RU2094077C1

RU2094077C1 - Chromatographic method for isolation of alfa-fetoprotein

Info

Publication number: RU2094077C1
Application number: RU96113901A
Authority: RU
Inventors: Д.В. Кулаев; С.М. Насибов; С.С. Маркин; Ю.Г. Бобков; М.П. Семенов
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа "Фосфосорб"
Priority date: 1996-07-23
Filing date: 1996-07-23
Publication date: 1997-10-27

Abstract

FIELD: chromatographic technique in biochemistry. SUBSTANCE: alfa- fetoprotein from human biological material is isolated by way of precipitation followed by four-step chromatography separation, 1st and 3rd steps being conducted on affinity immunosorbents, and 2nd and 4th steps on ion-exchange DEAE sepharose. EFFECT: enhanced isolation efficiency. 4 cl

Description

Изобретение относится к области биологической химии, в частности к хроматографическому выделению альфа-фетопротеина из биологических жидкостей и тканей. The invention relates to the field of biological chemistry, in particular to the chromatographic isolation of alpha-fetoprotein from biological fluids and tissues.

Известен способ выделения альфа-фетопротеина из абортивного материала путем его обработки бутиловым спиртом, диализа против буферного раствора, аффинной хроматографии на иммобилизованных экстрогенах и элюирования смесью бутилового спирта и буферного раствора [1]
Недостатком способа является невысокая степень чистоты препарата (95%).A known method of isolating alpha-fetoprotein from an abortive material by processing it with butyl alcohol, dialysis against a buffer solution, affinity chromatography on immobilized estrogens and eluting with a mixture of butyl alcohol and a buffer solution [1]
The disadvantage of this method is the low degree of purity of the drug (95%).

Наиболее близким по техническим сущности и достигаемому результату является хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина из фетального материала, включающий его очистку и колоночную хроматографию в три стадии. На первой стадии проводят аффинную хроматографию на колонке с цианбромированной сефарозой ковалентно связанной с овечьими антителами против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина глицин солянокислыми буфером при изменении pH до 2, 6, вторую стадию проводят на колонке с голубой сефарозой с элюацией 2 M NaCl, а третью стадию поводят на колонке с Con-A-сефарозой, уравновешенной ацетатным буфером с фракционной элюацией альфа-фетопротеина раствором метил-альфа-Д-глюкопираназаида с градиентом концентраций. Далее собирают 23-27-ю фракции, содержащие альфа-фетопротеин [2]
Недостатком данного способа является невысокий выход целевого продукта 20% поскольку элюирование ведется фракционно.The closest in technical essence and the achieved result is a chromatographic method for the isolation of alpha-fetoprotein from fetal material, including its purification and column chromatography in three stages. At the first stage, affinity chromatography is carried out on a column with cyanogen bromide sepharose covalently bound to sheep antibodies against human alpha-fetoprotein with elution with alpha-fetoprotein glycine hydrochloric acid buffer when the pH is changed to 2, 6, the second stage is carried out on a column with blue Sepharose NaCl with elution 2 M and the third stage is carried out on a column of Con-A-Sepharose, equilibrated with acetate buffer with fractional elution of alpha-fetoprotein with a solution of methyl-alpha-D-glucopyranazide with a concentration gradient. Next, the 23-27th fractions containing alpha-fetoprotein are collected [2]
The disadvantage of this method is the low yield of the target product of 20% since the elution is carried out fractionally.

Задачей настоящего изобретения является разработка хроматографического способа выделения альфа-фетопротеина высокой степени чистоты из фетального материала человека с повышенным выходом целевого продукта. The present invention is to develop a chromatographic method for the isolation of high-purity alpha-fetoprotein from human fetal material with an increased yield of the target product.

Поставленная цель достигается описанным способом хроматографического выделения альфа-фетопротеина, включающим предварительную очистку биологического фетального материала путем осаждения раствором сульфата аммония и колоночную хроматографию в четыре стадии, на первой стадии на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизованной поликлональными антителами животных, например, кроликов, овец, коз, мышей против альфа-фетопротеина человека с элюацией альфа-фетопротеина раствором карбоната натрия, на второй стадии на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором ацетатного буфера и нейтрализации элюата раствором гидроксида натрия, на третьей стадии - на колонке, заполненной цианбромированной сефарозой иммобилизированной антителами животных против белков нормальной сыворотки человека при элюации раствором карбоната натрия, а на четвертой стадии вновь на колонке с ионообменной диэтиламиноэтил сефарозой уравновешенной натрий-фосфатным буфером при элюации раствором хлорида натрия, содержащий натрий-фосфатный буфер и сахарозу. The goal is achieved by the described method for the chromatographic isolation of alpha-fetoprotein, including preliminary purification of the biological fetal material by precipitation with a solution of ammonium sulfate and column chromatography in four stages, in the first stage on a column filled with cyanbrominated sepharose immobilized by polyclonal antibodies of animals, for example, rabbits, sheep, goats , mice against human alpha-fetoprotein with elution of alpha-fetoprotein with sodium carbonate solution, in the second stage per count a cell with ion-exchange diethylaminoethyl sepharose balanced with sodium phosphate buffer while eluting with an acetate buffer solution and neutralizing the eluate with sodium hydroxide solution; in the third stage, on a column filled with cyanogen brominated sepharose immobilized with animal antibodies against normal human serum proteins and eluting with sodium carbonate solution; again on a column with ion-exchange diethylaminoethyl sepharose balanced with sodium phosphate buffer while eluting with a solution of sodium chloride, soda sodium phosphate buffer and sucrose.

После проведения колоночной хроматографии продукт можно заморозить и лиофильно высушить для хранения. After column chromatography, the product can be frozen and freeze-dried for storage.

В качестве исходного материала рекомендуется использовать абортальную или плацентарную сыворотки или пуповинную кровь. As a starting material, it is recommended to use abortal or placental serum or cord blood.

Пример осуществления способа. Предварительную очистку проводят с помощью фракционирования белков сыворотки осаждением 1,3 M раствором сульфата аммония. После выделения осадка на центрифуге (40 мин 8000g) супернатанат разводят в 3 раза забуференным физиологическим раствором и пропускают через колонку (3,0 x 10 см, скорость подачи 500 мл/ч) с имуносорбентом, который представляет собой ковалентно связанные с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональные антитела кролика против альфа-фетопротеина человека. Перед нанесением колонку промывают сначала 0,01 M раствором HCL, затем уравновешивают забуференным физиологическим раствором, pH 7,4. Затем колонку промывают сначала буферным раствором, содержащим 0,5 M хлорида натрия и физиологическим раствором хлорида натрия (0,9%) до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не снизится до 0,005 оптических единиц. После пропускания раствора через колонку альфа-фетопротеин элюируют с помощью 1% раствора углекислого натрия (pH 11,3). Профиль элюции контролируют спектрофотометрически, при 280 нм. После снятия белка с колонки pH раствора снижают до pH 7,4, добавляя 1N раствор HCL. Объем снятой с аффинной колонки альфа-фетопротеина составлял 2 объема иммуносорбента с титром 1/128, что соответствует концентрации белка 0,5 мг/мл. An example implementation of the method. Preliminary purification is carried out by fractionating whey proteins by precipitation with a 1.3 M solution of ammonium sulfate. After separating the precipitate in a centrifuge (40 min 8000g), the supernatant is diluted 3 times with buffered saline and passed through a column (3.0 x 10 cm, feed rate 500 ml / h) with an immunosorbent that is covalently linked to BrCN-activated sepharose CL-4B polyclonal rabbit antibodies against human alpha-fetoprotein. Before application, the column is washed first with 0.01 M HCL solution, then equilibrated with buffered saline, pH 7.4. Then the column is washed first with a buffer solution containing 0.5 M sodium chloride and physiological sodium chloride solution (0.9%) until the optical density of the solution leaving the column decreases to 0.005 optical units. After passing the solution through the column, alpha-fetoprotein is eluted with a 1% sodium carbonate solution (pH 11.3). The elution profile is monitored spectrophotometrically at 280 nm. After removing the protein from the column, the pH of the solution was reduced to pH 7.4 by adding a 1N HCL solution. The volume taken from the affinity column of alpha-fetoprotein was 2 volumes of immunosorbent with a titer of 1/128, which corresponds to a protein concentration of 0.5 mg / ml.

Полученный раствор альфа-фетопротеина (АФП) разбавляют в 2,5 раза дистиллированной водой и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрий-фосфатным буфером, pH 7,4. Затем колонку промывают 0,02 M фосфатным буфером, pH 6,2. Белок с колонки элюируют 0,1 M раствором ацетатного буфера, pH 4,5. Элюат нейтрализуют 1N раствором гидроокиси натрия до pH 7,4. The resulting alpha-fetoprotein (AFP) solution was diluted 2.5 times with distilled water and concentrated on a DEAE-Sepharose column equilibrated with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.4. Then the column is washed with 0.02 M phosphate buffer, pH 6.2. Protein from the column is eluted with 0.1 M acetate buffer, pH 4.5. The eluate is neutralized with a 1N sodium hydroxide solution to a pH of 7.4.

Далее проводят третью стадию колоночной хроматографии очистку от примеси ("негативная" иммуносорбция). Для того, чтобы очистить выделенный альфа-фетопротеин от возможных следовых количеств белков сыворотки, полученный раствор белка наносят на аффинную колонку с антителами кролика против нормальной сыворотки человека. Элюацию ведут раствором карбоната натрия. Next, the third stage of column chromatography is carried out to remove impurities ("negative" immunosorption). In order to purify the isolated alpha-fetoprotein of possible trace amounts of serum proteins, the resulting protein solution is applied to an affinity column with rabbit antibodies against normal human serum. Elution is carried out with a solution of sodium carbonate.

Далее раствор АФП после очистки от примесных белков разбавляют в 3 раза и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,02 M натрия-фосфатным буфером, pH 7,4. Колонку тщательно промывают 0,02 M фосфатным буфером и проводят элюцию с использованием 0,3 M раствора хлорида натрия, содержащий 0,02 M натрий-фосфатного буфера и 5% сахарозы. Конечная концентрация альфа-фетопротеина составила 20 мг/мл. Сразу после получения конечного продукта его замораживают и сушат лиофильно. Next, the AFP solution after purification from impurity proteins is diluted 3 times and concentrated on a column with DEAE-Sepharose, equilibrated with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.4. The column is washed thoroughly with 0.02 M phosphate buffer and eluted using a 0.3 M sodium chloride solution containing 0.02 M sodium phosphate buffer and 5% sucrose. The final concentration of alpha-fetoprotein was 20 mg / ml. Immediately after receiving the final product, it is frozen and freeze-dried.

Таким образом получен альфа-фетопротеин с выходом из исходного сырья примерно 30% чистотой 99%
Контроль качества выделенного АФП. Для контроля качества полученного препарата проводили гельхрамотографию на TOYOPEARL HW-55 (200 x 12 мм, проба
10 мг), предварительно диализовав раствор АФП против 0,005 M натрий-фосфатного буфера, pH 7,4.Thus, alpha-fetoprotein was obtained with a yield of approximately 30% from a feedstock of 99% purity.
Quality control of the selected AFP. To control the quality of the obtained preparation, gel chromatography was performed on a TOYOPEARL HW-55 (200 x 12 mm, sample
10 mg), after dialysing the AFP solution against 0.005 M sodium phosphate buffer, pH 7.4.

Таком образом предложенное изобретение позволяет выделить альфа-фетопротеин из фетального биологического материала последовательным применением иммунно-аффинной хроматограффии на BrCN-сефарозе и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Иммунно-аффинная хроматография включает в себя иммуносорбицию на поликлональных антителах животных против альфа-фетопротеина человека, и иммуносорбцию на антителах животных белков нормальной сыворотки человека. Thus, the proposed invention allows to isolate alpha-fetoprotein from fetal biological material by sequential application of immuno-affinity chromatography on BrCN-Sepharose and ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose. Immuno-affinity chromatography includes immunosorption on animal polyclonal antibodies against human alpha-fetoprotein, and immunosorption on animal antibodies of normal human serum proteins.

За счет двухстадийной иммуносорбции и двухстадийной ионообменной сорбции получен препарат высокой степени чистоты с высоким выходом целевого продукта. Due to two-stage immunosorption and two-stage ion-exchange sorption, a high-purity preparation with a high yield of the target product is obtained.

Claims

1. A chromatographic method for the isolation of alpha-fetoprotein, including preliminary purification of the initial biological fetal material and multi-stage column chromatography, characterized in that the preliminary purification is carried out by precipitation with a solution of ammonium sulfate, and chromatography is carried out in four stages, in the first stage on a column filled with cyanbrominated sepharose immobilized by animal polyclonal antibodies against human alpha-fetoprotein with elution of alpha-fetoprotein with sodium carbonate solution in the second stage, on a column with ion-exchange diethylaminoethyl sepharose, equilibrated with sodium phosphate buffer while eluting with an acetate buffer solution and neutralizing the eluate with sodium hydroxide solution, in the third stage, on a column filled with cyanogen brominated sepharose, immobilized with animal antibodies against normal serum protein sodium, and in the fourth stage again on the column with ion-exchange diethylaminoethyl sepharose, balanced sodium phosphate buffer, with elution creates sodium chloride containing sodium phosphate buffer and sucrose.

2. The method according to claim 1, characterized in that after column chromatography the product is frozen and freeze-dried.

3. The method according to claim 1, characterized in that abortal or placental serum or cord blood is used as biological fetal material.

4. The method according to claim 1, characterized in that the antibodies of animals use antibodies of rabbits, sheep, goats, mice.