RU2092853C1

RU2092853C1 - Immunodiagnosticum and a method of solid-phase immune analysis based on thereof

Info

Publication number: RU2092853C1
Authority: RU
Inventors: Александр Георгиевич Полтавченко; Юрий Ильич Сенькин; Виталий Семенович Караваев
Original assignee: Александр Георгиевич Полтавченко; Юрий Ильич Сенькин; Виталий Семенович Караваев
Priority date: 1992-10-12
Filing date: 1992-10-12
Publication date: 1997-10-10

Abstract

FIELD: medicine, veterinary science, biotechnology, immunochemistry. SUBSTANCE: immunodiagnosticum is an aqueous suspension of marker particles - inorganic catalyst (optimal size is 0.1-10 mcm) bound by sorption with one of specific immune reagent at ratio by mass marker to immune reagent at the range from 1000:1 to 100000:1 and stabilized with high-molecular polymers. Method of solid-phase analysis immune analysis involves: immobilization of ligand with matrix, immunological reaction carrying out between the immobilized ligand and immunodiagnosticum followed by detection of ligand complexes formed and immunodiagnosticum by the presence and amount of marker bound with matrix. EFFECT: simplified method, decreased cost, high sensitivity, increased safety of analysis, decreased analysis time. 7 cl

Description

Изобретение относится к иммунохимическим методам исследований и может быть использовано для выявления в исследуемых образцах специфических антигенов (АГ) и антител (АТ) в медицине, ветеринарии, биотехнологии и экспериментальной иммунохимии. The invention relates to immunochemical research methods and can be used to detect specific antigens (AH) and antibodies (AT) in the studied samples in medicine, veterinary medicine, biotechnology and experimental immunochemistry.

Известны иммунодиагностикумы для поверхностного блот-иммуноанализа на основе высокодисперсных (с размерами частиц от 3 до 450 нм) гидрозолей металлов и их соединений, использующихся в качестве маркеров [1] Такие маркеры способны при накоплении на поверхности среды блотинга создавать окраску, различимую визуально или регистрируемую спектрофотометрически. Известны также диагностикумы, использующие в качестве маркеров такие же высокодисперсные коллоиды неметаллов, в частности селена и теллура (Патент ЕПВ N 0298368, кл. G O1 N 33/58, кл. G O1 N 33/546), обуславливающие изменения оптических свойств реакционной среды при агглютинации (преципитации) диагностикума. И в том, и в другом случаях регистрируемый результат иммунологической реакции обусловлен количеством (концентрацией) и оптическими свойствами самого маркера. Эти методы надежны и просты в исполнении, однако вследствие того, что для формирования регистрируемых изменений оптических свойств требуются значительные концентрации меченого иммунореагента и лиганда, они уступают по чувствительности таким методам иммунодиагностики, как иммуноферментный анализ (ИФА). Known immunodiagnostics for surface blot immunoassay based on highly dispersed (with particle sizes from 3 to 450 nm) metal hydrosols and their compounds used as markers [1] Such markers are capable of creating a color that is visually or recorded spectrophotometrically when accumulated on the surface of the blotting medium . Diagnostics are also known that use the same highly dispersed non-metal colloids as markers, in particular selenium and tellurium (EPO Patent No. 0298368, class G O1 N 33/58, class G O1 N 33/546), which cause changes in the optical properties of the reaction medium with agglutination (precipitation) of the diagnosticum. In both cases, the recorded result of the immunological reaction is determined by the quantity (concentration) and optical properties of the marker itself. These methods are reliable and simple to implement, however, due to the fact that significant concentrations of labeled immunoreagent and ligand are required for the formation of recorded changes in optical properties, they are inferior in sensitivity to immunodiagnostic methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Известны также иммунодиагностикумы для иммуноферментного анализа, представляющие собой конъюгат одного из иммунореагентов с маркером одним из ферментов растительного или микробиологического происхождения. Конъюгирование указанных компонентов в таких диагностикумах производится за счет ковалентного связывания и определяется молярным соотношением около 1^oC1.Also known are immunodiagnostics for enzyme immunoassay, which are a conjugate of one of the immunoreagents with a marker of one of the enzymes of plant or microbiological origin. The conjugation of these components in such diagnostics is carried out due to covalent binding and is determined by a molar ratio of about 1 ^o C1.

Известно близкое к предлагаемому иммунодиагностикуму решение [1] в котором использован диагностический состав: коллоидный раствор частиц маркера (металла или его соединения) с заданной дисперсностью, сорбционно или ковалентно связанный со специфически имуннореагеном (антителами, антигенами или стафилококковым белком А) и стабилизированный высокомолекулярными неспецифицескими полимерами (бычьим сывороточным альбумином, яичным альбумином, полиэтиленгликолем и т. д.). Использование таких диагностикумов ограничено в ряде практических применений низкой чувствительностью его выявления. Как уже отмечено выше, выявление таких диагностикумов основывается на оптических свойствах маркера (окраске и контрастности) и достигается при накоплении на поверхности твердой фазы его визуально фиксируемых количеств. A solution close to the proposed immunodiagnostic is known [1] in which the diagnostic composition is used: a colloidal solution of marker particles (metal or its compound) with a given dispersion, sorption or covalently associated with a specific immunoreagen (antibodies, antigens or staphylococcal protein A) and stabilized with high molecular weight non-specific polymers (bovine serum albumin, egg albumin, polyethylene glycol, etc.). The use of such diagnostics is limited in a number of practical applications by the low sensitivity of its detection. As already noted above, the identification of such diagnostic kits is based on the optical properties of the marker (color and contrast) and is achieved by the accumulation of visually fixed amounts on the surface of the solid phase.

Известно, что чувствительность обнаружения следовых количеств неорганических веществ, обладающих каталитическими свойствами, может быть существенно увеличена применением индикаторных каталиметрических реакций. Так, для большинства элементов периодической системы нижняя граница концентраций, определяемых с применением каталиметрии, на 1-2 порядка ниже, чем значения, определяемые методами спектрофотометрии, полярографии и пламенного варианта атомной абсорбуции (С.У.Крейнгольд "Каталиметрия в анализе реактивов и веществ особой чистоты.", -М. Химия, 1983, с.23), не говоря уже о визуальной регистрации. Однако до настоящего времени принцип индикаторной каталиметрии в иммунологических тестах не использовался. It is known that the detection sensitivity of trace amounts of inorganic substances with catalytic properties can be significantly increased by the use of indicator catalytic reactions. So, for most elements of the periodic system, the lower limit of concentrations determined using catalymetry is 1-2 orders of magnitude lower than the values determined by spectrophotometry, polarography, and flame version of atomic absorption (S.U. Kreingold "Catalimetry in the analysis of special reagents and substances purity. ", -M. Chemistry, 1983, p.23), not to mention visual registration. However, to date, the principle of indicator catalimetry has not been used in immunological tests.

Наиболее близким к предлагаемому диагностикуму является иммунопероксидазный конъюгат для иммуноферментного анализа (Кревиня В.Я. Елигулашвили Р. К. Получение и исследование иммуноферментных комплексов. В сб. "Вирусные гепатиты типов А и В", Рига, 1983, с.110-115), представляющий собой один из иммунореагентов, ковалентно связанный в молярном соотношении 1:1 или 1:2 с пероксидазой хрена. Последний иммунодиагностикум имеет следующие недостатки:
значительная стоимость маркера и соответственно диагностикума на его основе, обусловленная сложной процедурой выделения и очистки активного фермента;
необходимость в хранении фермента при низких температурах и периодической оценке его активности;
неизбежная потеря активности фермента и иммуноглобулинов в процессе получения коньюгата ковалентного связывания этих реагентов;
относительно низкое насыщение коньюгата ферментной меткой (обычно молярное соотношение фермента и иммуноглобулинов 1:1), что требует для достижения высокой чувствительности применения сложных (как правило, афинных) методов очистки коньюгируемых иммуноглобулинов или антигенов;
подверженность диагностикума влиянию примесей в исследуемом образце, способных инактивировать или блокировать фермент;
необходимость обеспечения строгих физиологических условий (температура, буферные системы, особая чистота реактивов) в процессе приготовления, хранения и использования диагностикума для обеспечения нормального функционирования фермента.Closest to the proposed diagnosticum is an immunoperoxidase conjugate for enzyme-linked immunosorbent assay (Krevina V.Ya. Eligulashvili K. Production and study of enzyme-linked immunosorbent complexes. In the collection "Viral hepatitis types A and B", Riga, 1983, p. 110-115) , which is one of the immunoreagents, covalently linked in a molar ratio of 1: 1 or 1: 2 with horseradish peroxidase. The last immunodiagnostic has the following disadvantages:
the significant cost of the marker and, accordingly, the diagnosticum based on it, due to the complex procedure for the isolation and purification of the active enzyme;
the need for storage of the enzyme at low temperatures and periodic assessment of its activity;
the inevitable loss of activity of the enzyme and immunoglobulins in the process of obtaining a conjugate of covalent binding of these reagents;
relatively low saturation of the conjugate with the enzyme label (usually the molar ratio of the enzyme to immunoglobulins is 1: 1), which requires complex (usually affinity) methods for purification of conjugated immunoglobulins or antigens to achieve high sensitivity;
susceptibility of the diagnosticum to the influence of impurities in the test sample capable of inactivating or blocking the enzyme;
the need to ensure strict physiological conditions (temperature, buffer systems, high purity of reagents) during the preparation, storage and use of a diagnosticum to ensure the normal functioning of the enzyme.

Большинство из перечисленных недостатков обусловлены биологической природой маркера. Most of these shortcomings are due to the biological nature of the marker.

Основной задачей изобретения является создание более дешевого и стабильного иммунодиагностикума, обеспечивающего более высокую чувствительность анализа по сравнению с приведенными известными решениями. The main objective of the invention is the creation of a cheaper and more stable immunodiagnostic, providing higher sensitivity analysis compared to the known solutions.

Поставленная задача решается применением иммунодиагностикума, приготовленного на основе одного из нерастворимых или труднорастворимых катализаторов и представляющего собой водную взвесь частиц размером от 0,1 до 10 мкм маркера катализатора, сорбционно связанного при соотношении по массе от 100000: 1 до 1000: 1 соответственно с одним из специфических иммунореагентов (антителами, антигенами, стафилококковыми протеинами и т.п.) и стабилизированного высокомалекулярными полимерами (БСА, ПЭГ, желатин, поливинилпирралидон и т.п.). The problem is solved by the use of an immunodiagnostic prepared on the basis of one of the insoluble or sparingly soluble catalysts and representing an aqueous suspension of particles with a size of 0.1 to 10 μm of a marker of the catalyst adsorbed at a weight ratio of 100000: 1 to 1000: 1, respectively, with one of specific immunoreagents (antibodies, antigens, staphylococcal proteins, etc.) and stabilized with high molecular weight polymers (BSA, PEG, gelatin, polyvinylpyrralidone, etc.).

Причем удешевление и увеличение стабильности иммунодиагностикумов достигается использованием в качестве маркеров широкого круга доступных, дешевых и стабильных неорганических веществ, а также щадящим и экономным расходом иммунореагенов. Moreover, the cheaper and increased stability of immunodiagnostics is achieved by using as a marker a wide range of available, cheap and stable inorganic substances, as well as a sparing and economical consumption of immunoreagens.

Увеличение чувствительности достигается выбором в качестве маркеров веществ, обладающих выраженными каталитическими свойствами и способных с высокой чувствительностью выявляться в индикаторных каталиметрических реакциях (таких, как труднорастворимые в воде соединения железа или меди, или марганца, или хрома, или никеля, или кобальта, или титана, или молибдена, или вольфрама, или серебра, а также труднорастворимые в воде соли галогенводородных кислот или коллоиды селена или серебра или золота), а также применением более крупных частиц маркера, способных обеспечить накопление маркера, достаточной для эффективного проведения индикаторной каталиметрической реакции. An increase in sensitivity is achieved by choosing as markers substances with pronounced catalytic properties and capable of high sensitivity to be detected in indicator catalytic reactions (such as compounds of iron or copper, or manganese, or chromium, or nickel, or cobalt, or titanium, which are hardly soluble in water, or molybdenum, or tungsten, or silver, as well as water-insoluble salts of halogen acids or colloids of selenium or silver or gold), as well as the use of larger particles of m arkers capable of ensuring the accumulation of a marker sufficient to effectively conduct an indicator catalymetric reaction.

Новыми по сравнению с прототипами являются следующие признаки иммунодиагностикума:
используемые маркеры представляют собой активные неорганические катализаторы: золото или серебро, или селен, или труднорастворимые в воде соединения серебра или железа, или меди, или марганца, или хрома, или никеля, или кобальта, или титана, или молибдена, или вольфрама, или ванадия, или селена, или ртути, или труднорастворимые соли галогенводородных кислот;
предпочтительные размеры частиц маркера находятся в диапазоне 0,1 10 мкм;
сорбционная связь иммунореагента на частицах маркера установлена соотношением по массе иммунореагента к маркеру в диапазоне от 1:100000 до 1: 1000.New in comparison with the prototypes are the following signs of an immunodiagnosticum:
the markers used are active inorganic catalysts: gold or silver, or selenium, or water-insoluble compounds of silver or iron, or copper, or manganese, or chromium, or nickel, or cobalt, or titanium, or molybdenum, or tungsten, or vanadium or selenium or mercury or sparingly soluble salts of hydrohalic acids;
preferred marker particle sizes are in the range of 0.1 to 10 μm;
the sorption bond of the immunoreagent on the marker particles is established by the ratio by weight of the immunoreagent to the marker in the range from 1: 100000 to 1: 1000.

Наиболее близким решением предлагаемого способа имммуноанализа является способ твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (Авт. св. СССР N1243504, кл. G 01 N 33/54). Способ ИФА включает иммобилизацию лиганда на поверхности ячеек иммунологическмх планшетов (матрицу); осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и специфически связывающимся с ним иммунодиагностикумом; выявление иммунных комплексов "лиганд
иммунодиагностикум" по наличию или количеству связывающегося с матрицей маркера, определяемого в ферментативной реакции разложения субстрата в присутствии хромогенного индикатора. Метод ИФА нашел широкое применение в научной и медицинской практике благодаря своей доступности и высокой чувствительности. Описанный способ анализа является наиболее близким к предлагаемому решению и имеет следующие недостатки:
относительно высокая стоимость используемых в ИФА диагностикумов, обусловленная сложностью процедур выявления и очистки биологически активного фермента маркера и иммунореагентов, неизбежными значительными потерями маркера и иммунореагентов в процессе получения конъюгатов путем ковалентного связывания;
подверженность результатов анализа влиянию примесей в исследуемом образце, способных инактивировать или блокировать фермент, что ограничивает сферу применения ИФА исследованиями относительно чистых проб;
необходимость обеспечения в процессе анализа строгих физиологических условий (температура, буферные системы, особая чистота реактивов) для обеспечения нормального функционирования фермента.The closest solution to the proposed method of immunoassay is a method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Aut. St. USSR N1243504, CL G 01 N 33/54). The ELISA method involves the immobilization of the ligand on the surface of the cells of immunological tablets (matrix); the implementation of the immunological reaction between the immobilized ligand and the immunodiagnosticum specifically binding to it; identification of immune complexes "ligand
immunodiagnosticum according to the presence or quantity of a marker binding to the matrix, which is determined in the enzymatic reaction of substrate decomposition in the presence of a chromogenic indicator. The ELISA method has been widely used in scientific and medical practice due to its availability and high sensitivity. The described analysis method is the closest to the proposed solution and has following disadvantages:
the relatively high cost of diagnostic kits used in ELISA, due to the complexity of the procedures for identifying and purifying the biologically active marker enzyme and immunoreagents, the inevitable significant losses of the marker and immunoreagents in the process of obtaining conjugates by covalent binding;
the susceptibility of the results of the analysis to the influence of impurities in the test sample capable of inactivating or blocking the enzyme, which limits the scope of ELISA studies of relatively pure samples;
the need to ensure strict physiological conditions (temperature, buffer systems, high purity of reagents) in the analysis process to ensure the normal functioning of the enzyme.

Задачей изобретения является создание такого способа твердофазного иммуноанализа, который позволит использовать более дешевые и стабильные иммунодиагностикумы при сохранении или повышении чувствительности иммунологических тестов и скорости анализа по сравнению с ИФА. The objective of the invention is the creation of such a method of solid-phase immunoassay, which allows the use of cheaper and more stable immunodiagnostics while maintaining or increasing the sensitivity of immunological tests and the speed of analysis compared to ELISA.

Поставленная задача решается использованием способа твердофазного иммуноанализа, включающего иммобилизацию определяемого лиганда на матрицу - планшеты для иммунологических реакций, осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и иммунодиагностикумом, выявление образовавшихся иммунных комплексов "лиганд иммунодиагностикум" по наличию или количеству связавшегося с матрицей маркера. The problem is solved using the method of solid-phase immunoassay, which includes the immobilization of the determined ligand on the matrix - tablets for immunological reactions, the implementation of the immunological reaction between the immobilized ligand and the immunodiagnosticum, the identification of the formed immune complexes "ligand immunodiagnosticum" by the presence or quantity of the marker bound to the matrix.

При этом повышение чувствительности достигается применением эффектного способа выявления маркера индикаторной каталиметрической реакции, характерной для данного маркера, а также за счет увеличения массового соотношения "маркер: иммунореагент" путем преимущественного использования крупных частиц маркера с размерами, превышающими 0,1 мкм. At the same time, an increase in sensitivity is achieved by using an effective method for identifying a marker of an indicator catalytic reaction characteristic of this marker, as well as by increasing the mass ratio of the marker: immunoreagent by predominantly using large marker particles with sizes exceeding 0.1 μm.

Сокращение времени анализа достигается подбором эффективных комбинаций маркер (катализатор) субстрат, проведением каталиметрической реакции в объеме в гетерогенной системе после снятия маркера с поверхности матрицы и удаления с его поверхности биокомпонентов соответствующим буферным раствором или в гомогенной системе после перевода маркера в ионную форму добавлением кислоты или щелочи, а также возможностью проведения каталиметрической реакции при повышенной до 70^oC температуре.Reducing the analysis time is achieved by selecting effective combinations of the marker (catalyst) substrate, carrying out a catalymetric reaction in volume in a heterogeneous system after removing the marker from the matrix surface and removing biocomponents from its surface with an appropriate buffer solution or in a homogeneous system after the marker is converted to the ionic form by adding acid or alkali , as well as the possibility of carrying out a catalytic reaction at elevated to 70 ^o C temperature.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки способа твердофазного иммуноанализа:
выявление иммунных комплексов лиганда и иммунодиагностикума производят по наличию или количеству связывающегося с матрицей маркера в характерной для этого маркера индикаторной каталиметрической реакции путем введения в реакционную смесь субстрата, содержащего индикаторные вещества и обеспечивающие при контакте с маркером изменение оптических свойств этой реакционной среды;
индикаторную каталиметрическую реакцию осуществляют в объеме после снятия маркера с матрицы и удаления с его поверхности биокомпонентов соответствующим буферным раствором;
индикаторную каталиметрическую реакцию осуществляют в объеме после перевода маркера в ионную форму добавлением в ячейки планшета кислоты или щелочи;
индикаторную каталиметрическую реакцию проводят при повышенной до 70^oC температуре.New in comparison with the prototype are the following features of the method of solid-phase immunoassay:
ligand and immunodiagnosticum immune complexes are detected by the presence or quantity of a marker that binds to the matrix in a marker of a catalytic indicator characteristic of this marker by introducing into the reaction mixture a substrate containing indicator substances and providing, upon contact with the marker, a change in the optical properties of this reaction medium;
indicator catalytic reaction is carried out in volume after removing the marker from the matrix and removing biocomponents from its surface with an appropriate buffer solution;
indicator catalytic reaction is carried out in volume after the transfer of the marker into the ionic form by adding acid or alkali to the cells of the tablet;
indicator catalytic reaction is carried out at elevated to 70 ^o C temperature.

В соответствии с принципом, положенным в основу предлагаемого метода анализа, авторы считают целесообразным определять последний термином "твердофазный иммунокаталиметрический анализ" или в сокращении "ТИКА". Такая терминология использована в дальнейшем описании. In accordance with the principle underlying the proposed analysis method, the authors consider it appropriate to define the latter with the term "solid-phase immunocatalimetric analysis" or in the abbreviation "TIKA". Such terminology is used in the further description.

Термин "определяемый лиганд" в данном описании является определением вещества, соединения или образования, наличие или количество которого в тестируемом образце необходимо установить. "Определяемый лиганд" может быть антителами, моно- или полиспецифичным простым или сложным соединениями, имеющими, как минимум, один общий эпитопный сайт или рецептор, к которому может быть получен связывающий белок иммунореагент. Способом, описанным в изобретении, могут анализироваться иммуноглобулины, инфекционные агенты различной природы, гормоны, витамины, некоторые токсиканты и другие соединения, способные взаимодействовать со специфическими связывающими компонентами иммунореагентами. The term "detectable ligand" in this description is the definition of a substance, compound or formation, the presence or quantity of which in the test sample must be established. A “detectable ligand” can be antibodies, mono- or multispecific, simple or complex compounds having at least one common epitope site or receptor to which a protein binding immunoreagent can be obtained. By the method described in the invention, immunoglobulins, infectious agents of various nature, hormones, vitamins, some toxicants and other compounds capable of interacting with specific binding components of immunoreagents can be analyzed.

В соответствии с вышеизложенным, термином "иммунореагент" в настоящем описании определяются антигены, антитела, стафилококковый протеин А и другие соединения, способные специфически распознавать и связывать определяемый лиганд. In accordance with the foregoing, the term "immunoreagent" in the present description defines antigens, antibodies, staphylococcal protein A and other compounds capable of specifically recognizing and binding a defined ligand.

Термином "маркер" в данном описании определен широкий круг неорганических веществ (элементов и их соединений), способных образовывать взвеси в водной среде, обладающих выраженными каталитическими свойствами и способностью с высокой чувствительностью выявляться в индикаторных каталиметрических реакциях, а также не оказывающих при контакте повреждающего воздействия на специфические характеристики используемых иммунореагентов. Примерами веществ, способных выступать в роли "маркеров", могут служить платина, золото, серебро, цинк, железо, медь, хром, никель, кадмий, селен, мышьяк, сера и некоторые другие элементы; нерастворимые в воде соли Zn(IV), Co(II), Th(IV), Nb(V), Ta(V), Mo(VI), W(VI), Fe(III), Ti(IV), V(V), Cr(VI) и др. а также нерастворимые соли галогеноводородных кислот. Все перечисленные выше вещества обладают выраженными каталитическими свойствами по отношению к широкому кругу реакций. В частности, многие из них могут катализировать реакции окисления пероксидом водорода индикаторных веществ, используемых при постановке ИФА, таких, например, как орто-фенилендиамин. В отношении ряда из перечисленных потенциальных маркеров, таких как платина, золото, серебро, медь, селен, иодид серебра, бромид серебра, гидроокись меди, гидроокись хрома, оксид ванадия, сульфид мышьяка, сульфид свинца, сульфат бария, двуокись титана, окись железа, гидроокись железа, гидроокись алюминия и некоторых других в предыдущих исследованиях (см. Евр. пат. NN 0158746; 0298368), показана возможность получения стабильных препаратов при конъюгировании их с иммунореагенами. На выбор маркера накладывает ограничения необходимость проведения индикаторной каталиметрической реакции непосредственно в ячейках планшета для иммунологических реакций. Эти реакции должны протекать в объеме, ограниченном емкостью ячейки планшета, при нормальном давлении и температуре, лимитированной термостойкостью материала, со скоростью, достаточной для регистрации результатов в течение 20-30 мин. Кроме того, по экономическим соображениям в выборе маркера целесообразно ориентироваться на наиболее дешевые и доступные катализаторы и субстраты. Использование в примерах к настоящему описанию гидроокиси железа в качестве маркера и перекиси водорода с добавлением о-фенилендеамина в качестве субстрата демонстрирует одно из наиболее доступных и просто реализуемых в сложившихся условиях решений и не претендует на оптимальность сделанного выбора. Известные свойства таких активных и доступных катализаторов, как соли титана, кобальта, меди и других металлов позволяют уверенно предполагать наличие комбинаций "маркер - субстрат", обеспечивающих большую чувствительность и экспрессность твердофазного иммунокаталиметрического теста по сравнению с приведенными в настоящем описании примерами. The term "marker" in this description defines a wide range of inorganic substances (elements and their compounds), capable of forming suspensions in an aqueous medium, with pronounced catalytic properties and the ability to be detected with high sensitivity in indicator catalytic reactions, as well as not having a harmful effect on contact specific characteristics of the used immunoreagents. Examples of substances that can act as “markers” include platinum, gold, silver, zinc, iron, copper, chromium, nickel, cadmium, selenium, arsenic, sulfur and some other elements; water-insoluble salts of Zn (IV), Co (II), Th (IV), Nb (V), Ta (V), Mo (VI), W (VI), Fe (III), Ti (IV), V (V), Cr (VI), etc., as well as insoluble salts of hydrohalic acids. All of the above substances have pronounced catalytic properties with respect to a wide range of reactions. In particular, many of them can catalyze the reaction of oxidizing with hydrogen peroxide the indicator substances used in the production of ELISA, such as, for example, ortho-phenylenediamine. For a number of potential markers listed, such as platinum, gold, silver, copper, selenium, silver iodide, silver bromide, copper hydroxide, chromium hydroxide, vanadium oxide, arsenic sulfide, lead sulfide, barium sulfate, titanium dioxide, iron oxide, iron hydroxide, aluminum hydroxide and some others in previous studies (see Heb. Pat. NN 0158746; 0298368), the possibility of obtaining stable drugs by conjugating them with immunoreagens is shown. The choice of marker imposes limitations on the need for an indicator catalytic reaction directly in the cells of the tablet for immunological reactions. These reactions should proceed in a volume limited by the capacity of the tablet cell, at normal pressure and temperature, limited by the heat resistance of the material, at a speed sufficient to record the results for 20-30 minutes. In addition, for economic reasons, in choosing a marker, it is advisable to focus on the cheapest and most affordable catalysts and substrates. The use of iron hydroxide as a marker and hydrogen peroxide with the addition of o-phenylenedeamine as a substrate in the examples to the present description demonstrates one of the most accessible and simply implemented solutions under the current conditions and does not pretend to be optimal. The well-known properties of such active and available catalysts as salts of titanium, cobalt, copper and other metals can confidently suggest the presence of marker-substrate combinations that provide greater sensitivity and expressivity of the solid-phase immunocatalimetric test compared to the examples described in the present description.

Приготовление иммунодиагностикума включает следующие этапы. Preparation of an immunodiagnostic involves the following steps.

1. Получение водной взвеси частиц маркера с заданной дисперсностью;
2. Коньюгирование полученных на предыдущем этапе частиц маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом;
3. Стабилизация полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера высокомолекулярными биополимерами;
4. Коррекция водородного показателя водной взвеси полученного иммунодиагностикума до параметров, необходимых для осуществления иммунологической реакции.1. Obtaining an aqueous suspension of marker particles with a given dispersion;
2. Conjugation of marker particles obtained in the previous step with a specific immunoreagent specific for the ligand being determined;
3. Stabilization of the resulting conjugate and blocking of free binding sites on the surface of marker particles by high molecular weight biopolymers;
4. Correction of the hydrogen indicator of the aqueous suspension of the obtained immunodiagnostic to the parameters necessary for the implementation of the immunological reaction.

(1). Получение высокодисперстной водной взвеси маркера может быть осуществлено любым способом, в том числе и методами, описанными в ранее опубликованных патентах, использующих гидрозоли неорганических веществ. Однако в отличие от ранее опубликованных технических решений, использующих гидрозоли с размером частиц от 5 до 450 нм, в изобретении предпочтение отдается более крупным частицам с оптимумом размеров 0,1 10 мкм. При этом обоснованием нижней границы этого диапазона служит расчетная величина массы катализатора, необходимой для достижения чувствительности ИФА, а верхняя граница диапазона ограничена устойчивостью водной взвеси частиц катализатора. Для выделения фракции частиц необходимого размера можно использовать различные методы сепарирования, например центрифугирование в режимах, рассчитанных на основании седиментационных характеристик частиц определенного маркера с заданными размерами или фильтрование полидисперсной взвеси частиц маркера через мембраны с соответствующим размером пор. В ряде случаев необходимая дисперсность может быть обеспечена условиями получения гидрозолей. (one). The preparation of a highly dispersed aqueous suspension of the marker can be carried out by any method, including the methods described in previously published patents using hydrosols of inorganic substances. However, in contrast to the previously published technical solutions using hydrosols with a particle size of 5 to 450 nm, larger particles with an optimum size of 0.1 to 10 μm are preferred in the invention. In this case, the justification of the lower boundary of this range is based on the calculated value of the catalyst mass necessary to achieve the sensitivity of ELISA, and the upper limit of the range is limited by the stability of the aqueous suspension of catalyst particles. To separate the fraction of particles of the required size, various separation methods can be used, for example, centrifugation in modes calculated on the basis of sedimentation characteristics of particles of a certain marker with given sizes or filtering a polydisperse suspension of marker particles through membranes with an appropriate pore size. In some cases, the required dispersion can be ensured by the conditions for obtaining hydrosols.

(2) Коньюгирование полученных на этапе (1) частиц маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом может быть осуществлено различными известными способами, таким как ковалентное связывание, физическая сорбция или с использованием промежуточных связующих агентов (например, в случае конъюгирования маркера с иммуноглобулинами, поверхность маркера может быть предварительно насыщена молекулами стафилококкового протеина А, а затем путем иммунохимического взаимодействия последний может быть связан со специфическими к определяемому лиганду иммуноглобулинами). Степень насыщения поверхности частиц маркера специфическим иммунореагентом определяется качеством последнего. Вследствие значительной площади поверхности частиц маркера (с поверхностью частицы размером 1-2 мкм могут быть связаны сотни тысяч молекул типа иммуноглобулина G) в настоящем способе могут быть использованы иммунореагенты с относительно невысокой специфической активностью (1% и менее), поскольку достаточный уровень активности иммунодиагностикума может быть достигнут при сорбции на частице маркера от нескольких сотен до нескольких тысяч активных молекул специфического иммунореагента. По этой же причине при использовании предлагаемого способа отсутствует необходимость проводить конъюгирование при избытке иммунореагента достаточно хорошего качества, как это практиковалось ранее. Расчеты показывают, что оптимальная нагрузка маркера иммуноглобулинами класса G при использовании препаратов lgG, содержащих около 1% специфических активных молекул, и частиц маркера с размерами в диапазоне 0,1 10 мкм достигается при соотношении по массе конъюгируемых иммуноглобуленов и маркера в диапазоне соответственно от 1:1000 до 1:100000. При этом иммуноглобулины занимают около 6-10% поверхности маркера при общем числе таких молекул на одной частице около нескольких тысяч. Эксперименты показали, что больший уровень специфической нагрузки не дает выигрыша в чувствительности анализа и, более того, в ряде случаев повышает неспецифический фон определения. Экономное использование иммунореагентов выгодно отличает предлагаемый способ от ранее описанных методов получения диагностикумов, требующих применения значительного избытка дорогостоящих высокотитражных или аффинно очищенных иммунореагентов. (2) Conjugation of the marker particles obtained in step (1) with a specific ligand-specific immunoreagent can be carried out by various known methods, such as covalent binding, physical sorption, or using intermediate binding agents (for example, in the case of conjugation of a marker with immunoglobulins, the surface of the marker can be pre-saturated with staphylococcal protein A molecules, and then, by immunochemical interaction, the latter can be associated with specific elyaemomu ligand immunoglobulins). The degree of saturation of the surface of the marker particles with a specific immunoreagent is determined by the quality of the latter. Due to the significant surface area of the marker particles (hundreds of thousands of molecules of the type of immunoglobulin G may be associated with a particle surface of 1-2 μm in size), immunoreagents with relatively low specific activity (1% or less) can be used in this method, since a sufficient level of activity of the immunodiagnostic can be achieved by sorption on a marker particle from several hundred to several thousand active molecules of a specific immunoreagent. For the same reason, when using the proposed method, there is no need for conjugation with an excess of an immunoreagent of sufficiently good quality, as was previously practiced. Calculations show that the optimal marker load with class G immunoglobulins when using IgG preparations containing about 1% of specific active molecules and marker particles with sizes in the range of 0.1 to 10 μm is achieved with a mass ratio of conjugated immunoglobulins and marker in the range from 1, respectively: 1000 to 1: 100000. In this case, immunoglobulins occupy about 6-10% of the surface of the marker with a total number of such molecules per particle of about several thousand. The experiments showed that a higher level of specific load does not give a gain in the sensitivity of the analysis and, moreover, in some cases increases the non-specific background of the determination. The economical use of immunoreagents favorably distinguishes the proposed method from the previously described methods for producing diagnostic kits requiring the use of a significant excess of expensive high-volume or affinity-purified immunoreagents.

При обработке процедуры конъюгирования хорошие результаты получали связывая иммунореагент с поверхностью маркера методом простой физической сорбции. Причем при дробном добавлении взвеси маркера к раствору иммунореагента (в 3-5 приемов с интервалами 10-15 мин при перемещении) удается максимально сорбировать иммунореагент и избежать тем самым обязательной в ранее описанных способах процедуры отделения иммунодиагностикума от несвязавшегося с маркером иммуноградиента, что значительно упрощает процедуру приготовления реагента. Такое эффективное использование наиболее дорогостоящего компонента иммунодиагностикумов-иммуноградиента является экономически выгодным отличием изобретения от ранее описанных способов, при осуществлении которых, как правило, значительная часть иммуноградиента уходит в отходы. When processing the conjugation procedure, good results were obtained by binding the immunoreagent to the surface of the marker by simple physical sorption. Moreover, with the fractional addition of the suspension of the marker to the solution of the immunoreagent (in 3-5 doses at intervals of 10-15 minutes when moving), it is possible to sorb the immunoreagent to the maximum and thereby avoid the procedure for separating the immunodiagnostic from the immunogradient that did not contact the marker in the previously described methods, which greatly simplifies the procedure reagent preparation. Such an effective use of the most expensive component of immunodiagnostics-immunogradient is a cost-effective difference between the invention and the previously described methods, in the implementation of which, as a rule, a significant part of the immunogradient goes to waste.

(3) Стабилизацию полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера производят одним из известных высокомолекулярных соединений таких, как бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбумин, лактальбумин, желатин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т.п. или их комбинацией. Суммарная концентрация блокирующих полимеров должна находиться в диапазоне 0,1 3 мас. (3) Stabilization of the resulting conjugate and blocking of free binding sites on the surface of marker particles is performed by one of the known high molecular weight compounds such as bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, lactalbumin, gelatin, polyethylene glycol (PEG), etc. or a combination thereof. The total concentration of blocking polymers should be in the range of 0.1 to 3 wt.

(4) Коррекцию водородного показателя до физиологических параметров, необходимых для осуществления иммунологической реакции, производят 0,01 М фосфатным буферным раствором с 0,15 М NaCl (pH 7,2-7,4). (4) Correction of the hydrogen index to the physiological parameters necessary for the implementation of the immunological reaction is carried out with 0.01 M phosphate buffer solution with 0.15 M NaCl (pH 7.2-7.4).

При необходимости длительного хранения в полученный иммунодиагностикум могут добавляться консерванты такие, как азид натрия до 0,02-0,1% глицерин до 50% -ной конечной концентрации и т.п. В ряде случаев, при использовании недеформируемых частиц маркера, возможно лиофильное выслушивание иммунодиагностикума. If long-term storage is required, preservatives such as sodium azide up to 0.02-0.1% glycerol up to 50% final concentration and the like can be added to the immunodiagnostic obtained. In some cases, when using non-deformable marker particles, lyophilic listening to the immunodiagnostic is possible.

Полученный иммунодиагностикум используют при постановке твердофазного иммунокаталиметрического анализа. The resulting immunodiagnostic is used in the formulation of a solid-phase immunocatalimetric analysis.

Способ твердофазного иммунокаталиметрического анализа (ТИКА) включает следующие стадии:
1.иммобилизация определяемого линганда на матрице;
2.осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и иммунодиагностикумом;
3. осуществление индикаторной каталиметрической реакции;
4. учет результатов и их интерпретация.The method of solid-phase immunocatalimetric analysis (TIKA) includes the following stages:
1.immobilization of the determined lingand on the matrix;
2. the implementation of the immunological reaction between the immobilized ligand and the immunodiagnosticum;
3. the implementation of the indicator catalytic reaction;
4. accounting for the results and their interpretation.

(1) В качестве матрицы (твердой фазы) в описываемом способе могут быть использованы планшеты и отдельные ячейки для иммунологических реакций, изготовленные из полистирола полихлорвинила и других сорбирующих материалов. В то же время нет принципиальных ограничений для применения в качестве матрицы подложек и мембран из различных материалов, например нитроцеллюлозных, стекловолокнистых, найлоновых фильтров и других материалов, на которых может быть надежно зафиксирован определяемый лиганд, однако их использование требует модификации описываемого варианта ТИКА. (1) As a matrix (solid phase) in the described method, tablets and individual cells for immunological reactions made of polystyrene polyvinyl chloride and other sorbent materials can be used. At the same time, there are no fundamental restrictions for the use of substrates and membranes made of various materials as a matrix, for example, nitrocellulose, fiberglass, nylon filters, and other materials on which the detected ligand can be reliably fixed, however, their use requires modification of the described TIKA variant.

Иммобилизацию лиганда из жидкого образца на матрице осуществляют любым известным методом, не приводящим к утрате специфических свойств лиганда. Могут быть использованы такие способы, как физическая сорбция, ковалентное связывание, иммунное взаимодействие типа "сэндвич-способа" и т.п. По истечении периода инкубации, достаточного для фиксирования лиганда на матрице, остаток анализируемого жидкого образца удаляют и производят блокирование свободных сайтов связывания на поверхности матрицы блокирующими высокомолекулярными веществами, аналогичными описанным в п.3 процедуры приготовления иммунодиагностикума. Для того, чтобы избежать случайных взаимодействий, целесообразно использование одного и того же блокирующего агента в процедурах приготовления иммунодиагностикума и иммобилизации лиганда на матрице. (2) После достаточного периода инкубации блокирующего раствора и необязательной процедуры отмывки в ячейки планшета вносят рабочее разведение иммунодиагностикума и инкубируют при 37^oC в течение 20-30 мин для осуществления иммунной связи между иммубилизованным лигандом и частицами иммунодиагностикума, после чего остатки несвязавшегося иммунодиагностикума удаляют соответствующей процедурой отмывки.The ligand is immobilized from a liquid sample on a matrix by any known method that does not lead to the loss of specific properties of the ligand. Methods such as physical sorption, covalent bonding, sandwich-type immune interaction, and the like can be used. After an incubation period sufficient to fix the ligand on the matrix, the remainder of the analyzed liquid sample is removed and free binding sites on the matrix surface are blocked with blocking high molecular weight substances similar to those described in Section 3 of the preparation of the immunodiagnosticum. In order to avoid random interactions, it is advisable to use the same blocking agent in the procedures for preparing an immunodiagnosticum and immobilizing a ligand on a matrix. (2) After a sufficient period of incubation of the blocking solution and an optional washing procedure, a working dilution of the immunodiagnosticum is introduced into the plate cells and incubated at 37 ^° C for 20-30 minutes to effect an immune connection between the immobilized ligand and the particles of the immunodiagnosticum, after which the remaining unbound immunodiagnosticum is removed by appropriate washing procedure.

Из приведенного описания следует, что 1 и 2 стадии ТИКА по существу не отличаются от соответствующих стадий ИФА. From the above description it follows that the 1st and 2nd stages of TIKA essentially do not differ from the corresponding stages of ELISA.

(3) Выявление или количественное определение иммунных комплексов "лиганд-иммунодиагностикум" производят, определяя наличие (количество) связавшегося с матрицей маркера в характерной для него индикаторной каталиметрической реакции (ИКР). Для выявления маркера может быть использована любая известная для него каталиметрическая реакция, обеспечивающая наибольшую чувствительность, достаточную селективность и экспрессность определения. Скорость реакции должна обеспечивать изменение оптических свойств реакционной смеси не менее 0,2 ОД за 30 мин. Известно, что каталиметрическая реакция может развиваться на границе раздела частиц катализатора (маркера) и индикаторного раствора. Однако скорость такой реакции не велика. Повысить скорость можно путем увеличения площади контакта индикаторного раствора и катализатора за счет десорбции частиц маркера с матрицы и удаления покрывающих частицы маркера белков иммуноградиента и блокирующих компонентов. Однако наиболее активно протекает ИКР в гомогенной среде после перевода маркера-катализатора в ионную форму. Способ перевода маркера в ионную форму зависит от химической природы используемого катализатора и, как правило, осуществляется воздействием кислот или щелочей. Гомогенный вариант ИКР является наиболее предпочтительным в рамках концепции изобретения. Применение десорбционного варианта каталитической реакции в гетерогенной системе целесообразно при использовании катализаторов, которые в обычных условиях сложно или невозможно перевести в ионную форму (например, золи золота или платина). Дополнительным резервом увеличения скорости ИКР во всех описанных выше вариантах может служить повышение температуры реакции, практически ограниченное термостойкостью материала матрицы (около 70^oC).(3) The ligand-immunodiagnosticum immune complexes are detected or quantified by determining the presence (quantity) of a marker bound to the matrix in its characteristic indicator catalytic reaction (RBI). To detect a marker, any catalymetric reaction known to it can be used that provides the highest sensitivity, sufficient selectivity and expressivity of determination. The reaction rate should provide a change in the optical properties of the reaction mixture of at least 0.2 OD in 30 minutes. It is known that a catalytic reaction can develop at the interface between the catalyst particles (marker) and the indicator solution. However, the rate of such a reaction is not high. The speed can be increased by increasing the contact area of the indicator solution and the catalyst by desorption of marker particles from the matrix and removal of immunogradient proteins and blocking components covering the marker particles. However, the most active is the RBI in a homogeneous medium after the transfer of the marker catalyst to the ionic form. The way the marker is converted to ionic form depends on the chemical nature of the catalyst used and, as a rule, is carried out by the action of acids or alkalis. A homogeneous variant of RBI is most preferred within the framework of the concept of the invention. The use of a desorption variant of the catalytic reaction in a heterogeneous system is advisable when using catalysts that, under normal conditions, are difficult or impossible to convert to ionic form (for example, gold sols or platinum). An additional reserve for increasing the rate of RBI in all the above options can be an increase in the reaction temperature, which is practically limited by the heat resistance of the matrix material (about 70 ^° C).

(4) Результаты ТИКА могут учитываться визуально или регистрироваться спектрофотометрически при определенной длине волны пропускаемого света (например автоматическим сканирующим спектрофотоматериалом типа "Мультискан" для учета результатов ИФА на планшетах), как цветовой сигнал реакционной среды в ячейках планшета, характеризующий индикаторную каталиметрическую реакцию. Интенсивность цветового сигнала пропорциональна количеству маркера в определяемом объеме. (4) The TIKA results can be taken into account visually or recorded spectrophotometrically at a certain wavelength of transmitted light (for example, automatic scanning spectrophotomaterials of the "Multiscan" type to take into account the results of ELISA on tablets), as a color signal of the reaction medium in the cells of the tablet, characterizing the indicator catalymetric reaction. The intensity of the color signal is proportional to the number of marker in the determined volume.

Интерпретацию результатов производят путем сравнения интенсивности цветового сигнала анализируемого образца (образцов) с контрольными образцами, заведомо не содержащими определяемого лиганда, или в случае количественной оценки с серией известных разведений лиганда. Interpretation of the results is carried out by comparing the color signal intensity of the analyzed sample (s) with control samples that do not contain a known ligand, or in the case of quantitative assessment with a series of known dilutions of the ligand.

В настоящем примере описаны варианты получения разноименно заряженных гидрозолей гидроокиси железа. Наличие альтернативных вариантов заряда гидрозолей позволяет проводить конъюгирование с иммунореагентами, имеющими различные изоэлектрические точки, в наиболее щадящих (близких к физиологическим) условиях. This example describes the options for obtaining oppositely charged hydrosols of iron hydroxide. The presence of alternative hydrosol charge options allows conjugation with immunoreagents having various isoelectric points in the most sparing (close to physiological) conditions.

Вариант 1. Получение положительно заряженного гидрозоля гидроокиси железа (ГГЖ[+]). Option 1. Obtaining a positively charged hydrosol of iron hydroxide (GGZH [+]).

К одному объему кипящей дистиллированной воды медленно, так чтобы кипение практически не прекращалось, добавляют двукратный объем 6%-ного хлорного железа. После остывания смеси ее дважды центрифугируют по 10 15 мин при 4500-5000 об\мин, каждый раз отбрасывая надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в дистиллированной воде. При таком режиме центрифугирования оседают лишь частицы с размерами, превышающими 0,5 мкм. Измеряют водородный показатель гидрозоля и доводят его 1 М-ным раствором трисоснования до 3,9-4,1 ед. pH. В таком виде гидроокись железа имеет положительный заряд до значений 10-11 ед. pH и готова для конъюгирования с иммунореагентами. Для конъюгирования необходимо использовать свежий (не более суток с момента приготовления) гидрозоль. A double volume of 6% ferric chloride is added to one volume of boiling distilled water so that the boiling practically does not stop. After cooling the mixture, it is centrifuged twice for 10-15 minutes at 4500-5000 rpm, each time discarding the supernatant and resuspending the precipitate in distilled water. In this centrifugation mode, only particles with sizes exceeding 0.5 microns settle. The hydrogen index of the hydrosol is measured and adjusted with a 1 M Trisobase solution to 3.9-4.1 units. pH In this form, iron hydroxide has a positive charge up to 10-11 units. pH and ready for conjugation with immunoreagents. For conjugation, it is necessary to use a fresh (no more than a day from the time of preparation) hydrosol.

Вариант 2. Получение отрицательно заряженного гидрозоля гидроокиси железа (ГГЖ[-]). Option 2. Obtaining a negatively charged hydrosol of iron hydroxide (GGZH [-]).

Для получения отрицательно заряженных гидрозолей используют принцип модифицирования поверхности частиц гидроокиси железа за счет хемосорбции на ней анионов железосинеродистой кислоты. Наиболее полное насыщение поверхности этими анионами происходит при использовании свежих препаратов гидрозолей, описанных в варианте 1. To obtain negatively charged hydrosols, the principle of modifying the surface of iron hydroxide particles is used due to the chemisorption of iron-anhydrous acid anions on it. The most complete saturation of the surface with these anions occurs when using fresh preparations of hydrosols described in option 1.

К свежему препарату положительно заряженного гидрозоля, полученного по процедуре, описанной в варианте 1, добавляют концентрированный раствор железосинеродистого калия, содержащего 5-кратное его количество по отношению к массе гидроокиси железа. Трехкратным центрифугированием при 4-5 тыс. оборотов в течение 10-15 мин освобождаются от избытка реагентов, каждый раз удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок пипетированием в дистиллированной воде. Корректируют водородный показатель до 7,6-8,0 ед. pH добавлением соляной кислоты или трис-основания. В таком виде препарат может быть использован для конъюгирования с отрицательно заряженными биополимерами при нейтральных либо слабощелочных значениях водородного показателя. To the fresh preparation of positively charged hydrosol obtained according to the procedure described in embodiment 1, a concentrated solution of potassium iron-hydrogen sulfide is added containing 5 times its quantity relative to the weight of iron hydroxide. Three times centrifugation at 4-5 thousand revolutions for 10-15 minutes freed from excess reagents, each time removing the supernatant and resuspending the precipitate by pipetting in distilled water. Adjust the pH to 7.6-8.0 units. pH by adding hydrochloric acid or Tris base. In this form, the drug can be used for conjugation with negatively charged biopolymers at neutral or slightly alkaline values of the hydrogen index.

Вариант 3. Получение гидрозоля ферриглицерата аммония (ГФА). Option 3. Obtaining a hydrosol of ammonium ferriglycerate (HFA).

41,6 г хлорного железа растворяют в 66,4 мл дистиллированной воды и вносят в полученный раствор 33,3 мл глицерина. После перемешивания добавляют 26 мл 20% -ного раствора аммиака. К 10 мл ГФА добавляют при перемешивании 1 М раствор трис-основания до установки водородного показателя на уровне 7,4-7,6 ед. pH. Центрифугируют полученную взвесь так же, как в варианте 1. 41.6 g of ferric chloride are dissolved in 66.4 ml of distilled water and 33.3 ml of glycerol are added to the resulting solution. After stirring, add 26 ml of a 20% ammonia solution. 1 M Tris-base solution is added to 10 ml of HFA with stirring until the pH value is set at 7.4-7.6 units. pH Centrifuge the resulting suspension in the same way as in option 1.

Методом фильтрования через мембранные фильтры, высушивания и взвешивания определяют общую весовую концентрацию частиц в препарате ГГЖ[+] ГГЖ[-] или ГФА и в дальнейшем используют полученную величину для расчетов соотношения "гидрозоль:иммунореагент" при получении иммунодиагностикума. The method of filtering through membrane filters, drying and weighing determines the total weight concentration of particles in the preparation GGZH [+] GGZh [-] or HFA and then use the obtained value for calculating the ratio "hydrosol: immunoreagent" upon receipt of an immunodiagnosticum.

Для получения конъюгатов используют lgG, выделенные из иммунной сыворотки высаливанием сульфатом аммония с последующим диализом против стократных и более объемов 0,01 М трис-HCl буфера с водородным показателем 7,6-8,0 ед. pH с тремя сменами буфера. Возможно использование других методик выделения и очистки lgG. В полученных препаратах lgG спектрофотометрически измеряют концентрацию общего белка способом с применением Кумасси G-250. To obtain conjugates, IgG isolated from immune serum is used by salting out with ammonium sulfate, followed by dialysis against hundred and more volumes of 0.01 M Tris-HCl buffer with a hydrogen index of 7.6-8.0 units. pH with three buffer changes. Other methods for isolating and purifying lgG may be used. In the obtained preparations, IgG spectrophotometrically measure the concentration of total protein by the method using Coomassie G-250.

Вариант 1. Получение конъюгата ГГЖ[-] с иммуноглобулинами класса G. Option 1. Obtaining conjugate GGZH [-] with class G immunoglobulins

Отмеривают необходимый объем препарата lgG и определяют соответствующее ему количество гидрозоля из расчета: 1мг гидроокиси железа на 1 мкг общего белка препарата lgG. Добавляют к раствору иммунореагента расчетное количество гидрозоля в три приема с интервалами по 10-15 мин при перемешивании (в первый прием вносят половину расчетного объема ГГЖ[-] во второй половину остатка и в третий остаток), инкубируют при перемешивании 10-15 мин. К полученному таким образом препарату добавляют в соотношении 1:10 по объему 10% -ный раствор БСА на фосфатном буфере с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с добавлением 0,1% азида натрия. После 10-15 минутной экспозиции с перемешиванием к полученной смеси добавляют в соотношении 1:1 стабилизирующий раствор БСА на 0,01М трис-HCl буфере с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с 0,15 М хлористого натрия; 0,02 ПЭГ 20000; 0,03% ПЭГ 6000 и 0,02% азида натрия. The required volume of the drug lgG is measured and the corresponding amount of hydrosol is determined from the calculation: 1 mg of iron hydroxide per 1 μg of the total protein of the drug lgG. The calculated amount of the hydrosol is added to the immunoreagent solution in three doses at intervals of 10-15 minutes with stirring (half the calculated amount of GHL [-] in the second half of the residue and the third residue is added to the first dose), incubated with stirring for 10-15 minutes. To the preparation thus obtained, a 10% solution of BSA on phosphate buffer with a hydrogen index of 7.2-7.4 units is added in a ratio of 1:10 by volume. pH with the addition of 0.1% sodium azide. After a 10-15 minute exposure with stirring, a stabilizing solution of BSA in a 0.01 M Tris-HCl buffer with a hydrogen index of 7.2-7.4 units is added to the resulting mixture in a 1: 1 ratio. pH with 0.15 M sodium chloride; 0.02 PEG 20,000; 0.03% PEG 6000 and 0.02% sodium azide.

Вариант 2. Получение конъюгата ГГЖ[+] с иммуноглобулинами класса G. Option 2. Obtaining conjugate GGZH [+] with class G immunoglobulins

Значение водородного показателя препарата lgG доводят до значений в диапазоне 3,9-4,1 ед. pH добавлением раствора соляной кислоты. Вносят расчетное количество ГГЖ[+] так же, как в варианте 1, и, после 10-15 минутной экспозиции при перемешивании к полученной смеси добавляют 10%-ный раствор БСА с 0,1% азида натрия (pH 3,9-4,1) в соотношении 1:10. Спустя 10-15 мин доводят значение водородного показателя до 7,2-7,4 ед. pH добавлением 1 М трис-основания (за первый прием вносят 50 мкл раствора трис-основания на 1 мл внесенного 10%-ного раствора БСА, а затем проводят точную корректировку). К полученной смеси добавляют стабилизирующий 1%-ный раствор БСА (см. вариант 1) в соотношении 1:1. The pH value of the drug lgG adjusted to values in the range of 3.9-4.1 units pH by adding a solution of hydrochloric acid. The calculated amount of GHG [+] is added in the same way as in option 1, and after 10-15 minutes exposure with stirring, a 10% solution of BSA with 0.1% sodium azide is added to the resulting mixture (pH 3.9-4, 1) in a ratio of 1:10. After 10-15 minutes, the pH value is adjusted to 7.2-7.4 units. pH by adding 1 M Tris-base (50 μl of Tris-base solution per 1 ml of a 10% BSA solution added is added at the first dose, and then an exact adjustment is made). To the resulting mixture add a stabilizing 1% solution of BSA (see option 1) in a ratio of 1: 1.

Перед употреблением полученные иммунодиагностикумы разводят до рабочего разведения тем же стабилизирующим 1%-ным раствором БСА (рабочее разведение устанавливают экспериментально для каждой партии диагностикума). Before use, the resulting immunodiagnostics are diluted to a working dilution with the same stabilizing 1% BSA solution (working dilution is established experimentally for each batch of diagnosticum).

Вариант 3. Получение конъюгата ГФА с иммуноглобулинами класса G. Option 3. Obtaining a conjugate of HFA with class G immunoglobulins

Добавляют дробно (так, как описано в варианте 1) необходимое количество взвеси маркера к расчетному (см. вариант 1) объему раствора иммуноглобулинов (полученных по описанной в предисловии процедуре). После 10 минутного перемешивания при комнатной температуре добавляют 10%-ный раствор БСА в соотношении 1:10. После 10 минутного перемешивания добавляют 0,2%-ный раствор желатина в соотношении 1:2. Перемешивают полученную смесь в течение 10 мин. Измеряют водородный показатель и при необходимости корректируют его до значения 7,2-7,4 ед. pH, добавляют 5 мл глицерина в качестве консерванта-стабилизатора. В таком виде иммунодиагностикум хранят или используют в постановке ТИКА. The required amount of suspension of the marker is added fractionally (as described in option 1) to the calculated (see option 1) volume of the immunoglobulin solution (obtained by the procedure described in the preface). After 10 minutes stirring at room temperature, a 10% BSA solution was added in a ratio of 1:10. After 10 minutes of stirring, add a 0.2% solution of gelatin in a ratio of 1: 2. Stir the resulting mixture for 10 minutes. Measure the hydrogen index and, if necessary, adjust it to a value of 7.2-7.4 units. pH, add 5 ml of glycerol as a preservative stabilizer. In this form, the immunodiagnostic is stored or used in the formulation of TIKA.

Пример 3. Сравнение чувствительности твердофазных иммунокаталиметрического (ТИКА) и иммуноферментного (ИФА) методов выявления антител против lgG человека в прямом варианте постановки. Example 3. Comparison of the sensitivity of solid-phase immunocatalimetric (TIKA) and enzyme-linked immunosorbent (ELISA) methods for detecting antibodies against human IgG in a direct version of the formulation.

Для постановки ИФА использовали коммерческий препарат "Антитела кроличьи диагностические против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой, сухие", производства Ленинградского НИИВС. Для постановки ТИКА использовали конъюгаты ГГЖ[+] с антителами, выделенными из коммерческой козьей сыворотки против lgG человека, производства Московского ИЭМ АМН СССР. Оба метода использовали в прямой постановке с иммобилизацией антигена на отечественных планшетах для иммунологических реакций физической сорбцией в течение 18 ч при 4^oC.For the production of ELISA, we used the commercial preparation “Rabbit diagnostic antibodies against human immunoglobulins G labeled with peroxidase, dry”, manufactured by the Leningrad NIIIVS. For the production of TIKA, GGJ [+] conjugates with antibodies isolated from commercial goat serum against human IgG produced by the Moscow IEM of the USSR Academy of Medical Sciences were used. Both methods were used in direct formulation with antigen immobilization on domestic plates for immunological reactions by physical sorption for 18 h at 4 ^o C.

В качестве антигена и в том, и в другом случаях использовали препарат нормальных иммуноглобулинов человека производства МЭМ АМН СССР. Контролем служили ячейки планшета, в которые вместо антигена вносили по 50 мкл 0,01М калий фосфатного буфера 7,2-7,4. Трехкратные отмывки после стадий нанесения антигена и собственно иммунологической реакции проводили 0,01 М калий фосфатным буфером с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с 0,1% твин-20. В качестве субстратной смеси в ИФА использовали 0,01 М перекись водорода с 0,4 мг/мл о-фенилендиамина на 0,1 М цитратном буфере с водородным показателем 5,2-5,4 ед. pH, а в ТИКА 0,01 М перекись водорода с 2 мг/мл о-фенилендиамина на дистиллированной воде. При постановке ТИКА после осуществления стадии иммунологической реакции антиген-антитело в ячейки планшета вносили до 50 мкл 2N раствора соляной кислоты для перевода гидроокиси железа в ионную форму и сразу после этого добавляли по 100 мкл субстрата на ячейку. In both cases, a preparation of normal human immunoglobulins produced by the MEM of the USSR Academy of Medical Sciences was used as an antigen. The cells of the plate served as control, in which, instead of antigen, 50 μl of 0.01 M potassium phosphate buffer 7.2-7.4 were added. Three-time washing after the steps of applying the antigen and the immunological reaction itself was carried out with 0.01 M potassium phosphate buffer with a hydrogen index of 7.2-7.4 units. pH with 0.1% Tween-20. 0.01 M hydrogen peroxide with 0.4 mg / ml o-phenylenediamine in 0.1 M citrate buffer with a hydrogen index of 5.2-5.4 units was used as a substrate mixture in ELISA. pH, and in TIKA 0.01 M hydrogen peroxide with 2 mg / ml o-phenylenediamine in distilled water. When TIKA was established, after the immunological reaction step was completed, up to 50 μl of a 2N hydrochloric acid solution was added to the plate cells to convert iron hydroxide to the ionic form and 100 μl of substrate per cell was added immediately.

Взаимодействие с субстратной смесью осуществляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Учет результатов проводили на сканирующем спектрофотометре типа "Мультискан" (Финляндия) при длине волны 492 нм. The reaction with the substrate mixture was carried out at room temperature for 30 minutes. The results were taken into account on a scanning spectrophotometer of the Multiscan type (Finland) at a wavelength of 492 nm.

Результаты показали, что в исходной постановке, в одинаковых условиях предложенный способ (ТИКА) в 8 раз (3 двукратных разведения) чувствительнее аналога (ИФА). The results showed that in the original setting, under the same conditions, the proposed method (TIKA) is 8 times (3 double dilutions) more sensitive than analog (ELISA).

Пример 4. Выявление вируса осповакцины в жидких образцах в "сэндвич" - варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием конъюгатов на основе положительно и отрицательно заряженных гидрозолей гидроокиси железа. Example 4. Detection of smallpox vaccine virus in liquid samples in a "sandwich" - version of the proposed method (TIKA) using conjugates based on positively and negatively charged iron hydroxide hydrosols.

Использовали конъюгаты ГГЖ[+] и ГГЖ[-] с иммуноглобулинами класса G, выделенными из коммерческой противооспенной кроличьей сывортки, производства Томского НИИВС. Эти же антитела использовали для стандартной сенсибилизации ячеек отечественных планшетов для иммунологических реакций. В качестве антигена использовали коммерческий препарат антигена вируса осповакцины производства Томского НИИВС. В качестве контролей использовали ячейки без антигена, а также ячейки с антигеном, обработанные конъюгатом ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) с lgG из нормальной кроличьей сыворотки и ненагруженный ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) со стабилизаторами. Отмывки проводили 1М NaCl на дистиллированной воде с 061 М трис-основания и 0,05% твин-20. Все нанесения, экспозиции и отмывки выполняли в соответствии с общепринятой методикой постановки ИФА за исключением финальной стадии, на которой связавшийся с подложкой ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) переводили в ионную форму добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 2N соляной кислоты и затем вносили по 100 мкл субстрата (0,01М раствора перекиси водорода с 0,1 мг/мл о-фенилендиамина) на ячейку. Экспозиция до проявления результатов при комнатной температуре в среднем составляла 20 30 мин. Проявление можно было ускорить до 5-10 мин, повышая температуру до плюс 50-60^oС. Учет проводили так же, как описано в предыдущем примере.Used conjugates GGZH [+] and GGZh [-] with class G immunoglobulins isolated from commercial anti-smallpox rabbit serum, produced by Tomsk NIIIVS. The same antibodies were used for standard sensitization of cells of domestic plates for immunological reactions. As an antigen, a commercial preparation of smallpox vaccine virus antigen manufactured by Tomsk NIIVS was used. Cells without antigen were used as controls, as well as cells with antigen treated with the conjugate of HBG [+] (HBG [-]) with IgG from normal rabbit serum and unloaded HBG [+] (HBG [-]) with stabilizers. Washing was carried out with 1 M NaCl in distilled water with 061 M Tris base and 0.05% tween-20. All depositions, expositions, and washing were performed in accordance with the generally accepted ELISA technique except for the final stage, in which the HHL [+] (HHL [-]) bound to the substrate was converted into ionic form by adding 50 μl of 2N hydrochloric acid to each well and then 100 μl of substrate (0.01 M hydrogen peroxide solution with 0.1 mg / ml o-phenylenediamine) was added per well. The exposure before the results were manifested at room temperature averaged 20-30 minutes. The manifestation could be accelerated to 5-10 min, increasing the temperature to plus 50-60 ^o C. Accounting was carried out as described in the previous example.

Чувствительность определения вируса осповакцины в описанном варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием ГГЖ[+] составила около 1000 БОЕ/образец (2•10⁴ БОЕ/мл), а с применением ГГЖ[-] около 300 БОЕ/образец (6•10³БОЕ/мл) или соответственно около 20 и 3 нг/мл. Хранение конъюгатов при +4+1 С в течение 6 месяцев (срок наблюдения) привело к незначительному (не более 10%) снижению специфической активности препаратов.The sensitivity of the detection of vaccinia virus in the described version of the proposed method (TIKA) using GGH [+] was about 1000 PFU / sample (2 • 10 ⁴ PFU / ml), and using GGG [-] about 300 PFU / sample (6 • 10 ³ PFU / ml) or respectively about 20 and 3 ng / ml. Storage of conjugates at + 4 + 1 C for 6 months (observation period) led to a slight (no more than 10%) decrease in the specific activity of the preparations.

Пример 5. Определение вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в прямом варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием конъюгата специфических иммуноглобулинов с ГФА. Example 5. Determination of the Venezuelan encephalomyelitis virus in horses in the direct version of the proposed method (TIKA) using a conjugate of specific immunoglobulins with HFA.

В качестве антигена использовали очищенный высокоскоростным центрифугированием и инактивированный ультрафиолетовым облучением препарат вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (штамм Тринидат), из которого готовили серию стандартных двукратных разведений на фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4). A horse Venezuelan encephalomyelitis virus virus (Trinidate strain) purified by high speed centrifugation and inactivated by ultraviolet irradiation (Trinidate strain) was used as antigen, from which a series of standard double dilutions in phosphate buffer solution (pH 7.2-7.4) was prepared.

Для получения специфических конъюгатов по процедуре, описанной в варианте 3 примера 2, использовали lgG, выделенные сульфатом аммония из гипериммунных кроличьих сывороток против вируса ВЭЛ. В качестве контролей использовали конъюгаты ГФА с нормальными кроличьими lgG и ненагруженный ГФА со стабилизаторами, а также ячейки планшета без антигена. Рабочие разведения конъюгатов готовили на 0,01М фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4). To obtain specific conjugates according to the procedure described in embodiment 3 of Example 2, IgG isolated from ammonium sulfate from hyperimmune rabbit serums against VEL virus was used. HFA conjugates with normal rabbit IgG and unloaded HFA with stabilizers, as well as plate cells without antigen, were used as controls. Working dilutions of the conjugates were prepared in 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.2-7.4).

Иммобилизацию на отечественных полистироловых планшетах для иммунологических реакций проводили методом физической сорбции при 4 С в течение 18 ч с последующей блокировкой свободных сайтов связывания на поверхности планшета 1%-ным раствором БСА на 0,01М фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре. Immobilization on domestic polystyrene plates for immunological reactions was carried out by physical sorption at 4 ° C for 18 hours, followed by blocking of the free binding sites on the surface of the tablet with a 1% BSA solution in 0.01 M phosphate buffer solution (pH 7.2-7.4 ) for 2 hours at room temperature.

Отмывки производили 1М раствором NaCl на дистиллированной воде с 0,05% твин-20 трехкратно по 5-10 мин. Washing was carried out with a 1M NaCl solution in distilled water with 0.05% tween-20 three times for 5-10 minutes.

Общая постановка анализа в объеме 50 мкл на ячейку проводилась по общепринятой для ИФА методологии за исключением того, что пред внесением субстратной смеси гидрозоль, связавшийся с матрицей, переводили в ионную форму добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 2N раствора соляной кислоты. The general formulation of the analysis in a volume of 50 μl per cell was carried out according to the methodology generally accepted for ELISA, except that before introducing the substrate mixture, the hydrosol bound to the matrix was converted into ionic form by adding 50 μl of 2N hydrochloric acid solution to each cell.

Учет результатов проводили после 20 минутной экспозиции при комнатной температуре на ридере "мультискан" при длине волны 492 нм. The results were taken into account after a 20-minute exposure at room temperature on a multiscan reader at a wavelength of 492 nm.

Достоверное выявление вируса ВЭЛ при описанной постановке предложенного способа (ТИКА) было зафиксировано при концентрации около 10⁸ виронов/мл (10 нг/мл), а абсолютная чувствительность метода составила около 5•10⁶ вирионов/образец (0,5 нг/ образец).Reliable detection of VEL virus in the described formulation of the proposed method (TIKA) was recorded at a concentration of about 10 ⁸ viron / ml (10 ng / ml), and the absolute sensitivity of the method was about 5 • 10 ⁶ virions / sample (0.5 ng / sample) .

Гидроокись железа и ферроглицерат аммония являются примерами большого ряда неорганический веществ, для которых уже показана возможность получения стабильных диагностикумов при конъюгировании с иммунореагентами (Пат. ЕВП N 0158746 и N 0298368). Вещества из этого ряда и близкие к ним по физико-химическим свойствам, для которых отработаны высокочувствительные индикаторные реакции (см. Г.Мюллер, М.Отто, Г.Вернер "Каталиметрические методы в анализе следов элементов" -М.Мир, и веществ особой чистоты." -М. Химия, 1983) определили перечень маркеров, используемых в предложенном диагностикуме. Основанием для включения маркеров в этот перечень служат известные сведения о возможности получения на их основе стабильных диагностикумов, а также о возможности высокочувствительного выявления этих веществ в индикаторных каталиметрических реакциях. Iron hydroxide and ammonium ferroglycerate are examples of a large number of inorganic substances, for which the possibility of obtaining stable diagnosticums by conjugation with immunoreagents has already been shown (Pat. EVP N 0158746 and N 0298368). Substances from this series and close to them in physicochemical properties for which highly sensitive indicator reactions have been developed (see G. Muller, M. Otto, G. Werner "Catalytic methods in the analysis of trace elements" - M. Mir, and special substances purity. "-M. Chemistry, 1983) determined the list of markers used in the proposed diagnosticum. The basis for including markers in this list are known information about the possibility of obtaining stable diagnostics on their basis, as well as the possibility of highly sensitive detection of these in components in indicator catalytic reactions.

Предлагаемые иммунодиагностикумы и основанный на их применении способ твердофазного иммуноанализа за счет применения каталиметрического метода выявления связавшегося с матрицей маркера, а также использования крупных (более 0,1 мкм) его частиц и обусловленного этим высокого уровня соотношения "маркер:иммунореагент" обеспечивают чувствительность, не уступающую, а в ряде случаев превосходящую чувствительность ИФА и при этом имеют перед последним ряд преимуществ:
использование дешевой и стабильной метки;
простота получения иммунодиагностикума;
возможность использования иммунореагентов с относительно низким специфическим титром;
отсутствие в способе приготовления диагностикумов процедуры ковалентного связывания, существенно снижающей специфическую активность иммунореагентов;
экономное и безотходное использование иммунореагентов;
отсутствие потребности в буферных системах на стадии проявления результатов, необходимых в ИФА для функционирования фермента;
меньшая зависимость специфичности определения от примесей в образце и чистоты используемых препаратов;
возможность сокращения времени анализа на стадии проявления результатов за счет десорбции маркера с матрицы или перевода его в ионную форму, а также за счет повышения температуры реакции до 70^oC.The proposed immunodiagnostics and the method of solid-phase immunoassay based on their application through the use of a catalytic method for detecting a marker bound to the matrix, as well as the use of large (more than 0.1 μm) particles and the resulting high level of the marker: immunoreagent ratio, provide sensitivity that is not inferior , and in some cases superior sensitivity of ELISA, and at the same time they have a number of advantages over the latter:
the use of a cheap and stable tag;
ease of obtaining an immunodiagnosticum;
the possibility of using immunoreagents with a relatively low specific titer;
the lack of a covalent binding procedure in the method for preparing diagnosticums that significantly reduces the specific activity of immunoreagents;
economical and non-waste use of immunoreagents;
lack of need for buffer systems at the stage of manifestation of the results necessary in ELISA for the functioning of the enzyme;
less dependence of the specificity of determination on impurities in the sample and the purity of the preparations used;
the possibility of reducing the analysis time at the stage of manifestation of the results due to desorption of the marker from the matrix or its conversion to ionic form, as well as by increasing the reaction temperature to 70 ^o C.

Claims

1. An immunodiagnosticum containing an aqueous suspension of marker particles sorbed to one of the specific immunoreagents by an antigen or immunoglobulins, or staphylococcal protein A, stabilized by high molecular weight biopolymers, characterized in that water-insoluble or hardly soluble inorganic catalysts are introduced as marker particles inorganic 0.1 -10.0 μm with a significant excess of the ratio of the mass of the marker to the immunoreagent.

2. The immunodiagnosticum according to claim 1, characterized in that the marker is a highly dispersed aqueous suspension of selenium, or gold, or silver, or water-insoluble compounds of silver, or iron, or copper, or manganese, or chromium, or nickel, or cobalt or titanium, or molybdenum, or tungsten, or vanadium, or selenium, or mercury, or sparingly soluble salts of hydrohalic acids.

3. Immunodiagnostic according to paragraphs. 1 and 2, characterized in that the sorption bond of the immunoreagent on the marker particles is established by the ratio by weight of the immunoreagent and marker 1 100000 -1000, respectively.

4. The method of solid-phase immunoassay, including the immobilization of a ligand on a matrix, the implementation of an immunological reaction between an immobilized ligand and a specific immunodiagnosticum, followed by detection of the formed complexes of the ligand and immunodiagnosticum by the presence or amount of a marker bound to the matrix, characterized in that the ligand is complexed immunodiagnostic is produced in the indicator catalimetric reaction characteristic of this marker by introducing ia in the reaction mixture of a substrate containing indicator substances, providing, upon contact with a marker, a change in the optical properties of this reaction mixture.

5. The method according to claim 4, characterized in that the indicator catalytic reaction is carried out after desorption of the marker from the matrix and removal of the immunoreagent and blocking components from its surface by adding the appropriate buffer solution.

6. The method according to claim 4, characterized in that the indicator catalytic reaction is carried out after converting the marker into the ionic form by adding acid or whole.

7. The method according to PP. 4 to 6, characterized in that the indicator catalytic reaction is carried out at a temperature of 50 to 70 ^o C.