрование, центрифугирование и т.п. Полученный белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси при наличии таковых, подвергают дальнейшей обработке по мере необходимости с удалением низкомолекулярных примесных белков и других небелковых примесей, таких как осадители, солюбилизирующие средства, окислители, восстановители т.п. Обычно такие небелковые примеси удаляют диализом, хроматографией или иными приемлемыми способами, в то время как низкомолекулярные примесные белки отделяют от белка ионообменной хроматографией или ее разновидностью. Group IIA metal salts are added to such a solution in accordance with the present invention to precipitate high molecular weight impurity proteins. High molecular weight impurity proteins precipitated by the addition of Group IIA metal salts are removed from the solution by conventional means, such as filtration, centrifugation, etc. The resulting protein solution containing a recombinant protein, low molecular weight impurity proteins and other non-protein contaminants, if any, is further processed as necessary with the removal of low molecular weight impurity proteins and other non-protein contaminants, such as precipitants, solubilizing agents, oxidizing agents, reducing agents, etc. Typically, such non-proteinaceous impurities are removed by dialysis, chromatography, or other suitable methods, while low molecular weight impurity proteins are separated from the protein by ion exchange chromatography or a variety thereof.
Белковый раствор подвергают дальнейшей обработке с получением белка или белковой композиции, пригодных для намеченного использования, обычно лиофилизацией. Такие методы хорошо известны. The protein solution is further processed to obtain a protein or protein composition suitable for the intended use, usually by lyophilization. Such methods are well known.
Соли металлов IIА Группы, применимые в настоящем изобретении, включают все соли элементов IIА Группы Периодической таблицы: беррилия, магния, кальция, стронция, бария и радия. Рекомендуемые соединения включают соли магния, кальция, бария и стронция. Metal salts of Groups IIA of the group applicable in the present invention include all salts of elements of Group IIA of the Periodic Table: berrylium, magnesium, calcium, strontium, barium and radium. Recommended compounds include magnesium, calcium, barium, and strontium salts.
Наиболее рекомендуемые соединения настоящего изобретения включают: сульфат (SO4), хлорид (Cl2) и нитрат (NO3) магния, кальция, бария и стронция. Рекомендуемые соединения включают: сульфат кальция (CaSO4), безводный CaSO4, полугидрат CaSO4, нитрат кальция (Ca(NO3)2), лактат кальция, сульфат магния (MgSO4), хлорид магния (MgCl2), хлорид бария (BaCl2) и хлорид стронция (SrCl2).The most recommended compounds of the present invention include: sulfate (SO 4 ), chloride (Cl 2 ) and nitrate (NO 3 ) of magnesium, calcium, barium and strontium. Recommended compounds include: calcium sulfate (CaSO 4 ), anhydrous CaSO 4 , hemihydrate CaSO 4 , calcium nitrate (Ca (NO 3 ) 2 ), calcium lactate, magnesium sulfate (MgSO 4 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), barium chloride ( BaCl 2 ) and strontium chloride (SrCl 2 ).
Хотя количество солей металла IIА Группы, необходимое для осаждения, меняется в зависимости от концентрации белка, характеристик белка, добавляемого соединения и т.п. тем не менее соли металла IIА Группы обычно добавляют к раствору в количествах, достаточных для создания концентрации соединения в растворе 0,1-10% об, предпочтительно 1-3%
Рекомбинантным белком, выделяемым способом настоящего изобретения, может быть любой белок с молекулярной массой более 5000, продуцируемый рекомбинантными микроорганизмами, как правило, в телах включения. В их числе соматотропин, инсулины, соматомедины, соматостатины, пролактины, плацентальные лактогены и т.п.Although the amount of Group IIA metal salts required for precipitation varies depending on the protein concentration, protein characteristics, added compound, and the like. however, Group IIA metal salts are usually added to the solution in amounts sufficient to create a concentration of the compound in the solution of 0.1-10% v, preferably 1-3%
The recombinant protein secreted by the method of the present invention can be any protein with a molecular weight of more than 5000 produced by recombinant microorganisms, usually in inclusion bodies. Among them, somatotropin, insulins, somatomedins, somatostatins, prolactins, placental lactogens, etc.
Наиболее предпочтительно, если способом настоящего изобретения выделяют рекомбинантные соматотропины (молекулярная масса около 20000. Рекомбинантным соматотропином может быть рекомбинантный соматотропин из любого источника, но предпочтительно это бычий, свиной, птичий, овечий, человеческий рекомбинантный соматотропин, наиболее предпочтительно свиной или бычий рекомбинантный соматотропин. Most preferably, recombinant growth hormones (molecular weight about 20,000) are isolated by the method of the present invention. Recombinant growth hormone may be recombinant growth hormone from any source, but preferably bovine, pork, avian, sheep, human recombinant growth hormone, most preferably porcine or bovine recombinant growth hormone.
Способы получения таких рекомбинантных белков хорошо известны, см. например, патент США NN 4604359 и 433717, раскрывающие способы получения человеческих рекомбинантных соматотропинов, патент США NN 4431739, раскрывающий способ получения рекомбинантных соматотропинов, заявка на Европейский патент 0104920, раскрывающая способ получения рекомбинантного свиного соматотропина, патент США N 4443359, раскрывающий способ получения рекомбинантного бычьего соматропина, работу Schoner, Biotechnology, 3(2), 151-54, раскрывающую способ получения рекомбинантного соматотропина, и работу Buell, Nucleic Acid Res. 13, 1923-38 (1985), раскрывающую способ получения рекомбинантного соматомедина С. Methods for producing such recombinant proteins are well known, see, for example, U.S. Patent Nos. 4,604,359 and 4,337,717, disclosing methods for producing human recombinant growth hormones, US Pat. US patent N 4443359, disclosing a method for producing recombinant bovine somatropin, the work of Schoner, Biotechnology, 3 (2), 151-54, disclosing a method for producing recombinant somatotropin, and p bot Buell, Nucleic Acid Res. 13, 1923-38 (1985), disclosing a method for producing recombinant somatomedin C.
Кроме того, в заявке на Европейский патент, публикация 0103395, описано конструирование штамма-трансформанта E. coti, содержащего первую плазмиду, кодирующую бычий дельта-9-(Ser)-соматотропин (соматотропин, уменьшенный на свои 9 N-концевых аминокислот и с дополнительным остатком серина в N-окончании) под контролем лямбда-PL-промотора-оператора и имеющий область Шайн-Дальгарно, происходящего из бактериофага mu. Трансформатор содержит также вторую плазмиду (рс 1857), кодирующую продуцирование чувствительного к температуре белка-репрессора рс 1857. Белок-репрессор может быть дезактивирован повышением температуры примерно до 42oС с индуцированием в результате экспрессии бычьего дельта-9-(Ser)-соматотропина. Штамм-трансформант этого типа /E. coti HBIOI (PL-mu-дельта-9-(Ser)-соматотропин коровы и рс 1857) депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Роквилл, шт. МД под регистрационным N 53030.In addition, European patent application publication 0103395 describes the construction of an E. coti transform strain containing a first plasmid encoding a bovine delta-9- (Ser) somatotropin (somatotropin reduced by its 9 N-terminal amino acids and with an additional the remainder of serine at the N-terminus) under the control of a lambda-PL promoter operator and having a Shine-Dalgarno region originating from the bacteriophage mu. The transformer also contains a second plasmid (pc 1857) encoding the production of the temperature-sensitive pc 1857 repressor protein. The repressor protein can be deactivated by raising the temperature to about 42 ° C and inducing bovine delta-9- (Ser) somatotropin as a result of expression. A strain transformant of this type / E. coti HBIOI (PL-mu-delta-9- (Ser) -somatotropin cow and pc 1857) deposited in the American type culture collection (ATCC), Rockville, pc. MD under registration N 53030.
Конструирование аналогичного штамма-трансформанта, кодирующего продуцирование свиного дельта-7-соматотропина (свиной соматотропин, уменьшенный на свои 7 N-концевые аминокислоты) описано в заявке на Европейский патент, публикация N 0104920. Штамм-трансформант этого типа/E.coti HBIOI (PL-mu-дельта-7-соматотропин свиньи и рс 1857) депонирован в АТСС под регистрационным N 53031. The construction of a similar transformant strain encoding the production of porcine delta-7-somatotropin (porcine somatotropin reduced by its 7 N-terminal amino acids) is described in European Patent Application Publication No. 0104920. This type of transformant strain / E.coti HBIOI (PL pig mu-delta-7-somatotropin and pc 1857) deposited in ATCC under registration No. 53031.
Штаммы 53030 и 53031 являются продуктивными производителями соответственно бычьего дельта-9-(Ser)-соматотропина и свиного дельта-7-соматоропина. В обоих случаях экспрессированный белок секвестирован в клетке в виде нерастворимых, биологически неактивных, видимых под микроскопом тел включения. Известны и другие способы получения многих других аналогичных белков. Strains 53030 and 53031 are productive producers of bovine delta-9- (Ser) somatotropin and pork delta-7-somatoropine, respectively. In both cases, the expressed protein is sequestered in the cell in the form of insoluble, biologically inactive, inclusion bodies visible under the microscope. Other methods are known for producing many other similar proteins.
В рекомендуемом воплощении изобретения раствор рекомбинантного соматотропина, содержащий 1-50 мг/мл общего белка и 0,05-2 мг/мл рекомбинантного соматотропина, обрабатывают 1-3% CaSO4 с осаждением высокомолекулярных белковых примесей. Осадок удаляют центрифугированием, а рекомбинантный соматотропин выделяют из полученного раствора с помощью вышеприведенных процедур.In a recommended embodiment of the invention, a recombinant somatotropin solution containing 1-50 mg / ml total protein and 0.05-2 mg / ml recombinant somatotropin is treated with 1-3% CaSO 4 to precipitate high molecular weight protein impurities. The precipitate is removed by centrifugation, and recombinant somatotropin is isolated from the resulting solution using the above procedures.
Хотя вышеописанный способ выделения направлен на выделение рекомбинантных белков, способ в равной степени применим для отделения и выделения нерекомбинантных белков. К примеру, раствор, содержащий смесь (1) "полезного или целевого белка" (2) высокомолекулярных белков (с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз превышающей молекулярную массу полезного белка) и (3) низкомолекулярных белков (с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз меньше, чем у полезного белка), обрабатывают способом настоящего изобретения и осаждением высокомолекулярных белков и в результате отделением высокомолекулярных белков от полезного белка и низкомолекулярных белков. Высокомолекулярные белки отделяют от раствора и отбрасывают или при желании подвергают дальнейшей обработке, так высокомолекулярные белки могут быть выделены из осадка его повторным растворением и извлечением белков из раствора. Although the above isolation method is directed to the isolation of recombinant proteins, the method is equally applicable to the separation and isolation of non-recombinant proteins. For example, a solution containing a mixture of (1) “useful or target protein” (2) high molecular weight proteins (with a molecular weight of about 1.5 times the molecular weight of the healthy protein) and (3) low molecular weight proteins (with a molecular weight of approximately 1.5 times less than that of the useful protein), treated with the method of the present invention and the precipitation of high molecular weight proteins and, as a result, the separation of high molecular weight proteins from the useful protein and low molecular weight proteins. High molecular weight proteins are separated from the solution and discarded or, if desired, subjected to further processing, so high molecular weight proteins can be isolated from the precipitate by its repeated dissolution and extraction of proteins from the solution.
Полезный белок отделяют от низкомолекулярных белков обычными способами и при желании подвергают дальнейшей обработке с получением белкового продукта. Низкомолекулярные белки, отделенные от полезного белка, отбрасывают или при желании подвергают дальнейшей обработке. Как правило, низкомолекулярные белки могут быть отделены от полезного белка хроматографией или иным способом, применимым для разделения белков с близкими молекулярными массами. Многие такие способы разделения белков хорошо известны опытному специалисту и в равной степени применимы в настоящем изобретении. Useful protein is separated from low molecular weight proteins by conventional methods and, if desired, subjected to further processing to obtain a protein product. Low molecular weight proteins separated from the beneficial protein are discarded or further processed if desired. As a rule, low molecular weight proteins can be separated from the useful protein by chromatography or by another method applicable for the separation of proteins with similar molecular weights. Many of these protein separation methods are well known to those skilled in the art and are equally applicable to the present invention.
После того как изобретение раскрыто в общих чертах, нижеследующие примеры даются в качестве конкретных воплощений изобретения и с целью показать его практические возможности и его преимущества. Ясно, что примеры даются только с целью иллюстрации и ни в коей мере не предназначены для ограничения описания или последующей формулы изобретения. В частности, применяемые в опытах тела включения получены из трансформированных штаммов E.coti, продуцирующих свиной дельта-7-соматотропин. Тела включения выделены из E.coti штамма-хозяина HBIOI, трансформированного первой плазмидой (PL-mu-дельта-7-сСТ), кодирующей дельта-7 сСТ, и второй плазмидой (рс 1857), кодирующей чувствительный к температуре белок-репрессор лямбда-фага. Многие другие микроорганизмы продуцируют тела включения, содержащие рекомбинантные белки многих типов, которые будут работать в настоящем изобретении. Аналогично, способы выращивания таких микроорганизмов с целью получения тел включения хорошо известны. After the invention has been generally described, the following examples are given as specific embodiments of the invention and in order to show its practical capabilities and its advantages. It is clear that the examples are given for the purpose of illustration only and are in no way intended to limit the description or the following claims. In particular, the inclusions used in the body experiments were obtained from transformed E. coti strains producing pork delta-7-somatotropin. Inclusion bodies were isolated from E. coti of the HBIOI host strain transformed with the first plasmid (PL-mu-delta-7-cST) encoding delta-7 cST and the second plasmid (pc 1857) encoding the temperature-sensitive lambda-repressor protein phage. Many other microorganisms produce inclusion bodies containing many types of recombinant proteins that will work in the present invention. Similarly, methods for growing such microorganisms in order to obtain inclusion bodies are well known.
Пример 1. Рекомбинантный свиной соматотропин (рсСТ) выделяют из тел включения (1) растворителем тел включения в натрийдодецилсульфате (НДС) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3 и 21 мМ Na2CO3), (2) удалением из раствора нерастворимых примесей, (3) добавлением окислителя для окисления рсСТ и (4) удалением из раствора НДС с тем, чтобы позволить рсСТ принять биоактивную конфигурацию. Полученный белковый раствор содержит рсСТ, высокомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси.Example 1. Recombinant porcine somatotropin (PCST) is isolated from inclusion bodies (1) with a solvent of inclusion bodies in sodium dodecyl sulfate (VAT) in carbonate buffer (25 mM NaHCO 3 and 21 mM Na 2 CO 3 ), (2) removing insoluble impurities from the solution, (3) adding an oxidizing agent to oxidize the pcST; and (4) removing the VAT from the solution in order to allow the pcST to adopt a bioactive configuration. The resulting protein solution contains PCCT, high molecular weight impurity proteins and other non-protein contaminants.
К полученному раствору белка с восстановленной конфигурацией, содержащему 0,67 мг/мл мономерного рсСТ, с П/М отношением 5,1 (рН 9,8 при 22-25oC) добавляют CaSO4•2H2O до концентрации 2,5% (мас./об.) и перемешивают 2 часа. Смесь центрифугируют 10 минут при 5000•G с получением надосадочной жидкости. Содержание мономерного рсСТ и П/М отношение в надосадочной жидкости анализируют с помощью жидкостной хроматографии для быстрого определения белков (ЖХБОБ) на Супероузе-12. Полученные результаты показывают, что отношение П/М снизилось до 0,3, а выделение мономера составляет 83% Полученные данные показывают, что белковые агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются CaSO4•2H2O с оставлением в растворе мономеров.CaSO 4 · 2H 2 O is added to the resulting solution of the reconstituted protein containing 0.67 mg / ml of monomeric PCST with a P / M ratio of 5.1 (pH 9.8 at 22-25 ° C) to a concentration of 2.5 % (wt./about.) and stirred for 2 hours. The mixture is centrifuged for 10 minutes at 5000 • G to obtain a supernatant. The content of monomeric PCST and the P / M ratio in the supernatant was analyzed by liquid chromatography for rapid protein determination (LCBC) on Superose-12. The obtained results show that the P / M ratio decreased to 0.3, and the monomer release is 83%. The obtained data show that protein aggregate impurities and high molecular weight impurity proteins are selectively precipitated with CaSO 4 • 2H 2 O, leaving monomers in solution.
Пример 2. Воспроизведен пример 1, но с применением других солей кальция: безводного CaSO4, полугидрата CaSO4, нитрата кальция (Ca(NO3)2 и лактата кальция. Полученные результаты приведены в табл.1.Example 2. Example 1 is reproduced, but using other calcium salts: anhydrous CaSO 4 , hemihydrate CaSO 4 , calcium nitrate (Ca (NO 3 ) 2 and calcium lactate. The results are shown in table 1.
Данные табл. 1 показывают, что агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются при добавлении перечисленных солей. The data table. 1 show that aggregate impurities and high molecular weight impurity proteins are selectively precipitated by the addition of these salts.
Пример 3. Воспроизведен пример 1, но с применением солей щелочноземельных металлов: магния, бария и стронция. Полученные результаты приведены в табл.2. Example 3. Example 1 is reproduced, but using salts of alkaline earth metals: magnesium, barium and strontium. The results are shown in table.2.
Данные табл. 2 показывают, что агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются указанными в таблице солями щелочноземельных металлов. The data table. 2 show that aggregate impurities and high molecular weight impurity proteins are selectively precipitated by the alkaline earth metal salts indicated in the table.
Пример 4. К раствору белка с восстановленной конфигурацией примера 1, содержащего 0,4 мг/мл рсСТ мономера, с П/М отношением 4,7, добавляют CaCl2•2H2O до концентрации 0,4% (мас./об) и перемешивают 30 минут при комнатной температуре (22-25oC).Example 4. To a protein solution with the restored configuration of Example 1, containing 0.4 mg / ml pcST monomer, with a P / M ratio of 4.7, CaCl 2 • 2H 2 O was added to a concentration of 0.4% (w / v) and stirred for 30 minutes at room temperature (22-25 o C).
Значение рН смеси устанавливают равным примерно 9 и после центрифугирования 10 минут при 5000хG собирают надосадочную жидкость, которую анализируют ЖХБОБ на Супероузе-12. The pH of the mixture is set at about 9 and after centrifugation for 10 minutes at 5000xG, the supernatant is collected, which is analyzed by HCBCB on Superose-12.
В результате П/М отношение снижено до 0,4, а выделение мономера составляет 92,1% Эти данные свидетельствуют, что CaCl2•2H2O осаждает белковые агрегаты и высокомолекулярные примесные белки селективно с оставлением в растворе мономера.As a result, the P / M ratio was reduced to 0.4, and the monomer release was 92.1%. These data indicate that CaCl 2 • 2H 2 O precipitates protein aggregates and high molecular weight impurity proteins selectively, leaving the monomer in solution.
Пример 5. Раствор белка с восстановленной конфигурацией примера 1 концентрируют примерно вдвое и диафильтруют относительно 80 мМ этаноламинного буфера при рН 9. К диафильтрованному белковому раствору, содержащему 0,67 мг/мл мономерного рсСТ, с П/М отношением 3,5 добавляют CaCl2•2H2O до концентрации 0,4% (мас./об) и перемешивают 30 минут при 22-25oC. Центрифугированием 10 минут при 5000хG отделяют надосадочную жидкость, которую анализируют с помощью ЖХБОБ на Супероузе-12.Example 5. The protein solution with the restored configuration of Example 1 was concentrated approximately twice and diafiltered with respect to 80 mM ethanolamine buffer at pH 9. To the diafiltered protein solution containing 0.67 mg / ml of monomeric PCST, with a P / M ratio of 3.5, CaCl 2 was added. • 2H 2 O to a concentration of 0.4% (wt./about.) And stirred for 30 minutes at 22-25 o C. Centrifuged for 10 minutes at 5000xG, the supernatant was separated, which was analyzed using LCBCB on Superose-12.
В результате отношение П/М снижено до 0,22, а выделение мономера составляет 91,5% Приведенные данные показывают, что CaCl2•2H2O селективно осаждает белковые агрегаты и высокомолекулярные примесные белки в этаноламиновой буферной системе.As a result, the P / M ratio was reduced to 0.22, and the monomer release was 91.5%. The data presented show that CaCl 2 • 2H 2 O selectively precipitates protein aggregates and high molecular weight impurity proteins in the ethanolamine buffer system.
Очевидно, что в свете вышеизложенного возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения. В связи с этим необходимо подчеркнуть, что в объеме прилагаемой формулы изобретения само изобретение может быть осуществлено как-то иначе, чем в приведенных примерах. Obviously, in light of the foregoing, numerous modifications and variations of the present invention are possible. In this regard, it must be emphasized that in the scope of the attached claims, the invention itself can be implemented somehow differently than in the above examples.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/468,054 US4988798A (en) | 1990-01-22 | 1990-01-22 | Method for recovering recombinant proteins |
| US468054 | 1990-01-22 | ||
| PCT/US1990/005543 WO1991010678A1 (en) | 1990-01-22 | 1990-10-01 | Method for recovering recombinant proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2099348C1 true RU2099348C1 (en) | 1997-12-20 |
Family
ID=26781698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU925052820A RU2099348C1 (en) | 1990-01-22 | 1990-10-01 | Method of isolation of the recombinant polypeptide having somatotropin sequence |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2099348C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473556C1 (en) * | 2011-07-14 | 2013-01-27 | Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" | Method for commercial production and purification of human recombinant growth hormone of inclusion bodies |
| RU2492177C2 (en) * | 2011-12-15 | 2013-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | METHOD OF ISOLATING AND PURIFYING RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE SECRETED BY Saccharomyces cerevisiae YEAST |
-
1990
- 1990-10-01 RU SU925052820A patent/RU2099348C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. EP, 0226639, кл. C 12 P 21/00, 1987. 2. US, 4511502, кл. C 07 G 7/00, 1985. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2473556C1 (en) * | 2011-07-14 | 2013-01-27 | Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" | Method for commercial production and purification of human recombinant growth hormone of inclusion bodies |
| RU2492177C2 (en) * | 2011-12-15 | 2013-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | METHOD OF ISOLATING AND PURIFYING RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE SECRETED BY Saccharomyces cerevisiae YEAST |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69202049T2 (en) | METHOD FOR CLEANING INTACT AND CORRECTLY FOLDED IGF-I. | |
| AU584032B2 (en) | Method for the purification of erythroppietin and erythropoietin compositions | |
| JPH11506739A (en) | Method for reducing gelation of fatty acid acylated proteins | |
| EP0489711A2 (en) | Method for producing human growth hormone | |
| JPS63169995A (en) | Recovery and purification of beta-interferon | |
| US6084076A (en) | Method of refolding human activin A | |
| US4988798A (en) | Method for recovering recombinant proteins | |
| EP0949335B2 (en) | Process for preparing purified dimer of bone-derived factor | |
| AU615485B2 (en) | Method for promoting intramolecular disulfide bond formation in recombinant proteins contained in denaturant solution | |
| JP2798531B2 (en) | Purification method of somatotropin monomer | |
| RU2075509C1 (en) | Method of isolation of recombinant somatotropin | |
| RU2099348C1 (en) | Method of isolation of the recombinant polypeptide having somatotropin sequence | |
| US5109121A (en) | Method for recovering recombinant proteins | |
| US7744862B2 (en) | Production process of recombinant placental growth factor | |
| US4801691A (en) | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions | |
| US4371462A (en) | Method for purification of anterior pituitary hormones | |
| WO2004050672A2 (en) | Process for the extraction and isolation of insulin from recombinant sources | |
| JP3040189B2 (en) | Protein extraction method | |
| US7811793B2 (en) | Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor | |
| JP2537935B2 (en) | Agricultural reduction and desalination method for physiologically active substances | |
| CA2099967A1 (en) | Process for recovering peptides expressed as fusion proteins | |
| EP0226639A1 (en) | Process for preparing heterogenic protein | |
| JPH022388A (en) | Novel stimulation factor for human granulocyte macrophage colony |