RU2089912C1

RU2089912C1 - Method of stereospecific analysis and a method of preparing conjugate for stereospecific analysis

Info

Publication number: RU2089912C1
Application number: RU93057984A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Юрьевич Плаксин; Михаил Борисович Раев; Елена Тадеушевна Громаковская
Original assignee: Дмитрий Юрьевич Плаксин; Михаил Борисович Раев; Елена Тадеушевна Громаковская
Priority date: 1993-12-30
Filing date: 1993-12-30
Publication date: 1997-09-10

Abstract

FIELD: biotechnology, immunology, biochemistry. SUBSTANCE: method involves one-stage determination of analyte bound with conjugate. The latter has analyte-stereospecific compound (anti-analyte) bound covalently with suspension-like water-insoluble dyes (particle size is 50-350 nm). Carbon, formazanes, diformazanes and Sudans were used as dyes. Method involves direct visualization of analyte as color spots (dottes) or pattern on the solid phase surphase that were formed for a few seconds or minutes after conjugate addition. Invention can be used in biology, medicine and agriculture for making diagnostica for immunochemical, gene-hybridization and ligand-acceptor analysis and for rapid and simple testing. EFFECT: enhanced sensitivity, safety and stability of method and reagents. 3 cl

Description

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безинструментальных и надежных диагностикумов для генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализа. Область применения изобретения может включать практику аналитических исследований в биологии, медицине, сельском хозяйстве, криминологии, выполняемых с фундаментальными или прикладными (диагностическими) целями. The invention relates to immunobiotechnology and can be used in the production of highly sensitive test systems for (qualitative and quantitative) determination of antigens, antibodies and other immunoreactive compounds, as well as in the manufacture of tool-free and reliable diagnostics for gene hybridization and ligand-receptor analysis. The scope of the invention may include the practice of analytical research in biology, medicine, agriculture, criminology, performed with fundamental or applied (diagnostic) purposes.

Данное решение относится к объектам, один из которых предназначен для осуществления другого. This decision relates to facilities, one of which is designed to implement the other.

К настоящему времени в иммуноаналитической практике разработан ряд методов, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее визуализация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ (РИА) (Yalow R.S. Berson S.A. Nature, 1959, V. 184, p. 1648-1649), иммуноферментный анализ (ИФА) (Ngo T.T. Lenhoff H. M. Enzyme-mediated immunoassay, 1985, Plenum Press, New York.), био- и хемилюминесцентные иммуноанализы (Woodhead J.S. Weeks I. Pure Appl. Chem. 1985, v. 57, p. 523-529). Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определить любое соединение, против которого возможно получение специфических антител; избирательностью и специфичностью; высокой чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, у перечисленных (аналогичных заявляемому способу) методов анализа есть существенные недостатки. В первую очередь это опасность для здоровья, которую представляют введение изотопных меток, подготовка и выполнение РИА, а также использование токсических, канцерогенных хромогенов в ИФА; зависимость от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и ограниченно доступных реагентов, используемых либо в технологии изготовления диагностикумов, либо в самой процедуре анализа. To date, a number of methods have been developed in immunoanalytic practice, each of which can conditionally be divided into three stages: the formation of a specific antigen-antibody complex, the introduction of a label into it, and its visualization in one way or another. These methods include radioimmunoassay analysis (RIA) (Yalow RS Berson SA Nature, 1959, V. 184, p. 1648-1649), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Ngo TT Lenhoff HM Enzyme-mediated immunoassay, 1985, Plenum Press, New York.), Bio- and chemiluminescent immunoassays (Woodhead JS Weeks I. Pure Appl. Chem. 1985, v. 57, p. 523-529). All these methods have a number of positive qualities: universality, i.e. allow you to determine any compound against which specific antibodies are possible; selectivity and specificity; high sensitivity. However, along with the advantages, the listed (similar to the claimed method) analysis methods have significant disadvantages. First of all, this is a health hazard posed by the introduction of isotopic labels, the preparation and implementation of RIA, as well as the use of toxic, carcinogenic chromogens in ELISA; Dependence on complex and expensive recording equipment and the limited availability of reagents used either in the technology of manufacturing diagnostic kits or in the analysis procedure itself.

К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток латексы, в том числе цветные (Tarcha et al. Abbot Labs. Eur. pat. appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L. Avrameas S. Ann. Immunol. 1980, v.131 C,p. 389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al. Eur.pat.appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P. US Pat. 4.452. 886). Использование данных меток позволяет визуально определить присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) например, по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно) Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге, иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов. To date, analysis systems with direct labeling of analyte-specific compounds (anti-analytes) with optically dense particles or water-soluble color polymers of various nature and sizes are quite well known. Among these labels are latexes, including colored ones (Tarcha et al. Abbot Labs. Eur. Pat. Appl. 89116594.6), erythrocytes (Guesdon JL. Avrameas S. Ann. Immunol. 1980, v. 131 C, p. 389-396 ), non-metallic colloids of sulfur, selenium, tellurium (Yost et al. Eur.pat.appl. 88110459.0), polymerized dyes Congo red, Trypan blue, Lissamine blue (Henry Robert P. US Pat. 4.452. 886). Using these labels allows you to visually determine the presence of the analyte in homogeneous analysis systems (without separation of the reacting components), for example, by agglutination of rather large particles (with sizes from 0.2 to several micrometers) or by changing the spectral characteristics (color) of specific agglutinating colloids, and in numerous heterogeneous systems of Erythroimmunoadsorption and, more generally, Sedimentation-Adsorption (Immuno) Analysis; dot, Western, Southern, Northern blotting, immuno-and hybridofiltration (Flow-Through analyzes), immunomigration (immunochromatography) and several others for staining the specific binding zone of the analyte on a non-porous or porous solid-phase carrier. Despite the possibility of quantitative recording using simple colorimeters, reflectometers, densitometers, the main advantage of these methods is the direct visual determination of the analyte, which conditionally distinguishes them in the group of so-called tool-less methods.

Наиболее близкими к заявленным объектам по технической сущности и достигаемому результату являются способ стереоспецифического анализа с использованием конъюгатов анти-аналита с частицами коллоидного золота и способ получения конъюгатов для данного анализа (Roth J. Heitz P.U. Immunolabeling with the Protein A Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484). Closest to the claimed objects in terms of technical nature and the achieved result are a stereospecific analysis method using anti-analyte conjugates with colloidal gold particles and a method for producing conjugates for this analysis (Roth J. Heitz PU Immunolabeling with the Protein A Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13: 467-484).

В анализе-прототипе инкубируемый с иммобилизованным на твердофазном носителе первым анти-аналита определяемый лиганд (аналит) детектируют вторым анти-аналитом, меченным частицами коллоидного золота. В процессе детекции конъюгатом "анти-аналит/коллоидное золото" осуществляют прямую визуализацию специфически связанного аналита. Таким образом исключается дополнительная стадия визуализации самого конъюгата (как, например, стадия субстратного проявления ферментных конъюгатов в дот-ИФА), что принципиально отличает названный прямой прототип от вышеперечисленных аналогов. In a prototype assay, a detectable ligand (analyte) incubated with a first anti-analyte immobilized on a solid phase support is detected by a second anti-analyte labeled with colloidal gold particles. During the detection process with the anti-analyte / colloidal gold conjugate, a specific visualized analyte is directly visualized. This eliminates the additional stage of visualization of the conjugate itself (such as, for example, the stage of substrate manifestation of enzyme conjugates in dot-ELISA), which fundamentally distinguishes the named direct prototype from the above analogues.

Основным недостатком прототипа является относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью (цветностью в видимом диапазоне светового спектра) частиц коллоидного золота, что связано как собственно с оптическими характеристиками, которые обусловлены химической природой самих коллоидов золота, так и с ограниченными размерами частиц коллоида. Практически прототип исключает возможность использования в анализе частиц, с размерами, превышающими 80 нанометров, что связано с невозможностью получения более крупных конъюгатов из-за их нестабильности в растворах. (Эффективность прямой визуализации связанного аналита определяется способностью моно- или полислоев частиц метки поглощать или отражать свет. Интенсивность процесса реагирования с светом понятным образом зависит от размеров частиц: чем больше размер до определенного предела, за которым возможно гидромеханическое удаление частиц из зоны связанного аналита в процессе отмывки твердофазного носителя от непрореагировавшего конъюгата тем эффективнее визуализация и выше чувствительность анализа). Указанные причины не позволяют прототипу достигать чувствительности, которая была бы эквивалентна чувствительности большинства известных аналогов (в первую очередь чувствительности наиболее широко используемого и популярного в реальной аналитической практике ферментного дот-анализа). The main disadvantage of the prototype is the relatively low sensitivity associated with low chromophore (color in the visible range of the light spectrum) of colloidal gold particles, which is associated both with the optical characteristics proper, due to the chemical nature of the gold colloids themselves, and with the limited particle sizes of the colloid. In practice, the prototype excludes the possibility of using particles with sizes exceeding 80 nanometers in the analysis, which is associated with the impossibility of obtaining larger conjugates due to their instability in solutions. (The efficiency of direct visualization of bound analyte is determined by the ability of mono- or multilayers of label particles to absorb or reflect light. The intensity of the reaction process with light clearly depends on the particle size: the larger the size to a certain limit, beyond which hydromechanical removal of particles from the bound analyte zone in the process washing the solid-phase carrier from the unreacted conjugate, the more effective the visualization and higher sensitivity of the analysis). These reasons do not allow the prototype to achieve a sensitivity that would be equivalent to the sensitivity of most known analogues (primarily the sensitivity of the most widely used and popular in real analytical practice, enzymatic dot analysis).

Что касается способа получения конъюгатов анти-аналита с цветной суспензоидной меткой, то в известном прототипе используют нековалентную процедуру конъюгирования, которая по существу заключается в простом соединении свежеприготовленного метастабильного коллоида золота с анти-аналитом в зоне определенных оптимальных концентраций последнего, которая для каждого конкретного анти-аналита должна быть подобрана в индивидуальных экспериментах. При этом в соединении двух названных реагентов участвуют только нехимические адсорбиционные связи, которые существенно слабее ковалентных. В результате получаемые в прототипе конъюгаты не являются достаточно стабильными, что осложняет возможность их длительного хранения и, кроме того, накладывает ряд существенных ограничений на их использование в самих процедурах анализа - например, не позволяет использовать обычно применяемые в подавляющем большинстве твердофазных анализов с целью подавления неспецифических взаимодействий детергенты, которые способны разрушить нековалентный конъюгат "анти-аналит/коллоидное золото". В целом описанные характеристики критикуют прототип с позиций его неудовлетворительной надежности. As for the method for producing anti-analyte conjugates with a colored suspension label, the non-covalent conjugation procedure is used in the known prototype, which essentially consists in simply combining a freshly prepared metastable gold colloid with an anti-analyte in the zone of certain optimal concentrations of the latter, which for each particular anti- analyte should be selected in individual experiments. Moreover, only non-chemical adsorption bonds that are substantially weaker than covalent bonds are involved in the combination of the two reagents. As a result, the conjugates obtained in the prototype are not stable enough, which complicates the possibility of their long-term storage and, in addition, imposes a number of significant restrictions on their use in the analysis procedures themselves - for example, it does not allow the use of solid-state analyzes commonly used in the vast majority to suppress non-specific interactions with detergents that can destroy the non-covalent anti-analyte / colloidal gold conjugate. In general, the described characteristics criticize the prototype from the standpoint of its unsatisfactory reliability.

Задачей создания изобретения является увеличение чувствительности систем детекции для широкой группы перечисленных выше безинструментальных методов стереоспецифического анализа, а также увеличение надежности анализа и повышение стабильности конъюгатов для детекции. The objective of the invention is to increase the sensitivity of detection systems for a wide group of the above-mentioned toolless methods of stereospecific analysis, as well as to increase the reliability of analysis and increase the stability of conjugates for detection.

Первую поставленную задачу решают путем использования в качестве метки второго анти-аналита частиц углерода и водонерастворимых красителей из группы формазанов, диформазанов и суданов. Данные метки отличаются от используемого в прототипе золота очень высокой степенью оптической плотности в видимом диапазоне светового спектра. Кроме того, заявляемый способ получения конъюгата для анализа, в отличие от прототипа, не ограничивает размеры конъюгата, что дополнительно позволяет увеличивать чувствительность заявляемого способа анализа. The first task posed is solved by using carbon particles and water-insoluble dyes from the group of formazans, diformazans, and sudans as a second anti-analyte label. These labels differ from the gold used in the prototype by a very high degree of optical density in the visible range of the light spectrum. In addition, the inventive method for producing a conjugate for analysis, in contrast to the prototype, does not limit the size of the conjugate, which additionally allows you to increase the sensitivity of the proposed method of analysis.

Задачу повышения надежности анализа и стабильности используемых в анализе детектирующих реагентов решают путем ковалентного конъюгирования анти-аналита с цветными суспензоидными частицами. Для этого частицы покрывают водорастворимым полимером, который является инертным амфипатическим соединением, способным относительно прочно сорбироваться на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид цветной метки. Сорбированный полимер экспонирует в водную фазу функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо- и/или гетеробифункциональными конъюгирующими соединениями. Последующая обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам полимера, приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера и одновременно к внедрению на поверхность комплекса реакционноспособных групп бифункционального реагента. Последующее соединение освобожденной от избытка конъюгирующего реагента активированной метки с интактным (немодифицированным) анти-аналитом завершается ковалентной пришивкой молекул анти-аналита к поверхности цветной метки. В результате заявленный способ позволяет получать конъюгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах, в том числе в присутствии высоких концентраций детергентов, и очень стабильны при длительном хранении в широких температурных пределах (которые зависят только от природных характеристик анти-аналитов). Двухэтапный характер конъюгирования создает дополнительное преимущество, делая заявляемый способ более надежно воспроизводимым независимо от диапазона концентраций тех или иных анти-аналитов. Создаваемый способом положительный эффект в целом характеризуется существенно большей по сравнению с прототипом надежностью и универсальностью. The task of increasing the reliability of the analysis and the stability of the detecting reagents used in the analysis is solved by covalently conjugating the anti-analyte with colored suspension particles. For this, the particles are coated with a water-soluble polymer, which is an inert amphipathic compound capable of relatively strong adsorption on the surface of the particles. Sorption of the polymer makes it possible to obtain a color-stable suspension suspension in solutions. Sorbed polymer exposes to the aqueous phase functional groups capable of covalently reacting with homo- and / or heterobifunctional conjugating compounds. Subsequent treatment of the resulting complex with a bifunctional reagent, taken in large molar excess with respect to the functional groups of the polymer, leads to covalent crosslinking between the sorbed polymer molecules and, at the same time, to the introduction of reactive groups of the bifunctional reagent onto the surface of the complex. The subsequent connection of the activated label freed from excess conjugating reagent with an intact (unmodified) anti-analyte is completed by covalently attaching anti-analyte molecules to the surface of the color label. As a result, the claimed method allows to obtain conjugates of a strong covalent structure, which are stable in solutions, including in the presence of high concentrations of detergents, and are very stable during long-term storage in a wide temperature range (which depend only on the natural characteristics of anti-analytes). The two-stage nature of the conjugation creates an additional advantage, making the inventive method more reliable reproducible regardless of the concentration range of certain anti-analytes. The positive effect created by the method is generally characterized by significantly greater reliability and versatility compared to the prototype.

Заложенный в заявляемый способ принцип двухэтажного ковалентного конъюгирования представляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителей представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемых объектов. The principle of two-story covalent conjugation incorporated in the inventive method provides an opportunity for a very wide selection of specific adsorbed polymers and activating / conjugating reagents. This circumstance compels the applicants to submit the claims made in principle terms, an attempt to specify which would inevitably lead to a narrowing of the scope of the claimed objects.

В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве сорбируемого на поверхности частиц цветной суспензоидной метки полимера и глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо) бифункционального реагента. Использование данных веществ не является принципиальным для осуществления способа. Вместо БСА могут быть эффективно использованы другие как натуральные так и синтетические водорастворимые полимеры, способные сорбироваться на гидрофобных поверхностях и несущие на своей поверхности доступные для ковалентного реагирования функционально активные группы. Такими реагентами могут быть другие белки (иммуноглобулины, желатины) и смеси белков (например, сыворотки) а также искусственные полимерные соединения. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представлеными в возможных анти-аналитах и анти-анти-аналитах первичными аминогруппами (хотя, для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких анти-аналитов, как Fab' фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена). The specific examples presented below describe a method for producing detecting conjugates using bovine serum albumin as a color suspension polymer label and glutaraldehyde adsorbed on the surface of particles as a crosslinking (homo) bifunctional reagent. The use of these substances is not essential for the implementation of the method. Instead of BSA, other both natural and synthetic water-soluble polymers that are capable of adsorbing on hydrophobic surfaces and bearing functionally active groups accessible for covalent reaction on their surface can be effectively used. Such reagents can be other proteins (immunoglobulins, gelatins) and mixtures of proteins (for example, serum) as well as artificial polymeric compounds. Instead of glutaraldehyde, other well-known homo- and heterobifunctional compounds can be used which, in second-order reactions, are capable of reacting preferably with the primary amino groups that are most universally represented in possible anti-analytes and anti-anti-analytes (although, for covalent conjugation with suspension forms of such anti- analytes, such as Fab 'antibody fragments, may be more optimal, for example, maleimide reagents involved in thiol-disulfide exchange reactions).

Использование бычьего сывороточного альбумина (БСА) и глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа. БСА содержит большое количество (до 63-х) доступных для реагирования первичных аминогрупп, а глутаральдегид является гомобифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость БСА и глутаральдегида, что также выгодно отличает именно эти реагенты от возможных других, использование которых в рамках данного способа с экономической точки зрения, очевидно, является менее выгодной возможностью. The use of bovine serum albumin (BSA) and glutaraldehyde is preferred, since it additionally meets the requirement of universality of the proposed method. BSA contains a large number (up to 63) of primary amino groups available for reaction, and glutaraldehyde is a homobifunctional reagent that reacts relatively specifically with primary amino groups of proteins. In addition, an important circumstance is the availability and practically the lowest cost of BSA and glutaraldehyde, which also distinguishes these reagents from possible others, the use of which in the framework of this method from an economic point of view, is obviously a less profitable opportunity.

Примеры конкретного выполнения. Examples of specific performance.

Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных детектирующих реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом. The following examples are provided only to demonstrate the capabilities of the present invention, but in no way limit both the range of possible technological methods for the synthesis of specific detecting reagents and the scope of the possible application of the invention as a whole.

Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемых способов с точки зрения их существенных отличий, которыми в наиболее широком смысле являются использование новых цветных суспензоидных меток в стереоспецифическом анализе и их двухэтапное ковалентное конъюгирование с анти-аналитами. The specific quantitative parameters given in the examples, even in the range of the indicated ranges, are not fixed by the claims, because they are not fundamental conditions for the implementation of the claimed methods from the point of view of their significant differences, which in the broadest sense are the use of new color suspensory labels in stereospecific analysis and their two-stage covalent conjugation with anti-analytes.

Пример 1.Получение реагентов активированных цветных суспензоидных меток. Example 1. Obtaining reagents activated color suspensory labels.

К 20 мл раствора Бычьего Сывороточного Альбумина (БСА) 1-50 мг/мл в 0,01 0,2 М фосфатном Буферном Растворе pH 6-8,5 (ФБР) добавляют 0,1-2 грамма углерода. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц углерода. Полученную суспензию озвучивают в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы разбиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40^oC. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугируют при 6000 г в течение 5-10 мин с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. Покрытые БСА суспензоидные частицы углерода с размерами 50-350 нм, содержащиеся в супернатанте, в дальнейшем активируют раствором глутаральдегида. Диапазон эффективных концентраций реагента 1-25% время активации от 20 до 120 мин.To 20 ml of a solution of Bovine Serum Albumin (BSA) 1-50 mg / ml in 0.01 0.2 M phosphate Buffer Solution pH 6-8.5 (FBI) add 0.1-2 grams of carbon. The mixture is stirred on a magnetic stirrer or rotary shaker type "Vortex" for a period of time sufficient for complete preliminary peptization (wetting) of carbon particles. The resulting suspension is voiced in an ultrasonic disintegrator. The conditions for ultrasonic treatment of the suspension (intensity and power, the number and duration of the sounding cycles) are selected so that the breakable suspension is not heated to a temperature above 40 ^o C while cooling (possible), the suspension obtained by effective ultrasonic disintegration is centrifuged at 6000 g for 5-10 minutes to remove remaining relatively large particles. BSA-coated suspension particles of carbon with sizes of 50-350 nm contained in the supernatant are subsequently activated with a glutaraldehyde solution. The range of effective concentrations of the reagent is 1-25%, the activation time is from 20 to 120 minutes.

Активированный суспензоид освобождают от избытка глутаральдегида и несвязанного БСА 3х-4х кратным центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В, CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. The activated suspension is freed from excess glutaraldehyde and unbound BSA by 3x-4x centrifugation or gel filtration on a Sepharose column (6B, 4B, 2B, CL-6B, CL-4B, CL-2B), Sephacryl S-300, or other suitable gels (Toyoperls, Ultragels, etc.) with an exclusion limit of at least one million Daltons for globular proteins.

Описанный конкретный способ получения активированного суспензоида на основе коллоидного углерода позволяет в дальнейшем синтезировать конъюгаты черного цвета. Способ получения суспензоидных конъюгатов другого цвета ничем принципиально не отличается от описанного. Для синтеза конъюгатов красного цвета используют Судан II, темно-красного Судан III, серого Судан черный, фиолетового -Тетразолиевый фиолетовый формазан, темно-фиолетового - Неотетразолиевый диформазан, синего Тетразолиевый синий диформазан. The described specific method for producing an activated colloidal carbon suspension based on suspensions allows the synthesis of black conjugates. A method for producing a suspension of conjugates of a different color does not fundamentally differ from that described. For the synthesis of red conjugates, Sudan II, dark red Sudan III, gray Sudan black, violet — Tetrazolium violet formazan, dark violet — Neotetrazolium formazan, and blue Tetrazolium blue formazan are used.

Рабочая концентрация конъюгатов, используемая в анализах составляет 0,03 в пересчете на сухой вес метки. The working concentration of conjugates used in the assays is 0.03 based on the dry weight of the label.

2. Получение конъюгатов активированных суспензоидных меток (АСМ) с анти-аналитами (Белком А, Стрептавидином, Антителами). 2. Obtaining conjugates of activated suspension labels (AFM) with anti-analytes (Protein A, Streptavidin, Antibodies).

На роторном встряхивателе соединяют 9 объемов АСМ с 1 объемом раствора анти-аналита в ФБР в концентрации, позволяющей получить конечную концентрацию в объеме реакции от 0,1 до 2,0 мг/мл. Реакцию проводят в течение 2-4 ч при комнатной температуре. Полученные конъюгаты освобождают от избытка анти-аналита центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков, фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяют и добавляют БСА и глицерин до конечных концентраций соответственно 1% и 20%
По описанной схеме были синтезированы конъюгаты Белок А Углерод, использованные в нижеописываемых примерах анализа (п.п. 1.и 2.), Стрептавидин-Углерод, Стрептавидин-Судан III, Стрептавидин-Тетразолиевый синий диформазан, Стрептавидин-Неотетразолиевый диформазан (п.3), Анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) Углерод (п.4).On a rotary shaker, 9 volumes of AFM are combined with 1 volume of an anti-analyte solution in the FBI in a concentration that allows a final concentration in the reaction volume of 0.1 to 2.0 mg / ml to be obtained. The reaction is carried out for 2-4 hours at room temperature. The resulting conjugates are freed from excess anti-analyte by centrifugation or gel filtration on a column of Sepharose (6B, 4B, 2B, CL-4B, CL-2B), Sephacryl S-300 or other suitable gels (Toyoperli, Ultrageli, etc.), having an exclusion limit of at least one million Daltons for globular proteins, fractions that have left idle and contain conjugate are combined and BSA and glycerin are added to final concentrations of 1% and 20%, respectively
According to the described scheme, Protein A Carbon conjugates were synthesized, used in the analysis examples described below (items 1. and 2.), Streptavidin-Carbon, Streptavidin-Sudan III, Streptavidin-Tetrazolium blue formazan, Streptavidin-Neotetrazolium 3-formazan ( ), Anti-hCG antibodies (AB 0421) Carbon (Clause 4).

Способ анализа иллюстрируется следующими примерами. The analysis method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Иммунохроматографическое определение IgG человека с использованием конъюгата Белок А Углерод в сравнении с Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нанометров. Example 1. Immunochromatographic determination of human IgG using a protein A conjugate Carbon compared to Protein A labeled with colloidal gold with a particle size of 40 nanometers.

В анализе использовали полоски нитроцеллюлозы (Millipore) с размерами пор 5 микрометров с иммобилизированными на них в виде пятен IgG человека (наносимый объем 0,001 мл.) из кратных 10 разведений 1мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл. Край полоски, предварительно блокированной в растворе 1 казеина в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05 Твина 20 (ФБР-Тв.), помещали в раствор конъюгатов на 10-15 сек. (время, достаточное для прохождения за счет капиллярных сил фронтом реагентов расстояния около 10 мм. ), а затем в ФБР-Тв. По мере прохождения фронтом мигрирующего диагностикума зоны иммобилизации лиганда наблюдали проявление в виде черных пятен результатов анализа. Чувствительность системы детекции с использованием конъюгата Белок А Углерод составляла 10 пг/пятно, с конъюгатом Белок А Золото 100 пг/пятно. The analysis used strips of nitrocellulose (Millipore) with a pore size of 5 micrometers immobilized as human IgG spots (applied volume of 0.001 ml) from 10 dilutions of 1 mg / ml, 100 μg / ml, 10 μg / ml, 1 μg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. The edge of the strip, previously blocked in a solution of 1 casein in a phosphate buffer solution containing 0.05 Tween 20 (FBI-Tw.), Was placed in the conjugate solution for 10-15 seconds. (enough time for the passage through the capillary forces of the front of the reactants of a distance of about 10 mm.), and then to the FBI-TV. As the front of the migrating diagnosticum passes through the ligand immobilization zone, the results of the analysis are observed as black spots. The sensitivity of the detection system using the Protein A carbon conjugate was 10 pg / spot, with the Protein A Gold conjugate 100 pg / spot.

Пример 2. Серологическое определение анти-ВИЧ антител на непористой твердой фазе с использованием конъюгата Белок А Углерод. Example 2. Serological determination of anti-HIV antibodies on a non-porous solid phase using the conjugate Protein A Carbon.

В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведений из полистирола, внутреннюю поверхность лунок которых покрывали суммой синтетических пептидов, представляющих собой детерминанты основных структурных белков ВИЧ-1,3, на которую наносили по 0,001 мл. сыворотки кролика против ВИЧ антигенов из разведений кратных двум. После 15 мин инкубации и отмывки ФБР-Тв. в лунки вносили конъюгат Белок А Углерод на 15 мин, после чего, удалив конъюгат, наблюдали результаты анализа в виде четких контрастных пятен. Параллельно связанные антитела определяли Белком А, меченным пероксидазой хрена. Чувствительность анализа оценивали по конечному разведению сыворотки, дающему отличное от фона пятно. В результате сравнительного анализа получили чувствительность определения при помощи Углеродного конъюгата 1/20.480, с использованием ферментного конъюгата 1/1.280 (в стандартной процедуре проявления 4-хлорнафтолом) и практически неразличимые результаты определения конъюгатом Белок А Золото. Plates for serial dilutions from polystyrene were used as the solid phase, the inner surface of the holes of which was covered with the sum of synthetic peptides, which are the determinants of the basic structural proteins of HIV-1,3, onto which 0.001 ml was applied. rabbit serum against HIV antigens from dilutions of two. After 15 min of incubation and washing with FBI-Tv. Protein A carbon conjugate was added to the wells for 15 min, after which, removing the conjugate, the analysis results were observed in the form of clear contrasting spots. Parallel bound antibodies were detected with Protein A labeled with horseradish peroxidase. The sensitivity of the analysis was evaluated by the final dilution of the serum, giving a spot different from the background. As a result of the comparative analysis, the sensitivity of determination was obtained using the Carbon Conjugate 1 / 20.480, using the enzyme conjugate 1 / 1.280 (in the standard procedure for developing 4-chloronaphthol) and practically indistinguishable results of the determination of the Protein A Gold conjugate.

Пример 3. Дот-гибридизационный анализ ДНК фага лямбда. Example 3. Dot hybridization DNA analysis of phage lambda.

Кратные 10 серийные разведения денатурированной ДНК фага лямбда апплицировали в объемах по 1 мкл на нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм. Иммобилизированную мишеневую ДНК припекали в течение 2-х ч при 80^oC в вакууме.Multiple 10 serial dilutions of denatured lambda phage DNA were applied in 1 μl volumes to 0.45 μm nitrocellulose membranes. The immobilized target DNA was baked for 2 hours at 80 ^° C in vacuo.

Гибридизацию проводили с использованием в качестве зонда химически биотинилированной ДНК фага лямбда. Hybridization was carried out using chemically biotinylated lambda phage DNA as a probe.

Отмытые мембраны обрабатывали блокирующим буфером с 0,5 коллоидного казеина и 1 желатина в течение часа и осуществляли определение инкубацией с рабочими разведениями конъюгатов Стрептавидина с Углеродом (черный), с Суданом-III (темно-красный), с Тетразолиевым синим диформазаном (синий), с Неотетразолиевым диформазаном (темно-фиолетовый) в течении 30 мин при комнатной температуре и мягком покачивании, с последующей 3х-кратной отмывкой ФБР-Тв перед финальным учетом результатов. Параллельно детекцию осуществляли стандартным конъюгатом Стрептавидин-Пероксидаза Хрена с визуализацией гибридизованных образцов в колориметрической реакции с о-дианизидином. The washed membranes were treated with blocking buffer with 0.5 colloidal casein and 1 gelatin for an hour and determined by incubation with working dilutions of Streptavidin conjugates with Carbon (black), with Sudan-III (dark red), with Tetrazolium blue formazan (blue), with Neotetrazolium diformazan (dark violet) for 30 min at room temperature and gentle swaying, followed by 3-fold washing with FBI-TV before the final analysis of the results. Detection was carried out in parallel with the standard horseradish Streptavidin-Peroxidase conjugate with visualization of hybridized samples in a colorimetric reaction with o-dianisidine.

В результате описанных экспериментов в ряде воспроизводимых серий чувствительность анализа с применением обеих систем определения с использованием как суспензоидных (4-х различных цветов), так и ферментного конъюгатов составила от 1-до 0,1 пиктограммов мишеневой ДНК на точку. As a result of the described experiments, in a number of reproducible series, the sensitivity of the analysis using both determination systems using both suspension (4 different colors) and enzyme conjugates ranged from 1 to 0.1 pictograms of target DNA per point.

Пример 4. Двухсайтное иммунохроматографическое определение хорионического гонадотропина человека с использованием суспензоидного конъюгата Углерод-Моноклональные Антитела. Example 4. Two-site immunochromatographic determination of human chorionic gonadotropin using a suspension-conjugate Carbon-Monoclonal Antibodies.

Приготовление связывающих ХГЧ пористых полосок. Preparation of hCG binding porous strips.

На прозрачную (ПВХ) толстую (0,5 мм) жесткую клейкую ленту приклеивали полоску из 5-мкм нитроцеллюлозного фильтра с размерами 2•16 мм. Один из узких концов плотно, с помощью той же клейкой подложки, соединяли с впитывающим элементом (1•1 см квадрат толстой высокопористой хроматографической бумаги), считая в последующем данный конец верхним. На середину нитроцеллюлозной полоски тонкой линией с помощью Гамильтоновского шприца наносили моноклональные анти-ХГЧ антитела (АВ 0420), 1 мг/мл в ФБР. После подсыхания полоски 30 мин после нанесения связывающих антител полоску блокировали замачиванием в 1 казеине в ФБР-Тв на 1 ч при комнатной температуре, после чего отмывали ФБР-Тв и вновь высушивали. A strip of 5 μm nitrocellulose filter with dimensions of 2 • 16 mm was glued onto a transparent (PVC) thick (0.5 mm) rigid adhesive tape. One of the narrow ends was tightly, using the same adhesive backing, connected to an absorbent element (1 • 1 cm square of thick highly porous chromatographic paper), subsequently considering this end to be the upper one. Monoclonal anti-hCG antibodies (AB 0420), 1 mg / ml in the FBI, were applied to the middle of the nitrocellulose strip with a thin line using a Hamiltonian syringe. After drying of the strip 30 min after application of binding antibodies, the strip was blocked by soaking in 1 casein in FBI-Tv for 1 h at room temperature, after which the FBI-Tv was washed and dried again.

Определение стандарта ХГЧ. Definition of the hCG standard.

Стандарт ХГЧ разводили кратно 2 в ФБР-Тв и моче здорового донора, добавленной твином-20 до 0,1 К 50 мкл стандартных разведений ХГЧ, выполненных в лунках микротитровального планшета, добавляли по 50 мкл суспензоидного конъюгата анти-ХГЧ анитела (АВ 0421) Углерод в рабочем разведении в ФБР-Тв. Сразу же после этого в лунки опускали нижние концы хроматографических полосок с иммобилизированными на них моноклональными анти-ХГЧ антителами. Через 2-3 мин результата анализа определяли визуально по наличию (положительный результат: черные полосы на белом фоне) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител. Чувствительность анализа в нескольких сериях испытаний сконструированной системы составила 50 МЕ/л. Данная чувствительность удовлетворяет уровню диагностической потребности иммунохимического определения ранней беременности сроком в 1 неделю. The hCG standard was diluted in multiples of 2 in FBI-TV and the urine of a healthy donor, added with Tween-20 to 0.1 K 50 μl of standard dilutions of hCG performed in the wells of a microtiter plate, 50 μl of anti-hCG antibody suspension suspension conjugate (AB 0421) was added Carbon in working dilution at the FBI-TV. Immediately after this, the lower ends of the chromatographic strips with monoclonal anti-hCG antibodies immobilized on them were lowered into the wells. After 2-3 minutes, the analysis result was determined visually by the presence (positive result: black bars on a white background) or the absence (negative result) of suspension of the suspension of the conjugate in the immobilization zone of the first antibodies. The sensitivity of the analysis in several series of tests of the designed system was 50 IU / L. This sensitivity satisfies the level of diagnostic needs of the immunochemical determination of early pregnancy for a period of 1 week.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в существенном увеличении чувствительности и надежности стереоспецифического анализа с прямой визуализацией аналитов. Повышенная чувствительность анализа определяется исключительно высокой оптической плотностью предлагаемых меток по сравнению с оптической плотностью используемых в прототипе частиц коллоидного золота. Надежность анализа детерминируется предлагаемым универсальным способом двухэтапного синтеза реагентов для детекции, который позволяет получать очень стабильные ковалентные конъюгаты анти-аналитов с цветными суспензоидными метками. Способ может быть использован для получения конъюгатов анти-аналитов не только с предлагаемыми новыми, но и с ранее известными метками в том числе, например, с теми же коллоидами золота. The technical and economic efficiency of the invention consists in a substantial increase in the sensitivity and reliability of stereospecific analysis with direct visualization of analytes. The increased sensitivity of the analysis is determined by the extremely high optical density of the proposed labels in comparison with the optical density of the colloidal gold particles used in the prototype. Reliability of the analysis is determined by the proposed universal method of two-stage synthesis of reagents for detection, which allows to obtain very stable covalent conjugates of anti-analytes with color suspensory labels. The method can be used to obtain conjugates of anti-analytes not only with the proposed new, but also with previously known labels including, for example, with the same gold colloids.

От известных и широко распространенных аналогов, таких как ИФА, предлагаемый способ анализа выгодно отличается простотой, оперативностью и безопасностью, что определяется отсутствием дополнительной стадии субстратного проявления, предполагающей работу с вредными для здоровья хромогенами. Кроме того, цветные преципитаты ферментных реакций выцветают при длительном хранении, в то время как предлагаемый способ дает возможность неограниченно длительно сохранять результаты анализа. From the known and widespread analogues, such as ELISA, the proposed method of analysis compares favorably with simplicity, efficiency and safety, which is determined by the absence of an additional stage of substrate manifestation, involving work with harmful chromogens. In addition, color precipitates of enzymatic reactions fade during long-term storage, while the proposed method makes it possible to unlimitedly save analysis results.

Технология получения конъюгатов цветных суспензоидных меток независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Универсальность и надежная воспроизводимость предлагаемого способа доказана в 26 сериях повторных синтезов конъюгатов с различными анти-аналитами. The technology for producing conjugates of colored suspensory labels is independent of unique or expensive equipment and objectively deficient or expensive reagents. The versatility and reliable reproducibility of the proposed method is proved in 26 series of repeated syntheses of conjugates with various anti-analytes.

Способ стереоспецифического анализа вследствие высокой чувствительности, надежности, простоты и оперативности может служить основой создания эффективных безинструментальных систем для упрощенного диагностического тестирования и эффективно использоваться в разнообразных "один пациент один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, включая срочные клинические и эпидемиологические ситуации, а также в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования. Due to its high sensitivity, reliability, simplicity and efficiency, the method of stereospecific analysis can serve as the basis for the creation of effective tool-free systems for simplified diagnostic testing and can be effectively used in a variety of “one patient one test” kits for outpatient, hospital and hospital analyzes, including urgent clinical and epidemiological situations, as well as in mass "home" systems suitable for individual use.

Применение заявляемых цветных меток с целью увеличения чувствительности стереоспецифических анализов представляет универсальный и одновременно независимый технологический и методический подход, которым могут быть эффективно дополнены известные системы иммуноанализа. The use of the inventive color labels in order to increase the sensitivity of stereospecific analyzes represents a universal and at the same time independent technological and methodological approach, which can be effectively supplemented with known immunoassay systems.

Claims

1. The method of stereospecific analysis, including incubating the analysis with a solid phase immobilized first anti-analyte, followed by the development of a bound analyte with a second anti-analyte conjugate with a colored suspension label, characterized in that carbon particles and dyes from the group of formazans, diformazans and sudans are used as tags.

2. A method for producing a conjugate for stereospecific analysis, comprising combining an antianalyte with suspension particles of a water-insoluble dye, characterized in that initially a water-soluble polymer containing functional groups is adsorbed onto the particles, which are then covalently attached to the surface of the particles and simultaneously activated by treatment with a homo- or heterobifunctional reagent, after whereby the resulting activated complex is covalently conjugated to an antianalyte.

3. The method according to claim 2, characterized in that a protein containing functional amino groups, preferably bovine serum albumin, is used as a polymer adsorbed on the surface of the suspension particles of the polymer, and a homobifunctional reactant reacting with amino groups, preferably glutaraldehyde, is used as a stabilizing and activating compound.