RU2093575C1 - Method of hydrolysis of biological substrates - Google Patents
Method of hydrolysis of biological substrates Download PDFInfo
- Publication number
- RU2093575C1 RU2093575C1 RU93040067A RU93040067A RU2093575C1 RU 2093575 C1 RU2093575 C1 RU 2093575C1 RU 93040067 A RU93040067 A RU 93040067A RU 93040067 A RU93040067 A RU 93040067A RU 2093575 C1 RU2093575 C1 RU 2093575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- substrate
- hydrolysis
- native enzyme
- native
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предполагаемое изобретение относится к способам гидролиза растворимых и нерастворимых биологических субстратов с целью получения аминокислот, углеводов и других продуктов, и может быть использовано в химической, медицинской, микробиологической, пищевой промышленностях, а также для чистки бытовых и промышленных сточных вод. The alleged invention relates to methods for hydrolysis of soluble and insoluble biological substrates with the aim of obtaining amino acids, carbohydrates and other products, and can be used in the chemical, medical, microbiological, food industries, as well as for cleaning domestic and industrial wastewater.
Известен способ гидролиза сахара и аналогичных соединений протеиназой /1/, который осуществляется путем передавливания раствора белка или полисахаридов через ячейку ультрафильтрации, к мембране которой присоединен фермент. A known method of hydrolysis of sugar and similar compounds by proteinase / 1 /, which is carried out by squeezing a solution of protein or polysaccharides through an ultrafiltration cell, to the membrane of which an enzyme is attached.
Недостатком известного способа является низкая скорость гидролиза, т.к. взаимодействие с субстратом происходит только на относительно небольшой поверхности мембраны. Недостаток способа также заключается в невозможности гидролиза крупных объемов высокомолекулярных субстратов ввиду того, что гидролиз таких субстратов, из-за крупности их молекул, возможен только с одной стороны поверхности мембраны. The disadvantage of this method is the low rate of hydrolysis, because interaction with the substrate occurs only on a relatively small surface of the membrane. The disadvantage of this method is the impossibility of hydrolysis of large volumes of high molecular weight substrates due to the fact that the hydrolysis of such substrates, due to the size of their molecules, is possible only on one side of the membrane surface.
Известен способ гидролиза, осуществляемый с помощью только одного нативного фермента /2/. A known method of hydrolysis, carried out using only one native enzyme / 2 /.
Однако известно, что для осуществления полного гидролиза нативным ферментом, например, гидролиза дрожжей, нативного фермента оризин ПК требуется большое количество около 1,5% мас. к сухому весу дрожжей /2/. При этом фермент необратимо теряется, расход его велик, продукт загрязняется энзимом и продуктами его распада, а интенсивность гидролиза только одним нативным ферментом низка. However, it is known that for the complete hydrolysis of the native enzyme, for example, the hydrolysis of yeast, the native enzyme oryzin PC requires a large amount of about 1.5% wt. to the dry weight of the yeast / 2 /. Moreover, the enzyme is irreversibly lost, its consumption is high, the product is contaminated by the enzyme and its decomposition products, and the rate of hydrolysis by only one native enzyme is low.
Известен наиболее близкий предлагаемому способ /3/ колоночного гидролиза субстратов с применением иммобилизованного на пористых матрицах фермента, с целью получения растворов аминокислот. Known closest to the proposed method / 3 / column hydrolysis of substrates using an enzyme immobilized on porous matrices in order to obtain solutions of amino acids.
Особенностью известного способа является невозможность проведения гидролиза высокомолекулярных белков и недостаточная скорость, интенсивность процесса. A feature of the known method is the impossibility of hydrolysis of high molecular weight proteins and the insufficient speed, intensity of the process.
Целью предлагаемого изобретения является интенсификация процесса гидролиза, повышение выхода готового продукта, расширение функциональных границ способа за счет возможности использования в качестве сырья субстратов с неограниченной молекулярной массой. Целью также является исключения загрязнения готового продукта нативным ферментом и более эффективное использование последнего. The aim of the invention is the intensification of the hydrolysis process, increasing the yield of the finished product, expanding the functional boundaries of the method due to the possibility of using substrates with unlimited molecular weight as raw materials. The goal is also to eliminate contamination of the finished product with a native enzyme and more efficient use of the latter.
Поставленная цель достигается тем, что в способе гидролиза биологических субстратов путем их контакта с иммобилизованным на пористых матрицах ферментом, согласно изобретению, в объем обрабатываемого сырья дополнительно водят нативный фермент в количестве 0,001 0,1% мас. от массы гидролизуемого субстрата, и модификатор, придающий молекулам субстрата электрический заряд, а гидролиз ведут при pH среды, поддерживаемом в интервале величин между изоэлектрическими точками нативного фермента и субстрата. Для гидролиза используют матрицы, средний размер пор которых превышает средний размер молекул нативного фермента, при этом суспензию или раствор субстрата с находящимися в них нативным ферментом, последовательно обрабатывают сначала на матрицах, диаметры пор которых меньше размеров молекул нативного фермента, а затем на матрицах с диаметрами их пор, превышающими размеры молекул нативного фермента. Субстрат с ферментом помещают в электрическое поле с напряженность, от 3 до 25 в/см для создания направленной электромиграции молекул субстрата к поверхности иммобилизированного фермента и электромиграции нативного фермента от поверхности иммобилизованного. При гидролизе белковых субстратов в качестве модификатора используют преимущественно фосфорную кислоту или ее соли в количестве 0,1 1,4 мас. от массы обрабатываемого субстрата. При гидролизе углеводных субстратов в качестве модификатора преимущественно используют борную кислоту или бораты в количестве 0,2 3% мас. от массы субстрата. This goal is achieved by the fact that in the method of hydrolysis of biological substrates by contacting them with an enzyme immobilized on porous matrices, according to the invention, an additional native enzyme is additionally added to the volume of processed raw materials in an amount of 0.001 0.1% wt from the mass of the hydrolyzable substrate, and a modifier that imparts an electric charge to the substrate molecules, and hydrolysis is carried out at a pH of the medium maintained in the interval between the isoelectric points of the native enzyme and the substrate. For hydrolysis, matrices are used whose average pore size exceeds the average size of the native enzyme molecules, while the suspension or substrate solution with the native enzyme located in them is sequentially processed first on matrices whose pore diameters are smaller than the sizes of the native enzyme molecules, and then on matrices with diameters their pores exceeding the size of the molecules of the native enzyme. The substrate with the enzyme is placed in an electric field with a strength of 3 to 25 V / cm to create directional electromigration of the substrate molecules to the surface of the immobilized enzyme and electromigration of the native enzyme from the surface of the immobilized. In the hydrolysis of protein substrates, phosphoric acid or its salts in an amount of 0.1 to 1.4 wt.% Are used as a modifier. by weight of the processed substrate. In the hydrolysis of carbohydrate substrates, boric acid or borates in an amount of 0.2 to 3 wt% are predominantly used as a modifier. by weight of the substrate.
Сопоставительный анализ заявленного решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в гидролизуемый субстрат одновременно с иммобилизованным ферментом вводят нативный фермент, а также определенное количество модификатора с целью, придания молекулам субстрата электрического заряда, противоположного по знаку заряду молекул нативного фермента. При этом гидролиз ведут в направленном электрическом поле с определенной напряженностью, и при определенных пределах величин pH реакционной среды. Кроме того, для процесса используют носители (матрицы) иммобилизованного фермента с определенными диаметрами пор. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". A comparative analysis of the claimed solution with the prototype shows that the claimed method differs from the known one in that a native enzyme is introduced into the hydrolyzable substrate simultaneously with the immobilized enzyme, as well as a certain amount of modifier to give the substrate molecules an electric charge that is opposite in sign to the charge of the native enzyme molecules. In this case, hydrolysis is carried out in a directed electric field with a certain intensity, and at certain limits of the pH of the reaction medium. In addition, immobilized enzyme carriers (matrices) with specific pore diameters are used for the process. Thus, the claimed method meets the criterion of "novelty."
Анализ других известных способов гидролиза биологических субстратов не позволил выявить в них совокупность признаков, отличающую заявляемое решение от прототипа. Сумма известных и отличительных существенных признаков в предложенном способе дает положительный эффект, позволяющий достичь поставленной цели. Таким образом, по мнению автора, предложенное решение соответствует критерию "существенные отличия". Analysis of other known methods of hydrolysis of biological substrates did not allow to reveal in them a combination of features that distinguishes the claimed solution from the prototype. The sum of the known and distinctive essential features in the proposed method gives a positive effect, allowing to achieve the goal. Thus, according to the author, the proposed solution meets the criterion of "significant differences".
Суть предложенного способа состоит в том, что в раствор или суспензию с гидролизуемым белковым или углеводным субстратом, перед их гидролизом (или одновременно с началом гидролиза) иммобилизованным ферментом, вводят суперкаталическое количество нативного фермента. Нативный фермент, взаимодействуя с субстратом, подвергает высокомолекулярный субстрат предварительному гидролизу, расщепляя молекулы субстрата на части. При этом с объеме реакционной среды происходит некоторое снижение молекулярной массы субстрата и последний становится пригодным для последующего полного гидролиза иммобилизованным ферментом. Сам по себе полный гидролиз субстратов только с помощью нативного фермента представляет собой весьма долгий процесс, длящийся до нескольких суток. Гидролиз же высокомолекулярных соединений, особенно нерастворимых, невозможен в полном объеме иммобилизованным ферментом, т.к. процесс выходит через некоторое время на плато и в обрабатываемом растворе остаются непрогидролизованные молекулы субстрата с большим молекулярным весом. The essence of the proposed method is that a supercatalytic amount of the native enzyme is introduced into a solution or suspension with a hydrolyzable protein or carbohydrate substrate, before their hydrolysis (or simultaneously with the start of hydrolysis) by an immobilized enzyme. The native enzyme, interacting with the substrate, subjected the high molecular weight substrate to preliminary hydrolysis, splitting the substrate molecules into parts. In this case, a decrease in the molecular weight of the substrate occurs with the volume of the reaction medium, and the latter becomes suitable for subsequent complete hydrolysis of the immobilized enzyme. By itself, the complete hydrolysis of substrates using only the native enzyme is a very long process, lasting up to several days. Hydrolysis of high molecular weight compounds, especially insoluble ones, is not possible in full with an immobilized enzyme, because After a while, the process goes to a plateau and non-hydrolyzed substrate molecules with a high molecular weight remain in the treated solution.
Нативный фермент не только подготавливает высокомолекулярные соединения к гидролизу на матрицах путем предварительного разрушения массивных молекул субстрата в растворе, но и является катализатором гидролиза субстрата иммобилизованным ферментом, значительно ускоряя своим присутствием в растворе этот процесс. Замечено, что присутствие суперкаталического количества нативного фермента в растворе /суспензии/ является достаточным для катализа процесса полного гидролиза субстрата иммобилизованным ферментом. The native enzyme not only prepares macromolecular compounds for hydrolysis on matrices by preliminary destruction of massive substrate molecules in solution, but is also a catalyst for hydrolysis of the substrate by an immobilized enzyme, significantly accelerating this process in its presence in solution. It is noted that the presence of a supercatalytic amount of the native enzyme in the solution / suspension / is sufficient to catalyze the process of complete hydrolysis of the substrate by an immobilized enzyme.
Молекулы нативного фермента, в отличие от молекул субстрата, имеют заряд. Для создания взаимного притяжения молекул субстрата и нативного фермента необходимо придать молекулам субстрата противоположный заряд. Это дает убыстрение объемной скорости взаимодействия нативного фермента обрабатываемым субстратом за счет взаимопритяжения между их молекулами. Molecules of the native enzyme, in contrast to the molecules of the substrate, have a charge. To create a mutual attraction of the substrate molecules and the native enzyme, it is necessary to give the substrate molecules the opposite charge. This gives an acceleration of the volumetric rate of interaction of the native enzyme with the processed substrate due to the mutual attraction between their molecules.
Молекулы нативного и иммобилизованного ферментов, обладая одинаковыми по знаку зарядами, отталкиваются друг от друга. Однако взаимодействие некоторого количества их молекул происходит, что приводит к разрушению молекул нативного фермента. Чтобы как можно полнее избежать потерь нативного фермента, а также одновременно увеличить скорость поступления фермента к субстрату, в объеме гидролизера организуют направленное электрическое поле с определенной напряженностью. При наличии такого поля повышается скорость электромиграции молекул субстрата к молекулам нативного фермента, что увеличивает объемную скорость расщепления высокомолекулярного субстрата нативным ферментом, а значит и скорость полного гидролиза субстрата. Molecules of native and immobilized enzymes, having identical charges in terms of sign, are repelled from each other. However, the interaction of a certain number of their molecules occurs, which leads to the destruction of the native enzyme molecules. In order to avoid the loss of the native enzyme as completely as possible, as well as at the same time increase the rate of the enzyme entering the substrate, a directed electric field with a certain intensity is organized in the hydrolyzer volume. In the presence of such a field, the rate of electromigration of substrate molecules to the molecules of the native enzyme increases, which increases the volumetric rate of cleavage of the high molecular weight substrate by the native enzyme, and hence the rate of complete hydrolysis of the substrate.
Одновременно с этим, наличие направленного электрического поля полностью исключает контакт молекул нативного фермента с иммобилизованным ферментом за счет электромиграции молекул нативного фермента от поверхности иммобилизованного. Этим молекулы нативного фермента предохраняются от разрушения и функционируют в растворе продолжительное время. Кроме этого, достигается дополнительный эффект снижение вероятности попадания нативного фермента в готовый продукт, т.к. происходит электромиграция молекул фермента в противоположную от выходного патрубка гидролизера сторону. At the same time, the presence of a directed electric field completely excludes the contact of the native enzyme molecules with the immobilized enzyme due to the electromigration of the native enzyme molecules from the surface of the immobilized one. Thus, the molecules of the native enzyme are protected from destruction and function in solution for a long time. In addition, an additional effect is achieved by reducing the likelihood of the native enzyme entering the finished product, because there is an electromigration of enzyme molecules to the opposite side from the outlet of the hydrolyzer.
Загрязнение готового продукта нативным ферментом полностью исключается применением в гидролизере гранульных матриц с определенным диаметром пор. Верхний слой матриц в колонке может иметь поры, диаметр которых не превышает среднего размера молекул нативного фермента, и поэтому нативный фермент в растворе может присутствовать в этой зоне колонки. При дальнейшем опускании в колонке обрабатываемого раствора /суспензии/, раствор попадает в зону размещения матриц с порами, диаметры которых больше размера молекул нативного фермента. Если, невзирая на наличие направленного электрического поля, оттягивающего нативный фермент вверх на колонки, какое-то количество фермента "проскочит" в нижний уровень колонки, то его молекулы попадают в крупные поры матриц и разрушаются иммобилизованным ферментом. Contamination of the finished product with a native enzyme is completely eliminated by the use of granular matrices with a certain pore diameter in the hydrolyzer. The top layer of the matrices in the column can have pores whose diameter does not exceed the average size of the molecules of the native enzyme, and therefore, the native enzyme in solution can be present in this zone of the column. With further lowering in the column of the treated solution / suspension /, the solution enters the zone of placement of matrices with pores whose diameters are larger than the size of the native enzyme molecules. If, despite the presence of a directed electric field, pulling the native enzyme up to the columns, a certain amount of the enzyme will “slip” into the lower level of the column, then its molecules enter the large pores of the matrices and are destroyed by the immobilized enzyme.
Чтобы не нейтрализовать заряды молекул субстрата или нативного фермента, гидролиз ведут при pH среды, величина которого находится в интервале между изоэлектрическими точками нативного фермента и субстрата. In order not to neutralize the charges of the molecules of the substrate or native enzyme, hydrolysis is carried out at pH of the medium, the value of which is in the interval between the isoelectric points of the native enzyme and the substrate.
Осуществление предложенного способа поясняется с помощью устройства, представленного на чертеже. Устройство содержит реакционную колонку 1, заполненную пористыми матрицами 2 с иммобилизованным на их порах ферментом. Матрицы 2 могут быть выполнены в виде гранул силикагеля. Верхний уровень колонки 1, например, до середины, заполнен матрицами 2 с порами, диаметр которых не превышает размер молекул нативного фермента, а нижний уровень колонки 1 заполнен матрицами 2, имеющими поры, превышающими по диаметру средний размер молекул нативного фермента. Колонка 1 имеет входную верхнюю и выходную нижнюю горловины. Колонка 1 помещена внутрь емкости 3 и сообщена своей верхней горловиной с полостью емкости 3, а нижней горловиной с камерой 4 для отбора готового продукта. Емкость 3 снабжена патрубком 6 для подвода раствора или суспензии субстрата, а камера 4 патрубком 7 для отвода готового продукта. Объем емкости 3 больше объема колонки 1 в 1,5oC6 раз. Внутри емкости 3 установлен электрод 8, а в камере 4 установлен электрод 9. Электроды 8 и 9 подключены к источнику тока. Электрод 8 в несколько раз больше по площади электрода 9.The implementation of the proposed method is illustrated using the device shown in the drawing. The device contains a reaction column 1 filled with porous matrices 2 with an enzyme immobilized on their pores. Matrices 2 can be made in the form of silica gel granules. The upper level of column 1, for example, to the middle, is filled with matrices 2 with pores whose diameter does not exceed the size of the native enzyme molecules, and the lower level of column 1 is filled with matrices 2, which have pores larger in diameter than the average size of the native enzyme molecules. Column 1 has an input upper and output lower neck. Column 1 is placed inside the tank 3 and communicated with its upper neck with the cavity of the tank 3, and the lower neck with the chamber 4 for selection of the finished product. The tank 3 is equipped with a pipe 6 for supplying a solution or suspension of the substrate, and a chamber 4 with a pipe 7 for removal of the finished product. The volume of the tank 3 is greater than the volume of the column 1 in 1.5 o C6 times. An electrode 8 is installed inside the container 3, and an electrode 9 is installed in the chamber 4. The electrodes 8 and 9 are connected to a current source. The electrode 8 is several times larger in area of the electrode 9.
Предложенный способ реализуется следующим способом. В емкость 3 через патрубок 8 подают борный раствор или суспензию обрабатываемого биологического субстрата. Субстрат проникает в толщу матриц 2 в колонке 1, где подвергается полному гидролизу. Одновременно с этим в емкость 3 на устройства 5 непременно поступает необходимое количество нативного фермента (0,001 0,1% мас. от массы гидролизуемого субстрата). Кроме того, в емкость 3 добавляется модификатор для придания молекулам субстрата электрического заряда, противоположного по знаку молекул нативного фермента. Если гидролизуется белковый субстрат, то в качестве модификатора применяют преимущественно фосфорную кислоту или ее соли в количестве 0,1 1,4 мас. от массы гидролизуемого субстрата. При гидролизе углеводных субстратов в качестве модификатора преимущественно используют борную кислоту или бораты в количестве 0,2 3 мас. от массы субстрата. The proposed method is implemented in the following way. Boron solution or suspension of the processed biological substrate is fed into the container 3 through the pipe 8. The substrate penetrates into the thickness of matrices 2 in column 1, where it undergoes complete hydrolysis. At the same time, the required amount of the native enzyme (0.001 0.1% by weight of the mass of the hydrolyzable substrate) necessarily arrives in the container 3 on the device 5. In addition, a modifier is added to capacity 3 to give the substrate molecules an electric charge that is opposite in sign to the native enzyme molecules. If the protein substrate is hydrolyzed, then phosphoric acid or its salts in an amount of 0.1 to 1.4 wt.% Are used as a modifier. by weight of the hydrolyzable substrate. In the hydrolysis of carbohydrate substrates, boric acid or borates in an amount of 0.2 to 3 wt. by weight of the substrate.
Имеющие противоположные по знаку заряды, молекулы субстрата и нативного фермента притягиваются друг к другу, и молекулы субстрата расщепляются ферментом. Высокомолекулярный субстрат становится низкомолекулярным, пригодным для гидролиза иммобилизованным ферментом. При этом pH реакционной среды не должно совпадать по значению с изоэлектрическими точками субстрата и нативного фермента, чтобы не нейтрализовать их заряды и действие электрического поля, которое поддерживается с напряженностью 3-25 в/см электродами 8 и 9. Charges of opposite sign, the molecules of the substrate and the native enzyme are attracted to each other, and the molecules of the substrate are split by the enzyme. A high molecular weight substrate becomes a low molecular weight, immobilized enzyme suitable for hydrolysis. In this case, the pH of the reaction medium should not coincide in value with the isoelectric points of the substrate and the native enzyme, so as not to neutralize their charges and the action of the electric field, which is maintained with a voltage of 3-25 V / cm by electrodes 8 and 9.
Присутствие нативного фермента является катализатором гидролиза субстрата иммобилизованным ферментом. Вышеуказанное количество нативного фермента в субстрате достаточно для катализирования полного гидролиза субстрата на иммобилизированном ферменте. The presence of a native enzyme is a catalyst for hydrolysis of a substrate by an immobilized enzyme. The above amount of native enzyme in the substrate is sufficient to catalyze the complete hydrolysis of the substrate on an immobilized enzyme.
При контакте молекул нативного фермента с иммобилизированным, молекулы нативного фермента разрушаются и его количество в растворе субстрата может снизиться. Однако, благодаря одинаковому знаку заряда молекул этих ферментов, они взаимоотталкиваются, и, кроме того, электрическое поле вызывает электромиграцию молекул нативного фермента от иммобилизованного фермента, что снижает вероятность их контактирования. Upon contact of the molecules of the native enzyme with the immobilized, the molecules of the native enzyme are destroyed and its amount in the substrate solution may decrease. However, due to the identical sign of the charge of the molecules of these enzymes, they repel each other, and, in addition, the electric field causes electromigration of the native enzyme molecules from the immobilized enzyme, which reduces the likelihood of their contact.
Для полного исключения попадания нативного фермента в готовый продукт при выходе последнего из патрубка 7 камеры 4, предусмотрено увеличение диаметра пор матриц 2, расположенных в нижней половине колонки 1. Если нативный фермент достигает в колонке 1 зоны с крупнопористыми матрицами 2, фермент адсорбируется в порах и разрушается иммобилизованным ферментом. Находясь же в зоне мелкопористых матриц, нативный фермент не соприкасается с иммобилизованным, а свободно расщепляет здесь молекулы субстрата, являясь одновременно, как указано выше, и катализатором для гидролиза иммобилизованным ферментом. Таким образом, нативный фермент действует во всем объеме емкости 3 и в части объема колонки 1. To completely eliminate the ingress of the native enzyme into the finished product when the latter exits the pipe 7 of chamber 4, an increase in the pore diameter of the matrices 2 located in the lower half of column 1 is provided. If the native enzyme reaches zones with large porous matrices 2 in column 1, the enzyme is adsorbed in destroyed by an immobilized enzyme. Being in the zone of finely porous matrices, the native enzyme does not come into contact with the immobilized one, but freely breaks down the substrate molecules here, being simultaneously, as indicated above, a catalyst for hydrolysis of the immobilized enzyme. Thus, the native enzyme acts in the entire volume of the tank 3 and in part of the volume of the column 1.
Примеры конкретной реализации предлагаемого способа приведены ниже. Examples of specific implementations of the proposed method are given below.
Пример 1 Контрольный. Example 1 Control.
Гидролиз проводят без участия нативного фермента. В колбу загружают 17 мас. ч. желатина, 1 мас.ч. иммобилизованного по ионно-координационному механизму фермента Протосубтилина на 1,2 мас.ч. матрицы силикагеля с порами 1000 А и 100 мас.ч. воды. Гидролиз проводили при 30oC, при непрерывном перемешивании со скоростью 60 об/мин. мешалки. Полный гидролиз не осуществляется даже за 100 ч. гидролиз при pH 7,2 кислотности, выходит на плато уже за 130 мин. но даже за 100 ч. не превышает 27%
Пример 2.Hydrolysis is carried out without the participation of the native enzyme. 17 wt. part of gelatin, 1 part by weight the protosubtilin enzyme immobilized by the ion-coordination mechanism by 1.2 parts by weight silica gel matrices with pores of 1000 A and 100 parts by weight water. The hydrolysis was carried out at 30 o C, with continuous stirring at a speed of 60 rpm mixers. Complete hydrolysis is not carried out even after 100 hours. Hydrolysis at pH 7.2 acidity, reaches a plateau in 130 minutes. but even for 100 hours it does not exceed 27%
Example 2
Пример осуществляли по примеру 1, но дополнительно вводят нативный фермент Протосубтилин, в количестве 0,01 мас.ч. Время полного гидролиза (99%) составляет 32 мин. Кислотность среды 7,2. The example was carried out as in example 1, but additionally introduced the native enzyme Protosubtilin, in an amount of 0.01 wt.h. Complete hydrolysis time (99%) is 32 minutes. The acidity of the medium is 7.2.
Пример 3 Контрольный. Example 3 Control.
Все осуществляется по примеру 2, но без иммобилизованного фермента, время полного гидролиза, на 99% составляет 57 ч. Everything is carried out as in example 2, but without an immobilized enzyme, the time of complete hydrolysis, by 99%, is 57 hours.
Пример 4. Example 4
Осуществляли по примеру 2, но загружали нативного фермента /Протосубтилина/ всего 0,00001 мас.ч. Гидролизат с конверсией 99% получают за 30 ч. Carried out as in example 2, but loaded the native enzyme / Protosubtilin / total 0,00001 wt.h. A hydrolyzate with a conversion of 99% is obtained in 30 hours.
Пример 5. Example 5
В колонну, снабженную устройством для ввода нативного фермента, выполненной в виде капельной воронки, устройством для отвода гидролизата и устройства для ввода субстрата, помещают 100 мас. ч. трипсина, изоэлектрическая точка 4,2, иммобилизованного на матрице силикагеля с порами, размером 56А /5,6 нм/, с содержанием белка 31% В колонну подают раствор желатина, с изоэлектрической точкой 7,24 с концентрацией 10% раствор нативного Дрожжелитина /изоэлектрическая точка 4,8/ со средним размером молекул 27 А /2,7 нм/, так, чтобы концентрация желатина в растворе составляла 8% мас. а Дрожжелитина 0,008% мас. при pH 6,3 боратного буфера с концентрацией 1 моль/л. Раствор подавали с линейной скоростью 1 см/мин при высоте слоя иммобилизованного фермента в 10 см. Получают гидролизат с содержанием аминокислот 8% мас. с конверсией 99,9% не содержащего нативного фермента. Время контакта 10 минут. За десять минут конверсия составляет 99,9%
Пример 6.100 wt. including trypsin, isoelectric point 4.2, immobilized on a silica gel matrix with pores, size 56A / 5.6 nm /, with a protein content of 31%, a gelatin solution is fed into the column, with an isoelectric point of 7.24 with a concentration of 10% solution of native Drozhelitin / isoelectric point 4.8 / with an average molecular size of 27 A / 2.7 nm /, so that the concentration of gelatin in the solution was 8% wt. and Drozhelitina 0.008% wt. at a pH of 6.3 borate buffer with a concentration of 1 mol / L. The solution was supplied at a linear speed of 1 cm / min with an immobilized enzyme layer height of 10 cm. A hydrolyzate with an amino acid content of 8% by weight was obtained. with a conversion of 99.9% free of native enzyme. Contact time 10 minutes. In ten minutes, the conversion is 99.9%
Example 6
Осуществляют согласно Примеру 5, но используют желатин с концентрацией 12% мас. перед колонкой помещают предколонку с размером пор в силикагеле 18 А /1,8 нм/. Получают раствор аминокислот с концентрацией 10% мас. не содержащей нативный Дрожжелитин, конверсией 100% время контакта 11 мин. Carried out according to Example 5, but using gelatin with a concentration of 12% wt. a column with a pore size in silica gel of 18 A / 1.8 nm / is placed in front of the column. Get a solution of amino acids with a concentration of 10% wt. not containing native Drojelitin, 100% conversion, contact time 11 min.
Пример 7. Example 7
По примеру 5, но вводят электроды и создают напряженность электрического поля 3 В/см. Проводят гидролиз крахмала с концентрацией его в растворе 8% мас. на иммобилизованной и нативной амилазе с концентрацией амилазы на иммобилизованном ферменте в матрице силикагеля 235 мг/г и концентрацией нативной амилазы в растворе 0,0001 мас. Изоэлектрическая точка амилазы 5,3. В субстрат вводят 0,2% мас. боратного буфера поддерживающего кислотность субстрата 3,4. Время контакта 20 мин. конверсия 99% нативный фермент в гидролизате отсутствует, пока есть напряжение, при отключении напряжения проникает нативная амилаза с концентрацией 0,0001% мас. In example 5, but the electrodes are introduced and an electric field of 3 V / cm is created. Hydrolysis of starch is carried out with its concentration in a solution of 8% wt. on immobilized and native amylase with an amylase concentration on an immobilized enzyme in a silica gel matrix of 235 mg / g and a native amylase concentration in a solution of 0.0001 wt. Isoelectric point of amylase 5.3. 0.2% wt. 3.4 borate buffer supporting acidity substrate. Contact time 20 min. the conversion of 99% of the native enzyme in the hydrolyzate is absent, as long as there is tension, when the voltage is turned off, native amylase with a concentration of 0.0001% wt.
Пример 8. Example 8
По примеру 7, но создают напряженность электрического поля 25 В/см. Гидролизуют яичный альбумин /изоэлектрическая точка 6,2/ в присутствии фосфатного буфера с концентрацией 0,1% мас. при концентрации белка 10% мас. при pH 5,3. Концентрация нативного Дрожжелитина 0,0001% его изоэлектрическая точка 3,8. В этом примере использован иммобилизованный трипсин по примеру 5. При времени контакта в 60 мин, получают конверсию 100% концентрации аминокислот 10% полном отсутствии нативного фермента. According to example 7, but create an electric field of 25 V / cm Egg albumin is hydrolyzed (isoelectric point 6.2) in the presence of phosphate buffer with a concentration of 0.1% wt. at a protein concentration of 10% wt. at pH 5.3. The concentration of native Drozhelitin is 0.0001%; its isoelectric point is 3.8. In this example, the immobilized trypsin of Example 5 was used. With a contact time of 60 minutes, a conversion of 100% amino acid concentration to 10% complete absence of native enzyme was obtained.
Пример 9 Контрольный. Example 9 Control.
По примеру 8, но без напряжения на электродах. При этом на выходе из колонки появляется нативный фермент в количестве 0,00008% мас. по активности. According to example 8, but without voltage on the electrodes. At the same time, the native enzyme in the amount of 0.00008% wt. by activity.
Пример 10. Example 10
По примеру 7, но модификатор вводят в количестве 3% мас. от массы субстрата. Время контакта 20 мин. конверсия 99,9% нативный фермент отсутствует. In example 7, but the modifier is administered in an amount of 3% wt. by weight of the substrate. Contact time 20 min. conversion of 99.9% native enzyme is absent.
Пример 11. Example 11
По Примеру 8, но модификатор вводят в количестве 1,4 мас. Через 50 минут контакта выход составил 99,6% мас. концентрация аминокислот 10% мас. нативный фермент в гидролизате отсутствует. According to Example 8, but the modifier is introduced in an amount of 1.4 wt. After 50 minutes of contact, the yield was 99.6% wt. amino acid concentration of 10% wt. there is no native enzyme in the hydrolyzate.
При концентрации модификатора меньше указанных минимальных пределов, заряд молекул фермента и субстрата недостаточен для электромиграции. При большей начинает уменьшаться активность нативного и иммобилизованного ферментов. При напряженности электрического поля менее 3 В/см скорость электромиграции недостаточна для эффективного предотвращения диффузии нативного фермента и ускоренной диффузии субстрата к иммобилизованному ферменту. При большей, чем 25 В/см, напряженности, раствор сильно перегревается и за счет электролиза теряется активность фермента. When the modifier concentration is less than the specified minimum limits, the charge of the enzyme and substrate molecules is insufficient for electromigration. With a larger, the activity of native and immobilized enzymes begins to decrease. When the electric field is less than 3 V / cm, the electromigration rate is insufficient to effectively prevent diffusion of the native enzyme and accelerated diffusion of the substrate to the immobilized enzyme. At a voltage greater than 25 V / cm, the solution overheats and the enzyme activity is lost due to electrolysis.
Предложенный способ гидролиза биологических субстратов интенсифицирует процесс гидролиза, повышает качество и чистоту получаемого продукта, позволяет использовать в качестве обрабатываемого сырья не только низкомолекулярные, но и высокомолекулярные белковые и полисахаридные субстраты. Исключается потеря нативного фермента и увеличивается выход готового продукта. Сокращаются потери на закупку дорогостоящего оборудования. Очистка сточных вод, содержащих отходы с утилизацией аминокислот, позволит улучшить экологическую ситуацию и получить дополнительный экономический эффект. The proposed method for the hydrolysis of biological substrates intensifies the hydrolysis process, improves the quality and purity of the obtained product, and allows us to use not only low molecular weight, but also high molecular weight protein and polysaccharide substrates as processed raw materials. The loss of the native enzyme is eliminated and the yield of the finished product increases. Losses on the purchase of expensive equipment are reduced. The treatment of wastewater containing waste with the disposal of amino acids will improve the environmental situation and get an additional economic effect.
Источники информации. Sources of information.
1. Пат. N 79-06616 Нидерланды, МКИ C 12 P 12/02, 1980 г. 1. Pat. N 79-06616 Netherlands, MKI C 12 P 12/02, 1980
2. Неклюдов А.Д. Навашин С.М. "Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами", журнал "Прикладная биохимия и микробиология", 1985, т.21, N1, с. 3-17. 2. Neklyudov A.D. Navashin S.M. "Obtaining protein hydrolysates with desired properties," Journal of Applied Biochemistry and Microbiology, 1985, v.21, N1, p. 3-17.
3. Менеке Г. Полянский Д. "Реакционоспособные носители для иммобилизации биокатализаторов" в сб. Синтез и химические превращения полимеров, Л. ЛГУ, 1986 г. с. 45-75 (прототип). 3. Meneke G. Polyansky D. "Reactive carriers for immobilization of biocatalysts" in sb. Synthesis and chemical transformations of polymers, L. Leningrad State University, 1986 p. 45-75 (prototype).
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93040067A RU2093575C1 (en) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Method of hydrolysis of biological substrates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93040067A RU2093575C1 (en) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Method of hydrolysis of biological substrates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU93040067A RU93040067A (en) | 1996-08-20 |
| RU2093575C1 true RU2093575C1 (en) | 1997-10-20 |
Family
ID=20146247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93040067A RU2093575C1 (en) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Method of hydrolysis of biological substrates |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2093575C1 (en) |
-
1993
- 1993-08-06 RU RU93040067A patent/RU2093575C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Менеке Г., Полянский Д. Реакционноспособные носители для иммобилизации биокатализаторов. Сб. Синтез и химические превращения полимеров. - Л.: ЛГУ, 1986, с.45 - 75. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rosevear | Immobilised biocatalysts—a critical review | |
| Kimura et al. | Application of immobilized lipase to hydrolysis of triacylglyceride | |
| NO140233B (en) | PROCEDURE FOR CARRYING OUT AN ENZYME-CATALIZED CONVERSION, AS WELL AS ENZYMOUS UNITS FOR USE IN THE PROCEDURE | |
| Weetall et al. | Preparation and characterization of isolubilized l‐amino acid oxidase | |
| JPS62257386A (en) | Method for preserving nitrile hydrating activity | |
| Dronawat et al. | The effects of agitation and aeration on the production of gluconic acid by Aspergillus niger | |
| US5006472A (en) | Enzymatic purification process | |
| Korus et al. | The use of α‐galactosidase and invertase in hollow fiber reactors | |
| Tomotani et al. | Catalytic performance of invertase immobilized by adsorption on anionic exchange resin | |
| EP0034933B1 (en) | Immobilized enzymes, a process for their preparation, and their use in converting substrates to products | |
| RU2093575C1 (en) | Method of hydrolysis of biological substrates | |
| US3989597A (en) | Aggregate of flocculated cells | |
| Karube et al. | Production of L-glutamate by immobilized protoplasts | |
| US3989596A (en) | Aggregate of dried flocculated cells | |
| JPH0611328B2 (en) | Method for treating liquid using porous hollow fiber to which physiologically active substance is immobilized | |
| Szczesna et al. | PVA-biocatalyst with entrapped viable Bacillus subtilis cells | |
| JPS5974984A (en) | Preparation of immobilized enzyme or microorganism | |
| USRE29130E (en) | Enzymatic process using immobilized microbial cells | |
| Karube et al. | Bacteriolysis by immobilized enzymes | |
| JPS6258708B2 (en) | ||
| Hua et al. | Continuous biocatalytic resolution of dl-pantolactone by cross-linked cells in a membrane bioreactor | |
| Slokoska et al. | Production of acid proteinase by Humicola lutea 120-5 immobilized in mixed photo-cross-linked polyvinyl alcohol and calcium-alginate beads | |
| NL8120168A (en) | ||
| Szczęsna et al. | Protein hydrolysis by immobilised Bacillus subtilis cells | |
| USRE29136E (en) | Enzymatic process using immobilized microbial cells |