RU2098134C1

RU2098134C1 - Method of inactivation of enteric infection pathogen infectious activity and vaccine for animal immunization

Info

Publication number: RU2098134C1
Application number: RU95101395A
Authority: RU
Inventors: К.Е. Егоров; Б.В. Гнетов; В.С. Кокорев; Л.А. Носырева; Т.Э. Снитковская; Ю.А. Кирсанов; Е.Б. Соколовский; В.Ф. Залесский
Original assignee: Акционерное общество "Титан"
Priority date: 1995-02-01
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 1997-12-10

Abstract

FIELD: veterinary science, medicine, microbiology. SUBSTANCE: microbe-containing medium is treated in microwave furnace at irradiation frequency 23450-2450 MHz at specific power in working chamber 1-3 W/ml for 1-110 min. Correction of specific power is carried out using water as the ballast loading. Method can be used for inactivation of food toxic infection pathogens (salmonellosis, escherichiosis). EFFECT: improved method of inactivation. 3 cl, 1 tbl

Description

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для инактивации инфекционности микроорганизмов, находящихся в жидких средах, в частности возбудителей пищевых токсикоинфекций (сальмонеллезов, эшерихиозов) путем обработки их СВЧ полем. The invention relates to veterinary medicine and medicine, in particular to microbiology, and can be used to inactivate the infectivity of microorganisms in liquid media, in particular pathogens of foodborne toxicoinfections (salmonella, escherichiosis) by treating them with a microwave field.

Известен способ уничтожения (или угнетения) электромагнитным полем сверхвысокой частоты в импульсном режиме возбудителей болезней растений, животных и человека преимущественно за счет электродинамических факторов, при котором обработка ведется на основной частоте 860 МГц, тип волны H₁₀, частота следования импульсов 500 Гц, длительность импульсов 2 с, поляризация поля линейная, режим волны бегущий. Обработка в таком режиме комбикорма, зараженного кишечной палочкой или сальмонеллой показала его полную стерилизацию (См. Бородин И. Ф. Кузнецов С.Г. Воздействие импульсного электромагнитного поля сверхвысокой частоты на микроорганизмы /Вестн. с.-х. науки, 1991, N 3 (414), с. 84-86).A known method of destruction (or oppression) by an electromagnetic field of ultrahigh frequency in a pulsed mode of pathogens of diseases of plants, animals and humans, mainly due to electrodynamic factors, in which processing is carried out at a fundamental frequency of 860 MHz, wave type H ₁₀ , pulse repetition rate 500 Hz, pulse duration 2 s, linear polarization of the field, traveling wave mode. Processing in this mode of compound feed infected with Escherichia coli or Salmonella showed its complete sterilization (See Borodin I.F. Kuznetsov S.G.The effect of pulsed electromagnetic fields of superhigh frequency on microorganisms / Vestnik s.kh.kh. nauki, 1991, No. 3 (414), pp. 84-86).

Недостатками этого способа СВЧ обработки является то, что для обработки используются мощные СВЧ генераторы промышленной частоты 860 МГц, используемые на радиолокационных станциях и практически не применяемые в пищевой промышленности и медицине, которые требуют дополнительных средств защиты и специальных помещений для работы, что повышает стоимость такой стерилизации. The disadvantages of this method of microwave processing is that the processing uses powerful microwave generators of industrial frequency 860 MHz, used at radar stations and practically not used in the food industry and medicine, which require additional protective equipment and special rooms for work, which increases the cost of such sterilization .

Известен также "Способ стерилизации медицинских инструментов" (а.с. N 1123705, A 61 L 2/12, 82), при котором обеззараживание инструментов от споровых форм микроорганизмов в частности Bac. anthracoides, проводят в СВЧ печах "Электроника", работающих на частоте 2400±50 МГц. Also known is the "Method of sterilization of medical instruments" (and.with. N 1123705, A 61 L 2/12, 82), in which the disinfection of instruments from spore forms of microorganisms in particular Bac. anthracoides, carried out in microwave ovens "Electronics", operating at a frequency of 2400 ± 50 MHz.

При общей доступности и простоте осуществления недостатком этого способа стерилизации является то, что он не пригоден для работы с жидкими средами, содержащими микроорганизмы, так как в нем используются специальные формы для размещения инструментов из пористой керамики, в которых материал нагревается до конечных температур нагрева 160-470^oC при скорости нагрева 15-210^oC/мин, а при работе с жидкими средами такие режимы приведут к взрывному кипению и разбрызгиванию среды.With the general availability and ease of implementation, the disadvantage of this method of sterilization is that it is not suitable for working with liquid media containing microorganisms, since it uses special forms for placing porous ceramic instruments in which the material is heated to a final heating temperature of 160- 470 ^o C at a heating rate of 15-210 ^o C / min, and when working with liquid media such modes will lead to explosive boiling and spraying of the medium.

Задачей изобретения является разработка способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, в частности, родов Salmonella и Escherichia, содержащихся в жидких питательных средах, после осуществления которого микроорганизмы сохраняют иммуногенность, но утрачивают способность размножаться in vitro и in vivo, теряя таким образом свою патогенность. При этом обработка жидкой среды с микроорганизмами должна производиться на общепромышленных или бытовых СВЧ печах с минимальными затратами времени и средств на инактивацию и обслуживание оборудования. The objective of the invention is to develop a method of inactivating the infectious activity of pathogens of intestinal infections, in particular, the genera Salmonella and Escherichia contained in liquid nutrient media, after the implementation of which microorganisms retain immunogenicity, but lose their ability to reproduce in vitro and in vivo, thus losing their pathogenicity. In this case, the processing of a liquid medium with microorganisms should be carried out on general industrial or domestic microwave ovens with minimal time and money spent on inactivation and maintenance of equipment.

Задача решается тем, что для инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, находящихся в жидкой среде, применяют воздействие на них СВЧ излучением с частотой от 2350 до 2450 МГц, при плотности СВЧ излучения в рабочей камере от 1 до 3 ватт на миллилитр среды в течение 10-110 мин. The problem is solved in that in order to inactivate the infectious activity of pathogens of intestinal infections in a liquid medium, they are exposed to microwave radiation with a frequency of 2350 to 2450 MHz, with a microwave density in the working chamber of 1 to 3 watts per milliliter of medium for 10 -110 minutes

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Среду, содержащую культуры Salmonella enteritidis, S. dublin, S. typhimurium, E. coli (сероварианты 0124, 0111, 026, 0114), помещают в химический стакан из термостойкого стекла. Емкость с содержимым ставят в рабочую камеру микроволновой печи и обрабатывают СВЧ излучением с частотой 2350-2450 МГц от 1,0 до 110 мин при мощности СВЧ излучения от 1 до 3 Вт/мл. В процессе СВЧ обработки за счет термодинамических и электродинамических факторов СВЧ воздействия на жидкую среду происходит инактивация инфекционной активности микроорганизмов. The medium containing cultures of Salmonella enteritidis, S. dublin, S. typhimurium, E. coli (serovariants 0124, 0111, 026, 0114) is placed in a beaker made of heat-resistant glass. The container with the contents is placed in the working chamber of the microwave oven and treated with microwave radiation with a frequency of 2350-2450 MHz from 1.0 to 110 min with a microwave power of 1 to 3 W / ml. In the process of microwave processing due to thermodynamic and electrodynamic factors of microwave exposure to a liquid medium, inactivation of the infectious activity of microorganisms occurs.

Оценку результатов инактивации проводят по определению подвижности микробов, микроскопии мазков, окрашенных по Граму, посеву на различные питательные среды (мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среду Эндо, среду Симонса, среду Клиглера), а также по выживаемости лабораторных животных (белых мышей), которым вводят (подкожно или внутрибрюшинно) летальные дозы микробов, подвергнутых действию микроволнового излучения в сравнении с выживаемостью контрольной группы животных, зараженных необработанными СВЧ излучением суспензиями микроорганизмов. The inactivation results are evaluated by determining the mobility of microbes, microscopy of smears stained by Gram, plating on various nutrient media (meat-peptone broth (MPB), meat-peptone agar (MPA), Endo medium, Simons medium, Kligler medium), as well on the survival of laboratory animals (white mice), which are administered (subcutaneously or intraperitoneally) lethal doses of microbes exposed to microwave radiation in comparison with the survival of the control group of animals infected with untreated microwave radiation of the suspension microorganisms.

Пример 1. Односуточные, суспендированные в 50 мл физиологического раствора, чистые культуры Salmonella dublin или S. typhimurium в концентрации 3,0•10⁶ микробных клеток в миллилитре, налитые в химический термостойкий стакан, помещают в рабочую камеру СВЧ печи "Титан". Мощность СВЧ излучения в рабочей камере 600 Ватт. Объем воды для балластной загрузки - 400 мл с температурой воды +15^oC. Экспозиция СВЧ обработки от 1 до 140 мин. Повторность опытов 4х-кратная. При сохранении подвижности и морфологических свойств микробы теряли способность размножаться. Результаты представлены в таблице.Example 1. One-day suspended in 50 ml of physiological saline, pure cultures of Salmonella dublin or S. typhimurium at a concentration of 3.0 • 10 ⁶ microbial cells per milliliter, poured into a heat-resistant chemical beaker, are placed in the working chamber of the Titan microwave oven. The power of microwave radiation in the working chamber is 600 watts. The volume of water for the ballast load is 400 ml with a water temperature of +15 ^o C. The exposure of the microwave treatment from 1 to 140 minutes The repetition of experiments is 4 times. While maintaining mobility and morphological properties, microbes lost the ability to reproduce. The results are presented in the table.

Пример 2. Бактериальную суспензию чистой культуры S. typhimurium на физиологическом растворе в концентрации 3,0•10⁶ микробных клеток/мл, в объеме 50 мл наливают в химический термостойкий стакан и помещают в рабочую камеру СВЧ печи. Объем воды для балластной загрузки 400 мл при начальной температуре воды 15^oC. Экспозиция от 1 до 140 мин в зависимости от аранжировки опыта. Повторность опытов 4х-кратная. После отключения СВЧ печи и охлаждения с обработанными в микроволновой печи суспензиями проводили микробиологические исследования. Характерные результаты представлены в таблице.Example 2. A bacterial suspension of a pure culture of S. typhimurium in physiological solution at a concentration of 3.0 • 10 ⁶ microbial cells / ml, in a volume of 50 ml is poured into a chemical heat-resistant glass and placed in a working chamber of a microwave oven. The volume of water for a ballast charge is 400 ml at an initial water temperature of 15 ^o C. Exposure is from 1 to 140 minutes, depending on the arrangement of the experiment. The repetition of experiments is 4 times. After turning off the microwave oven and cooling with the suspensions processed in the microwave oven, microbiological studies were carried out. Typical results are presented in the table.

Исследования молока, зараженного Salmonella и Escherichia coli и обработанного СВЧ излучением при экспозициях от 5 до 40 мин, показало, что микробы, как и в опытах с чистыми культурами, не потеряли подвижности, не утратили способность расти на питательных (МПБ и МПА) средах. Studies of milk infected with Salmonella and Escherichia coli and treated with microwave radiation at exposures of 5 to 40 minutes showed that microbes, as in experiments with pure cultures, did not lose mobility and did not lose their ability to grow on nutrient (MPB and MPA) media.

Заражение лабораторных животных (белых мышей) подкожно культурой Salmonella typhimurium в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл не утратившими подвижность, но утратившими способность расти на питательных средах после 10-минутного воздействия СВЧ облучения показало, что указанные культуры микробов потеряли инфекционность: 100% -ная выживаемость опытных животных и 100%-ная гибель животных в контрольных группах. Всего в работе было использовано и микроскопировано (методом раздавленной капли) 95 препаратов, произведено 118 посевов на различные питательные среды, окрашено по Граму и изучено 60 мазков. Заражено и микробиологически обследовано по 4 группы опытных и контрольных животных.Infection of laboratory animals (white mice) subcutaneously with a culture of Salmonella typhimurium at a concentration of 3.0 • 10 ⁶ MK / ml did not lose their mobility, but lost their ability to grow on culture media after 10 minutes of exposure to microwave radiation showed that these microbial cultures lost infectivity: 100% survival of experimental animals and 100% death of animals in the control groups. In total, 95 preparations were used and microscopically (using the crushed drop method), 118 crops were sown on various nutrient media, Gram stained, and 60 smears were studied. 4 groups of experimental and control animals were infected and microbiologically examined.

Оценку иммуногенных свойств инактивированных микробных суспензий S. typhimurium и E. coli проводили путем подкожного заражения 1-кратно иммунизированных (по 3,0•10⁶ м.к./мл) белых мышей (через 7 суток после иммунизации) нативной суспензией микробов в концентрации 5,0•10⁶ м.к./мл. Отмечалась 100%-ная гибель животных в контрольных группах и 100%-ная выживаемость иммунизированных животных.Evaluation of the immunogenic properties of inactivated microbial suspensions of S. typhimurium and E. coli was carried out by subcutaneous infection of 1-fold immunized (3.0 • 10 ⁶ MK / ml) white mice (7 days after immunization) with a native suspension of microbes in concentration 5.0 • 10 ⁶ m.k. / ml. 100% death of animals in the control groups and 100% survival of immunized animals were noted.

Пример 3. Бактериальную суспензию культуры на физиологическом растворе в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл в объеме 50 мл наливали в химический термостойкий стакан и помещали в рабочую камеру СВЧ печи "Титан". Объем воды для балластной загрузки 400 мл. Экспозиция 10 мин. После охлаждения микробной суспензии ее в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл (в объеме 0,3 мл) вводили подкожно белым мышам.Example 3. A bacterial suspension of culture on physiological saline at a concentration of 3.0 • 10 ⁶ mc / ml in a volume of 50 ml was poured into a chemical heat-resistant glass and placed in the working chamber of the Titan microwave oven. The volume of water for ballast loading is 400 ml. Exposition 10 min. After cooling the microbial suspension, its concentration in a concentration of 3.0 • 10 ⁶ MK / ml (in a volume of 0.3 ml) was injected subcutaneously in white mice.

Через 7 суток после иммунизации подопытных животных, а также группы контрольных (неиммунизированных) белых мышей, заражали неинактивированной суспензией S. typhimurium в концентрации 5,0•10⁶ м.к./мл подкожно (в объеме 0,5 мл). Через 3-е суток отмечалась 100%-ная гибель невакцинированных животных. Все вакцинированные животные выжили. В крови животных контрольной группы в реакции агглютинации выявлены антитела к S. typhimurium. Аналогичные результаты получены и в опытах с E. coli.7 days after the immunization of the experimental animals, as well as the group of control (non-immunized) white mice, they were infected with an uninactivated suspension of S. typhimurium at a concentration of 5.0 • 10 ⁶ mc / ml subcutaneously (in a volume of 0.5 ml). After 3 days, 100% death of unvaccinated animals was observed. All vaccinated animals survived. In the blood of animals of the control group, antibodies to S. typhimurium were detected in the agglutination reaction. Similar results were obtained in experiments with E. coli.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что воздействие микроволнового излучения с частотой 2350-2450 МГц при экспозиции от 1 до 110 мин и мощности от 1 до 3 ватт на мл среды на микробные культуры Salmonella typhimurium, S. dublin, Esherichia coli приводит к инактивации их инфекционности (100% -ная выживаемость лабораторных животных белых мышей). СВЧ облучение в этих параметрах вызывает изменение биологических свойств микроорганизмов: потерю способности расти на питательных средах при сохранении подвижности. Подвижность эшерихии теряют при экспозиции 110 мин. Сальмонеллы сохраняли подвижность и при 140 мин СВЧ облучения (срок наблюдения). При полной потере инфекционной активности микробы сохраняли иммуногенные свойства, что выражалось в выработке антител и 100%-ном предотвращении гибели лабораторных животных (белых мышей), подвергнутых последующему заражению летальными дозами возбудителей. The results of the studies allow us to conclude that exposure to microwave radiation with a frequency of 2350-2450 MHz at an exposure of 1 to 110 min and a power of 1 to 3 watts per ml of medium on microbial cultures of Salmonella typhimurium, S. dublin, Esherichia coli leads to their inactivation infectivity (100% survival of laboratory animals of white mice). Microwave irradiation in these parameters causes a change in the biological properties of microorganisms: loss of ability to grow on nutrient media while maintaining mobility. The mobility of Escherichia is lost upon exposure for 110 minutes. Salmonella remained mobile even at 140 min of microwave irradiation (observation period). With a complete loss of infectious activity, microbes retained immunogenic properties, which was expressed in the production of antibodies and 100% prevention of the death of laboratory animals (white mice), subjected to subsequent infection with lethal doses of pathogens.

Использование предложенного способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций позволяет упростить и оптимизировать технологию производства диагностических и профилактических препаратов на основе микроорганизмов, в частности инактивированных вакцин для ветеринарии и медицины. Using the proposed method for inactivating the infectious activity of intestinal pathogens makes it possible to simplify and optimize the production technology of diagnostic and prophylactic drugs based on microorganisms, in particular, inactivated vaccines for veterinary medicine.

При использовании этого способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, диагностические и профилактические препараты возможно изготовлять в условиях ветеринарных лабораторий, имеющих производственные отделы, при оснащении их микроволновыми печами, соответствующим оборудованием и технической документацией. Using this method of inactivating the infectious activity of intestinal pathogens, diagnostic and prophylactic preparations can be made in the conditions of veterinary laboratories having production departments, equipped with microwave ovens, appropriate equipment, and technical documentation.

Данный способ может быть использован также в работе предприятий по производству бактерийных препаратов. This method can also be used in the work of enterprises for the production of bacterial preparations.

Использование предложенного способа даст значительный экономический и социальный эффект для народного хозяйства Российской Федерации. Using the proposed method will give significant economic and social effect for the national economy of the Russian Federation.

Claims

1. A method of inactivating the infectious activity of pathogens of intestinal infections, comprising treating the microbial medium with microwave radiation, characterized in that the microbial liquid medium is placed in a microwave oven in a chemical heat-resistant glass, and the treatment is carried out with a microwave frequency of 2350 2450 MHz for 1 110 min and power 1 3 W / ml inactivated medium.

2. The method according to claim 1, characterized in that the specific power of the microwave radiation is adjusted using a ballast load in the form of water.

3. The use of inactivated microwave radiation for 10 110 min microbial suspension of intestinal infection with a concentration of 3.0 x 10 ⁷ MK / ml as a vaccine for immunization of animals.