RU2092838C1

RU2092838C1 - Biosensor for quantitatively determining synthetic surfactants in water

Info

Publication number: RU2092838C1
Authority: RU
Inventors: Людмила Юрьевна Бержанская; Ольга Николаевна Постникова; Юрий Семенович Кривошеин
Original assignee: Людмила Юрьевна Бержанская; Ольга Николаевна Постникова; Юрий Семенович Кривошеин
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1997-10-10

Abstract

FIELD: environmental control; biotechnology; medicine; sanitary hygiene. SUBSTANCE: proposed biosensor is constituted by culture of Photobacterium fischeri bacteria capable of varying bioluminescence intensite as synthetic surfactant is added to prepared culture sample. Biosensor is highly sensitive and specific to ampholytic synthetic surfactants. EFFECT: rapid and highly accurate measurements of ampholytic surfactants can be effected down to concentrations 10^-5M - 10^-4M. 3 tbl

Description

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, в частности к разработке биосенсоров для определения поверхностно-активных веществ в водных растворах с использованием микроорганизмов и ферментов и может быть применено в медицине, санитарной гигиене, охране окружающей среды для быстрого обнаружения и анализа низких концентраций синтетических поверхностно-активных веществ /СПАВ/. The invention relates to ecology and biotechnology, in particular to the development of biosensors for the determination of surfactants in aqueous solutions using microorganisms and enzymes and can be used in medicine, sanitary hygiene, environmental protection for the rapid detection and analysis of low concentrations of synthetic surfactants substances / surfactant /.

Известные в настоящее время методы определения СПАВ обладают низкой чувствительностью, малой селективностью, трудоемки из-за необходимости операций экстракции, осаждения и др. связаны с использованием токсичных веществ. Предлагаемый биосенсор для определения низких концентраций СПАВ позволяет повысить чувствительность определения СПАВ, значительно сократить время анализа, избежать трудоемких операций и контакта с вредными веществами. Currently known methods for the determination of surfactants have low sensitivity, low selectivity, are time-consuming due to the need for extraction, precipitation, etc. are associated with the use of toxic substances. The proposed biosensor for determining low concentrations of surfactants can increase the sensitivity of determination of surfactants, significantly reduce the analysis time, to avoid time-consuming operations and contact with harmful substances.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения антибиотической активности препаратов, в котором в качестве тест-организма используется периодическая культура бактерий Photobacterium leiognathi в стадии нарастания интенсивности свечения клеток, а активность антибиотиков определяется по изменению интенсивности свечения после их добавления в культурную пробу. Closest to the proposed invention is a method for determining the antibiotic activity of drugs, in which a periodic culture of Photobacterium leiognathi bacteria is used as a test organism in the stage of increasing intensity of cell luminescence, and the activity of antibiotics is determined by the change in luminescence intensity after they are added to the culture sample.

Недостатками этого способа, не позволяющими использовать его для быстрого определения низких концентраций СПАВ, являются: длительность операций по подготовке тест-системы к анализу и отсутствие чувствительности культуры бактерий Ph. leiognathi к аморфным СПАВ типа N-окиси третичного амина. The disadvantages of this method, not allowing it to be used to quickly determine low concentrations of surfactants, are: the duration of the operations for preparing the test system for analysis and the lack of sensitivity of the bacteria culture Ph. leiognathi to amorphous surfactants such as tertiary amine N-oxide.

Целью данного изобретения является разработка биосенсора для быстрого и чувствительного определения низких концентраций СПАВ в водных растворах. The aim of this invention is to develop a biosensor for quick and sensitive determination of low concentrations of surfactants in aqueous solutions.

Поставленная цель достигается благодаря тому, что в качестве тест-организма в предлагаемом биосенсоре используется культура бактерий Photobacterium fischeri с высоким стабильным уровнем свечения, количество СПАВ определяется по изменению интенсивности свечения после добавления вещества в пробу культуры, а в качестве СПАВ применены амфотерные соединения типа N-окиси третичного амина. This goal is achieved due to the fact that the test organism in the proposed biosensor uses a bacterial culture of Photobacterium fischeri with a high stable level of luminescence, the amount of surfactant is determined by the change in the glow intensity after adding the substance to the culture sample, and amphoteric compounds of the N- type are used as surfactants tertiary amine oxide.

Сущность предлагаемого биосенсора для определения низких концентраций СПАВ заключается в следующем. Культуру Ph. fischeri выращивают на твердой полусинтетической среде при 24^oC в течение 22 ч до достижения высокой стабильной интенсивности свечения, смывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером /pH 7,4/, готовят суспензию бактерий в концентрации 10⁷ кл/мл, разливают в кюветы люминометра по 0,5 мл и определяют интенсивность свечения исходной тест-системы I₀. Для нахождения концентрационной зависимости действия вещества готовят ряд разведений СПАВ. По 5 мкл каждого разведения СПАВ добавляют в соответствующую исходную пробу культуры не менее чем в трех повторениях. Полученный ряд проб с СПАВ и контрольный образец тестовой системы помещают в кювету люминометра и регистрируют изменение свечения в течение 15-20 мин.The essence of the proposed biosensor for determining low concentrations of surfactants is as follows. Culture Ph. fischeri is grown on a solid semisynthetic medium at 24 ^o C for 22 h until a high stable luminous intensity is achieved, washed with 0.1 M phosphate-buffered saline (pH 7.4), a bacterial suspension of 10 ⁷ cells / ml is prepared, poured into 0.5 ml luminometer cuvettes and determine the luminescence intensity of the initial test system I ₀ . To find the concentration dependence of the action of a substance, a number of dilutions of surfactants are prepared. 5 μl of each dilution of SAS is added to the corresponding initial culture sample in at least three repetitions. The obtained series of samples with surfactants and a control sample of the test system are placed in a luminometer cuvette and the change in luminosity is recorded for 15-20 minutes.

Эффективность влияния каждого из исследуемых разведений СПАВ определяют по изменению интенсивности свечения культуры как отношение I_t/I₀ в процентах. Для каждого разведения строят график зависимости I_t=f/t/. В течение опыта свечения контрольного образца остается постоянным, а зависимость I_t= f/t/ для t=15-20 мин при измерении СПАВ имеет практически линейный характер, что позволяет проводить измерения низких концентраций СПАВ с высокой степенью точности. Достоверным считают изменение интенсивности свечения в пробе на 10% и более от исходного, контрольного образца.The effectiveness of the influence of each of the studied dilutions of the surfactants is determined by the change in the intensity of the glow of the culture as the ratio I _t / I ₀ in percent. For each dilution, a plot of I _t = f / t / is plotted. During the experiment, the luminescence of the control sample remains constant, and the dependence I _t = f / t / for t = 15-20 min when measuring SAS is almost linear in nature, which allows measurements of low concentrations of SAS with a high degree of accuracy. Reliable consider the change in the intensity of the glow in the sample by 10% or more from the original, control sample.

Пример 1. Культуру Ph. fischeri выращивают на твердой питательной среде при 24^oC в течение 22 ч, смывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером, приготавливают суспензию клеток 5,0•10₇ кл/мл. Разливают по 0,5 мл суспензии в кюветы, измеряют исходное свечение I₀. Готовят ряд разведений амфолита /дезинтегрона-O/ СПАВ 0-14: 1,8•10^-5M, 2,4•10^-5M, 3,0•10^-5M.3,0•10^-4M. По 5 мкл каждого разведения добавляют в соответствующую пробу; полученный ряд разведений и контрольный образец помещают в люминометр, измеряют изменение интенсивности свечения в течение 15 мин. Для каждого разведения дезинтегрона-O /в 3-х повторениях/ определяют отношение I_t/I₀ в процентах, находят среднее значение. Результаты представлены в табл. 1. По этим данным строят калибровочные графики для определения низких концентраций СПАВ. В течение анализа изменения интенсивности свечения тестовой культуры в диапазоне измеряемых концентраций дезинтенгрона-O: 2,0•10^-5M - 3,0•10^-4M наносят линейный характер, что позволяет с высокой точностью определять низкие концентрации детергента. Для определения СПАВ 0-14, превышающих 3,0•10^-4M, длительность измерений сокращают из-за быстрого ответа сенсора. Чувствительность определения дезинтегрона-O с помощью данного сенсора составляет 2,0•10^-5M, средняя относительная ошибка измерений -5% быстрота ответа сенсора позволяет производить более ста анализов СПАВ в час.Example 1. Culture Ph. fischeri is grown on solid nutrient medium at 24 ^° C for 22 hours, washed with 0.1 M phosphate-buffered saline, and a cell suspension of 5.0 x 10 ₇ cells / ml is prepared. Pour 0.5 ml of suspension into cuvettes, measure the initial glow I ₀ . A number of dilutions of ampholyte / disintegron-O / SPAS 0-14 are prepared: 1.8 • 10 ^-5 M, 2.4 • 10 ^-5 M, 3.0 • 10 ^-5 M.3.0 • 10 ^-4 M. 5 μl of each dilution is added to the corresponding sample; the obtained series of dilutions and a control sample are placed in a luminometer, the change in the intensity of luminescence is measured for 15 minutes. For each dilution of the disintegron-O / in 3 repetitions / determine the ratio I _t / I ₀ in percent, find the average value. The results are presented in table. 1. Based on these data, calibration graphs are constructed to determine low concentrations of surfactants. During the analysis, changes in the glow intensity of the test culture in the range of measured concentrations of desintengron-O: 2.0 • 10 ^-5 M - 3.0 • 10 ^-4 M are linear in nature, which allows high determinants to be determined with low accuracy. For the determination of surfactants 0-14, exceeding 3.0 • 10 ^-4 M, the duration of the measurements is reduced due to the rapid response of the sensor. The sensitivity of determining the disintegron-O using this sensor is 2.0 • 10 ^-5 M, the average relative measurement error of -5%, the speed of response of the sensor allows more than a hundred analyzes of surfactants per hour.

Пример 2. Суспензию клеток Ph.fischeri, плотностью 5•10⁷ кл/мл готовят как описано в примере 1, а амфолитные СПАВ берут с различной длиной радикала. Разливают в кюветы по 0,5 мл суспензии, измеряют исходное свечение I₀. Готовят разведения 3,0•10^-4M ряда амфолитов типа N-окиси третичного амина с различной длиной гидрофобного радикала и по 5,0 мкл раствора каждого соединения добавляют к соответствующей пробе. Изменение интенсивности свечения определяют в течение 15 мин, находят отношение I_t/I₀ в процентах, результаты представлены в табл. 2, и строят калибровочные графики для определения данного амфолита.Example 2. A suspension of Ph.fischeri cells with a density of 5 • 10 ⁷ cells / ml was prepared as described in example 1, and ampholytic surfactants were taken with different radical lengths. Poured into cuvettes of 0.5 ml of suspension, measure the initial glow I ₀ . Dilutions of 3.0 • 10 ^-4 M of a series of ampholytes of the type of tertiary amine N-oxide with different lengths of hydrophobic radical are prepared, and 5.0 μl of a solution of each compound is added to the corresponding sample. The change in the intensity of the glow is determined within 15 minutes, find the ratio I _t / I ₀ in percent, the results are presented in table. 2, and build calibration graphs to determine this ampholyte.

Средняя относительная ошибка при определении амфолитов с разной длиной радикала при концентрации детергента 3,0•10^-4M составляет 5% С помощью данного сенсора в течение часа можно провести анализ более 30 различных амфолитов при действующей на сенсорную систему концентрации СПАВ.The average relative error in the determination of ampholytes with different radical lengths at a detergent concentration of 3.0 • 10 ^-4 M is 5%. Using this sensor, over 30 different ampholytes can be analyzed within an hour when the surfactant concentration acting on the sensor system is analyzed.

Пример 3. Суспензию клеток готовят как описано в предыдущих примерах 1, 2 и измеряют свечение исходных образцов I₀. По 0,5 мкл раствора дезинтегрона-О заданной концентрации, например, 3,0•10^-5M и 3,0•10^-4M добавляют в трех повторах в соответствующие пробы и измеряют изменение интенсивности свечения в процентах от исходного уровня биолюминесценции, результаты представлены в табл. 3, и по средним значениям строят калибровочные графики для соответствующих концентраций СПАВ. Предлагаемый биосенсор, как видно из табл. 3, позволяет с высокой степенью точности строить концентрационные графики амфолитных СПАВ в пределах разведения детергента 3,0•10^-5M 3,0•10^-4M. Достигнутая с помощью данного сенсора точность тестирования СПАВ позволяет определять разные концентрации детергентов и использовать биосенсор также для анализа степени чистоты применяемого СПАВ.Example 3. A cell suspension is prepared as described in the previous examples 1, 2 and the luminescence of the initial samples I _{0 is} measured. 0.5 μl of a disintegron-O solution of a given concentration, for example, 3.0 • 10 ^-5 M and 3.0 • 10 ^-4 M, is added in three repetitions to the corresponding samples and the change in luminous intensity is measured as a percentage of the initial level of bioluminescence, the results are presented in table. 3, and calibration curves are constructed from the average values for the corresponding concentrations of surfactants. The proposed biosensor, as can be seen from the table. 3, it allows to build concentration charts of ampholytic surfactants with a high degree of accuracy within a dilution of detergent 3.0 • 10 ^-5 M 3.0 • 10 ^-4 M. The accuracy of testing of surfactants achieved with this sensor allows one to determine different concentrations of detergents and use the biosensor for analysis of the degree of purity of the used surfactants.

Таким образом, предлагаемый биосенсор для определения СПАВ позволяет быстро, с высокой степенью точности определять низкие концентрации амфолитов типа N-окиси третичного амина в водных растворах, определять амфолиты с различной длиной гидрофобного радикала и строить калибровочные графики определенных низких концентраций данных соединений для определения их химической чистоты. Диапазон определяемых с помощью биосенсора концентраций амфолитных СПАВ составляет 10^-5M 10⁴M, средняя относительная ошибка измерений 5% Сенсор позволяет проводить до 100 измерений в час прост в употреблении, автоматизирован, обработка данных возможна с помощью сопряжений с люминометром ЭВМ.Thus, the proposed biosensor for the determination of surfactants makes it possible to quickly, with a high degree of accuracy determine low concentrations of ampholytes such as tertiary amine N-oxide in aqueous solutions, determine ampholytes with different lengths of hydrophobic radicals, and construct calibration graphs of certain low concentrations of these compounds to determine their chemical purity . The range of ampholytic surfactant concentrations determined using a biosensor is 10 ^-5 M 10 ⁴ M, the average relative measurement error is 5%. The sensor allows up to 100 measurements per hour to be easy to use, automated, data processing is possible using interfaces with a computer luminometer.

Claims

The use of Photobacterium fischeri bacteria as a biosensor for the quantification of synthetic surfactants in water.