RU2097766C1 - Способ прогнозирования течения вич-инфекции - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности, к инфекционным болезням - медицинской вирусологии. Целью изобретения является повышение точности прогноза течения ВИЧ-инфекции. Поставленная цель достигается тем, что у больного, инфицированного ВИЧ, берут кровь, отделяют лимфоцитарную фракцию, проводят тотальное выделение ДНК лимфоцитов и выявляют вирусные агенты из группы Herpesviridae. При наличии двух и более вирусов прогнозируют тяжелое течение заболевания и определяют характер превентивной терапии.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным болезням, и может быть использовано для оценки влияния герпес-вирусов на течение ВИЧ-инфекции, прогнозирования развития заболевания и обоснования своевременного терапевтического воздействия.

Известен способ прогнозирования течения ВИЧ-инфекции, основанный на клинических признаках, в частности, на характеристике IV-х стадий и 6 фаз (В.И.Покровский, 1989 год).

Накопленный клиницистами опыт позволяет делать некоторые прогнозы о длительности этих стадий и таким образом предсказывать скорость течения инфекции и необходимость терапевтического воздействия. Однако, указанный способ отличается субъективностью и не всегда позволяет обосновать своевременное применение противовирусной терапии.

Наиболее близким к заявленному способу является иммунологический способ классификации ВИЧ-инфекции, основанный на определении абсолютного содержания и соотношения CD4 и CD8 в периферической крови (ССД/ВОЗ, 1987). Этот способ дает четкое представление о степени пораженности лимфоцитов вирусом, однако возможности этого метода в отношении прогнозирования течения ВИЧ-инфекции более ограничен, так как прогнозирование и в этом случае основано на эмпирическом опыте перехода одной стадии в другую, и прогноз при этом также не отличается высокой точностью.

Целью предлагаемого способа является повышение точности прогноза течения ВИЧ-инфекции.

Поставленная цель достигается тем, что у больного, инфицированного ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), берут пробу крови, гепаринизируют ее, отделяют лимфоцитарную фракцию, проводят тотальное выделение ДНК лимфоцитов и определяют в них наличие основных вирусов из группы Herpesviridae путем одновременного использования ДНК содержащих зондов к генам вируса простого герпеса первого (ВПГ-1), второго типов (ВПГ-2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), и вируса герпеса шестого типа (ВГ-6).

Индикация вирусов герпеса проводится в мононуклеарах периферической крови. Принцип метода основан на комплементарности азотистых оснований конкретного молекулярного зонда и определяемой ДНК из группы герпесвирусов. В качестве зонда используют уже клонированный фрагмент ДНК, далее данную плазмиду метят методом ник-трансляции. Суть его заключается в замещении нуклеотидов в составе фрагмента ДНК зонда in vitro мечеными нуклеотидами при помощи ДНК полимеразы I Ech. coli. Далее на предобработанные фильтры (нитроцеллюлозные мембраны) наносят пробы денатурированной испытуемой ДНК и иммобилизируют их на мембранах. Затем фильтры с фиксированной ДНК предгибридизуют в растворе с высокомолекулярными соединениями, препятствующими неспецифической сорбции при последующим добавлении меченых молекулярных зондов. При этом происходит соединение (комплементарных) участков меченого молекулярного зонда с аналогичными участками исследуемой ДНК. По окончании гибридизации фильтры отмывают от не прореагировавшей метки и выявляют специфически связанную ее часть. Для учета результатов анализа используют визуальную оценку эффективности гибридизации последовательно разведенных препаратов нуклеиновых кислот. При обнаружении двух и более вирусов герпеса прогнозируют быстрый (менее одного года) переход в более тяжелую стадию заболевания, что предполагает немедленное включение специфической противовирусной химиотерапии.

Известно, что при приобретенном иммунодефиците, вызванном вирусом иммунодефицита человека, проявляют свой патогенный потенциал, главным образом, условно-патогенные микроорганизмы, в норме контролируемые клеточным иммунитетом. В качестве кофакторов прогрессирования течения ВИЧ-инфекции к таковым относят герпесвирусы.

Применение результатов комплексной вирусной диагностики, в частности из семейства Herpesviridae (ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ, ВГ-6) с целью прогнозирования течения ВИЧ-инфекции ранее известно не было, как в отношении числа возбудителей так и в отношении их качественного состава (ЦМВ, ВГ-6, ВПГ-1).

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами конкретного выполнения:
Пример 1. Больного В. начали обследовать во время клинической стадии II, фазы В, диагноз: персистрирующая генерализованная лимфоаденопатия. Для этого из кубитальной вены было взято 10,0 мл крови в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемещали. Гепарированную кровь разводят физиологическим раствором в соотношении 1:2, 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9% фикола и 5 частей 33,9% гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирку центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают физиологическим раствором. Концентрацию клеток доводят до 2-4 млн. в 1 мл. Далее приступают к выделению тотальной ДНК из полученной взвеси лимфоцитов. К полученной взвеси добавляют равный объем насыщенного фенола и встряхивают 5-15 мин при 60^oC. Смесь центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин, водную фазу отбирают и добавляют к ней равный объем фенола. Вторую и третью экстракцию фенола проводят при комнатной температуре. Водную фазу отбирают и добавляют раствор 20•SSC (1•SSC: NaCl 0,15 M; Na-цитрат 0,015 M) до конечной концентрации 10•SSC. Количество ДНК определяют на спектрометре при длине волны 250 нм, исходя из того, что оптическая плотность D=1 соответствует 40 мкг/мл ДНК. Нитроцеллюлозный фильтр перед нанесением ополаскивают водой, затем 6•SSC раствором и после укрепления фильтра в держателе, каждую лунку промывают 6•SSC раствором. ДНК денатурируют 2 мин при 100^oC и быстро охлаждают на ледяной бане. На фильтр наносят в конечном объеме 200-600 мкл. В качестве контролей используют: ДНК зонда, нанесенную в убывающих 10-кратных разведениях от 100 нг до 1 пг (положительный контроль), дрожжевую ДНК 1 мкг/мл и тотальную ДНК из печени мышей 10-30 мкг на одну точку (отрицательный контроль). После нанесения ДНК фильтр ополаскивают в 6•SSC растворе, высушивают на фильтровальной бумаге и иммобилизуют под ультрафиолетовой лампой в течение 4 мин. Для ник-трансляции используют ДНК зонды с концентрацией 0,5-1,0 мкг/мк. При этом в 1,5 мл полипропиленовую пробирку, содержащую 50 мкКи выпаренного-32 Р-дНТФ, последовательно вносят: 5 мкл 10•буфера для ник-трансляции, 1 мкл (1 нмоль) каждого из дНТФ, кроме меченого 1 мкл ДНК-азы, 1 мкл (5 единиц) ДНК-полимеразы i E.coli, 1 мкл (0,5 мкг) ДНК-зондов, H₂O до 50 мкл. Смесь инкубируют при 16^oC 60 мин, затем с интервалом в 20 мин переносят 0,5 мкл смеси на ДЕАЕ бумагу, отмывают ее от свободной метки 0,2М фосфатным буфером и оценивают включение 32 P по разнице счета до и после отмывки. Реакцию останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Зонд переосаждается 2,5 объемами этанола с добавлением 5 мкл 3 М ацетата натрия и 1 мкл ДНК из тимуса с концентрацией 5 мкг/мкл. Смесь помещают на 2 ч при -20^oC. Предгибризационный раствор готовят, исходя из следующих соотношений (на 10 мл): 2,5 мл 20•SSC; 1,0 мкл 50•раствора Дэнхардта (1% раствор БСА); 1,25 мл 0,4 М Na-фосфатного буфера; 0,25 мл 10% ДНС; 4,75 мл формамида; 0,2 мкл ДНК-тимуса. Растворы должны быть теплыми и прозрачными. ДНС вносить в последнюю очередь. Предгибридизацию проводят в запаянных полиэтиленовых мешках или в чашках Петри при температуре 42^oC в течение 4 ч. Необходимо следить, чтобы весь фильтр был смочен предгибридизационным раствором (0,2 мл на 1 см нитроцеллюлозного фильтра). Моченый 32 P ДНК-зонд осаждают из-под спирта центрифугированием (12000 об/мин 4 мин). Пробирки ополаскивают 2 раза 70% спиртом, подсушивают и растворяют в 100 мкл буфера ТЕ и 100 мкл формамида. Растворенный ДНК-зонд денатурируют кипячением 5 мин и помещают в лед. В предгибридизационный раствор вносят 0,5 М ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ (на 10 мл раствора 200 мкл 0,5 М ЭДТА) после чего добавляют ДНК-зонд. Гибридизацию проводят 1-3 сут при 42^oC. Отмывку фильтров осуществляют 2 раза 2•SSC и 1% SDS (додецилсульфат Na) раствором при комнатной температуре по 30 мин, а затем 2 раза по 1,5 ч 0,1•SSC и 1% SDS растворами при температуре 65^oC. После отмывки фильтры подсушивают и закладывают в кассету для рентгеновской пленки на 24-72 ч. По окончании экспозиции пленки проявляют, фиксируют и высушивают. Оценку результатов проводят визуально, сравнивая положительные контроли и сигналы исследуемой ДНК. Чувствительность метода 10 вирусных геномов в одной точке, что соответствует 1 пкг ДНК вируса из группы герпеса.

Данным методом на данной стадии заболевания было выявлено наличие ДНК цитомегаловируса. Второе обследование больной проходил, находясь в стадии III, фазе А, где вышеописанным методом, помимо ДНК цитомегаловируса, обнаруживали уже и присутствие ДНК вируса герпеса шестого типа. Ни явных клинических признаков, ни серологических маркеров гепервирусных инфекций выявлено не было, однако при тщательном обследовании у больного отмечались слабо выраженные признаки энцефалопатии. Следующее обследование данный пациент прошел, находясь в стадии III, фазе Б. Методом молекулярной гибридизации были выявлены ДНК ВПГ-1, ЦМВ, ВГ-6. Клинически только на этой стадии заболевания были зафиксированы признаки цитомегаловирусной инфекции (язвенный эзофагит, ретинит) и энцефалопатия, по-видимому связанная с воздействием вируса герпеса шестого типа (Steeper Teresa A. et al. 1990). Только после появления явных клинических проявлений больному была назначена специфическая противовирусная терапия. Но менее чем через год больной перешел в стадию III, фазу В, характеризующуюся присоединением генерализованных бактериальных, вирусных и грибковых заболеваний, которые привели больного к летальному исходу. При постмортальном обследовании выявление ВПГ-1, ЦМВ, ВГ-6 было подтверждено выше описанным методом. Помимо перечисленных маркеров герпес вирусов была обнаружена ДНК ВПГ-2.

Пример 2. Больного П. обследовали во время клинической стадии II, фазы В, диагноз: ВИЧ-инфекция. Персистирующая генерализованная лимфоаденопатия.

Данным методом на данной стадии заболевания не было выявлено наличия ДНК группы герпесвирусов. Второе обследование больной проходил, находясь в стадии III, фазе А, где вышеописанным в примере 1 предлагаемым методом, была выявлена ДНК цитомегаловируса. Ни клинических признаков, ни серологических маркеров герпесвирусных инфекций выявлено не было, но специфическое противовирусное лечение было назначено, что способствовало смягчению симптомов основного заболевания. Следующее обследование данный пациент прошел, находясь в стадии III, фазе Б. Методом молекулярной гибридизации были выявлены ДНК ЦМВ, ВГ-6. Клинически на этой стадии заболевания были зафиксированы только признаки энцефалопатии, по-видимому также связанной с воздействием вируса герпеса шестого типа (Steeper Teresa A. et al. 1990). В настоящее время прошло обследование больного, находящегося в стадии III, фазе В. Методом молекулярной гибридизации, описанным выше, были выявлены ДНК ЦМВ, ВГ-6 и ВПГ-1. Состояние данного пациента расценивается как удовлетворительное. Специфическая противовирусная химиотерапия способствует отсутствию клинических проявлений герпесвирусных инфекций. Время наблюдения больного на данной стадии заболевания составляет уже более двух лет.

Применение предлагаемого способа позволяет на ранних стадиях инфицирования обнаружить присутствие вирусных агентов, утяжеляющих течение основного заболевания, проводить своевременную специфическую химиотерапию, что в свою очередь приводит к предотвращению обострения и продлевает жизнь безнадежно больных.

Помимо этого социально-медицинского эффекта способ обеспечивает и значительный экономический эффект, обусловленный экономией средств, связанных с затратами на более длительное лечение этих же больных, когда они поступают на более поздней и, следовательно, более тяжелой стадии заболевания.

Литература.

1. Покровский В.И. ВИЧ-инфекция или СПИД? Тер.архив, 1989, N 11, с. 3-6.

2. CDC. AIDS. MMWR, 1987, 31, p. 700-701.

3. Steeper Theresa A. Horwitz Charles A. Ablashi Dharam V. et al - Amer. J.Clin.Pathol, 1990. 93, N 6, p. 776-783.

Claims (1)

1. Способ прогнозирования течения ВИЧ-инфекции, включающий исследование периферической крови обследуемого, отличающийся тем, что выделяют лимфоцитарную фракцию крови, проводят в ней тотальное выделение ДНК, методом ДНК-зонда выделяют вирусные агенты из группы Herpesviridae и при наличии двух и более агентов прогнозируют осложнение течения заболевания.