RU2081914C1

RU2081914C1 - Method of foreign dna incorporation in spermatozoons

Info

Publication number: RU2081914C1
Application number: RU94027663A
Authority: RU
Inventors: Андрей Вадимович Кузнецов; Ирина Владимировна Кузнецова; Борис Савельевич Народицкий; Игорь Львович Гольдман; Лев Константинович Эрнст
Original assignee: Андрей Вадимович Кузнецов; Ирина Владимировна Кузнецова; Борис Савельевич Народицкий; Игорь Львович Гольдман; Лев Константинович Эрнст
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1994-07-21
Publication date: 1997-06-20
Also published as: RU94027663A

Abstract

FIELD: genetic engineering. SUBSTANCE: before spermatozoons washing from the semen fluid their subjected for flotation. Spermatozoon suspension is incubated with DNA to be incorporated firstly at the room temperature in the presence of 1% DMSO, then DMSO concentration is increased to 3% and mixture is cooled to 0-(+4) C followed by its heating to 42 C. EFFECT: improved method of DNA incorporation. 2 cl, 1 tbl

Description

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения трансформированных сперматозоидов. The invention relates to genetic engineering and can be used to produce transformed sperm.

В настоящее время для получения трансгенных животных используют технику микроинъекции ДНК в пронуклеусы зигот, трансфекцию ES-клеток с пересадкой их в бластоцисту, а также инфицирование предъимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами. Эти процедуры отличаются ориентацией на конкретный вид животного, низкой эффективностью и большой трудоемкостью. Из сказанного следует, что в трансгении ощущается потребность в универсальном и эффективном векторе для доставки чужеродной ДНК в клетку-мишень. Таким вектором могут служить сперматозоиды, т.е. клетки, специализированные на доставке ДНК в ооцит. Использование сперматозоидов в качестве нативного вектора для переноса экзогенной ДНК в яйцеклетки характеризуется естественностью, универсальностью, технологичностью и высокой эффективностью. С помощью трансформированных сперматозоидов были получены трансгенные животные разных видов. Трансгены, привнесенные в зиготу спермием, экспрессировались и передавались потомству. Currently, to obtain transgenic animals, they use the technique of microinjection of DNA into pronuclei of zygotes, transfection of ES cells with transplantation into a blastocyst, and infection of pre-implantation embryos with recombinant retroviruses. These procedures are distinguished by focusing on a specific type of animal, low efficiency and high complexity. It follows from the above that transgeny needs a universal and effective vector for delivering foreign DNA to the target cell. Sperm cells, i.e. cells specialized in delivering DNA to an oocyte. The use of spermatozoa as a native vector for transfer of exogenous DNA to the eggs is characterized by naturalness, versatility, adaptability and high efficiency. Using transformed sperm, transgenic animals of different species were obtained. Transgenes introduced into the zygote by sperm were expressed and transmitted to offspring.

Известны следующие способы введения чужеродной ДНК /чДНК/ в сперматозоиды: самопроизвольное поглощение и принудительное пропитывание /импрегнация/ клеток чужеродной ДНК. Феномен спонтанного поглощения экзогенной ДНК в отсутствии семенной плазмы был описан для зрелых спермиев. Показано, что сперматозоиды способны переносить "захваченную" чДНК в яйцеклетку. Среди рожденных животных 30 особей содержали экзогенную ДНК. Однако, данный способ, несмотря на высокую результативность, отличается плохой воспроизводимостью. В основе другого подхода /импрегнация спермиев чДНК/ лежит применение различных химических и физических факторов на сперматозоиды с целью более эффективного проникновения чДНК в клетку. В качестве таких агентов используют диметилсульфоксид, электропорацию, а также предварительно заключают чДНК в липосомы /липофекация/. В результате применения указанных способов обработки сперматозоидов часто нарушаются физиологические функции спермиев: падает подвижность, разрушается цитоплазматическая мембрана, происходит спонтанная акросомальная реакция, теряется оплодотворяющая способность сперматозоидов. В связи с этим возникает проблема использования таких методов введения чДНК в мужские гаметы, которые бы не нарушали их биологических функций. The following methods are known for introducing foreign DNA / hDNA into spermatozoa: spontaneous absorption and forced impregnation / impregnation / of foreign DNA cells. The phenomenon of spontaneous absorption of exogenous DNA in the absence of seminal plasma has been described for mature sperm. It has been shown that spermatozoa are capable of transferring "captured" hDNA to the egg. Among the animals born, 30 individuals contained exogenous DNA. However, this method, despite its high performance, is characterized by poor reproducibility. Another approach (impregnation of sperm cDNA) is based on the use of various chemical and physical factors on sperm cells in order to more efficiently penetrate cDNA into the cell. As such agents, dimethyl sulfoxide, electroporation are used, and cDNA is preliminarily enclosed in liposomes / lipofecation /. As a result of using these methods of sperm treatment, the physiological functions of sperm cells are often disrupted: mobility decreases, the cytoplasmic membrane is destroyed, a spontaneous acrosomal reaction occurs, and the fertilizing ability of sperm cells is lost. In this regard, the problem arises of using such methods of introducing cDNA into male gametes that would not violate their biological functions.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является способ, описанный Brackett. Согласно этому способу, сперматозоиды получают от половозрелых самцов кролика с помощью искусственной вагины. Клетки отмывают фосфатным раствором Кребса-Рингера и инкубируют с чДНК в синтетической среде для оплодотворения ин витро в течение 2 часов при 37-38^oC в атмосфере 5% CO₂ в присутствии 3 диметилсульфоксида /ДМСО/. После этого сперматозоиды отмывают раствором Кребса-Рингера и поддерживают в синтетической среде, содержащей 20% инактивированной кроличьей сыворотки, в атмосфере 5% CO₂ в течение 24-48 часов. Далее спермии вновь отмывают солевым раствором и используют для осеменения крольчих при помощи инъекции сперматозоидов в каждый из рогов матки.The closest technical solution to the proposed is the method described by Brackett. According to this method, sperm are obtained from sexually mature male rabbits using an artificial vagina. Cells are washed with Krebs-Ringer phosphate solution and incubated with cDNA in a synthetic medium for in vitro fertilization for 2 hours at 37-38 ^° C in an atmosphere of 5% CO ₂ in the presence of 3 dimethyl sulfoxide / DMSO /. After that, the sperm are washed with a Krebs-Ringer solution and maintained in a synthetic medium containing 20% inactivated rabbit serum in an atmosphere of 5% CO ₂ for 24-48 hours. Next, the sperm are again washed with saline and used for insemination of rabbits by injection of sperm into each of the uterine horns.

Эффективность этого способа с точки зрения включения экзогенной ДНК в сперматозоиды составляет около 30% при частоте переноса чДНК в ооциты не более 40% а оплодотворяющая способность трансформированных спермиев достигает лишь 30-50% при плохой воспроизводимости результатов. Такой результат объясняется возможными повреждениями, которые накапливаются в клетках в результате продолжительного взаимодействия сперматозоидов с ДМСО и длительной инкубацией их в среде, поддерживающей метаболические процессы, что приводит к расходу энергетических ресурсов и утрате сперматозоидами биологических функций. The efficiency of this method from the point of view of incorporation of exogenous DNA into spermatozoa is about 30% at a frequency of transfer of cDNA into oocytes of not more than 40% and the fertilizing ability of transformed sperm reaches only 30-50% with poor reproducibility of the results. This result is explained by possible injuries that accumulate in the cells as a result of prolonged interaction of spermatozoa with DMSO and their long incubation in an environment that supports metabolic processes, which leads to the consumption of energy resources and the loss of biological functions by sperm.

Технический эффект от использования предполагаемого изобретения заключается в увеличении количества сперматозоидов, содержащих чДНК при сохранении ими биологических функций, что позволит повысить частоту передачи чДНК в ооциты и достичь высокой оплодотворяемости яйцеклеток. The technical effect of the use of the proposed invention is to increase the number of spermatozoa containing cDNA while maintaining their biological functions, which will increase the frequency of transmission of cDNA to oocytes and achieve high fertility of the eggs.

Технический эффект достигается за счет способа введения чужеродной ДНК в сперматозоиды, включающего получение сперматозоидов от донора, отмывку их от семенной жидкости солевым раствором и инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК в присутствии ДМСО при заданном температурном режиме, отличающегося тем, что перед отмывкой сперматозоиды подвергают флотации, а инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК осуществляют сначала при комнатной температуре в присутствии 1 ДМСО в течение 10 минут, затем концентрацию ДМСО доводят до 3 и смесь охлаждают до 0 -(+4^o) с последующим ее нагреванием до 42^oC.The technical effect is achieved due to the method of introducing foreign DNA into the sperm, including obtaining sperm from the donor, washing them from the seminal fluid with saline and incubating a suspension of sperm with introduced DNA in the presence of DMSO at a given temperature, characterized in that the flots are subjected to flotation before washing, and incubation of a suspension of sperm with the introduced DNA is carried out first at room temperature in the presence of 1 DMSO for 10 minutes, then the concentration of DMSO d lead to 3 and the mixture cooled to 0 - (+ 4 ^o), followed by heating it to 42 ^o C.

Флотация позволяет отобрать клетки, обладающие высокой подвижностью и активно поглощающие чДНК. Дробное добавление ДМСО исключает возможные побочные эффекты действия этого реагента на клетки, а совместное применение ДМСО и теплового шока способствует увеличению продуктивности включения чДНК в сперматозоиды. Сокращение времени манипулирования со спермиями ин витро максимально сохраняет их биологические функции. Кроме того, использование солевого раствора Эрла, являющегося более бедной средой по сравнению со средой Кребса-Рингера, и низкой температуры инкубирования 0 (+4^o) вызывает временное замедление метаболических процессов, происходящих в сперматозоидах, а последующая тепловая обработка спермиев вновь активизирует метаболизм и восстанавливает подвижность их, что благоприятствует процессу оплодотворения.Flotation allows you to select cells with high mobility and actively absorb hDNA. Fractional addition of DMSO eliminates the possible side effects of the action of this reagent on the cells, and the combined use of DMSO and heat shock increases the productivity of incorporation of hDNA into spermatozoa. Reducing the time of manipulation with sperm in vitro maximally preserves their biological functions. In addition, the use of Earl's salt solution, which is a poorer environment compared to Krebs-Ringer medium, and a low incubation temperature of 0 (+4 ^o ) causes a temporary slowdown in the metabolic processes occurring in spermatozoa, and subsequent heat treatment of sperm again activates the metabolism and restores their mobility, which favors the process of fertilization.

В результате применения данного способа экзогенная ДНК включается не менее чем в 35% сперматозоидов, частота переноса составляет более 60% оплодотворяемость яйцеклеток не менее 80%
Таким образом, предлагаемый способ отличается от известного большей эффективностью и воспроизводимостью. Способ универсален и распространяется вне зависимости от клеток-мишеней на все типы сперматозоидов Metazoa, а также на все типы ДНК независимо от ее происхождения. Метод может найти широкое применение при изучении регуляции генов на ранних стадиях эмбриогенеза, в тератологии, в пренатальной генотерапии и при создании трансгенных животных.As a result of using this method, exogenous DNA is included in at least 35% of spermatozoa, the frequency of transfer is more than 60%, egg fertility is not less than 80%
Thus, the proposed method differs from the known greater efficiency and reproducibility. The method is universal and applies regardless of the target cells to all types of Metazoa sperm, as well as to all types of DNA, regardless of its origin. The method can be widely used in studying the regulation of genes in the early stages of embryogenesis, in teratology, in prenatal gene therapy and in the creation of transgenic animals.

Предлагаемый способ введения чужеродной ДНК в сперматозоиды сводится к следующей последовательности операций. The proposed method for introducing foreign DNA into sperm is reduced to the following sequence of operations.

Сперму получают от половозрелых самцов с помощью искусственной вагины и подвергают флотации в 10-ти кратном объеме среды Эрла. Фракцию подвижных спермиев дважды отмывают средой и доводят до определенной концентрации. К суспензии клеток в среде Эрла добавляют ДМСО в количестве 1% и экзогенную ДНК. Через 10 минут инкубирования при комнатной температуре добавляют ДМСО до 3% и в течение 20 минут охлаждают до 0-(+4)^o, а затем помещают на 2 минуты в водяную баню с температурой 42^oC. Суспензию клеток разводят в три раза средой Эрла и используют для осеменения.Sperm is obtained from mature males using an artificial vagina and is flotated in a 10-fold volume of Earl medium. The motile sperm fraction is washed twice with medium and adjusted to a certain concentration. To a cell suspension in Earl's medium, 1% DMSO and exogenous DNA are added. After 10 minutes of incubation at room temperature, DMSO is added to 3% and cooled to 0 - (+ 4) ^o over 20 minutes, and then placed in a water bath at 42 ^° C for 2 minutes. The cell suspension is diluted three times with Earl medium and used for insemination.

Для отработки данного способа, а также в виде примера использовали сперматозоиды кролика и репортерную ДНК pRK3lacZ. Плазмида pRK3lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, который можно идентифицировать при помощи гистохимического окрашивания, используя хромогенный субстрат X-gal. Сине-зеленая окраска опытных зародышей свидетельствует об успешном выполнении спермиями векторных функций. To develop this method, as well as an example, rabbit sperm and reporter DNA pRK3lacZ were used. Plasmid pRK3lacZ encodes a β-galactosidase enzyme that can be identified by histochemical staining using the X-gal chromogenic substrate. The blue-green color of the experimental embryos indicates the successful fulfillment of vector functions by sperm.

Эффективность предлагаемого способа оценивали по продуктивности включения чДНК в сперматозоиды с помощью иммунохимического метода обнаружения чДНК, меченной дигоксигенином. Частоту переноса чДНК спермиями в ооциты в результате оплодотворения и оплодотворяющую способность сперматозоидов, выражающуюся в доле оплодотворенных яйцеклеток, определяли после гистохимического окрашивания ранних эмбрионов. The effectiveness of the proposed method was assessed by the productivity of incorporation of cDNA into spermatozoa using the immunochemical method for the detection of cDNA labeled with digoxigenin. The frequency of transfer of sDNA by sperm to oocytes as a result of fertilization and the fertilizing ability of spermatozoa, expressed in the proportion of fertilized eggs, was determined after histochemical staining of early embryos.

Пример, иллюстрирующий предлагаемый способ. An example illustrating the proposed method.

Кроличью сперму получали от половозрелых самцов породы шиншилла с помощью искусственной вагины. В опыт брали эякулят от 2-3 самцов. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-ти кратном объеме среды Эрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в среде Эрла до конечной концентрации 10⁷ кл/мл. К 500 мкл исходной суспензии сперматозоидов кролик добавляли ДМСО до 1% и в толщу суспензии вводили ДНК pRK3lacZ (10 мкг в 50 мкл буфера ТЕ). Смесь тщательно перемешивали и выдерживали 10 минут при комнатной температуре, после чего добавляли еще раз ДМСО до 3% Затем ее охлаждали в течение 20 минут до 0-(+4^o) и сразу помещали на 2 минуты в водяную баню с температурой 42^oC. Суспензию трансформированных сперматозоидов в три раза разводили средой Эрла и использовали для искусственного осеменения крольчих (500 мкл на одну самку). Перед осеменением определяли количество трансформированных сперматозоидов иммунохимическим методом обнаружения чДНК, меченной дигоксигенином. Через 46 часов после осеменения из яйцеводов крольчих вымывали эмбрионы, которые подвергали гистохимическому окрашиванию, используя хромогенный субстрат X-gal. После окрашивания определяли частоту переноса чДНК спермиями в ооциты и оплодотворяющую способность трансформированных сперматозоидов. Результаты представлены в таблице.Rabbit sperm was obtained from sexually mature males of a chinchilla breed using an artificial vagina. In the experience they took ejaculates from 2-3 males. Active sperm cells were separated from immobile sperm cells by flotation in a 10-fold volume of Earl medium. The motile cell suspension was centrifuged twice at 200 g for 5 minutes. The pellet was resuspended in Earl medium to a final concentration of 10 ⁷ cells / ml. DMSO up to 1% was added to 500 μl of the initial rabbit sperm suspension and pRK3lacZ DNA (10 μg in 50 μl TE buffer) was added to the suspension. The mixture was thoroughly mixed and kept for 10 minutes at room temperature, after which DMSO was added again to 3%. Then it was cooled for 20 minutes to 0 - (+ 4 ^o ) and immediately placed in a water bath for 2 minutes at a temperature of 42 ^o C. The suspension of transformed sperm was diluted three times with Earl medium and used for artificial insemination of rabbits (500 μl per female). Before insemination, the number of transformed spermatozoa was determined by the immunochemical method for the detection of digoxigenin-labeled hDNA. 46 hours after insemination, rabbits were washed from rabbit oviducts, which were histochemically stained using X-gal chromogenic substrate. After staining, the frequency of sDNA transfer by sperm to oocytes and the fertilizing ability of transformed spermatozoa were determined. The results are presented in the table.

Claims

1. The method of introducing foreign DNA into the sperm, including obtaining sperm from the donor, washing them from the seminal fluid with saline and incubating a suspension of sperm with the introduced DNA in the presence of DMSO at a given temperature regime, characterized in that the flots are subjected to flotation in saline before washing, and incubation is carried out first at room temperature in the presence of 1% DMSO, then the concentration is adjusted to 3% and the mixture is cooled to 0 ^{° C.} , followed by heating to 42 ^° C.

2. The method according to p. 1, characterized in that the incubation of spermatozoa with the introduced DNA in the presence of 1% DMSO is carried out for 10 minutes, with cooling to 0 ^o With stand for 20 minutes and heated to 42 ^o With for 2 minutes